CN104813940B - 一种白接骨的组织培养快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种白接骨的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：①丛生芽的诱导：3月取材的外植体在添加了6‑BA+NAA 的MS基本培养基培养到芽长3 cm时取出，沿着茎切将两侧腋芽分开，然后转移接种于添加了6‑BA +ZT的第一MS基本培养基，②不定芽的增殖生长：将上步诱导产生的丛生芽切成2‑3个一组，转接于添加了6‑BA +ZT +NAA的第二MS基本培养基；③不定芽的生根培养：将上步增殖培养获得的不定芽丛切成单个不定芽，转接到添加了NAA的1/4强度的MS基本培养基中；④再生苗的炼苗和移栽。采用本发明的方法，能够快速地获得白接骨再生苗植株，利于产业化生产。
Description
技术领域
本发明属于植物组培快速繁殖技术领域，具体涉及白接骨的组培快速繁殖方法。
背景技术
白接骨[Asystasiellaneesiana(Wall.) Lindau]为爵床科（Acanthaceae）白接骨属多年生草本植物，分布于江苏、浙江、安徽、江西、福建、广东、广西、湖南（芷江、大庸、永顺、宜章）、湖北、云南、贵州、重庆、四川等地，生林下或溪边。全草入药，名白接骨、玉龙盘、无骨苎麻、玉梗半枝莲、玉接骨、血见愁、玉钱草、麒麟草、玉连环、接骨草、猢狲节根、金不换、橡皮草、华可西达、小阿西达、蛀木虫等。夏、秋季采收，晒干或鲜用。性凉，味苦、淡，入肺经。具化瘀止血、续筋接骨、利尿消肿、清热解毒之功效，主治吐血、便血、外伤出血、跌打瘀肿、扭伤骨折、风湿肢肿、腹水、疮疡溃烂、疖肿、咽喉肿痛等症。其花可仅观赏用。在中国，该属仅白接骨[Asystasiellaneesiana(Wall.) Lindau]一个种。白接骨的自然繁殖主要靠种子和根状茎，其中每个果实仅含4粒种子，靠自然繁殖显然不能达到大量繁殖的目的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种白接骨的组织培养快速繁殖方法。
为实现本发明之目的，采用以下技术方案予以实现：一种白接骨的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
①丛生芽的诱导：3月取材的外植体在添加了6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L 的的MS基本培养基培养到芽长3 cm时取出，沿着茎切将两侧腋芽分开，然后转移接种于第一MS基本培养基，置于培养室光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30.1-40 μmol/(m2·s)；
所述的第一MS基本培养基添加了：
6-BA 0.1-3.0 mg/L+NAA 0.1-1.0 mg/L、
6-BA 0.1-3.0 mg/L+IAA 0.1-3.0 mg/L、
6-BA 0.1-3.0 mg/L +TDZ 0.1-2.0 mg/L、
6-BA 0.1-3.0 mg/L +ZT 0.1-2.0 mg/L、
ZT 0.1-2.0 mg/L+NAA 0.1-1.0 mg/L、
ZT 0.1-2.0 mg/L+IAA 0.1-3.0 mg/L或
TDZ 0.1-2.0 mg/L+NAA 0.1-1.0 mg/L；
②不定芽的增殖生长：将上步诱导产生的丛生芽切成2-3个一组，转接于第二MS基本培养基，置于培养室光照培养；
所述的第二MS基本培养基添加了：
6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5 mg/L+NAA 0.1-1.0mg/L、
6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5 mg/L+IBA 0.1-1.0 mg/L或
6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5 mg/L+IAA0.1-3.0 mg/L；
③不定芽的生根培养：将上步增殖培养获得的不定芽丛切成单个不定芽，转接到添加了NAA 0.1-1.0 mg/L、IAA 0.1-3.0 mg/L或IBA 0.1-1.0 mg/L的1/4强度的MS基本培养基中；
④再生苗的炼苗和移栽：将上步完成生根培养的不定芽的培养瓶打开一条缝，让其与外部空气相通，6 h后半开瓶盖，加入少量无菌水以保持培养基的湿润，过1d后完全打开瓶盖，让它完全接受培养室的日光灯管的直接光照2d后将培养基捣碎，小心取出带少量琼脂的再生苗植株，在缓慢流水中用软刷仔细清洗根部沾有的琼脂块，将清洗干净的再生苗植株移栽至添加蛭石的消毒土中，在培养容器上罩以聚乙烯塑料薄膜以保持培养容器的湿度，培养容器置于阴凉地，5天即可揭开塑料蒲膜，于阴凉处培养7d后移至大田。
作为优选方案：所述的第一MS基本培养基添加了6-BA 0-3.0 mg/L +ZT 0-2.0mg/L。
作为优选方案：所述的第二MS基本培养基添加了：6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L、6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5 mg/L+IAA 1.5 mg/L或6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5mg/L+IBA 0.3 mg/L。
与现有技术相比较，本发明的有益效果是：采用本发明的方法，能够快速地获得白接骨再生苗植株，利于产业化生产。采用本发明方法，白接骨丛生芽的诱导率高达91.5%，不定芽增殖率可达6.1，植株移栽成活率可达98.3%以上。
具体实施方式
外植体取样时间的选择：于无雨的上午，选取3-11月的白接骨茎，剪成带腋芽的茎段，先留约2cm的叶柄，先用软毛刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4min，用流水冲洗0.5 h后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有5滴吐温-80的0.1% HgCl2溶液内浸泡消毒9-10 min，无菌水冲洗3次后插入到添加6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L的MS基本培养基（灭菌前用1 mol/L NaOH或HCl调节pH至5.8-6.0，蔗糖3%，琼脂0.8%，于121℃下灭菌20 min）中，置于黑暗中2 d，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)。15 d统计污染率和腋芽启动（即腋芽恢复生长）率。结果表明，污染率介于3-24%，腋芽启动率介于42-90%之间，其中以3月取材的、腋芽尚未长出明显叶片的外植体的污染率和腋芽启动率最高，分别为3%和90%；11月取材的外植体腋芽启动率最低（42%），因为此时地上部开始死亡，故在以下实施例中均选取3月份的白接骨茎段进行丛生芽的诱导。
实施例1
一种白接骨的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
①丛生芽的诱导：3月取材的外植体在添加了6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L 的MS基本培养基培养到芽长3 cm时取出，沿着茎切将两侧腋芽分开，然后转移接种于第一MS基本培养基，置于培养室光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗（14小时光照培养，10小时黑暗中培养循环交替），光照强度30.1-40 μmol/(m2·s)；
所述的第一MS基本培养基添加了：6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5 mg/L；丛生芽诱导率为91.5%，平均不定芽数为6.3个。
②不定芽的增殖生长：将上步诱导产生的丛生芽切成2-3个一组，转接于第二MS基本培养基，置于培养室光照培养；
所述的第二MS基本培养基添加了：6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L，在培养30 d后不定芽的长度可超过3 cm，叶色正常，叶片较大，不定芽增殖的倍数达到6.1。
③不定芽的生根培养：将上步增殖培养获得的不定芽丛切成单个不定芽，转接到添加了IBA 0.1-1.0 mg/L的1/4强度的MS基本培养基中（1/4强度指的是MS基本培养基中各组分均是原配方浓度至1/4浓度）；生根最早于转接后10 d发生，但大量发生则为转接后15-18 d，于转接30 d后统计生根率，生根率为达到94.3%。
④再生苗的炼苗和移栽：将上步完成生根培养的不定芽的培养瓶打开一条缝，让其与外部空气相通，6 h后半开瓶盖，加入少量无菌水以保持培养基的湿润，过1d后完全打开瓶盖，让它完全接受培养室的日光灯管的直接光照2d后将培养基捣碎，小心取出带少量琼脂的再生苗植株，在缓慢流水中用软刷仔细清洗根部沾有的琼脂块，将清洗干净的再生苗植株移栽至添加蛭石的消毒土中，在培养容器上罩以聚乙烯塑料薄膜以保持培养容器的湿度，培养容器置于阴凉地，5天即可揭开塑料蒲膜，于阴凉处培养7d后移至大田。经统计，组培再生苗移栽的成活率为98.3%。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于第一MS基本培养基添加的组分不同，以此试验不同培养基对丛生芽诱导率的影响：
添加了6-BA+NAA的第一MS基本培养基的丛生芽诱导率为14.5%-48.6%，平均不定芽数为1.3-2.8个，最佳的组合为6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，其丛生芽诱导率为48.4%，平均不定芽数为2.8个。
添加了6-BA+IAA的第一MS基本培养基的丛生芽诱导率为15.6%-50.4%，平均不定芽数为1.4-3.3个，最佳的组合为6-BA 2.0 mg/L+IAA 1.5 mg/L，其丛生芽诱导率为50.4%，平均不定芽数为3.3；
添加了6-BA+TDZ的第一MS基本培养基的丛生芽诱导率为45.7%-83.2%，平均不定芽数为2.5-5.4，最佳的组合为6-BA 2.0 mg/L+TDZ 1.0 mg/L，其丛生芽诱导率为83.2%，平均不定芽数为5.4个；
添加了ZT+NAA的第一MS基本培养基的丛生芽诱导率为37.4%-74.2%，平均不定芽数为2.3-4.8个，最佳的组合为ZT 0.5 mg/L +NAA 0.5 mg/L，其丛生芽诱导率为74.2%，平均不定芽数为4.8个；
添加了ZT +IAA的第一MS基本培养基的丛生芽诱导率为36.5%-74.5%，平均不定芽数为2.4-4.7个，最佳的组合为ZT 0.5 mg/L +NAA 0.5 mg/L，其丛生芽诱导率为74.5%，平均不定芽数为4.7个；
添加了TDZ+NAA的第一MS基本培养基的丛生芽诱导率为17.4%-58.3%，平均不定芽数为2.1-3.6个，最佳的组合为TDZ 1.0mg/L +NAA 0.5 mg/L，其丛生芽诱导率为58.3，平均不定芽数为3.6；
表明细胞分裂素在促进丛生芽诱导中起了决定性作用，而生长素（NAA、IAA）主要起到了促进芽伸长的作用。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于第二MS基本培养基添加的组分不同，以此试验不同培养基对不定芽增殖的影响：
添加了6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5 mg/L+IAA 1.5 mg/L的第二MS基本培养基，不定芽增值率达到5.8。
添加了6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5 mg/L+IBA 0.3 mg/L的第二MS基本培养基，不定芽增值率达到5.95。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于1/4强度的MS基本培养基添加的组分不同，以此试验不同培养基对生根率的影响：
添加了NAA 0.3 mg/L的1/4强度的MS基本培养基，生根率为92.8%。
添加了IAA 1.0 mg/L的1/4强度的MS培养基，生根率为92.5%。
对比上述实施例可发现，实施例1最终可获得最多的再生苗植株，为最佳的实施例。
文中所涉及缩略词的含义：
6-BA 6-苄基腺嘌呤
NAA α-萘乙酸
IAA 吲哚-3-乙酸
IBA 吲哚丁酸
TDZ 噻苯隆
ZT 玉米素
MS培养基Murashige和Skoog（1962）报道的培养基
d 天
h小时
min 分钟。
Claims (1)
1.一种白接骨的组织培养快速繁殖方法，其特征在于依次包括以下步骤：
①丛生芽的诱导：3月取材的外植体在添加了6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L 的MS基本培养基培养到芽长3 cm时取出，沿着茎中间将两侧的腋芽切开分离，然后转移接种于第一MS基本培养基，置于培养室光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10 h暗（14小时光照培养，10小时黑暗中培养循环交替），光照强度30.1-40 μmol/(m2·s)；
所述的第一MS基本培养基添加了：6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5 mg/L；
②不定芽的增殖生长：将上步诱导产生的丛生芽切成2-3个一组，转接于第二MS基本培养基，置于培养室光照培养；
所述的第二MS基本培养基添加了：6-BA 2.0 mg/L +ZT 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L；
③不定芽的生根培养：将上步增殖培养获得的不定芽丛切成单个不定芽，转接到添加了IBA 0.1-1.0 mg/L的1/4强度的MS基本培养基中；所述1/4强度指的是MS基本培养基中各组分均是原配方浓度的1/4浓度；
④再生苗的炼苗和移栽：将上步完成生根培养的不定芽的培养瓶打开一条缝，让其与外部空气相通，6 h后半开瓶盖，加入少量无菌水以保持培养基的湿润，过1d后完全打开瓶盖，让它完全接受培养室的日光灯管的直接光照2d后，将培养基捣碎，小心取出带少量琼脂的再生苗植株，在缓慢流水中用软刷仔细清洗根部沾有的琼脂块，将清洗干净的再生苗植株移栽至添加蛭石的消毒土中，在培养容器上罩以聚乙烯塑料薄膜以保持培养容器的湿度，培养容器置于阴凉地，5天即揭开塑料薄膜，于阴凉处培养7d后移至大田。
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