CN103688857A - 一种快速繁育铁皮石斛的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物育种或组织培养领域，具体公开了一种快速繁育铁皮石斛的方法，包括将铁皮石斛植株上的叶片切成叶块；在诱导胚性愈伤培养基上将叶块培养成胚性愈伤组织；在原球茎液体悬浮培养基上将胚性愈伤组织培养成原球茎；在继代生长培养基上将原球茎培养成小苗；和，在生根培养基上使得小苗长成试管苗。
Description
技术领域
本发明属于植物育种或组织培养领域，具体而言，本发明涉及快速繁育铁皮石斛的方法，尤其适用于规模化生产优质铁皮石斛试管苗。
背景技术
铁皮石斛（学名：Dendrobium officinale）又名黑节草，属气生兰科草本植物。石斛可分为黄草、金钗、马鞭等数十种，其中铁皮石斛为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名。原产中国安徽大别山、浙东天台山、福建宁化、广西天峨、云南文山以及四川等地，多分布于海拔近千米的山地半阴湿岩石上，一般均能耐－5℃的低温。
铁皮石斛是极其珍贵的中药材，应用历史悠久，在《神农本草经》中被列为上品，现已证实它具有滋阴清热、生津健胃、止咳润肺、润喉明目、提高人体免疫功能、防治肿瘤和心血管疾病以及改善睡眠、防治白内障、延年益寿等功效。近年来由于受经济利益的驱使，人们在采收石斛时将其连根拔起，导致石斛濒临灭绝。由于铁皮石斛繁殖系数低，种子极小，无胚乳，甚至不能结实（通常越是优质的铁皮石斛越是不能结实），因此自然条件下繁殖缓慢，远不能满足生产上的需要。
即使进行组织培养，效率也不高，甚至存在风险。例如，目前有相当多的技术是直接使用铁皮石斛或其苗作为初始培养材料，如中国专利200610017604、200910051663、201310282962、200910238037、201010202793、201210374262、201310186625、201310282955等，这样其实浪费了原来就比较难获得的铁皮石斛苗，尤其是优质的铁皮石斛苗，如果组织培养的效率不高，那么就没有什么意义，甚至可能由于组织培养失败而浪费了优质的铁皮石斛苗；
另外许多技术是使用铁皮石斛（苗）的（幼）茎、茎尖或芽，如中国专利200710160571、200810058043、200810058044、200810058316、200910164340、201010000764、201110035697、201110284479、201110365328、201310146960等，这样破坏了茎，使得铁皮石斛这样直立茎的植物无法继续生长，也会存在以上组织培养的效率不高所带来的问题，尤其不适合应用于优质的铁皮石斛品系。
更为严重的是，在取茎段或芽的时候，上述现有技术基本上都明确要求弃去叶片。
为此，本发明人经过艰苦的研究，没有受到现有技术阻碍的影响，令人意外地采用铁皮石斛的叶片作为初始材料，以非破坏原植物生长的方式来进行组织培养，快速繁殖出铁皮石斛，尤其是优质的铁皮石斛品系，特别有益于我国农村（尤其是山区）农户更多地种植优质的铁皮石斛品系，发展农村经济，促进山区群众增收。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的快速繁育铁皮石斛的方法，另外还提供了新的快速繁育铁皮石斛中的应用，等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了快速繁育铁皮石斛或其试管苗的方法，其包括
1）取铁皮石斛植株上的叶片，经消毒和水洗后，切成0.01～0.3mm（优选是0.05～0.25mm，更优选是0.1～0.2mm）的叶块；
2）在诱导胚性愈伤培养基上将叶块培养成胚性愈伤组织；
3）在原球茎液体悬浮培养基上将胚性愈伤组织培养成原球茎；
4）在继代生长培养基上将原球茎培养成小苗；
5）在生根培养基上使得小苗长成试管苗；和，
6）任选将试管苗移植于田间长成铁皮石斛植株，优选是长成成熟的铁皮石斛植株。
现有技术要么直接使用铁皮石斛种子或幼苗等繁殖材料，要么使用植株中生长旺盛的材料（如茎尖、芽），与此非常不同，本发明人发现使用铁皮石斛植株上的叶片，不破坏被取叶片的铁皮石斛植株本身的生长，就能够高效地快速繁育出铁皮石斛或其试管苗。
在本文中，铁皮石斛植株具有本领域技术人员所熟知的含义。由于是植株，所以不可能是种子、器官或者组织。优选在本发明中，铁皮石斛植株是非苗铁皮石斛植株，即非苗期的铁皮石斛植株，优选是成熟（收获期）的铁皮石斛植株。
在本文中，叶片具有本领域技术人员所熟知的含义。根据标准的定义，叶片不可能是芽。为了更清楚起见，优选在本发明中，叶片是非芽叶片，即不带芽的叶片，优选是成熟（收获期）的叶片。
本发明特别有益于优质的铁皮石斛的繁育。由于铁皮石斛的品种/品系众多，单单浙江省中一个地区常规栽培的品种/品系之间的差异就很大（如参见《温州地区4个铁皮石斛栽培品种的形态特征与多糖含量分析》，浙江农业科学，2010（6）：1261-1263），优质的铁皮石斛的品种/品系往往繁育困难，尤其是因为植株量少而育种人不原意对植株进行现有技术破坏性繁育，甚至可能导致仅有的一些植株由于繁育失败而失去这个优质品种/品系。所以，本发明的方法彻底消除了这种风险，甚至可以在收获前采摘叶片来进行繁育。
本发明的方法关键在于叶片所切成的叶块不能大，也不能太小。本发明人发现，切成的叶块大了的话，非常容易白化死亡，即使周围有更小的小块，也十分容易被诱导死亡，导致最终几乎无法获得胚性愈伤组织（更无法获得试管苗），这也是现有技术（一般肉眼操作，最多是切成1mm左右的小块）中明确要求弃去叶片的原因；如果切得非常小，如利用（不完全的）匀浆操作，将导致大量破坏细胞，细胞裂解液也会促使周围的（完整）细胞或细胞群死亡，将严重影响获得胚性愈伤组织的效率。所以在本发明中，叶块的尺寸是最长边的边长是0.01～0.3mm的叶块，优选是最长边的边长是0.05～0.25mm的叶块，更优选是最长边的边长是0.1～0.2mm的叶块，另外也优选可以是正方形的叶块。
优选在在本发明的方法中，诱导胚性愈伤培养基的配方为：含琼脂的基本培养基+水解乳蛋白0.8～1.2g/L+ABA0.2～1.2mg/L+BA0.8～1.6mg/L+NAA0.6～1.2mg/L。
优选在在本发明的方法中，原球茎液体悬浮培养基的配方为：1/2不含琼脂的基本培养基+ABA0.2～0.6mg/L+BA0.2～0.8mg/L+NAA0.1～0.5mg/L。
优选在在本发明的方法中，继代生长培养基的配方为：含琼脂的基本培养基+BA0.1～0.3mg/L+NAA0.1～0.3mg/L+马铃薯0.25～0.35kg/L。
优选在在本发明的方法中，生根培养基的配方为：含琼脂的基本培养基+NAA0.1～0.3mg/L。
在上述培养基中，含琼脂的基本培养基的配方为：MS基本培养基+蔗糖22～28g/L+琼脂6～10g/L，pH5.5～6；和/或，不含琼脂的基本培养基的配方为：MS基本培养基+蔗糖22～28g/L，pH5.5～6。
以上培养基中还可以添加抗菌素，从而防止污染，使得操作过程更为便利（无需过度要求无菌环境）。抗菌素优选是广谱抗菌素，如青霉素、赤霉素、链霉素等；抗菌素在培养基中的含量可以是0.1～5mg/L，优选是0.2～1mg/L，更优选是0.3～0.8mg/L，如0.5mg/L。根据操作的规模或精细程度（污染的可能性程度）以及相应阶段植物组织的病菌耐受性，本发明人建议只在继代生长培养基中加入抗菌素。
优选在在本发明的方法中，步骤1）中的消毒和水洗是依次用水洗、用酒精消毒、用升汞消毒和用水洗。
优选在在本发明的方法中，步骤2）是将叶块接种在诱导胚性愈伤培养基上，先在25土3℃、光强1000土100lux、光照16土2小时∕天的条件下培养，至四周后光照增强到2000土200lux，六周后光照增强到4000土400lux，继续培养至生长出胚性愈伤组织。
优选在在本发明的方法中，步骤3）是将胚性愈伤组织接种在原球茎液体悬浮培养基上，以转速50土10rpm、25土3℃和黑暗条件下培养,其中每15土5天更换一次新鲜的原球茎液体悬浮培养基，培养至出现原球茎。
优选在在本发明的方法中，步骤4）是将原球茎接种在继代生长培养基上，在25土3℃、光强2500土300lux、光照16土2小时∕天的条件下培养，直至长成小苗。
优选在在本发明的方法中，步骤5）是将小苗接种到生根培养基上，在25土3℃，光强2500土300lux、光照16土2小时∕天下培养，直至长成试管苗。
在第二方面，本发明提供了铁皮石斛植株上的叶片或由该叶片切成的叶块在快速繁育铁皮石斛中的应用。
优选在本发明的应用中，叶片是非芽叶片。
优选在本发明的应用中，叶块是0.01～0.3mm（优选是0.05～0.25mm，更优选是0.1～0.2mm）的叶块。
优选在本发明的应用中，铁皮石斛植株是非苗铁皮石斛植株。
优选在本发明的应用中，快速繁育铁皮石斛是以本发明第一方面的方法快速繁育铁皮石斛。
本发明的有益效果在于，以植株的叶片为初始材料进行铁皮石斛组培快速繁育，对原植株的生长没有破坏性；特别有益于量少的优质铁皮石斛的繁育，彻底消除了由于繁育操作不慎等事故引起一些量少的优质铁皮石斛品种/品系的灭绝的风险；操作容易，繁育速度快，一年四季都可采集叶片，适应性好；配合本发明优化的培养基和培育过程，生产试管苗的效率高，生产的试管苗苗质好，移栽成活率高达98%以上。
附图说明
图1是本发明的快速繁育铁皮石斛的方法所培育出的试管苗的照片。
图2是本发明的快速繁育铁皮石斛的方法所培育出的试管苗移植在田间（大棚）生长的前期照片。
图3是本发明的快速繁育铁皮石斛的方法所培育出的试管苗移植在田间（大棚）生长的后期照片。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进行说明，其中未特别详细说明的工具、试剂均为本领域技术人员所熟知的，可以从市场所购买，如MS基本培养基可购自浙江省农科院（不含琼脂）），也可以参见植物组培的书籍或实验手册；其中所用的铁皮石斛非芽叶片采摘自成熟的圣草堂品系铁皮石斛，该鲜叶可购自浙江省农科院，该鲜叶采摘后冷冻于4℃冷冻箱中并于12小时内开始进行快速繁育。
实施例1快速繁育铁皮石斛的方法1
配制如下培养基：
1）基本培养基：含琼脂配方：MS基本培养基+蔗糖25g/L+琼脂7g/L，pH5.6；不含琼脂配方：MS基本培养基+蔗糖25g/L，pH5.6；
2)诱导胚性愈伤培养基：含琼脂的基本培养基+水解乳蛋白1g/L+ABA（脱落酸）0.7mg/L+BA（6-苄氨基嘌呤）1mg/L+NAA（萘乙酸）1mg/L；
3)原球茎液体悬浮培养基：1/2不含琼脂的基本培养基+ABA0.3mg/L+BA0.3mg/L+NAA0.1mg/L；
4）继代生长培养基：含琼脂的基本培养基+BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L+马铃薯（粉）0.3kg/L；
5）生根培养基：含琼脂的基本培养基+NAA0.1mg/L；
铁皮石斛的组织培养步骤如下：
1）材料预处理：取新鲜非芽叶片用自来水冲洗10-30分钟，依次浸入70%（V/V）酒精消毒30秒，用0.1%升汞加一滴土温摇动消毒8分钟，然后用无菌水洗3-5次后，最后在显微镜下将叶片切成0.1-0.2mm见方的微小叶块（不可超过0.3mm），备用；
2）诱导愈伤和胚性培养：将叶块接种在诱导胚性愈伤培养基上，先在25土2℃、光强1000lux、光照16小时∕天下培养，至四周后光照增强到2000lux，六周后光照增强到4000lux，继续培养9周，生长出胚性愈伤组织；
3）原球茎液体悬浮培养：将胚性愈伤组织接种在原球茎液体悬浮培养基上，以摇床转速50rpm、25土2℃和黑暗条件下培养,其中每15天更换一次新鲜的原球茎液体悬浮培养基，1个月后培养基中出现原球茎；
4）继代生长培养：将原球茎接种在继代生长培养基上，在25土2℃，光强2500lux、光照16小时∕天下培养，直至长成3-5分蘖小苗；
5）生根培养：将小苗接种到生根培养基上，在25土2℃，光强2500lux、光照16小时∕天下培养，约1周后长出根系成为完整试管苗，即可收获。
实施例2快速繁育铁皮石斛的方法2
配制如下培养基：
1）基本培养基：含琼脂配方：MS基本培养基+蔗糖25g/L+琼脂8g/L，pH5.7；不含琼脂配方：MS基本培养基+蔗糖25g/L，pH5.7；
2)诱导胚性愈伤培养基：含琼脂的基本培养基+水解乳蛋白1g/L+ABA0.9mg/L+BA1.3mg/L+NAA0.7mg/L；
3)原球茎液体悬浮培养基：1/2不含琼脂的基本培养基+ABA0.3mg/L+BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L；
4）继代生长培养基：含琼脂的基本培养基+BA0.2mg/L+NAA0.2mg/L+马铃薯（粉）0.3kg/L；
5）生根培养基：含琼脂的基本培养基+NAA0.2mg/L；
铁皮石斛的组织培养步骤同实施例1，最终产生的试管苗如图1所示，可以用于田间移植，每采摘一片新鲜非芽叶片（不破坏原植株），通过本发明的方法，可以获得约120株试管苗，移栽成活率99%以上（见图2），经过长时间种植后的照片见图3。
实施例3快速繁育铁皮石斛的方法3
配制如下培养基：
1）基本培养基：含琼脂配方：MS基本培养基+蔗糖25g/L+琼脂9g/L，pH5.8；不含琼脂配方：MS基本培养基+蔗糖25g/L，pH5.8；
2)诱导胚性愈伤培养基：含琼脂的基本培养基+水解乳蛋白1g/L+ABA1.1mg/L+BA1.5mg/L+NAA0.9mg/L；
3)原球茎液体悬浮培养基：1/2不含琼脂的基本培养基+ABA0.5mg/L+BA0.7mg/L+NAA0.3mg/L；
4）继代生长培养基：含琼脂的基本培养基+BA0.3mg/L+NAA0.3mg/L+马铃薯（粉）0.3kg/L；
5）生根培养基：含琼脂的基本培养基+NAA0.3mg/L；
铁皮石斛的组织培养步骤同实施例1。
Claims (10)
1.快速繁育铁皮石斛的方法，其包括：
1）取铁皮石斛植株上的叶片，经消毒和水洗后，切成0.01～0.3mm（优选是0.05～0.25mm，更优选是0.1～0.2mm）的叶块；
2）在诱导胚性愈伤培养基上将叶块培养成胚性愈伤组织；
3）在原球茎液体悬浮培养基上将胚性愈伤组织培养成原球茎；
4）在继代生长培养基上将原球茎培养成小苗；和
5）在生根培养基上使得小苗长成试管苗。
2.权利要求1所述的方法，其中
诱导胚性愈伤培养基的配方为：含琼脂的基本培养基+水解乳蛋白0.8～1.2g/L+ABA0.2～1.2mg/L+BA0.8～1.6mg/L+NAA0.6～1.2mg/L；
原球茎液体悬浮培养基的配方为：1/2不含琼脂的基本培养基+ABA0.2～0.6mg/L+BA0.2～0.8mg/L+NAA0.1～0.5mg/L；
继代生长培养基的配方为：含琼脂的基本培养基+BA0.1～0.3mg/L+NAA0.1～0.3mg/L+马铃薯0.25～0.35kg/L；和/或，
生根培养基的配方为：含琼脂的基本培养基+NAA0.1～0.3mg/L；
而且上述培养基中，含琼脂的基本培养基的配方为：MS基本培养基+蔗糖22～28g/L+琼脂6～10g/L，pH5.5～6；和/或，不含琼脂的基本培养基的配方为：MS基本培养基+蔗糖22～28g/L，pH5.5～6。
3.权利要求1所述的方法，其中
步骤1）中的消毒和水洗是依次用水洗、用酒精消毒、用升汞消毒和用水洗；
步骤2）是将叶块接种在诱导胚性愈伤培养基上，先在25土3℃、光强1000土100lux、光照16土2小时∕天的条件下培养，至四周后光照增强到2000土200lux，六周后光照增强到4000土400lux，继续培养至生长出胚性愈伤组织；
步骤3）是将胚性愈伤组织接种在原球茎液体悬浮培养基上，以转速50土10rpm、25土3℃和黑暗条件下培养,其中每15土5天更换一次新鲜的原球茎液体悬浮培养基，培养至出现原球茎；
步骤4）是将原球茎接种在继代生长培养基上，在25土3℃、光强2500土300lux、光照16土2小时∕天的条件下培养，直至长成小苗；和/或，
步骤5）是将小苗接种到生根培养基上，在25土3℃，光强2500土300lux、光照16土2小时∕天下培养，直至长成试管苗。
4.权利要求1所述的方法，其中叶片是非芽叶片。
5.权利要求1所述的方法，其中步骤1）中的铁皮石斛植株是非苗铁皮石斛植株。
6.铁皮石斛植株上的叶片或由该叶片切成的叶块在快速繁育铁皮石斛中的应用。
7.权利要求6所述的方法，其中叶片是非芽叶片。
8.权利要求6所述的方法，其中叶块是0.01～0.3mm（优选是0.05～0.25mm，更优选是0.1～0.2mm）的叶块。
9.权利要求6所述的方法，其中铁皮石斛植株是非苗铁皮石斛植株。
10.权利要求6所述的方法，其中快速繁育铁皮石斛是以权利要求1～5之任一所述的方法快速繁育铁皮石斛。
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