CN110604060A - 一种红山茶花药离体培养获得再生植株的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请属于植物细胞工程领域，具体涉及一种红山茶花药离体培养获得再生植株的方法。所述红山茶花药离体培养获得再生植株的方法，包括：将红山茶的花药进行低温预处理，愈伤组织诱导培养，分化培养和生根培养；其中，所述愈伤组织诱导培养采用暗培养；所采用的愈伤组织诱导培养基包括：激素组合，防褐变剂以及30‑80g/L的蔗糖，所述激素组合为2,4‑D、KT和TDZ组合，或2,4‑D、6‑BA和TDZ组合。所述方法能够显著提高红山茶花药再生培养的愈伤诱导率、分化率和生根率。

Description

一种红山茶花药离体培养获得再生植株的方法
技术领域
本申请属于植物细胞工程领域，具体涉及一种红山茶花药离体培养获得再生植株的方法。
背景技术
红山茶主要来自山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)红山茶组(Sect Camellia)的物种及其品种，花红色，艳丽，具有极高的观赏价值，同时一些物种结实率和种仁含油率较高，还可以作为优质的木本食用油料。
浙江红山茶(Camellia chekiangoleosa Hu)，又称为浙江红花油茶，是我国山茶属(Camellia spp.)的特有种，是一种优良的红山茶种。浙江红山茶耐寒，开花于早春，花朵硕大鲜艳且密集，果实酷似苹果，颜色鲜红或黄绿色，成熟时满树红果，具有极高的观赏价值。红花油茶具有很高的油用价值。红花油茶的种仁含油率高达60％左右，茶油中油酸的含量高达85％左右，其种仁含油率和油酸含量均显著高于普通油茶、攸县油茶、小果油茶、越南油茶等白花油茶物种。茶油是我国特有的木本食用油料，其富含油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸，有“东方橄榄油”之美誉，含有维生E、角鲨烯、甾醇等微量成分，是一种具有多种保健作用的功能性食用油。浙江红山茶集观赏、油用、药用于一身，具有重要的经济价值，在油茶和花卉生产中有着巨大的潜在价值。
日本红山茶(Camellia Japanica)为山茶属(Camellia spp.)红山茶组(SectionCamellia)植物，主要分布在日本的伊豆诸岛、九洲、五岛、本洲、四国及最南面的冲强县。日本红山茶一般高4～5m，11月至次年1-2月开花，花色艳丽，树型美观，可作园林观赏树种和盆景生长。日本红山茶产量较高，盛果期茶油产量可达450kg/hm2。研究表明，日本红山茶的油酸含量高达84％,与浙江红山茶的茶油相似，可以作为优质的木本食用油料，经加工后可达到化妆品用茶油标准，使用后对人体皮肤十分有益。山茶花名贵品种‘玉之浦’(Tama-no-ura,日文名)是日本人在野生的日本红山茶(Camellia Japanica)林中发现的一个变异植株。‘玉之浦’在国际茶花界名声很大,是国内外茶花苗圃和爱好者心目中的名种。从1993年起,陆续从‘玉之浦’实生苗中选育出了10多个新品种。由于红山茶为多年生木本植物，基因高度杂合，具有丰富的遗传多样性，传统杂交育种方式周期长，其再生培养的诱导率、分化率和生根率相对较低，再生效率低，难以获得纯合植株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红山茶花药离体培养获得再生植株的方法，为红山茶育种提供单倍体育种材料，也为红山茶转基因育种提供了理想的受体材料；所述方法能够显著提高红山茶花药再生培养的愈伤诱导率、分化率和生根率。
本发明所述一种红山茶花药离体培养获得再生植株的方法，包括：将红山茶的花药进行低温预处理，愈伤组织诱导培养，分化培养和生根培养；所述愈伤组织诱导培养所采用的愈伤组织诱导培养基包括：激素组合，防褐变剂以及30-80g/L的蔗糖，所述激素组合为2,4-D、KT和TDZ组合，或2,4-D、6-BA和TDZ组合。
本发明提供的方法，以红山茶的花药为材料，通过低温预处理、花药愈伤组织的诱导、愈伤组织增殖和分化、幼苗生根，最终获得红山茶完整植株，建立了一套适合红山茶的花药离体再生体系。
本发明通过花药培养可快速有效地获得纯合双单倍体，通过单倍体育种可以大大缩短育种周期，加快育种进程，同时能获得纯合植物，在植物遗传育种理论和实践研究中具有广泛的应用前景。为红山茶的单倍体育种、遗传图谱的构建及转基因育种等提供技术支撑，同时对红山茶的遗传改良和新品种选育具有重要意义。为红山茶育种提供单倍体育种材料，也为红山茶转基因育种提供了理想的受体材料。
本发明所述红山茶选自日本红山茶或者浙江红油茶。
本发明所述低温预处理包括：将花药置于2-6℃，1-10天；优选地，低温预处理的温度为3-4℃，处理时间为3-7天。试验证明，适宜的低温预处理更有利于提高愈伤组织的诱导率。
本发明所述方法中，现以花蕾形式进行低温预处理，处理后切开花蕾，剥去苞片，取不带花丝的花药进行愈伤组织诱导培养。
本发明所述方法中，所述愈伤组织诱导培养采用暗培养。具体操作为：培养温度为25℃±2℃，培养30-50天后，诱导出的愈伤组织。例如，当花药取自山茶花时，愈伤诱导培养中，花药接种量为每皿(90mm)80-300粒。每22-28天继代一次，培养30-40天。当花药取自红花油茶时，愈伤诱导培养中，花药接种量为每皿(90mm)100-400粒，优选地每皿接种150-250粒。愈伤诱导培养只需要在暗培养30-50天后转接一次，减少了转接的次数，节省了时间，降低了污染率，降低了褐化程度。花药诱导出来之前，有一个相对较稳定的环境，有利于愈伤组织的诱导，同时降低褐化率和污染率。
所述愈伤组织诱导培养所采用的愈伤组织诱导培养基可采用以下配方中的一种：
当花药取自日本红山茶时，愈伤组织诱导培养基配方包括：1/2的MS培养基、1.0-2.0mg/L的2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)、1.0-3.0mg/L的6-BA(6-Benzylaminopurine，6-苄氨基嘌呤)、0.5-2.00mg/L的TDZ(Thidiazuron，噻苯隆)、30-80g/L的蔗糖、7-9g/L的琼脂、200-500mg/L的水解酪蛋白、200-500mg/L的水解乳蛋白、80-200mg/L的脯氨酸、80-200mg/L的谷氨酰胺、80-200mg/L的甘氨酸、50-100mL/L的椰子水，以及防褐变剂，并调整pH为5.6-5.8；所述防褐变剂选自1-2g/L的交联聚维酮、100-500mg/L的维生素C或5-20mg/L的硝酸银中的至少一种。
当花粉粒取自浙江红山茶时，愈伤组织诱导培养基配方包括：MS基本培养基(粉末)、0.5-2.0mg/L的2,4-D、0.1-2.0mg/L的KT(6-Furfurylaminopurine，激动素)、1-2.0mg/L的TDZ、30-80g/L的蔗糖、7-9g/L的琼脂、100-500mg/L的水解酪蛋白、100-500mg/L的水解乳蛋白、70-200mg/L的脯氨酸、70-200mg/L的甘氨酸、70-200mg/L的谷氨酰胺、40-100mL/L的椰子水，以及防褐变剂，并调整pH为5.5-5.8；所述防褐变剂选自1-2g/L的交联聚维酮、100-500mg/L的维生素C或5-20mg/L的硝酸银中的至少一种。
本发明通过实验发现，2,4-D、KT(6-BA)和TDZ之间存在协同作用，通过这一特定组合能够更容易诱导组织产生，提高愈伤诱导率；同时，实验还发现，适当增加蔗糖的浓度30-80g/L，提高渗透压，能够提高愈伤的诱导率；此外，水解酪蛋白、水解乳蛋白、脯氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺的添加也可以促进愈伤组织的诱导、体细胞胚的形成和生长。
本发明所述的方法中，所述分化培养所采用的分化培养基选自下述配方之一：
当花药取自红花油茶时，所述分化培养基包括：1/2的MS培养基、0.01-0.5mg/L的NAA、0.1-1mg/L的KT、0.001-0.1mg/L的TDZ、30-50g/L的蔗糖、7-10g/L的琼脂、100-500mg/L的水解酪蛋白、100-500mg/L的水解乳蛋白、70-200mg/L的脯氨酸、70-200mg/L的甘氨酸、70-200mg/L的谷氨酰胺、50-100mL/L的椰子水，以及防褐变剂，并调整pH为5.6-5.8；所述防褐变剂选自1-2g/L的交联聚维酮、100-500mg/L的维生素C或5-20mg/L的硝酸银中的至少一种。
当花药取自红花油茶时，所述分化培养基包括：1/2MS培养基(粉末)、0.05-0.3mg/L的NAA(1-naphthylacetic acid，萘乙酸)、1.0-3.0mg/L的6-BA、0-0.5mg/L的TDZ、30-50g/L的蔗糖、7-10g/L的琼脂、100-500mg/L的水解酪蛋白、100-500mg/L的水解乳蛋白、70-200mg/L的脯氨酸、70-200mg/L的甘氨酸、70-200mg/L的谷氨酰胺、40-100mL/L的椰子水，以及防褐变剂，pH调整为5.5-5.8；所述防褐变剂选自1-2g/L的交联聚维酮、100-500mg/L的维生素C或5-20mg/L的硝酸银中的至少一种。
本发明通过合理配置激素组份，适当提高蔗糖浓度，同时增加有机添加物以及防褐变剂，能够显著提高愈伤分化率。
在所述分化培养中，通常选择生长状态良好，质地紧实、淡黄色(白中透黄)或表面有白色小球状胚状体的愈伤组织接种到分化培养基。所述分化培养的条件：暗培养，培养温度为25℃±2℃，25-30天继代一次，培养30-60天后，分化出不定芽体。
本发明所述方法中，所述生根培养可根据不同花药作出调整：
当花药取自日本红山茶花时，所述生根培养包括：生长至2-4cm的不定芽体基部用生根剂浸泡后移栽到已消毒的混合育苗基质中进行生根培养，生根和驯化培养同时进行，能够提高幼苗的移栽成活率。使用的生根剂，例如为IBA溶液，其浓度可选的为0.1-0.6mg/L，浸泡的时间可选的为5-30s。培养期间覆上透光覆盖物并浇施hogland营养液，示例性地将浸泡后的不定芽体移栽到装有已消毒的混合育苗基质的透明塑料杯中进行生根培养，塑料杯口用保鲜膜封住或将塑料杯放在育苗盘上用透明塑料盖盖住。然后移到大棚或苗圃中进行常规管理。
当花药取自红花油茶时，所述生根培养包括：将不定芽体转接到生根培养基中，1800-2400lux光照培养15-18h，例如1800-2400lux光照培养16h，或2000lux光照培养16h。然后培养28-35天长出不定根，待生根幼苗长至3-5cm后移栽到混合育苗基质中进行驯化培养。然后移到大棚或苗圃中进行常规管理。
所采用的生根培养基包括：1/2或1/4的MS基本培养基(粉末)、0.6-1.0mg/L的NAA、0.1-0.5mg/L的IBA、0.5-1.0mg/LGA3(赤霉素)、10-30g/L蔗糖、2.3-2.6g/L的植物凝胶，pH为5.5-5.8。经研究发现，适量的GA3可与其他组分产生协同作用，更有利于促进再生植株长出不定根。
所述生根培养通过合适的光照，使得植株逐步完成光合作用，植株能够靠自身的光合作用合成，完成新陈代谢，进行自主的生长，摆脱培养基。诱导幼苗长出较多的不定根，有利于植株的营养吸收和移栽的成活率。
所述生根培养中使用的混合育苗基质是由蛭石、珍珠岩和泥炭土按照一定质量比例混合得到，例如质量比依次为1-2：1-2：3，可选的为1：1：3。用蛭石和泥炭土制备混合育苗基质，蛭石保证移动的疏松度，有利于植株根部的呼吸；泥炭土提供营养物质，并起到废物回收利用的目的，资源的有效利用，环保节约。
本发明所述方法中，所述花药的选择是根据花的不同而有所区别：当进行日本红山茶花药离体培养时，选择11-12月份的晴天上午采摘日本红山茶花。当进行红花油茶离体培养时，选择10-12月份的晴天上午，采摘红花油茶的花蕾。采摘完成后装进自封袋，放入冰盒及时带回实验室，通过预实验观察小孢子发育时期，筛选合适花蕾用于后续培养。
研究发现，10月份中旬-11月初采摘的花蕾，花药大都是淡黄色(白中透黄)，花药大都处于四分体时期、单核早期和单核靠边期的较多。因此，按照此时期采集花蕾，根据剥开花蕾中花药的颜色和花蕾，选择合适的花蕾用于后续培养。
花蕾选择方法包括：将采回的花蕾按照横径大小分为5组，剥开花苞，观察不同组花粉粒的颜色，然后将花药用醋酸洋红染色，在显微镜下观察小孢子处于哪个发育阶段。大多数植物的花粉离体培养试验表明，当花药发育阶段处于单核靠边期时，最容易诱导出胚性愈伤组织和分化出植株。
本发明所述方法中，所述花药在愈伤组织诱导培养之前，还须进行外植体消毒：将低温预处理后的花蕾用清洁剂和杀菌剂浸泡后，经流水冲洗后，置于无菌操作台中进行表面消毒。
所述外植体消毒的方法:将花蕾用洗洁精浸泡10-20min，浸泡期间，可选的间断性搅动。用杀菌剂浸泡8-15分钟后，可选的浸泡过程中间断性地用毛刷进行搅动，流水冲洗2-4h后，用酒精浸泡45-60s，采用的酒精的浓度可选的为70-80％(v/v)，例如75％(v/v)，然后用无菌水清洗3-4次，再以HgCl2消毒15-20min，采用的HgCl2的浓度可选的为0.05-0.15％(m/m)，例如为0.1％(m/m)，然后以无菌水清洗6-8次。
采用酒精浸泡，一方面可以起到杀菌和消毒的作用；另外一方面，通过酒精可以溶解一些附着在花蕾的一些杂质，起到清洁的效果；且酒精的处理时间较短，可以避免因为酒精导致花粉失水，避免花粉因为失水活性降低影响后续的培养。HgCl2对花粉进行全面的、深层的消毒，保证样本的无菌。
优选地，利用洗洁精清洗花蕾前，先用手剥去花蕾表面的1-2层苞片。由于表层的苞片与外界接触，会存在较多的微生物，进行该操作后使得后续的消毒操作中灭菌更彻底。
优选地，杀菌剂中的有效成分包括多菌灵、多抗霉素中的一种或两种。在一些可选的实施方案中，杀菌剂包括：0.15-0.2％(m/m)的有效成分为50％的多菌灵，和/或，0.05-0.15(m/m)的有效成分为1％的多抗霉素。可选的，杀菌剂中多菌灵的质量分数为0.2％左右，其含有的多灵菌中有效成分含量为50％，即该杀菌剂中有效的多灵菌的含量约为0.2％*50％；杀菌剂中多抗霉素的质量分数为1％左右，其含有的多抗霉素的有效成分含量为1％，即该杀菌剂中有效的多抗霉素的含量约为1％*1％。
在实施例中，通过多菌灵可以抑制真菌的生长，防止菌类的附着。多菌灵是一种广谱性杀菌剂，对多种作物由真菌(如半知菌、多子囊菌)引起的病害有防治效果。且多抗霉素是一种广谱性抗生素类杀菌剂，能够实现很好的杀菌效果在一些可选的实施例中，愈伤诱导培养根据花粉粒选自不同种类的红山茶，对愈伤诱导培养基的有效成分种类及用量进行匹配性调整。
本发明的有益效果如下：
与现有技术相比，本申请提供的红山茶花药离体培养获得再生植株的方法，通过花蕾选择、低温预处理、花药愈伤组织的诱导、愈伤组织增殖和分化、幼苗生根，最终获得红花油茶完整植株的方法。本发明为红花油茶的单倍体育种、遗传图谱的构建及转基因育种等提供技术支撑和试验材料，同时对红花油茶的遗传改良和新品种选育具有重要意义，非常值得广泛推广应用。
附图说明
图1为本申请实验例提供的花药愈伤组织的诱导图。
图2为本申请实验例提供的愈伤组织分化出不定芽体图。
图3为本申请实验例提供的不定芽体生根图。
图4为本申请实验例提供的生根幼苗的移栽图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种浙江红山茶花药离体培养获得再生植株的方法，包括如下步骤：
(1)花蕾的选择
选择10月份的晴天上午，采摘浙江红山茶的花蕾装进自封袋，放入冰盒及时带回实验室。将采回的花蕾按照横径大小分为5组，剥开花苞，观察不同组花粉粒的颜色，然后将花药用醋酸洋红染色，在显微镜下观察小孢子的发育时期。根据显微镜下观察结果、花蕾的大小和颜色，选择小孢子处于单核靠边期的对应花蕾进行后续培养。
(2)花蕾低温预处理
将花蕾放入自封塑料袋内置于冰箱中，调节冰箱温度为4℃，低温处理3天。
(3)外植体消毒
用镊子剥去花蕾表面的1-2层苞片，然后用洗洁精浸泡花蕾10min(间断性搅动)，再利用0.2％(m/m)的多菌灵(50％有效成分)和1％(m/m)的多抗霉素(1％有效成分)浸泡10min(浸泡过程中间断性地用毛刷进行搅动)，继续用自来水冲洗2h；将清洗后的花蕾，用75％(v/v)的乙醇消毒45s，无菌水清洗3-4次，再利用0.1％(m/m)的HgCl2表面消毒15min，再用无菌水清洗6-8次。
(4)愈伤组织诱导培养
用解剖刀切开花蕾，用镊子剥去苞片，用镊子将花药(不带花丝)捋到愈伤诱导培养基上。每皿(90mm)接种花药100-400粒。将接种好的培养皿放在培养室中进行暗条件培养，温度为23-27℃，培养30-50天后，诱导出愈伤组织。
愈伤诱导培养基为：MS基本培养基(粉末)、1mg/L的2,4-D、0.8mg/L的KT、1.2mg/L的TDZ、50g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、500mg/L的水解酪蛋白、500mg/L的水解乳蛋白、100mg/L的脯氨酸、100mg/L的甘氨酸、100mg/L的谷氨酰胺、1g/L的交联聚维酮、5mg/L的硝酸银和50mL/L的椰子水，并调整pH为5.8。
(5)愈伤组织增殖和分化培养
选择生长状态良好，质地紧实、淡黄色(白中透黄)或表面有白色小球状胚状体的愈伤组织，接种到愈伤增殖和分化培养基进行暗培养，培养温度为25℃±2℃，25-30天继代一次，培养30-60天后，分化出不定芽体。
增殖和分化培养基为：1/2MS培养基(粉末)、0.05mg/L的NAA、1.5mg/L的6-BA、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、250mg/L的水解酪蛋白、250mg/L的水解乳蛋白、100mg/L的脯氨酸、100mg/L的甘氨酸、100mg/L的谷氨酰胺、1g/L的交联聚维酮、300mg/L的维生素C和100mL/L的椰子水，并将pH调整为5.6。
(6)生根培养
将长至2-4cm的不定芽体继代到生根培养基中培养，培养温度为23-27℃，1800-2400lux光照培养16h，培养28-35天长出不定根。
生根培养基为：1/2的MS基本培养基(粉末)、1.0mg/L的NAA、0.5mg/L的IBA、30g/L蔗糖、2.5g/L的植物凝胶，pH为5.6。
(7)生根幼苗移栽
将生根的幼苗移栽到装有混合基质的育苗钵中经驯化后，移到大棚或苗圃中进行常规管理。
混合基质由蛭石、珍珠岩和泥炭土按照1：1：3的比例混合得到。
实施例2
本实施例提供了一种浙江红山茶花药离体培养获得再生植株的方法，其步骤与实施例1相同，不同之处在于个别步骤的条件有所不同，所使用的培养基不同，本实施例采用的不同条件及培养基具体参照如下，未明确写明的实验步骤及条件请参见实施例1：
(2)花蕾低温预处理
低温处理5天。
(3)外植体消毒
用洗洁精浸泡花蕾15min(间断性搅动),利用0.2％(m/m)的多菌灵(50％有效成分)和1％(m/m)的多抗霉素(1％有效成分)浸泡用75％(v/v)的乙醇消毒50s，0.1％(m/m)的HgCl2表面消毒18min。
(4)愈伤组织诱导培养
愈伤诱导培养基为:MS基本培养基(粉末)、1mg/L的2,4-D、1.5mg/L的KT、1.2mg/L的TDZ、60g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、500mg/L的水解酪蛋白、500mg/L的水解乳蛋白、200mg/L的脯氨酸、200mg/L的甘氨酸、200mg/L的谷氨酰胺、1g/L的交联聚维酮、10mg/L的硝酸银和100mL/L的椰子水，并调整pH为5.7。
(5)愈伤组织增殖和分化培养
增殖和分化培养基为：1/2MS培养基(粉末)、0.1mg/L的NAA、2.0mg/L的6-BA、0.005mg/LTDZ、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、500mg/L的水解酪蛋白、500mg/L的水解乳蛋白、200mg/L的脯氨酸、200mg/L的甘氨酸、200mg/L的谷氨酰胺、1g/L的交联聚维酮、5mg/L的硝酸银和100mL/L的椰子水，并将pH调整为5.6。
(6)生根培养
生根培养基为：1/2的MS基本培养基(粉末)、1.0mg/L的NAA、0.5mg/L的IBA、0.5mg/LGA3、20g/L蔗糖、2.3g/L的植物凝胶，pH为5.6。
实施例3
本实施例提供了一种浙江红山茶花药离体培养获得再生植株的方法，其步骤与实施例1相同，不同之处在于个别步骤的条件有所不同，所使用的培养基不同，本实施例采用的不同条件及培养基具体参照如下，未明确写明的实验步骤及条件请参见实施例1：
(2)花蕾低温预处理
低温处理7天。
(3)外植体消毒
用洗洁精浸泡花蕾20min(间断性搅动),利用0.2％(m/m)的多菌灵(50％有效成分)和1％(m/m)的多抗霉素(1％有效成分)浸泡15min(浸泡过程中间断性地用毛刷进行搅动)，继续用自来水冲洗4h；将清洗后的花蕾，用75％(v/v)的乙醇消毒60s，无菌水清洗3-4次，在利用0.1％(m/m)的HgCl2表面消毒20min，再用无菌水清洗6-8次。
(4)愈伤组织诱导培养
愈伤诱导培养基为:MS基本培养基(粉末)、2mg/L的2,4-D、0.8mg/L的KT、1.2mg/L的TDZ、70g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、500mg/L的水解酪蛋白、500mg/L的水解乳蛋白、200mg/L的脯氨酸、200mg/L的甘氨酸、200mg/L的谷氨酰胺、1g/L的交联聚维酮、5mg/L的硝酸银和100mL/L的椰子水，并调整pH为5.8。
(5)愈伤组织增殖和分化培养
增殖和分化培养基为：1/2MS培养基(粉末)、0.05mg/L的NAA、2.0mg/L的6-BA、0.01mg/LTDZ、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、500mg/L的水解酪蛋白、500mg/L的水解乳蛋白、200mg/L的脯氨酸、200mg/L的甘氨酸、200mg/L的谷氨酰胺、10mg/L的硝酸银和100mL/L的椰子水，并将pH调整为5.8。
(6)生根培养
生根培养基为：1/2的MS基本培养基(粉末)、1.0mg/L的NAA、0.5mg/L的IBA、1.0mg/LGA3、15g/L蔗糖、2.3g/L的植物凝胶，pH为5.6。
实施例4
一种日本红山茶花药离体培养获得再生植株的方法，包括如下步骤：
(1)花蕾的选择
选择11月份的晴天上午，采摘日本红山茶‘玉之浦’花蕾装进自封袋，放入冰盒及时带回实验室。将采回的花蕾按照横径大小分为5组，剥开花苞，观察不同组花粉粒的颜色，然后将花药用醋酸洋红染色，在显微镜下观察小孢子的发育时期。根据显微镜下观察结果、花蕾的大小和颜色，选择小孢子处于单核靠边期的对应花蕾进行后续培养。
(2)花蕾低温预处理
将花蕾放入自封塑料袋内置于冰箱中，调节冰箱温度为4℃，低温处理3天。
(3)外植体消毒
用镊子剥去花蕾表面的1-2层苞片，然后用洗洁精浸泡花蕾10min(间断性搅动),再利用0.2％(m/m)的多菌灵(50％有效成分)和1％(m/m)的多抗霉素(1％有效成分)浸泡10min(浸泡过程中间断性地用毛刷进行搅动),继续用自来水冲洗3h；将清洗后的花蕾，用75％(v/v)的乙醇消毒45s,无菌水清洗3-4次，再利用0.1％(m/m)的HgCl2表面消毒15min，再用无菌水清洗6-8次。
(4)愈伤组织诱导培养
用解剖刀切开花蕾，用镊子剥去苞片，用镊子将花药(不带花丝)捋到愈伤诱导培养基上。每皿(90mm)接种花药80-300粒。将接种好的培养皿放在培养室中进行暗条件培养，温度为23-27℃，每22-28天继代一次，培养30-40天后，诱导出愈伤组织。
愈伤诱导培养基为:1/2MS基本培养基(粉末)、1.5mg/L的2,4-D、1.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的TDZ、40g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、250mg/L的水解酪蛋白、250mg/L的水解乳蛋白、100mg/L的脯氨酸、100mg/L的甘氨酸、100mg/L的谷氨酰胺、1g/L的交联聚维酮、5mg/L的硝酸银和80mL/L的椰子水，并调整pH为5.6-5.8。
(5)愈伤组织增殖和分化培养
选择生长状态良好，质地紧实、淡黄色(白中透黄)或表面有白色小球状胚状体的愈伤组织，接种到愈伤增殖和分化培养基进行暗培养，培养温度为25℃±2℃，25-30天继代一次，培养40-60天后，分化出不定芽体。
增殖和分化培养基为：1/2MS培养基(粉末)、0.05mg/L的NAA、0.5mg/L的KT、0.003mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、500mg/L的水解酪蛋白、500mg/L的水解乳蛋白、100mg/L的脯氨酸、100mg/L的甘氨酸、100mg/L的谷氨酰胺、1g/L的交联聚维酮、5mg/L的硝酸银和100mL/L的椰子水，并将pH调整为5.6。
(6)生根培养
将长至2-4cm的不定芽体基部用0.3mg/L的IBA溶液浸泡30s，然后移栽到装有已消毒的混合育苗基质的透明塑料杯中进行生根培养，塑料杯口用保鲜膜封住或将塑料杯放在育苗盘上用透明塑料盖盖住，培养期间浇施hogland营养液。
混合基质由蛭石、珍珠岩和泥炭土按照1：1：3的比例混合得到。
实施例5
一种日本红山茶花药离体培养获得再生植株的方法，其步骤及条件与实施例4大致相同，不同之处在于所使用的培养基即不同，生根培养的生根剂以及浸泡时间不同，具体参照如下：
愈伤诱导培养基为:1/2MS基本培养基(粉末)、2.0mg/L的2,4-D、1.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的TDZ、50g/L的蔗糖、7.5g/L的琼脂、300mg/L的水解酪蛋白、300mg/L的水解乳蛋白、150mg/L的脯氨酸、150mg/L的甘氨酸、150mg/L的谷氨酰胺、1g/L的交联聚维酮、300mg/L的维生素C和100mL/L的椰子水，并调整pH为5.6-5.8。
增殖和分化培养基为：1/2MS培养基(粉末)、0.07mg/L的NAA、0.3mg/L的KT、0.002mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、500mg/L的水解酪蛋白、500mg/L的水解乳蛋白、200mg/L的脯氨酸、200mg/L的甘氨酸、200mg/L的谷氨酰胺、1g/L的交联聚维酮、10mg/L的硝酸银和100mL/L的椰子水，并将pH调整为5.8。
生根剂为0.5mg/L的IBA溶液，浸泡时间10s。
实施例6
一种日本红山茶花药离体培养获得再生植株的方法，包括如下步骤：
愈伤诱导培养基为:1/2MS基本培养基(粉末)、1.5mg/L的2,4-D、1.0mg/L的6-BA、1.0mg/L的TDZ、70g/L的蔗糖、8g/L的琼脂、500mg/L的水解酪蛋白、500mg/L的水解乳蛋白、200mg/L的脯氨酸、200mg/L的甘氨酸、200mg/L的谷氨酰胺、2g/L的交联聚维酮、10mg/L的硝酸银和100mL/L的椰子水，并调整pH为5.6-5.8。
增殖和分化培养基为：1/2MS培养基(粉末)、0.06mg/L的NAA、0.6mg/L的KT、0.005mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂、500mg/L的水解酪蛋白、500mg/L的水解乳蛋白、200mg/L的脯氨酸、200mg/L的甘氨酸、200mg/L的谷氨酰胺、2g/L的交联聚维酮、5mg/L的硝酸银和100mL/L的椰子水，并将pH调整为5.8。
生根剂为0.5mg/L的IBA溶液，浸泡时间5s。
实验例
本实验例参考实施例1的红山茶花药离体培养获得再生植株的方法，进行再生植株的培育和驯化。
通过培养基培养得到的愈伤组织如图1所示。愈伤组织的褐化率低，具备较高的转化率。
将愈伤组织接种到分化培养基进行分化暗培养，得到不定芽体，分化暗培养的温度为23℃，时间为30天，不定芽体的结果如图2所示，不定芽体的生长活力较高。
生长至2cm只有的不定芽体接种到生根培养基进行生根培养，得到胚性愈伤再生植株；得到的胚性愈伤再生植株的培养结果如图3所示。胚性愈伤再生植株具有多根须根，有利于胚性愈伤再生植株的后续生长培养。
将胚性愈伤组织再生植株移栽到混合育苗基质培育驯化，结果如图4所示，植株的叶片叶绿素丰富，生长旺盛。
同时，参考实施例1-6中的方法进行再生植株的培养，分别对愈伤组织诱导培养的愈伤诱导率，愈伤组织增殖和分化培养的分化率，以及生根培养的生根率，进行统计，其结果如表1所示。
表1培养情况统计表
项目 愈伤诱导率 分化率 生根率
实施例1 87.4％ 17.1％ 92.3％
实施例2 92.7％ 19.5％ 93.5％
实施例3 96.1％ 22.7％ 96.9％
实施例4 82.7％ 14.6％ 90.8％
实施例5 86.4％ 17.8％ 95.2％
实施例6 90.6％ 12.1％ 91.6％
对比例1
与实施例3相同，区别仅在于：
(4)愈伤组织诱导培养：2,4-D的浓度为1mg/L，TDZ的浓度为0.5mg/L，其他成分均相同；
经检测，愈伤诱导率为82.6％。
(5)愈伤组织增殖和分化培养：增殖和分化培养基的培养基与实施例3相同，但培养方式是在光照条件培养；
经检测，愈伤分化率为9.4％。
对比例2
与实施例6相同，区别仅在于：
(4)愈伤组织诱导培养：在光照条件下培养，其他成分均相同；
经检测，愈伤诱导率为87.8％。
(5)愈伤组织增殖和分化培养：增殖和分化培养基中NAA的浓度为0.1mg/L，其他成分均与实施例6相同；
经检测，愈伤分化率为8.7％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种红山茶花药离体培养获得再生植株的方法，其特征在于，包括：将红山茶的花药进行低温预处理，愈伤组织诱导培养，分化培养和生根培养；其中，所述愈伤组织诱导培养采用暗培养；所采用的愈伤组织诱导培养基包括：激素组合，防褐变剂以及30-80g/L的蔗糖，所述激素组合为2,4-D、KT和TDZ组合，或2,4-D、6-BA和TDZ组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低温预处理包括：将花药置于2-6℃，1-10天；优选地，低温预处理的温度为3-4℃，处理时间为3-7天。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养所采用的愈伤组织诱导培养基采用以下配方中的一种：
当花药取自山茶花时，配方包括：1/2的MS培养基、1.0-2.0mg/L的2,4-D、1.0-3.0mg/L的6-BA、0.5-2.00mg/L的TDZ、30-80g/L的蔗糖、7-9g/L的琼脂、200-500mg/L的水解酪蛋白、200-500mg/L的水解乳蛋白、80-200mg/L的脯氨酸、80-200mg/L的谷氨酰胺、80-200mg/L的甘氨酸、50-100mL/L的椰子水，以及防褐变剂，并调整pH为5.6-5.8；所述防褐变剂选自1-2g/L的交联聚维酮、100-500mg/L的维生素C或5-20mg/L的硝酸银中的至少一种；
当花粉粒取自红花油茶时，配方包括：MS基本培养基、0.5-2.0mg/L的2,4-D、0.1-2.0mg/L的KT、1-2.0mg/L的TDZ、30-80g/L的蔗糖、7-9g/L的琼脂、100-500mg/L的水解酪蛋白、100-500mg/L的水解乳蛋白、70-200mg/L的脯氨酸、70-200mg/L的甘氨酸、70-200mg/L的谷氨酰胺、40-100mL/L的椰子水，以及防褐变剂，并调整pH为5.5-5.8；所述防褐变剂选自1-2g/L的交联聚维酮、100-500mg/L的维生素C或5-20mg/L的硝酸银中的至少一种。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养的条件为:培养温度为25℃±2℃，培养30-50天；
优选地，当花药取自山茶花时，接种量为每皿80-300粒，每22-28天继代一次，培养30-40天；当花药取自红花油茶时，接种量为每皿100-400粒。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述分化培养所采用的分化培养基选自下述配方之一：
当花药取自红花油茶时，所述分化培养基包括：1/2的MS培养基、0.01-0.5mg/L的NAA、0.1-1mg/L的KT、0.001-0.1mg/L的TDZ、30-50g/L的蔗糖、7-10g/L的琼脂、100-500mg/L的水解酪蛋白、100-500mg/L的水解乳蛋白、70-200mg/L的脯氨酸、70-200mg/L的甘氨酸、70-200mg/L的谷氨酰胺、50-100mL/L的椰子水，以及防褐变剂，并调整pH为5.6-5.8；所述防褐变剂选自1-2g/L的交联聚维酮、100-500mg/L的维生素C或5-20mg/L的硝酸银中的至少一种；
当花药取自红花油茶时，所述分化培养基包括：1/2MS培养基、0.05-0.3mg/L的NAA、1.0-3.0mg/L的6-BA、0-0.5mg/L的TDZ、30-50g/L的蔗糖、7-10g/L的琼脂、100-500mg/L的水解酪蛋白、100-500mg/L的水解乳蛋白、70-200mg/L的脯氨酸、70-200mg/L的甘氨酸、70-200mg/L的谷氨酰胺、40-100mL/L的椰子水，以及防褐变剂，pH调整为5.5-5.8；所述防褐变剂选自1-2g/L的交联聚维酮、100-500mg/L的维生素C或5-20mg/L的硝酸银中的至少一种。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述分化培养的条件：暗培养，培养温度为25℃±2℃，25-30天继代一次，培养30-60天。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，当花药取自山茶花时，所述生根培养包括：不定芽体基部用生根剂浸泡后移栽到混合育苗基质中进行生根培养，然后移到大棚或苗圃中进行常规管理；
当花药取自红花油茶时，所述生根培养包括：将不定芽体转接到生根培养基中，1800-2400lux光照培养15-18h，然后培养28-35天长出不定根，待生根幼苗长至3-5cm后移栽到混合育苗基质中进行驯化培养，然后移到大棚或苗圃中进行常规管理。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述生根培养基包括：1/2或1/4的MS基本培养基、0.6-1.0mg/L的NAA、0.1-0.5mg/L的IBA、0.5-1.0mg/LGA3、10-30g/L蔗糖、2.3-2.6g/L的植物凝胶，pH为5.5-5.8。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述花药的选择：当进行山茶花药离体培养时，选择11-12月份的晴天上午采摘山茶花；当进行红花油茶离体培养时，选择10-12月份的晴天上午，采摘红花油茶的花蕾。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述花药在愈伤组织诱导培养之前，还须进行外植体消毒：将低温预处理后的花蕾用清洁剂和杀菌剂浸泡后，经流水冲洗后，置于无菌操作台中进行表面消毒。
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