CN107711513B - 一种粗肋草组织培养快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种粗肋草组织培养快速繁殖方法，依次经过芽的诱导培养、丛生芽的增殖培养、丛生芽的继代培养、以及生根培养后，得到完整植株，即可出瓶炼苗，并移栽。本发明的方法操作容易，生产成本低，不污染环境，可以实现规模化生产。通过本发明培育出的粗肋草，其繁殖子代苗遗传稳定，性状表达全面，观赏性状优良。而且本技术体系生产成本低，环保不污染环境，量产速度快，完全实现了规模化量产的技术要求。
Description
技术领域
本发明属于组织培养快速繁殖技术领域，具体涉及一种粗肋草组织培养快速繁殖方法。
背景技术
粗肋草(Aglaonema Schott)，属天南星科(Araceae)植物。彩叶粗肋草观赏性状丰富，叶色鲜亮而大方，有较高的观赏价值。而且粗肋草耐强光、耐荫湿、耐高温闷热，是优良的室内盆栽、水培、租摆等的首选观赏植物种类。现国内市场调研发现彩叶粗肋草已是极受欢迎且潜力广阔的观赏物种，尤其是吉祥如意品种，已是供不应求的状态。但是目前生产中还是以常规顶芽切割扦插为主的繁殖方式。顶芽切割扦插的繁殖方式的特点决定了其很大的局限性：有明显的季节性、要求有大量的母本、需要大量的人力和栽培设施、难以连续提供稳定规格的商品苗。以上方面造成了粗肋草囤而不售，售又无后继之货，致有价无市这一不正常状况，严重制约了产业发展。近年来已有研究者对一些粗肋草品种的组培快繁和再生进行研究，但还是因扩繁系数不高，难以达到量产化技术要求，而又因粗肋草不同观赏性状品种之间的繁殖性状差异很大，且发现彩叶程度越高、绿叶比例越低的品种繁殖难度越高，组培增殖扩繁难度也越大。目前还未见粗肋草品种的组培快繁技术技术研究资料。因此粗肋草的可行高效的工厂化再生扩繁技术对具有重要的意义和价值。
发明内容
鉴于上述产业发展和技术研究所需，本技术体系所解决的技术问题在于提供了一种提高粗肋草繁殖速度，可行于工厂化量产的粗肋草组织培养快速繁殖方法。通过丛生芽的途径进行粗肋草组织培养能够获得大量遗传性状稳定的试管苗，保持良好的亲本特性，并且具备包括不变性、投入少、产出高、周期短在内的诸多优势。
本发明通过以下技术方案来解决上述技术问题：
一种粗肋草组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)预处理和外植体取材、消毒：选取性状优良、生长健壮的粗肋草栽培株，先将母株放置于通风良好的场所，定期喷施谱杀菌药7天/次，喷施2次后可取材，从基部第二个芽上切下茎；用手术刀将叶片叶柄从基部去除露出芽点后，用75％乙醇溶液震荡消毒50秒后用无菌水冲洗，而后在超净工作台上用有效氯含量1.5％的漂白水溶液+TWEEN-20消毒18-22分钟；消毒期间频繁震荡容器使消毒剂充分渗透，然后用无菌水冲洗3-5次，每次2分钟，后用无菌滤纸将消毒茎残余水分吸干，用消毒过的镊子和手术刀仔细将芽点切下，每个芽点取材大小5毫米左右，接种到诱导培养基；
(2)丛生芽的诱导：外植体接种入诱导培养基后放置于培养室，先暗培养7天后转光照培养，光周期12小时/天，光照度1200-1500lx，室内温度控制25±2℃，7天后可见白色芽点转绿，30天后芽体伸长，35天后可切下芽体转入增殖培养基扩繁；
(3)丛生侧芽增殖：将诱导获得的无菌芽体切掉叶片，保留从基部向上1.5厘米的茎部，转接到增殖培养基进行增殖培养；培养条件光周期12小时/天，光照度1200-1500lx，室内温度控制25±2℃，培养45-50天后，即可获得增殖系数达2.5-3.5的丛生芽丛；将丛生芽切割为单独芽体或丛芽团继续转接到同样的增殖培养基中多次继代培养，转接周期40-50天一代，培养温度和光强、光照度同增殖培养，以获得所需要的量产数量；
(4)无根芽体复壮培养：继代增殖数达到预期数量后，将丛生芽分单株苗分切，转接如复壮培养基，培养温度，25±2℃，光照周期转变为16小时/天，光照度同增殖培养，培养35天后可以转接；
(5)生根培养：复壮培养后，丛生芽恢复健壮，个体长大，将高度达到2.5厘米的苗转接到生根培养基促使发根，高度不够的弱小芽体重复复壮一次后再生根培养，生根培养环境光照和温度控制同复壮培养期间，培养25天左右可见发根后即可开始自然驯化；
(6)自然驯化：生根培养25-30天后，已见不定根长出和后续的根原基萌发，瓶苗转到温室设施内接受自然光和温度的驯化，驯化期间温度幅15-28℃，光照幅3000-5000lx，驯化20-25天后可生根苗出瓶移栽；
(7)组培苗移栽：将驯化好的生根组培苗从瓶中取出，洗净根系所粘的培养基，高锰酸钾溶液浸泡消毒1分钟后取出，用72穴筛盘、基质泥炭土种植，种植后设施温室内湿度在70～80％，温度保持在15℃以上至室温范围内，高于30℃必须用风机、水帘降温。
优选地，所述诱导培养基成分中含有DCR基本培养基大量盐分+MS配方微量元素+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)2-3mg/L+NAA(萘乙酸)0.10mg/L+；培养基含糖20g/L，琼脂0.56％，PH值5.5-5.8。
优选地，所述增殖培养基成分中含有1/3MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)3-5mg/L+NAA(萘乙酸)0.15-0.2mg/L+GA3(赤霉酸)0.5mg/L+吡效隆(TDZ)0.5-1mg/L，培养基含糖20g/L，琼脂0.56％。
优选地，复壮培养基成分中含有1/4MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.6mg/L+NAA(萘乙酸)0.6mg/L+1g/L活性炭，培养基含糖20g/L，琼脂0.56％。
优选地，生根培养基成分中含有1/5MS+NAA(萘乙酸)0.5～1.0mg/L+白砂糖25g/L+3.0～5.0g/L活性炭。
优选地，步骤(1)中是用75％乙醇溶液震荡消毒50秒后用无菌水冲洗，而后在超净工作台上用有效氯含量1.5％的漂白水溶液+3滴/升漂白水溶液的TWEEN-20消毒18-22分钟。
优选地，步骤(7)用于浸泡小苗根部的高锰酸钾溶液为0.1％的高锰酸钾溶液。
相比于现有技术，本发明的粗肋草组织培养快速繁殖方法的有益效果在于：该方法操作容易，生产成本低，不污染环境，数量增殖快，能够实现规模化生产。通过本发明培育出的粗肋草种苗，其遗传性状稳定，保持了亲本的特性，具备包括不变性、投入少、产出高、周期短在内的诸多优势。
具体实施方式
有鉴于此，本发明具体实施方式中提供的一种杂交兰组织培养快速繁殖方法，具体包括以下步骤：
(1)预处理和外植体取材、消毒：选取性状优良、生长健壮的粗肋草栽培株，先将母株放置于通风良好的场所，定期喷施谱杀菌药7天/次，喷施2次后可取材，从基部第二个芽上切下茎；用手术刀将叶片叶柄从基部去除露出芽点后，用75％乙醇溶液震荡消毒50秒后用无菌水冲洗，而后在超净工作台上用有效氯含量1.5％的漂白水溶液+TWEEN-20消毒18-22分钟；消毒期间频繁震荡容器使消毒剂充分渗透，然后用无菌水冲洗3-5次，每次2分钟，后用无菌滤纸将消毒茎残余水分吸干，用消毒过的镊子和手术刀仔细将芽点切下，每个芽点取材大小5毫米左右，接种到诱导培养基；
(2)丛生芽的诱导：外植体接种入诱导培养基后放置于培养室，先暗培养7天后转光照培养，光周期12小时/天，光照度1200-1500lx，室内温度控制25±2℃，7天后可见白色芽点转绿，30天后芽体伸长，35天后可切下芽体转入增殖培养基扩繁；
(3)丛生侧芽增殖：将诱导获得的无菌芽体切掉叶片，保留从基部向上1.5厘米的茎部，转接到增殖培养基进行增殖培养；培养条件光周期12小时/天，光照度1200-1500lx，室内温度控制25±2℃，培养45-50天后，即可获得增殖系数达2.5-3.5的丛生芽丛；将丛生芽切割为单独芽体或丛芽团继续转接到同样的增殖培养基中多次继代培养，转接周期40-50天一代，培养温度和光强、光照度同增殖培养，以获得所需要的量产数量；
(4)无根芽体复壮培养：继代增殖数达到预期数量后，将丛生芽分单株苗分切，转接如复壮培养基，培养温度，25±2℃，光照周期转变为16小时/天，光照度同增殖培养，培养35天后可以转接；
(5)生根培养：复壮培养后，丛生芽恢复健壮，个体长大，将高度达到2.5厘米的苗转接到生根培养基促使发根，高度不够的弱小芽体重复复壮一次后再生根培养，生根培养环境光照和温度控制同复壮培养期间，培养25天左右可见发根后即可开始自然驯化；
(6)自然驯化：生根培养25-30天后，已见不定根长出和后续的根原基萌发，瓶苗转到温室设施内接受自然光和温度的驯化，驯化期间温度幅15-28℃，光照幅3000-5000lx，驯化20-25天后可生根苗出瓶移栽；
(7)组培苗移栽：将驯化好的生根组培苗从瓶中取出，洗净根系所粘的培养基，高锰酸钾溶液浸泡消毒1分钟后取出，用72穴筛盘、基质泥炭土种植，种植后设施温室内湿度在70～80％，温度保持在15℃以上至室温范围内，高于30℃必须用风机、水帘降温。
上述各个步骤中涉及到的处理方式、培养条件、培养时间和培养基的成分都会根据具体需要进行适当的调整。
其中，丛生芽的诱导步骤中，所述诱导培养基成分中含有DCR基本培养基大量盐分+MS配方微量元素+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)2-3mg/L+NAA(萘乙酸)0.10mg/L+；培养基含糖20g/L，琼脂0.56％，PH值5.5-5.8。
丛生芽的增殖步骤中，所述增殖培养基成分中含有1/3MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)3-5mg/L+NAA(萘乙酸)0.15-0.2mg/L+GA3(赤霉酸)0.5mg/L+吡效隆(TDZ)0.5-1mg/L，培养基含糖20g/L，琼脂0.56％。
无根芽体复壮培养步骤中，复壮培养基成分中含有1/4MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.6mg/L+NAA(萘乙酸)0.6mg/L+1g/L活性炭，培养基含糖20g/L，琼脂0.56％。
生根培养步骤中，生根培养基成分中含有1/5MS+NAA(萘乙酸)0.5～1.0mg/L+白砂糖25g/L+3.0～5.0g/L活性炭。
另外，由于培养过程受诸如温度、光照、湿度等多种因素的影响，因而，在本发明的各步骤中，处理方式、培养条件、培养时间都会根据具体需要进行适当的调整。
其中，在步骤(1)中是用75％乙醇溶液震荡消毒50秒后用无菌水冲洗，而后在超净工作台上用有效氯含量1.5％的漂白水溶液+3滴/升漂白水溶液的TWEEN-20消毒18-22分钟。而步骤(7)用于浸泡小苗根部的高锰酸钾溶液为0.1％的高锰酸钾溶液。
为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
实施例1、粗肋草(Aglanonema spp.)‘贵妇人’的组织培养快速繁殖一：
本实施例中选择粗肋草(Aglanonema spp.)的一个彩叶品种‘贵妇人’进行组织培养快速繁殖。该粗肋草品种叶色嫣红，抗性好，观赏性状极佳。
选取性状优良、生长健壮的粗肋草(Aglanonema spp.)‘贵妇人’的90杯栽培株，先将母株放置于通风良好的场所，定期多菌灵7天/次，喷施2次后取材。从基部第二个芽上切下茎。用手术刀将叶片叶柄从基部去除露出芽点后，用75％乙醇溶液震荡消毒45秒后用无菌水冲洗。在超净工作台上用有效氯含量1.5％的漂白水溶液+TWEEN-20(3滴/升漂白水溶液)消毒18分钟。消毒期间频繁震荡容器使消毒剂充分渗透。然后用无菌水冲洗3次，每次2分钟，后用无菌滤纸将消毒茎残余水分吸干。用消毒过的镊子和手术刀仔细将芽点切下，每个芽点取材大小5毫米左右，接种到诱导培养基DCR大量盐分+MS配方微量元素+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)3㎎/L+NAA(萘乙酸)0.10㎎/L；培养基含糖20g/L，琼脂0.56％，PH值5.7.
先暗培养7天后转光照培养。光周期12小时/天，光照度1200-1500lx。室内温度控制25±2℃。
7天后可见白色芽点转绿，30天后芽体伸长，35天后将诱导获得的无菌芽体切掉叶片，保留从基部向上1.5厘米的茎部，转接到增殖培养基1/3MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)5㎎/L+NAA(萘乙酸)0.15㎎/L+GA3(赤霉酸)0.5mg/L+吡效隆(TDZ)1㎎/L，培养基含糖20g/L，琼脂0.56％。培养条件光周期12小时/天，光照度1500lx。室内温度控制25±2℃。培养45-50天后，即可获得增殖系数达3的丛生芽丛。将丛生芽切割为单独芽体或丛芽团继续转接到同样的增殖培养基中多次继代培养，转接周期40-50天一代，培养温度和光强、光周期同，以获得所需要的量产数量。
继代增殖数达到预期数量后，将丛生芽分单株苗分切，转接如复壮培养基1/4MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.6㎎/L+NAA(萘乙酸)0.6㎎/L+1g/L活性炭，培养基含糖20g/L，琼脂0.56％。培养温度，25±2℃，光照周期转变为16小时/天，光照度同继代期间。
35天后将高度达到2.5厘米的苗转接生根培养基1/5MS+NAA(萘乙酸)1.0㎎/L+白砂糖25g/L+3.0/L活性炭。生根培养环境光照和温度控制同复壮培养期间。培养25天左右可见发根。后即可开始自然驯化。
生根培养25-30天后，已见不定根长出和后续的根原基萌发。瓶苗转到温室设施内接受自然光和温度的驯化。驯化期间温度幅15-28℃，光照在驯化前10天控制3000lx，后期逐渐升至5000lx。驯化20-25天后可生根苗出瓶移栽。将生根组培苗从瓶中取出，洗净根系所粘的培养基，用0.1％高锰酸钾溶液浸泡消毒1分钟移栽于72穴筛盘，基质泥炭土种植。种植后设施温室内湿度在70～80％，温度保持在18℃以上至室温范围内，高于30℃必须用风机、水帘降温。移栽成活率可达到95％以上。
实施例2、粗肋草(Aglanonema spp.)‘中国红’的组织培养快速繁殖一：
本实施例中选择粗肋草(Aglanonema spp.)的一个彩叶品种‘红’进行组织培养快速繁殖。该品种株形优良，叶色鲜红市场受欢迎，但因叶部叶绿素含量极低，扦插难以生根，亟需通过组培技术克服量产问题。
选取性状优良、生长健壮的粗肋草(Aglanonema spp.)‘中国红’的90杯栽培株，先将母株放置于通风良好的场所，定期多菌灵7天/次，喷施2次后取材。从基部第二个芽上切下茎。用手术刀将叶片叶柄从基部去除露出芽点后，用75％乙醇溶液震荡消毒45秒后用无菌水冲洗。在超净工作台上用有效氯含量1.5％的漂白水溶液+TWEEN-20(3滴/升漂白水溶液)消毒22分钟。消毒期间频繁震荡容器使消毒剂充分渗透。然后用无菌水冲洗5次，每次2分钟，后用无菌滤纸将消毒茎残余水分吸干。用消毒过的镊子和手术刀仔细将芽点切下，每个芽点取材大小5毫米左右，接种到诱导培养基DCR大量盐分+MS配方微量元素+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)2㎎/L+NAA(萘乙酸)0.10㎎/L；培养基含糖20g/L，琼脂0.56％，PH值5.7。消毒成功率75％以上。
先暗培养7天后转光照培养。光周期12小时/天，光照度12002lx。室内温度控制25±2℃。
7天后可见白色芽点转绿，30天后芽体伸长，35天后将诱导获得的无菌芽体切掉叶片，保留从基部向上1.5厘米的茎部，转接到增殖培养基1/3MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)4㎎/L+NAA(萘乙酸)0.10㎎/L+GA3(赤霉酸)0.5mg/L+吡效隆(TDZ)0.5㎎/L，培养基含糖20g/L，琼脂0.56％。培养条件光周期12小时/天，光照度1500lx。室内温度控制25±2℃。培养45-50天后，即可获得增殖系数达3.5的丛生芽丛。将丛生芽切割为单独芽体或丛芽团继续转接到同样的增殖培养基中多次继代培养，转接周期40-50天一代，培养温度和光强、光周期同，以获得所需要的量产数量。
继代增殖数达到预期数量后，将丛生芽分单株苗分切，转接如复壮培养基1/4MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.6㎎/L+NAA(萘乙酸)0.6㎎/L+1g/L活性炭，培养基含糖20g/L，琼脂0.56％。培养温度，25±2℃，光照周期转变为16小时/天，光照度同继代期间。
35天后将高度达到2.5厘米的苗转接生根培养基1/5MS+NAA(萘乙酸)1.0㎎/L+白砂糖25g/L+3.0/L活性炭。生根培养环境光照和温度控制同复壮培养期间。培养25天左右可见发根。后即可开始自然驯化。
生根培养25-30天后，已见不定根长出和后续的根原基萌发。瓶苗转到温室设施内接受自然光和温度的驯化。驯化期间温度幅15-28℃，光照在驯化前10天控制3000lx，后期逐渐升至5000lx。驯化20-25天后可生根苗出瓶移栽。将生根组培苗从瓶中取出，洗净根系所粘的培养基，用0.1％高锰酸钾溶液浸泡消毒1分钟移栽于72穴筛盘，基质泥炭土种植。种植后设施温室内湿度在70～80％，温度保持在18℃以上至室温范围内，高于30℃必须用风机、水帘降温。移栽成活率可达到95％以上。
相比于现有技术，本发明的粗肋草组织培养快速繁殖方法的有益效果在于：该方法操作容易，生产成本低，不污染环境，且繁殖系数高，数量增殖快，能够实现规模化生产。通过本发明培育出的粗肋草种苗，其遗传性状稳定，保持了亲本的特性，具备包括不变性、投入少、产出高、周期短在内的诸多优势。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (3)
1.一种粗肋草组织培养快速繁殖方法,其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)预处理和外植体取材、消毒：选取性状优良、生长健壮的粗肋草栽培株，先将母株放置于通风良好的场所，定期喷施杀菌药7天/次，喷施2次后可取材，从基部第二个芽上切下茎；用手术刀将叶片叶柄从基部去除露出芽点后，用75％乙醇溶液震荡消毒50秒后用无菌水冲洗，而后在超净工作台上用有效氯含量1.5％的漂白水溶液+TWEEN-20消毒18-22分钟；消毒期间频繁震荡容器使消毒剂充分渗透，然后用无菌水冲洗3-5次，每次2分钟，后用无菌滤纸将消毒茎残余水分吸干，用消毒过的镊子和手术刀仔细将芽点切下，每个芽点取材大小5毫米，接种到诱导培养基；
(2)丛生芽的诱导：外植体接种入诱导培养基后放置于培养室，先暗培养7天后转光照培养，光周期12小时/天，光照度1200-1500lx，室内温度控制25±2℃，7天后可见白色芽点转绿，30天后芽体伸长，35天后可切下芽体转入增殖培养基扩繁；
(3)丛生侧芽增殖：将诱导获得的无菌芽体切掉叶片，保留从基部向上1.5厘米的茎部，转接到增殖培养基进行增殖培养；培养条件光周期12小时/天，光照度1200-1500lx，室内温度控制25±2℃，培养45-50天后，即可获得增殖系数达2.5-3.5的丛生芽丛；将丛生芽切割为单独芽体或丛芽团继续转接到同样的增殖培养基中多次继代培养，转接周期40-50天一代，培养温度和光强、光照度同增殖培养，以获得所需要的量产数量；
(4)无根芽体复壮培养：继代增殖数达到预期数量后，将丛生芽分单株苗分切，转接如复壮培养基，培养温度，25±2℃，光照周期转变为16小时/天，光照度同增殖培养，培养35天后转接；
(5)生根培养：复壮培养后，丛生芽恢复健壮，个体长大，将高度达到2.5厘米的苗转接到生根培养基促使发根，高度不够的弱小芽体重复复壮一次后再生根培养，生根培养环境光照和温度控制同复壮培养期间，培养25天可见发根后即可开始自然驯化；
(6)自然驯化：生根培养25-30天后，已见不定根长出和后续的根原基萌发，瓶苗转到温室设施内接受自然光和温度的驯化，驯化期间温度15-28℃，光照3000-5000lx，驯化20-25天后可生根苗出瓶移栽；
(7)组培苗移栽：将驯化好的生根组培苗从瓶中取出，洗净根系所粘的培养基，高锰酸钾溶液浸泡消毒1分钟后取出，用72穴筛盘、基质泥炭土种植，种植后设施温室内湿度在70～80％，温度保持在15℃以上至室温范围内，高于30℃必须用风机、水帘降温；
所述诱导培养基成分中含有DCR基本培养基大量盐分+MS配方微量元素+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)2-3mg/L+NAA(萘乙酸)0.10mg/L+；培养基含糖20g/L，琼脂0.56％，PH值5.5-5.8；
所述增殖培养基成分中含有1/3MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)3-5mg/L+NAA(萘乙酸)0.15-0.2mg/L+GA3(赤霉酸)0.5mg/L+吡效隆(TDZ)0.5-1mg/L，培养基含糖20g/L，琼脂0.56％；
复壮培养基成分中含有1/4MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.6mg/L+NAA(萘乙酸)0.6mg/L+1g/L活性炭，培养基含糖20g/L，琼脂0.56％；
生根培养基成分中含有1/5MS+NAA(萘乙酸)0.5～1.0mg/L+白砂糖25g/L+3.0～5.0g/L活性炭。
2.如权利要求1所述的粗肋草组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤(1)中是用75％乙醇溶液震荡消毒50秒后用无菌水冲洗，而后在超净工作台上用有效氯含量1.5％的漂白水溶液+3滴/升漂白水溶液的TWEEN-20消毒18-22分钟。
3.如权利要求1所述的粗肋草组织培养快速繁殖方法，其特征在于：步骤(7)用于浸泡小苗根部的高锰酸钾溶液为0.1％的高锰酸钾溶液。
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