CN111972287A - 一种灿烂粗肋草组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种灿烂粗肋草组织培养方法，以灿烂粗肋草的茎干作为组织培养的外植体，经过母本预处理、外植体消毒接种、启动诱导期、增殖扩繁期、生根诱导期这些阶段的培养，获得了保持母本优良性状的组培苗，增殖扩繁率高，生根率高，利于量化生产，供应市场需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物组织培养技术领域，尤其涉及粗肋草组织培养技术。
背景技术
天南星科红叶粗肋草大多具有红色叶斑、叶脉或叶缘，观赏期长、易于形成大色块景观的特点，应用前景广阔。灿烂粗肋草是粗肋草的其中一个红叶品种。可在气候适宜的地区露地栽培。早期生产常规繁殖大多以顶芽及茎段两种扦插法为主要的繁殖方式，但是繁殖速度有限。近些年业界虽然有使用组织培养方式尝试进行生产，但是组培过程中总是存在生根困难的问题，使组培在大规模生产应用上受到极大的限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灿烂粗肋草组织培养方法，以解决粗肋草组织培养过程中生根困难导致大规模生产受到限制的问题。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
一种灿烂粗肋草组织培养方法，包括如下步骤：
(1)外植体处理：整个植株切下，去掉叶片，切割好茎干；茎干切成单节段，节间短的切成2-3个节的节段，作为外植体；
(2)外植体消毒与接种：外植体先后用75％酒精、升汞对外植体进行消毒；外植体接种到启动诱导培养基1进行培养，使外植体萌发；
(3)启动诱导：外植体节上的腋芽萌发，继续培养至芽长达到要求，把芽切下，转接到启动诱导培养基2进行培养；再继续转接到诱导培养基3进行培养；再继续转接到诱导培养基4进行培养；
(4)增殖扩繁：将步骤(3)得到的丛生芽分成小芽团，转接到增殖扩繁培养基培养；
(5)生根诱导：将步骤(4)得到的苗接种到生根培养基。
进一步地，所述步骤(1)外植体处理详细过程是：从距离基质表面1-2cm处把整个植株切下，去掉叶片，干净、通风、安全的地方晾干，直到茎干表面水分散失，表皮略微脱水干皱茎干微软；从叶柄基部环切茎干上残留的叶片或叶柄，切割过程中避免切伤侧芽和茎干。
进一步地，所述步骤(2)中使用的升汞是含有0.2mL/L吐温80的0.1％升汞；
所述步骤(2)的消毒时间是：外植体直径为:0.5-1cm：75％酒精消毒20S，升汞消毒20min；外植体直径为:1-2cm：酒精消毒30S,升汞消毒30min；外植体直径>2cm，酒精消毒>30S,升汞消毒>30min；
酒精冲洗消毒时，酒精液位到材料瓶一半高度即可，当消毒时间离目标时间5秒钟时，倾倒出消毒酒精到一个备用的空广口瓶中存放废酒精，当酒精的目标消毒时间到达瞬间倒入备用好的升汞到外植体材料瓶中，升汞液位淹没外植体，消毒过程中，每隔2-3分钟用力摇动外植体材料瓶，每次快速摇动7-8次后，将外植体材料瓶轮流正放和倒放，升汞消毒时间到目标时间一半时，更换升汞，升汞液位淹没外植体，消毒过程中，每隔2-3分钟用力摇动外植体材料瓶，每次快速摇动7-8次后，将外植体材料瓶轮流正放和倒放；
消毒结束，用无菌水充分清洗干净外植体。
进一步地，所述步骤(2)中接种时，镊子紧夹茎段，手术刀小心切去茎段两端，切口厚2mm，镊子夹住茎段形态学上部插入到启动诱导培养基1中，插入培养基深度3mm，每瓶接种一个外植体；
启动诱导培养基1：MS+6-BA 3.0mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L,pH6.0-6.2或MS+6-BA5.0mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，,pH6.0-6.2,其培养条件是：26℃，散光培养，3000-4500lx，16h光/8h暗；
培养期间挑去真菌细菌污染的。
进一步地，所述步骤(3)中，经过启动诱导培养基1培养腋芽萌发后，继续培养，待芽长至2-3cm高，把芽切下，切割要求：若芽较小，可留一些母体的组织，去顶增殖；若芽较大较粗时，可以去顶剖成两半；切完后，转接到启动诱导培养基2，每瓶接1个单芽；
启动诱导培养基2：
MS+6-BA3.0mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L；
pH6.0-6.2；
其培养条件：温度28℃，光照3000LX；16h光8h/暗；
培养1.5个月。
进一步地，所述步骤(3)中，经过启动诱导培养基2的培养，单芽长成丛芽，切割，切割要求：去顶；切分成2-3芽/团，方向性分割；较大的芽去顶后剖成两半，切完后，转接启动诱导培养基3，每瓶接1～2团；
启动诱导培养基3：
MS+6-BA3.0mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L；
pH6.0-6.2；
培养条件：温度28℃，光照3000LX；16h光8h/暗；
培养40天～45天。
进一步地，所述步骤(3)，经过启动诱导培养基3培养，在转接启动诱导培养基4前，切割要求如下：
去顶；去掉黑头；去根；去枯黄苞叶、疏松变黑的愈伤；较大的芽去顶后剖成两半，小的芽去顶后划一刀，与茎尖切面垂直；基部较大，节较多，可横切分成几段；从芽分成2-3芽/团，方向性切割；切完后，转接到新鲜的启动诱导培养基4中；瓶中所接的团块数量随继代次数的增加而逐渐增加，每瓶最多达12团；
启动诱导培养基4成分：
MS+6-BA3.0mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L；
pH6.0-6.2；
其培养条件是：26℃，3000LX光培养，16h光8h/暗，2个月。
进一步地，所述步骤(4)增殖扩繁中，经过步骤(3)的培养，团块的数量多到需要大量扩繁时，切割转接增殖扩繁培养基，切割要求是：
(1)去掉明显的黑头；
(2)去顶：生产不急需苗而扩大库存时，去顶至只留0.8-1cm高的芽组织；若急需苗则留长点增殖组织，留＞1cm高的芽组织；
(3)去根；
(4)去枯黄苞叶、疏松变黑的愈伤；
(5)较小的丛生芽分成2-3芽/团，方向性切割；较大的芽纵切分成2-4份/芽；
所述增殖扩繁培养基是：
MS+6-BA3.0mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L；
pH6.0-6.2，12团/瓶；
其培养条件是：26℃，光培养：3000LX，16h光8h/暗，40天。
进一步地，所述步骤(4)培养后，切割，转接生根诱导培养基培养，切割要求：
株高≥2.5cm；叶宽≥1cm；叶≥1.5片；有1～2个节；去掉枯黄的苞叶、叶片；
所述生根诱导培养基是：
1#MS+AC0.1g/L+SUG15g/L+NAA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+6g/L的卡拉胶，
或1#MS+AC0.1g/L+SUG20g/L+NAA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+6g/L的卡拉胶，
或1#MS+AC0.5g/L+SUG20g/L+NAA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+6g/L的卡拉胶，
或2#MS+AC0.1g/L+SUG20g/L+NAA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+6g/L的卡拉胶；
pH值＝6.20，每瓶接种5株，大小分开放；
其培养条件是26℃，光培养:3000LX，16h光8h/暗，1个月。
本发明的优点包括：
(1)先后用75％酒精、加有0.2mL/L吐温80的0.1％升汞对外植体进行消毒，能够对组培成功率有积极作用；
(2)外植体可以采用大小不同的茎段；
(3)经过外植体接种处理、启动诱导期多次转接培养能够利于获得保持母本优良性状的组培苗，增殖扩繁率高；
(4)在生根诱导培养基成分恰当，生根率高。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1是外植体接种到启动诱导培养基1的实验图；
图2是外植体经诱导培养基1培养后萌芽的实验图；
图3是增殖扩繁培养基培养效果实验图；
图4是生根诱导处理1号培养基实验图；
图5是生根诱导处理2号培养基实验图；
图6是生根诱导处理3号培养基实验图；
图7是生根诱导处理4号培养基实验图；
图8是生根诱导处理5号培养基实验图；
图9是生根诱导处理6号培养基实验图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
首先，对本发明中出现的相关名词作简要说明：
1、本发明中出现在培养基之后的“+”(例如“MS+6-BA3.0mg/L”)表示MS培养基包含“+”之后所列举的一种或多种物质(例如上述6-BA)。
2、操作过程中的细节如使用的工具，使用75％酒精进行消毒的操作细节等是常规操作，本领域技术人员均能够理解，本文不一一赘述。
3、本发明中1#MS培养基是指：KNO3和NH4NO3浓度是MS培养基配方中KNO3和NH4NO3的浓度的1/2，其他成分与MS培养基的相同；
4、本发明中2#MS培养基是指：KNO3和NH4NO3浓度是MS培养基配方中KNO3和NH4NO3的浓度的1/4，其他成分与MS培养基的相同；
5、本发明中3#MS培养基是指：KNO3和NH4NO3浓度是MS培养基配方中KNO3和NH4NO3的浓度的1/8，其他成分与MS培养基的相同。
6、本发明中MS培养基、1#MS培养基、2#MS培养基、3#MS培养基的配方是：
灿烂粗肋草的组织培养方法步骤如下：
STG0母本预处理
选取生长健壮、无病虫害、遗传性状纯正的母株，放干燥通风处晾干几天，不浇水，防淋雨，使基质变干至表层灰白。
STG1外植体消毒与接种
1.1外植体预处理
选晴天，从距离基质表面1-2cm处把整个植株切下，去掉叶片，如此一个个植株进行切割，将切割好的所有茎干(外植体)整齐散开摆放到干净的接种碟或铺有报纸的塑料筐上，放到干净、通风、安全的地方晾干，晾干2-3天，直到茎干表面水分散失，表皮略微脱水干皱茎干微软为宜，晾干期间防止淋雨或淋水。
1.2外植体细处理
将预处理好的外植体从叶柄基部环切茎干上残留的叶片或叶柄，注意切割过程中避免切伤侧芽和茎干，从茎干顶部茎节开始，一直处理到茎干基部茎节，如果茎干表面有残留老叶或老皮或其他残渣污垢，需要用消毒好的手术刀小心刮净，刮净处理中尽量避免刮伤茎干表皮，当处理完一整个茎干后，放到一个干净的接种碟中备用。
1.3外植体消毒
将细处理好的外植体茎干切成单节段，节间很短的也可以切成2-3个节的节段，根据茎段粗细规格不同将茎段分别分级夹放到不同的干净广口瓶中备用消毒，一个广口瓶中外植体的堆放一般不超过70％的容量，取备用好的75％酒精瓶和加有0.2mL/L吐温80的0.1％升汞瓶、若干个干净的广口瓶备用，往外植体材料瓶倒入75％酒精同时计时，酒精液位到材料瓶一半高度即可，盖上外植体材料瓶盖，边冲洗消毒边看计时时间，当消毒时间离目标时间大约5秒钟时，倾倒出消毒酒精到一个备用的空广口瓶中存放废酒精，当酒精的目标消毒时间到达瞬间倒入备用好的升汞到外植体材料瓶中，升汞液位必须淹没外植体，旋紧外植体材料瓶盖用力摇动几次，在升汞消毒过程中，每隔2-3分钟用力摇动外植体材料瓶，使外植体和瓶内壁充分被升汞消毒彻底，每次快速摇动7-8次后，将外植体材料瓶轮流正放和倒放，当升汞消毒时间到目标时间一半时，倾倒出废升汞到一个备用的空广口瓶中，当外植体材料瓶内升汞倒出完毕后，重新加入新升汞到淹没外植体液位为止，盖紧外植体材料瓶盖继续消毒，消毒过程中同样每隔2-3分钟用力摇动7-8次外植体瓶，并使外植体材料瓶正反轮番颠倒放置消毒碟中，消毒过程中，准备好8瓶左右无菌水，当升汞的消毒时间结束时，快速倾倒出废升汞到备用的空广口瓶中存放，往外植体材料瓶倒入无菌水，轻轻摇动清洗外植体和瓶内壁，摇动清洗2分钟左右后，倒出清洗过无菌水到一个空广口瓶中存放，然后再打开第二瓶无菌水盖子，把无菌水倾倒入外植体材料瓶后轻轻摇动清洗外植体，清洗2分钟左右后倒出清洗过的无菌水到一个空广口瓶中存放，如此清洗7次左右后，外植体消毒清洗处理完毕，最后一次清洗的无菌水保留在外植体瓶中不用倒出。
消毒时间：外植体直径为:0.5-1cm：酒精20S，升汞20min；外植体直径为:1-2cm：酒精30S,升汞30min；外植体直径>2cm，可根据情况适当延长酒精和升汞的消毒时间。
1.4外植体接种
用枪形镊子从外植体材料瓶中夹取一个外植体茎段到接种碟中，镊子紧夹茎段，手术刀小心切去茎段两端切口厚约2mm，镊子从接种碟中夹住茎段形态学上部插入到启动诱导培养基1中，插入培养基深度约3mm，每瓶接种一个外植体，如图1所示。
启动诱导培养基1：MS+6-BA 3.0mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L,pH6.0-6.2或MS+6-BA5.0mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L,pH6.0-6.2；
培养条件：26℃，散光培养，3000-4500lx，16h光/8h暗。
一星期后，挑去真菌细菌污染的。
经常查看，观察外植体生长情况，如发现外植体除芽点外其余部分变成白色，说明消毒时间过长，应当缩短消毒时间。
STG2启动诱导期
培养一段时间后，节上的腋芽萌发，见图2：
继续培养，待芽长至2-3cm高，把芽切下，切割要求：
(1)如果芽较小，可留一些母体的组织，去顶增殖；
(2)芽较大较粗时，可以去顶剖成两半。
切完后，转接到新鲜的启动诱导培养基2中，每瓶接1个单芽。
启动诱导培养基2：
MS+6-BA3.0mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L；
pH6.0-6.2；
培养条件：温度28℃，光照3000LX；16h光/8h暗；
继续培养1.5个月，单芽长成丛芽，切割：
(1)去顶；
(2)切分成2-3芽/团，方向性分割；
(3)较大的芽去顶后剖成两半。
切完后，转接到新鲜的启动诱导培养基3中，每瓶接1～2团。
启动诱导培养基3：
MS+6-BA3.0mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L；
pH6.0-6.2；
培养条件：温度28℃，光照3000LX；16h光/8h暗
如此，每培养40天～45天，就转接一次，增殖的团块可能产生黑头、基部发根、叶柄变枯黄，切割时要把这些都切去，具体要求如下：
(1)去顶；
(2)去掉黑头；
(3)去根；
(4)去枯黄苞叶、疏松变黑的愈伤；
(5)较大的芽去顶后剖成两半，小的芽去顶后划一刀(与茎尖切面垂直)；
(6)基部较大，节较多，可横切分成几段；
(7)从芽分成2-3芽/团，方向性切割。
切完后，转接到新鲜的启动诱导培养基4中。
启动诱导培养基4：
MS+6-BA3.0mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L；
pH6.0-6.2；每瓶数团(瓶中所接的团块数量随继代次数的增加而逐渐增加，最多达12团。)
培养条件：26℃，3000LX光培养。16h光/8h暗
转接周期：2个月左右。
STG3增殖扩繁期
当团块的数量达到一定量进行大量扩繁，需要切割接种到新的增殖扩繁培养基，切割要求：
(1)去掉明显的黑头；
(2)去顶：生产不急需苗而扩大库存时，一般去顶至只留0.8-1cm高的芽组织；若急需苗则留长点增殖组织；
(3)去根；
(4)去枯黄苞叶、疏松变黑的愈伤；
(5)较小的丛生芽分成2-3芽/团，方向性切割；较大的芽纵切分成2-4份/芽。
增殖扩繁培养基：MS+6-BA3.0mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L；
pH6.0-6.2，12团/瓶。
培养条件：26℃，光培养：3000LX；16h光/8h暗
转接周期：40天；
培养效果如图3所示。
STG4生根诱导期
经过增殖扩繁培养后，需要进行生根诱导培养，生根切割要求：
株高≥2.5cm；
叶宽≥1cm；
叶≥1.5片；
有1～2个节；
去掉枯黄的苞叶、叶片；
根可以保留也可以去掉。一般，如果根较长会截去，方便夹进袋子或瓶子里。
接种至生根培养基：
1#MS+AC0.1g/L+SUG20g/L+NAA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，PH值6.20，10棵/袋，大小分开放。
培养条件：26℃，光培养:3000LX，16h光/8h暗
生根时间：1个月。
当然，为了验证不同生根诱导培养基对生根情况的影响，本发明做出如下不同培养基进行试验：
以下试验培养基均添加NAA0.5mg/L，IBA0.3mg/L，其他成分按下表添加，定容后调节PH值至6.20，最后添加6g/L的卡拉胶。切取两叶一心的苗或较大的芽接于试验培养基中，每瓶接种5株，培养条件、培养时间同上。
表1
| 处理序号 | MS | AC(g/L) | SUG(g/L) | 生根率 |
| 1 | 1#MS | 0.1 | 15 | 65.71％ |
| 2 | 1#MS | 0.1 | 20 | 85.71％ |
| 3 | 1#MS | 0.5 | 20 | 70.67％ |
| 4 | 2#MS | 0.1 | 20 | 72.86％ |
| 5 | 3#MS | 1 | 15 | 14.67％ |
| 6 | 1#MS | 1.0 | - | 41.33％ |
处理1号的实验图如图4所示，处理2号的实验图如图5所示，处理3号的实验图如图6所示，处理4号的实验图如图7所示，处理5号的实验图如图8所示，处理6号的实验图如图9所示。
随着无机盐浓度的降低，灿烂粗肋草的生根率随之降低，并且，1#MS是灿烂粗肋草生根较适宜的无机盐配方。从添加活性炭的含量来看，灿烂的生根情况与活性炭的添加量并没有表现出明显的相关性。从添加蔗糖的含量来看，总体上添加20g/L的糖生根情况要优于添加15g/L的生根情况。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (9)
1.一种灿烂粗肋草组织培养方法，其特征在于：
包括如下步骤：
(1)外植体处理：整个植株切下，去掉叶片，切割好茎干；茎干切成单节段，节间短的切成2-3个节的节段，作为外植体；
(2)外植体消毒与接种：外植体先后用75％酒精、升汞对外植体进行消毒；外植体接种到启动诱导培养基1进行培养，使外植体萌发；
(3)启动诱导：外植体节上的腋芽萌发，继续培养至芽长达到要求，把芽切下，转接到启动诱导培养基2进行培养；再继续转接到诱导培养基3进行培养；再继续转接到诱导培养基4进行培养；
(4)增殖扩繁：将步骤(3)得到的丛生芽分成小芽团，转接到增殖扩繁培养基培养；
(5)生根诱导：将步骤(4)得到的苗接种到生根培养基。
2.根据权利要求1所述的一种灿烂粗肋草组织培养方法，其特征在于：
所述步骤(1)外植体处理详细过程是：从距离基质表面1-2cm处把整个植株切下，去掉叶片，干净、通风、安全的地方晾干，直到茎干表面水分散失，表皮略微脱水干皱茎干微软；从叶柄基部环切茎干上残留的叶片或叶柄，切割过程中避免切伤侧芽和茎干。
3.根据权利要求1所述的一种灿烂粗肋草组织培养方法，其特征在于：
所述步骤(2)中使用的升汞是含有0.2mL/L吐温80的0.1％升汞；
所述步骤(2)的消毒时间是：外植体直径为:0.5-1cm：75％酒精消毒20S，升汞消毒20min；外植体直径为:1-2cm：酒精消毒30S,升汞消毒30min；外植体直径>2cm，酒精消毒>30S,升汞消毒>30min；
酒精冲洗消毒时，酒精液位到材料瓶一半高度即可，当消毒时间离目标时间5秒钟时，倾倒出消毒酒精到一个备用的空广口瓶中存放废酒精，当酒精的目标消毒时间到达瞬间倒入备用好的升汞到外植体材料瓶中，升汞液位淹没外植体，消毒过程中，每隔2-3分钟用力摇动外植体材料瓶，每次快速摇动7-8次后，将外植体材料瓶轮流正放和倒放，升汞消毒时间到目标时间一半时，更换升汞，升汞液位淹没外植体，消毒过程中，每隔2-3分钟用力摇动外植体材料瓶，每次快速摇动7-8次后，将外植体材料瓶轮流正放和倒放；
消毒结束，用无菌水充分清洗干净外植体。
4.根据权利要求2所述的一种灿烂粗肋草组织培养方法，其特征在于：
所述步骤(2)中接种时，镊子紧夹茎段，手术刀小心切去茎段两端，切口厚2mm，镊子夹住茎段形态学上部插入到启动诱导培养基1中，插入培养基深度3mm，每瓶接种一个外植体；
启动诱导培养基1：MS+6-BA 3.0mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L,pH6.0-6.2或MS+6-BA5.0mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，,pH6.0-6.2,其培养条件是：26℃，散光培养，3000-4500lx，16h光/8h暗；
培养期间挑去真菌细菌污染的。
5.根据权利要求1所述的一种灿烂粗肋草组织培养方法，其特征在于：
所述步骤(3)中，经过启动诱导培养基1培养腋芽萌发后，继续培养，待芽长至2-3cm高，把芽切下，切割要求：若芽较小，可留一些母体的组织，去顶增殖；若芽较大较粗时，可以去顶剖成两半；切完后，转接到启动诱导培养基2，每瓶接1个单芽；
启动诱导培养基2：
MS+6-BA3.0mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L；
pH6.0-6.2；
其培养条件：温度28℃，光照3000LX，16h光8h/暗；
培养1.5个月。
6.根据权利要求1所述的一种灿烂粗肋草组织培养方法，其特征在于：
所述步骤(3)中，经过启动诱导培养基2的培养，单芽长成丛芽，切割，切割要求：去顶；切分成2-3芽/团，方向性分割；较大的芽去顶后剖成两半，切完后，转接启动诱导培养基3，每瓶接1～2团；
启动诱导培养基3：
MS+6-BA3.0mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L；
pH6.0-6.2；
培养条件：温度28℃，光照3000LX；16h光8h/暗，
培养40天～45天。
7.根据权利要求1所述的一种灿烂粗肋草组织培养方法，其特征在于：
所述步骤(3)，经过启动诱导培养基3培养，在转接启动诱导培养基4前，切割要求如下：
去顶；去掉黑头；去根；去枯黄苞叶、疏松变黑的愈伤；较大的芽去顶后剖成两半，小的芽去顶后划一刀，与茎尖切面垂直；基部较大，节较多，可横切分成几段；从芽分成2-3芽/团，方向性切割；切完后，转接到新鲜的启动诱导培养基4中；瓶中所接的团块数量随继代次数的增加而逐渐增加，每瓶最多达12团；
启动诱导培养基4成分：
MS+6-BA3.0mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L；
pH6.0-6.2；
其培养条件是：26℃，3000LX光培养，16h光8h/暗，2个月。
8.根据权利要求1所述的一种灿烂粗肋草组织培养方法，其特征在于：
所述步骤(4)增殖扩繁中，经过步骤(3)的培养，团块的数量多到需要大量扩繁时，切割转接增殖扩繁培养基，切割要求是：
(1)去掉明显的黑头；
(2)去顶：生产不急需苗而扩大库存时，去顶至只留0.8-1cm高的芽组织；若急需苗则留长点增殖组织，留＞1cm高的芽组织；
(3)去根；
(4)去枯黄苞叶、疏松变黑的愈伤；
(5)较小的丛生芽分成2-3芽/团，方向性切割；较大的芽纵切分成2-4份/芽；
所述增殖扩繁培养基是：
MS+6-BA3.0mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L，
或MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L+6g/L的卡拉胶+蔗糖30g/L；
pH6.0-6.2，12团/瓶；
其培养条件是：26℃，光培养：3000LX，16h光8h/暗，40天。
9.根据权利要求1所述的一种灿烂粗肋草组织培养方法，其特征在于：
所述步骤(4)培养后，切割，转接生根诱导培养基培养，切割要求：
株高≥2.5cm；叶宽≥1cm；叶≥1.5片；有1～2个节；去掉枯黄的苞叶、叶片；
所述生根诱导培养基是：
1#MS+AC0.1 g/L+SUG15g/L+NAA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+6g/L的卡拉胶，
或1#MS+AC0.1 g/L+SUG20g/L+NAA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+6g/L的卡拉胶，
或1#MS+AC0.5g/L+SUG20g/L+NAA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+6g/L的卡拉胶，
或2#MS+AC0.1 g/L+SUG20g/L+NAA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+6g/L的卡拉胶；
pH值＝6.20，每瓶接种5株，大小分开放；
其培养条件是26℃，光培养:3000LX，16h光8h/暗，1个月。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN113303228A (zh) * | 2021-07-07 | 2021-08-27 | 江门粤恬科技有限公司 | 一种彩叶粗肋草组培工厂化生产的方法 |
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2020
- 2020-07-21 CN CN202010703540.1A patent/CN111972287A/zh active Pending
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