CN114467760A - 一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，具体步骤包括：材料准备、成熟胚预处理消毒、胚性愈伤组织的诱导和愈伤组织的增殖。本发明以睡莲成熟胚为外植体，取材方便，经消毒处理后污染率低，愈伤组织诱导率高，增殖效果好，可用于遗传转化、种质资源保存与快繁生产，为睡莲再生体系、转基因研究建立基础。

Description

一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法

技术领域

本发明涉及一种植物组织培养技术，特别涉及一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法。

背景技术

睡莲（Nymphaea）是睡莲科(Nymphaeaceae)睡莲属(Nymphaea)的多年生浮叶型水生草本植物，主要分布在温带及热带，其茎叶对水中富营养物和有害物质具有强吸附能力被广泛应用于园林水景中（廖卫伟，2016），市场需求广阔。目前睡莲品种中绝大多数还是通过人工杂交和自然杂交的手段结果的，育种周期长，随机性较强（李淑娟，2019），通过组织培养的方式生产种苗,生产速度快、可缩短繁育周期,有效保持种苗的优良性状并可以保存珍稀的睡莲种质资源，因此通过组织培养快速繁殖是目前尽快满足应用需求的有效途径，建立睡莲的无菌体系、离体再生体系迫在眉睫。

睡莲从淤泥水中长出，内生菌多，极易污染，离体培养过程中外植体灭菌和内生菌抑制的难度都较其它植物高，灭菌时间过短，会全部污染；灭菌时间过长则全部死亡（吴丽爽，2008），无菌材料的获得成为睡莲离体再生体系建立的技术瓶颈，这一技术难点若不加以有效解决，则很难进行商业化生产。

戚华沙等以蓝药睡莲的根状茎、根、叶片、叶柄及种子作为外植体，进行消毒试验研究，结果表明，采用根状茎及种子为材料消毒效果较好，并分别探索出了根状茎及种子的最佳消毒方法，但方法均建立在使用升汞消毒的前提下，现如今由于升汞的剧毒性，已被管制，需探究新的种子消毒试剂及方法；朱木兰等探究了一种睡莲无菌材料的制备方法，以睡莲种子为起始材料，经预处理、消毒、预培养等步骤，加快了种子萌发的时间，能快速获得睡莲无菌材料。但我们进行实验发现不同亚属睡莲的无菌苗获得需要使用不同的消毒方式，如热带睡莲九品香水莲的种子用常规的消毒方法较容易获得无菌苗，但不适用于雪白睡莲、‘曼拉’等多种耐寒睡莲的种子消毒，因此，需要进一步探索其有效的消毒方法。

目前，国内外也未见睡莲离体再生的成功报道，孙春青等以睡莲3个杂交组合的幼胚为外植体，研究出授粉后13～18d幼胚在1/2MS + 2,4-D 2.0 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L培养基中诱导出睡莲愈伤组织，但愈伤组织增殖方面相关技术难题仍未攻克。

本发明主要目的就是为了解决睡莲组培难的问题，建立起睡莲稳定的无菌体系，通过成熟胚诱导胚性愈伤探索睡莲胚性愈伤组织诱导及增殖方法，为睡莲再生体系、转基因研究建立基础。此外，愈伤组织也可用于遗传转化、种质资源保存与快繁生产。

发明内容

本发明提供了一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其目的在于克服睡莲难消毒、愈伤难诱导难增殖的问题，建立睡莲稳定的无菌体系，为后续建立睡莲再生体系、遗传转化体系以及睡莲基因功能研究建立基础。

本发明的技术方案如下：

一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，包括以下步骤：

（1）取睡莲成熟胚置于流水下冲洗干净，再在多菌灵溶液中消毒后用蒸馏水冲洗至无多菌灵残余；

（2）准备愈伤组织诱导培养基；

（3）成熟胚消毒处理：

（a）将没有多菌灵残余的成熟胚装在离心管中，转移到超净工作台中；

（b）在超净工作台中对成熟胚进行消毒灭菌，先使用75%酒精消毒，消毒后用无菌水冲洗至无酒精残余，接着用10%次氯酸钠消毒，消毒后用无菌水冲洗至无次氯酸钠残余，将处理后的成熟胚放在经高温灭菌烘干后的滤纸上晾干；

（c）将成熟胚坚硬种皮剥掉，取出成熟胚置于离心管中；

（d）在超净工作台中，将去种皮成熟胚先用75%酒精消毒，消毒后用无菌水冲洗至无酒精残余，接着用3%次氯酸钠消毒，消毒后用无菌水冲洗至无次氯酸钠残余，将处理后的去种皮成熟胚放在经高温灭菌烘干后的滤纸上晾干，晾干后接入愈伤组织诱导培养基中；

（4）准备愈伤继代培养基，其成分同步骤（2），将成熟胚从诱导培养基中转接入继代培养基，直到形成颗粒明显的愈伤组织；

（5）准备愈伤增殖培养基；

（6）增殖培养：待步骤（4）的愈伤组织直径长到4~8mm时，将其转移至愈伤增殖培养基中去，继续黑暗培养，从而获得大量胚性愈伤组织。

其中，所述睡莲为耐寒睡莲。

本发明为睡莲尤其是耐寒睡莲探索了新的消毒方法，通过先对成熟胚带种皮消毒、去除种皮后再进一步消毒，显著降低了胚的污染率，为愈伤组织的诱导及增殖提供有利的条件，最终实现了睡莲成熟胚愈伤组织的诱导及增殖。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤（1）中，睡莲成熟胚为商业购买，或自行套袋收种。

优选的，所述睡莲成熟胚洗净后用无菌水浸泡，置于4℃冰箱中保存备用。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤（1）中，选择饱满健康的睡莲成熟胚，将流水冲洗后的睡莲成熟胚放在10g/L多菌灵溶液中常温涡旋振荡消毒20±5min，用蒸馏水冲洗至多菌灵无残余。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤（2）和步骤（4）中，培养基经配制得到，所述培养基成分为：1/2MS + 1.5~2.5 mg/L 2,4-D + 0.2~0.8 mg/L TDZ + 50g/L蔗糖 + 8g/L琼脂，调节pH为5.8±0.1，于121℃灭菌20min。

优选的，所述培养基成分为：1/2MS + 1.5~2.5 mg/L 2,4-D + 0.2~0.5 mg/L TDZ+ 50g/L蔗糖 + 8g/L琼脂，调节pH为5.8，于121℃灭菌20min。

更优选的，愈伤组织诱导培养基成分为1/2MS + 1.5 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/LTDZ + 50g/L蔗糖 + 8g/L琼脂，其中1/2MS为2.47g/L。

前述愈伤组织诱导培养基配制时，称取1/2MS培养基、琼脂及蔗糖于容器中，加入1L蒸馏水加热溶解，再加入生长素2,4-D、细胞分裂素TDZ，调节pH为5.8，现配现用。

其中，使用1mol/L NaOH对pH进行调节。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤（a）中，每个离心管中所装睡莲成熟胚不超过离心管的1/3，以便后续可以消毒充分。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤（b）中，使用75%的酒精处理1±0.1min，无菌水冲洗至无酒精残余，接着用10%的次氯酸钠溶液处理10±0.5min，无菌水冲洗至无次氯酸钠残余，将处理后的成熟胚放在高温灭菌烘干后的滤纸晾干。

优选的，所述步骤（b）中，使用75%的酒精处理1min，无菌水冲洗至无酒精残余，接着用10%的次氯酸钠溶液处理10min，无菌水冲洗至无次氯酸钠残余，将处理后的成熟胚放在滤纸上晾干。

所述步骤（c）中，使用刀和镊子小心剥除睡莲成熟胚的外表坚硬种皮，露出白色胚乳；剥皮时尽量不要破坏胚乳，会影响后期诱导愈伤的效果。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤（d）中，在超净工作台中用75%酒精处理去种皮成熟胚30±3s，无菌水冲洗至无酒精残余，再用3%次氯酸钠处理3±0.3min，无菌水冲洗至无次氯酸钠残余，放在经高温灭菌烘干后的滤纸上晾干，接入愈伤组织诱导培养基中，置于26±1℃条件下黑暗培养20-30天，优选25天。

优选的，所述步骤（d）中，在超净工作台中用75%酒精处理去种皮成熟胚30s，无菌水冲洗至无酒精残余，再用3%次氯酸钠处理3min，无菌水冲洗至无次氯酸钠残余，放在经高温灭菌烘干后的滤纸上晾干，接入愈伤组织诱导培养基中，置于26±1℃条件下黑暗培养20-30天。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤（5）中，愈伤增殖培养基经配制得到，所述愈伤增殖培养基配方为MS + 2.0mg/L 2,4-D + 1.0 mg/L 6-BA + 30g/L蔗糖+ 6g/L琼脂，调节pH为5.8±0.1，于121℃灭菌20min。

优选的，所述步骤（5）中，所述愈伤增殖培养基配方为MS + 2.0mg/L 2,4-D + 1.0mg/L 6-BA + 30g/L蔗糖+ 6g/L琼脂，其中，MS浓度为4.74g/L。

前述愈伤增殖培养基配制时，称取MS培养基（市售MS 固体培养基，不含琼脂和蔗糖）4.74g、琼脂6g及蔗糖30g于搪瓷缸中，加入1L蒸馏水加热溶解，再加入生长素2,4-D2.0mg、细胞分裂素6-BA 1.0mg，调节pH为5.8，现配现用。

其中，使用1mol/LNaOH对pH进行调节。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤（6）中，当颗粒明显的愈伤组织直径长至6mm时，切去成熟胚只留愈伤组织，并将其转接到愈伤增殖培养基中；每隔25天更换一次培养基，获得胚性愈伤组织。

作为本申请的优选技术方案，所述愈伤诱导培养和愈伤增殖培养全过程均置于黑暗条件下，其培养环境温度控制在26℃。

有益效果

本发明提供了一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，与现有技术相比，具有如下有益效果：

（1） 本发明所提供的消毒方法，首次创造性地解决了雪白睡莲、‘曼拉’等耐寒睡莲的种子消毒问题，将污染率从96.67%降低到6.67%；

（2） 使用本发明所提供的愈伤增殖方法，创造性地解决了睡莲愈伤组织增殖难的问题；愈伤组织增殖快，成团状增殖；

（3） 本发明首次从成熟胚出发，解决了其愈伤组织难诱导难增殖的问题，建立睡莲稳定的无菌体系，为后续建立睡莲再生体系、遗传转化体系以及睡莲基因功能研究建立基础。

附图说明

图1为诱导的雪白睡莲愈伤组织；

图2为雪白睡莲愈伤组织增殖培养前；

图3为雪白睡莲愈伤组织增殖培养后。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实施方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，包括如下步骤：

（1）成熟胚预处理：取饱满健康的雪白睡莲成熟胚进行试验，置于流水下冲洗2h，再置于10g/L多菌灵溶液中常温涡旋振荡消毒20min，用蒸馏水冲洗3~5遍，直至没有多菌灵溶液残留。

（2）诱导培养基的配制：配制愈伤组织诱导培养基，培养基成分为1/2MS + 1.5mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ + 50g/L蔗糖 + 8g/L琼脂，配制方式为称取1/2MS培养基（市售1/2MS 固体培养基，不含琼脂和蔗糖）2.47g、琼脂8g及蔗糖50g于搪瓷缸中，加入1L蒸馏水加热溶解，再加入生长素2,4-D 1.5mg、细胞分裂素TDZ 0.5mg，用1mol/L NaOH调节pH为5.8，于121℃灭菌20min，趁热倒板分装，冷却后封板备用。

（3）成熟胚消毒处理：

（a）将没有多菌灵残余的成熟胚装在离心管中，每个离心管中所装睡莲成熟胚不超过离心管的1/3，转移到超净工作台中；

（b）在超净工作台中对成熟胚进行消毒，先用75%的酒精处理1min，无菌水冲洗3~5次，接着用10%的次氯酸钠溶液处理10min，无菌水冲洗3~5次，将处理后的成熟胚放在滤纸上晾干；

（c）晾干后，使用刀镊小心剥除睡莲成熟胚的外表坚硬种皮，露出白色胚乳，剥皮时尽量不要破坏胚乳，置于离心管中；

（d）在超净工作台中，用75%酒精处理去种皮成熟胚30s，无菌水冲洗3~5次，再用3%次氯酸钠处理3min，无菌水冲洗3~5次，放在经高温灭菌烘干后的滤纸上晾干，接入愈伤组织诱导培养基中，置于26±1℃条件下黑暗培养25天。

（4）每隔25天，将愈伤组织从诱导培养基中转接入继代培养基。

（5）配制愈伤增殖培养基：愈伤增殖培养基配方为MS + 2.0mg/L 2,4-D + 1.0mg/L 6-BA + 30g/L蔗糖 + 6g/L琼脂，配制方式为称取MS培养基（不含琼脂和蔗糖）4.74g、琼脂6g及蔗糖30g于搪瓷缸中，加入1L蒸馏水加热溶解，再加入生长素2,4-D 2.0mg、细胞分裂素6-BA 1.0mg，用1mol/L NaOH调节pH为5.8，于121℃灭菌20min，趁热倒板分装，冷却后封板备用。

（6）增殖培养：当愈伤组织直径长至4~8优选6mm时，切去成熟胚只留愈伤组织，并将其转接到愈伤增殖培养基中；每隔25天更换一次培养基，获得胚性愈伤组织。

所述愈伤诱导培养和愈伤增殖培养全过程均置于黑暗条件下，其培养环境温度控制在26±1℃。

实施例2

其他同实施例1，不同点在于，诱导培养基中TDZ添加量为0.2 mg/L，2,4-D添加量为1.5 mg/L。

实施例3

其他同实施例1，不同点在于，诱导培养基中TDZ添加量为0.2 mg/L，2,4-D添加量为2.0mg/L。

实施例4

其他同实施例1，不同点在于，诱导培养基中TDZ添加量为0.2 mg/L，2,4-D添加量为2.5 mg/L。

实施例5

其他同实施例1，不同点在于，诱导培养基中TDZ添加量为0.5 mg/L，2,4-D添加量为2.0 mg/L。

实施例6

其他同实施例1，不同点在于，诱导培养基中TDZ添加量为0.5mg/L，2,4-D添加量为2.5 mg/L。

对比例1

其他同实施例1，不同点在于，诱导培养基中TDZ添加量为0.8mg/L，2,4-D添加量为1.5 mg/L。

对比例2

其他同实施例1，不同点在于，诱导培养基中TDZ添加量为0.8mg/L，2,4-D添加量为2.0 mg/L。

对比例3

其他同实施例1，不同点在于，诱导培养基中TDZ添加量为0.8mg/L，2,4-D添加量为2.5 mg/L。

对比例4

其他同实施例1，不同点在于，对比例1中增殖培养基未添加6-BA和2,4-D，而添加2.0mg/L NAA 和0.5mg/L 花宝一号。

对比例5

其他同实施例1，不同点在于，对比例2中增殖培养基未添加6-BA和2,4-D，而添加0.5mg/L NAA、0.5mg/L水解酪蛋白和6.0mg/L PIC。

对比例6

其他同实施例1，不同点在于，对比例2中增殖培养基未添加6-BA和2,4-D，而添加2.0mg/L 玉米素。

指标测试

1.消毒方法对耐寒睡莲成熟胚消毒效果的影响

以实施例1的消毒方法作为实施例，以酒精和次氯酸钠的其他不同组合消毒处理睡莲成熟胚的方法作为对比例，将预处理过的雪白睡莲种子转移入超净工作台，进行酒精和次氯酸钠不同组合消毒处理，酒精消毒后，用无菌水冲洗至无酒精残留；次氯酸钠溶液消毒后，无菌水冲洗至无次氯酸钠残留。清洗后的种子放在滤纸上晾干后，接入培养基中。记录30d后不同消毒方法处理下的成熟胚污染率，如表1所示。

表1 耐寒睡莲成熟胚消毒方法对比

注：表中数据形式为平均值±SE。同列相同小写字母表示差异不显著（P＞0.05），不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。

睡莲种子长时间低温保存在水中，种子表面所含细菌真菌及内生菌很多，所以在进行无菌操作前需要先进行流水冲洗不仅可以清除种子表面杂质，还可以使种子从低温中恢复生长。另外，同一批种子随着储存时间越长，内生菌滋生，消毒难度越大，这就需要加大消毒试剂处理时间以及增加预处理步骤达到无菌状态。

由处理3、4、5可以发现，在预处理相同、酒精处理相同情况下，随着10%次氯酸钠处理时间增加，污染率明显下降但整体污染率还是偏高。

多菌灵是一种高效低毒有内吸性的杀菌剂，具有内吸治疗和保护的作用，主要用途是防治由真菌引起的多种作物病害。用10g/L多菌灵溶液振荡洗涤处理，可以将种子表面所含真菌及部分内生真菌杀死，消毒效果更显著。由处理1和4、处理2和6（实施例1）可以看出，进行多菌灵振荡洗涤处理的比未进行多菌灵振荡洗涤处理的污染率低。

由处理1和2，处理4和6（实施例1）可以发现，先将种子带种皮进行消毒处理，再将种皮剥掉取出成熟胚，用75%酒精处理30s，3%次氯酸钠处理3min比直接带种皮消毒处理效果更好，且效果显著。综上，处理6（实施例1）为最佳处理，污染率最低。

将处理6应用在耐寒睡莲‘曼拉’上，设置3次重复，每个重复接种30粒，发现依旧适用，污染率可低至6.67%，平均污染率10%，消毒效果显著，结果如表2所示。

表2 最适消毒方法下‘曼拉’种子的污染率

2. 不同品种耐寒睡莲愈伤组织的增殖

选取‘粉妆’、‘曼拉’、雪白睡莲三个耐寒睡莲品种的成熟胚作为实验材料，分别接种在实施例1的诱导培养基上，在黑暗条件下，每隔25天将愈伤组织转接入继代培养基，观察三个品种愈伤生长状态。结果如表3所示。

表3 不同品种耐寒睡莲愈伤诱导率及愈伤组织形态

注：表中数据形式为平均值±SE。同列相同小写字母表示差异不显著（P＞0.05），不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。

如表3所示，采用睡莲成熟胚诱导愈伤培养基培养‘粉妆’、‘曼拉’、雪白睡莲三个品种，均能诱导出愈伤组织，仅仅是诱导率及愈伤组织形态有所不同。其中雪白睡莲出愈率最高，达到74.44%，显著高于‘粉妆’，愈伤组织诱导量较大，呈黄绿色，质地紧密；其次是‘曼拉’，出愈率为68.89%，愈伤组织呈深绿色，质地较坚硬；‘粉妆’出愈率最低，为51.11%，愈伤组织呈浅黄色发白，质地较硬。

不同激素配比对耐寒睡莲成熟胚诱导愈伤效果的影响

以雪白睡莲作为实验材料，采用1/2MS培养基为基本培养基，加50g/L蔗糖、8g/L琼脂。在黑暗条件下诱导愈伤，每隔20-30天将愈伤组织转接入继代培养基，直到形成颗粒明显的愈伤组织。筛选出诱导愈伤效率最高的激素配比，结果如表4所示。

表4 耐寒睡莲成熟胚诱导愈伤培养基配方的筛选

注：表中数据形式为平均值±SE。同列相同小写字母表示差异不显著（P＞0.05），不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。

由处理1、2、3，7、8、9分析可得，在TDZ浓度相同情况下，随着2,4-D浓度的增加，出愈率呈先降低再增加的趋势，处理4、5、6中，出愈率则是随着2,4-D浓度的增加而下降，且当2,4-D浓度为1.5mg/L时，出愈率最高。

由处理1、4、7分析可得，在2,4-D浓度相同情况下，随着TDZ浓度的增加，出愈率呈先增加再降低的趋势，此规律在2、5、8和3、6、9处理组中也得到证明，低浓度范围内增加TDZ浓度可以提高愈伤诱导率，而高浓度的TDZ则会抑制愈伤诱导，所以诱导愈伤的最适TDZ浓度为0.5mg/L，此时诱导出愈率最高。

从而筛选出处理4（实施例1）为睡莲成熟胚诱导愈伤的最佳激素配比，1/2MS +1.5mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ + 50g/L蔗糖 + 8g/L琼脂培养基诱导出愈率高达到74.17%。

4不同愈伤增殖培养基配方对耐寒睡莲愈伤组织增殖效果的影响

当愈伤组织直径长至4-8mm时，切去成熟胚只留愈伤组织，并将其转接到愈伤增殖培养基中。培养基相同的基本成分为基本培养基MS、30g/L蔗糖、 6g/L琼脂，pH＝5.8，在黑暗条件下进行增殖，每25天更换新鲜培养基。增殖效果如表5所示。

表5 睡莲愈伤组织增殖培养基配方筛选

注：“-”不增殖；“++”增殖效果一般；“+++”增殖效果好。

从增殖效果及愈伤组织生长情况分析，愈伤组织在处理1培养基上不能增殖并逐渐褐化死亡；处理2上愈伤有增殖趋势，但速度较慢并且伴随着部分褐化衰竭；处理3上愈伤不增殖，愈伤部分褐化，部分保持原来大小形态，呈浅黄色；处理4上愈伤成团状增殖，增殖速度快；筛选出愈伤组织在MS + 1.0mg/L 6-BA + 2.0mg/L 2,4-D培养基上增殖效果最佳。

综上所述，本方法通过对睡莲成熟胚进行去种皮消毒，以及对睡莲愈伤组织的诱导与增殖，可以大量获得睡莲胚性愈伤组织，为睡莲再生体系、转基因研究建立基础。

上述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims (10)

1.一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）成熟胚预处理：取睡莲成熟胚置于流水下冲洗干净，再在多菌灵溶液中消毒后用蒸馏水冲洗至无多菌灵残余；

（2）诱导培养基准备：准备愈伤组织诱导培养基；

（3）成熟胚的消毒处理：

（a）将没有多菌灵残余的成熟胚装在离心管中，转移到超净工作台中；

（b）在超净工作台中对成熟胚进行消毒灭菌，先使用75%酒精消毒处理1±0.1min，消毒后用无菌水冲洗至无酒精残余，接着用10%次氯酸钠消毒10±0.5min，消毒后用无菌水冲洗至无次氯酸钠残余，处理后的成熟胚晾干；

（c）将成熟胚坚硬种皮剥掉，取出成熟胚置于离心管中；

（d）在超净工作台中，将去种皮成熟胚先用75%酒精消毒30±3s，消毒后用无菌水冲洗至无酒精残余，接着用3%次氯酸钠消毒3±0.3min，消毒后用无菌水冲洗至无次氯酸钠残余，将处理后的去种皮成熟胚晾干后接入愈伤组织诱导培养基中，置于26±1℃条件下黑暗培养20-30天；

（4）准备愈伤继代培养基，其成分同步骤（2），将成熟胚从诱导培养基中转接入继代培养基，直到形成颗粒明显的愈伤组织；

（5）准备愈伤增殖培养基；

（6）增殖培养：待步骤（4）的愈伤组织直径长到4~8mm时，将其转移至愈伤增殖培养基中去，继续黑暗培养，从而获得大量胚性愈伤组织；

其中，所述睡莲为耐寒睡莲。

2.如权利要求1所述的一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，选择饱满健康的睡莲成熟胚，将流水冲洗后的睡莲成熟胚放在10g/L多菌灵溶液中常温涡旋振荡消毒20±5min，用蒸馏水冲洗至多菌灵无残余。

3.如权利要求1或2所述的一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，愈伤组织诱导培养基经配制得到，所述愈伤组织诱导培养基成分为：1/2MS+ 1.5~2.5 mg/L 2,4-D + 0.2~0.5 mg/L TDZ + 50g/L蔗糖 + 8g/L琼脂。

4.如权利要求3所述的一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，愈伤组织诱导培养基配制时，称取1/2MS培养基、琼脂及蔗糖于容器中，加入1L蒸馏水加热溶解，再加入生长素2,4-D 、细胞分裂素TDZ，调节pH为5.8±0.1，121℃灭菌20min。

5.如权利要求1或2所述的一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，愈伤增殖培养基经配制得到，所述愈伤增殖培养基配方为MS + 2.0mg/L2,4-D + 1.0 mg/L 6-BA + 30g/L蔗糖+ 6g/L琼脂。

6.如权利要求5所述的一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，愈伤增殖培养基配制时，称取MS培养基、琼脂及蔗糖于容器中，加入1L蒸馏水加热溶解，再加入生长素、细胞分裂素6-BA，调节pH为5.8±0.1，121℃灭菌20min。

7.如权利要求1、2、4或6任一所述的一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述步骤（6）中，当颗粒明显的愈伤组织直径长至6mm时，切去成熟胚只留愈伤组织，并将其转接到愈伤增殖培养基中；每隔25天更换一次培养基，获得胚性愈伤组织。

8.如权利要求1所述的一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养和愈伤增殖培养全过程均置于黑暗条件下，其培养环境温度控制在26℃。

9.如权利要求1所述的一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述步骤（b）中，先使用75%的酒精处理1min，无菌水冲洗至无酒精残余，接着用10%的次氯酸钠溶液处理10min，无菌水冲洗至无次氯酸钠残余，将处理后的成熟胚放在经高温灭菌烘干后的滤纸上晾干。

10.如权利要求1或9所述的一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述步骤（d）中，在超净工作台中用75%酒精处理去种皮成熟胚30s，无菌水冲洗至无酒精残余，再用3%次氯酸钠处理3min，无菌水冲洗至无次氯酸钠残余，放在经高温灭菌烘干后的滤纸上晾干，接入愈伤组织诱导培养基中，置于26±1℃条件下黑暗培养20-30天。

Images