CN105359972A - 小麦成熟胚愈伤组织诱导培养及植株再生体系的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明以冬小麦栽培品种京411、Brock和春麦S10鉴-6、春麦津强5号四种小麦成熟胚为外植体，进行愈伤组织诱导、分化及再生体系优化，构建高效脱分化、再生植株以及获得再生籽粒系统：成熟胚采用纵切处理，愈伤组织诱导培养基为MS+2.0mg·L^-12,4-D+200mg·L^-1CH+100mg·L^-1MI+250mg·L^-1Glu，分化和植株再生培养基为MS+10mg·L^-1ZT+0.1mg·L^-1IAA，分化率为100%，成苗率为49.33%，生根培养基为1/2MS，生根后的试管苗经过炼苗、大田移栽及移栽后管理，可以收获再生籽粒。与已有京411再生体系的报道相比，本研究的植株再生率显著提高。本研究建立的京411成熟胚组织培养及再生体系为后续的转基因研究提供了良好的受体材料。

Description

小麦成熟胚愈伤组织诱导培养及植株再生体系的构建方法

国家自然科学基金（编号：31071671）和天津市科委青年基金项目（14JCQNJC14900）天津市科技支撑重点（11ZCKFNC00700）资助。

技术领域

本发明属于农业生物技术工程，涉及小麦成熟胚愈伤组织诱导、再分化、再生植株以及大田移栽、结籽一系列过程，在小麦分子育种及小麦基因转化方面有重要应用。

背景技术

小麦是我国主要粮食作物之一，在生产上，逆境胁迫和病虫害制约着小麦产量和质量，培育抗逆、抗病、优质的小麦品种是解决这一问题的有效途径之一。目前小麦育种的主要技术有基因工程育种、细胞工程育种、轮回选择育种等，利用基因工程育种能打破种间隔离，缩短育种年限，对小麦进行定向改良具有广阔的应用前景。从方法上来说，转基因技术可分为依赖和不依赖植物组培两类，依赖植物组织培养常见的转基因方法有基因枪法和农杆菌介导法。然而与烟草、大豆和水稻等其它作物相比，小麦组织培养再生率低，遗传转化难度大，这阻碍了转基因技术在小麦育种中的应用。优化小麦再生体系提高其植株再生率是小麦转基因研究的重要基础工作。

不同基因型小麦愈伤组织的再生能力差异很大，外植体的选择也对植株再生能力具有很大影响。目前小麦的幼胚（He等，1986）、成熟胚（刘芳等，2010）、花药（庄家骏等，1984；韩晓峰等，2010）、幼穗（Chin等，1977）等多种材料均已被选作外植体进行愈伤组织诱导和植株再生研究。由于来源于幼胚的愈伤组织再生能力较强，所以大多数学者以幼胚为外植体进行诱导、研究，但小麦幼胚的获得受季节限制、幼胚的消毒程度不易控制：消毒力度小，在后续的诱导培养中容易染菌；消毒力度大又会抑制愈伤组织生长，降低诱导率，与幼胚相比，成熟胚为外植体，具有易于消毒，取材方便，不受季节限制等优点，但再分化率较幼胚低。因此本发明以成熟胚为外植体，在种子消毒、成熟胚处理、激素浓度、诱导、分化、生根培养基的组成等进行优化，以期获得高频再生率的成熟胚愈伤组织诱导及植株再生体系，为小麦遗传转化提供重要的基础性材料。

发明内容

本发明公开了一种通过小麦京411成熟胚为外植体，构建愈伤组织诱导、植株再生及获得再生籽粒体系，为小麦遗传转化提供重要的基础性材料。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种小麦成熟胚愈伤组织诱导培养及植株再生体系的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）植物材料：选取色泽、大小均匀的冬小麦栽培品种，70%(w/w)酒精处理5min，无菌水冲洗2-3次，用50%(w/w)次氯酸钠消毒30min，无菌水冲洗3次，4℃冷藏2h后取出再用无菌水冲洗一次；所述的小麦栽培品种指的是：京411、Brock、春麦S10鉴-6、春麦津强5号；

（2）诱导和再生培养基的筛选：通过对6个诱导培养基、8个分化培养基的筛选，获得成熟胚从脱分化到再分化以及形成再生苗的系统为：愈伤组织诱导培养基为MS+2.0mg·L^-12,4-D+200mg·L^-1CH+100mg·L^-1MI+250mg·L^-1Glu，分化和植株再生培养基为MS+10mg·L^-1ZT+0.1mg·L^-1IAA，生根培养基为1/2MS；以上所有培养基均添加30g·L^-1蔗糖，琼脂粉8.5g·L^-1，PH5.8，在121℃下经1.1kg/cm²高压湿热灭菌20min；

（3）成熟胚的处理和诱导：取步骤（1）中消毒并低温处理好的种子，不去掉胚乳，将胚纵向全切但胚乳不完全切开，置于诱导培养基，直径6cm的培养皿，平均每皿接种20个，25℃暗培养，在培养皿上标明品种、培养基、日期和接种外植体数，培养10d后统计出愈率，挑选胚性愈伤组织继代，每周继代一次，继代四次后转入分化培养基进行光照培养，光强2000Lux，每天光照16h，培养温度为25℃，每15d继代一次，30d后统计愈伤组织分化率及出苗率，待分化苗长至3-4cm时接入生根培养基进行生根培养，30d后统计植株生根率；

（4）组培苗的管理：

待试管苗的根长4-5cm，生长一个月后将其炼苗培养，炼苗营养土为经高压蒸汽灭菌后的泥炭土、蛭石和珍珠岩，其泥炭土：蛭石：珍珠岩的质量比为6:3:1，炼苗培养2周后将苗移栽至田间，定期管理，直至植株成熟收获；

愈伤组织继代4次后转移到分化培养基上进行再分化，大部分愈伤组织在一周后开始分化，长出绿点，15天后开始出现植株幼苗，25天后幼苗长至3-4cm高时，接入1/2MS生根培养基，生根培养30天后移栽炼苗，田间炼苗2周后植株移栽至田间，用一薄层芦苇草覆盖田间麦苗，翌年3月初组培苗正常返青，4月可发现植株分蘖，植株数量明显增多，茎干粗壮，5月初植株开始抽穗，待麦穗成熟后收割，平均每颗穗约收51粒种子。

本发明进一步公开了小麦成熟胚愈伤组织诱导培养及植株再生体系的构建方法在提高小麦遗传转化率方面的应用。特别是在提高成熟胚再生出苗率方面的应用，所述的成熟胚指的是：栽培小麦品种京411的成熟胚。

本发明以冬小麦栽培品种京411、Brock和春麦S10鉴-6、春麦津强5号四种不同基因型小麦成熟胚为外植体，进行愈伤组织诱导培养基的筛选，获得出愈率较高培养基MS+2.0mg·L^-12,4-D+200mg·L^-1CH+100mg·L^-1MI+250mg·L^-1Glu。小麦京411在所述诱导培养基中获得最高诱导率，为95.38%，因此选取京411进行再分化、植株再生体系进一步优化，其分化率和再生成苗率最高的培养基为MS+10mg·L^-1ZT+0.1mg·L^-1IAA，分化率为100%，成苗率为49.33%。

本发明更加详细的制备方法如下：

1材料与方法

1.1植物材料

栽培小麦（TriticumaestivumL.）京411为农艺性状优良的华北地区当家品种，易感白粉病；抗白粉病栽培小麦Brock；春麦S10鉴-6为强抗白粉病品种，春麦津强5号为易感白粉病品种。上述小麦品种现均种植于天津师范大学生物科技园。

培养基

表1诱导、分化、生根培养基的代号及成分

诱导培养基：分别以MS和NB为基本培养基并添加蔗糖、琼脂、营养物质和激素。

分化培养基：以MS培养基为基本培养基，添加蔗糖、琼脂，并根据添加激素与否及激素配比不同构成8种分化培养基。

生根培养基：以1/2MS培养基为基本培养基，添加蔗糖和琼脂。

以上所有培养基均添加30g·L^-1蔗糖，琼脂粉8.5g·L^-1，PH5.8，在121℃下经1.1kg/cm²高压湿热灭菌20min。

方法

1.3.1种子的处理

选取色泽、大小均匀的小麦种子，70%酒精处理5min，无菌水冲洗2-3次，用50%次氯酸钠消毒30min，无菌水冲洗3次，4℃冷藏2h后取出再用无菌水冲洗一次。

成熟胚的诱导

取有胚乳支撑的成熟胚，将其纵全切（沿胚轴完全切开至种脐），置于诱导培养基，（直径6cm的培养皿，平均每皿接种20个）25℃暗培养，在培养皿上标明品种、培养基、日期和接种外植体数，培养10d后统计出愈率。挑选胚性愈伤组织继代，每周继代一次，继代四次后转入分化培养基进行光照培养，光强2000Lux，每天光照16h，培养温度为25℃，每15d继代一次，30d后统计愈伤组织分化率及出苗率。待分化苗长至3-4cm时接入生根培养基进行生根培养，30d后统计植株生根率。

组培苗的管理

待试管苗的根生长一个月后（根长约4-5cm）将其炼苗培养，炼苗营养土为经高压蒸汽灭菌后的泥炭土、蛭石和珍珠岩，其比例为6:3:1。炼苗培养2周后将苗移栽至田间，定期管理，直至植株成熟收获。

数据处理与分析

出愈率=（出愈外植体数÷接种外植体数）×100%

分化率=（分化出绿点的愈伤数÷接种愈伤数）×100%

成苗率=（分化出绿芽的愈伤数÷接种愈伤数）×100%

生根率=（生根成苗的愈伤组织块数÷接种的愈伤组织块数）×100%

所有统计分析应用SPSSStatistics17.0软件完成，成熟胚的脱分化率比较试验中，每个处理设置3个重复，数据分析采用t检验；愈伤组织分化培养试验设置3个重复，数据分析采用单因素S-N-K检验法。

所得结果

2.1基因型和诱导培养基对小麦成熟胚出愈率的影响

将4个品种的小麦接种在6种不同的诱导培养基中。两个冬小麦品种京411和Brock在接种第3天时，就开始有愈伤组织形成，但两个春麦品种春麦S10鉴-6和春麦津强5号接种6天才诱导出愈伤组织。由于冬麦和春麦材料出愈的时间不同，我们连续观察了诱导15天的出愈情况，发现冬麦在诱导培养基上诱导7天时，愈伤组织长势良好，可以满足继代培养要求；而春麦需要10天的诱导才能切下继代培养，因此在诱导培养第10天统计各培养基的愈伤组织出愈率并评定愈伤组织质量。

统计结果发现，与其它3个品种相比，在本实验设计的6种诱导培养基中，小麦京411成熟胚的平均出愈率最高，且在MS1培养基上的出愈率高达95.38%；Brock成熟胚在各培养基中的平均诱导率居中，也在MS1中的诱导率最高，达到了70.06%；春麦S10鉴-6成熟胚在各诱导培养基中的平均出愈率仅次于Brock，其在NB2中的出愈率最高，达到了61.29%；春麦津强5号成熟胚在各诱导培养基中的平均出愈率最低，仅为27.21%，其在NB2培养基中的出愈率最高，为34.34%。说明MS1培养基适用于冬麦品种京411和Brock，NB2培养基适用于春麦品种春麦S10鉴-6和春麦津强5号。结果还表明，本实验设计的这6种培养基中，MS1培养基诱导愈伤的平均出愈率最高（表2），其次是NB2培养基。

表2不同品种的小麦成熟胚在不同培养基上的出愈率结果（%）

注：a代表平均出愈率最高的品种,b代表平均诱导率最高的培养基，*平均最高出愈率

综上所述，成熟胚基因型和培养基种类对出愈率均是重要影响因素。由于四个品种中京411的平均出愈率最高且在MS1培养基上愈伤组织的诱导率达到了95.38%，所以选定MS1培养基作为京411的诱导培养基并对京411愈伤组织进行再生培养研究。

成熟胚的不同处理方式对其脱分化及形成愈伤组织状态的影响

本实验以京411成熟胚（有胚乳支持）为材料，比较纵全切(沿胚轴完全切开至种脐)和不切这两种处理方式对其脱分化及形成愈伤组织状态的影响。两种方式各接种了约300颗种子于MS1培养基中，结果发现，纵全切胚的出愈效果较好，愈伤组织块大、干燥、呈淡黄色，出愈率达到95.38%。未切的成熟胚形成胚芽较多，有较多的愈伤组织因为长芽而呈空苞状，愈伤组织逐渐变小，并且长芽，出愈率仅为64.12%。说明破坏胚的完整性抑制了其萌发，从而将更多的营养用于愈伤组织的形成，提高了出愈率和愈伤组织的质量。这两种处理方式脱分化率差异显著，纵全切出愈效果较好，因此本实验主要采用此方式处理具胚乳支撑的成熟胚。

不同浓度2,4-D对小麦成熟胚愈伤组织诱导的影响

为筛选出最适宜京411成熟胚诱导愈伤组织的激素浓度，试分析了不同浓度的2,4-D对愈伤组织出愈率及质量的影响。诱导愈伤组织培养基（MS1）2,4-D浓度为0.5、1.0、2.0、4.0mg·L^-1四个浓度。将京411成熟胚接种到这四个浓度培养基中，诱导培养7天，每个浓度接种100个外植体，重复3次。统计分析结果（见表3）表明，诱愈培养基的2,4-D浓度为2.0mg·L^-1时，对京411愈伤组织出愈率和愈伤组织质量有极显著影响。在诱愈培养基2,4-D浓度为2mg·L^-1时，愈伤组织出愈率最高达到95.38%，愈伤组织质量较好，呈颗粒状。2,4-D浓度为4mg·L^-1时出愈率仅为78.67%，并且诱导出的愈伤组织大多为水浸状，乳白色呈松散状态，甚至停止生长（图3）。小麦成熟胚诱愈培养基2,4-D的浓度以2mg·L^-1为宜，这与王常云等对小麦幼胚的研究结果类似。因而，后续诱导过程中诱愈培养基2,4-D浓度均采用2mg·L^-1。

表3不同浓度2,4-D对小麦京411成熟胚愈伤组织诱导率的影响

注：表中**表示小麦京411在不同2,4-D浓度的诱导培养基上出愈率差异级显著(P<0.01).

2.4不同比例的KT、ZT和IAA对小麦成熟胚愈伤组织分化率及生根率的影响

将长势良好的愈伤组织继代培养4次后转移到不同的分化培养基上进行再分化。通过统计和观察，我们发现，不同激素配比均可诱导小麦京411成熟胚愈伤组织的分化，且分化率差异不明显，但出苗率差异较大（表4）。以MS为基本培养基，添加不同配比的激素KT与IAA，愈伤组织的分化率和出苗率在10mg·L^-1KT+0.1mg·L^-1IAA的激素配比下最高，达到了96.67%和23.33%。

以MS为基本培养基添加激素ZT与IAA：当添加10mg·L^-1ZT+0.1mg·L^-1IAA时，愈伤组织的分化率和出苗率为100%和49.33%，与添加10mg·L^-1KT+0.1mg·L^-1IAA的激素配比相比，愈伤组织的出苗率提高一倍多，而0mg·L^-1ZT/KT+0mg·L^-1IAA+MS基本培养基的分化率和出苗率仅为76.76%和15.85%，说明激素种类和配比对出苗的作用较大。

表4不同激素配比下对小麦京411分化率、出苗率及生根率的影响（%）

注：表中**表示小麦京411在不同分化培养基上成苗率差异极显著(P<0.01).

综上所述，小麦成熟胚诱导的愈伤组织在MS+10mg·L^-1ZT+0.1mg·L^-1IAA的培养基上，分化率、出苗率和生根率均最高（图4），因此，F7培养基(MS+10mg·L^-1ZT+0.1mg·L^-1IAA)最适合京411愈伤组织再生。

组培苗的炼苗、移栽及田间管理

愈伤组织继代4次后转移到分化培养基上进行再分化，大部分愈伤组织在一周后开始分化，长出绿点，15天后开始出现植株幼苗（图5-a），期间持续统计各培养基中愈伤组织的分化率及出苗率。25天后，幼苗长至3-4cm高时(图5-b)，接入1/2MS生根培养基(图5-c)，生根培养30天后移栽炼苗（图5-d、e），田间炼苗2周后植株叶片开始变壮，观察其根的情况（图5-f），发现根明显比炼苗前粗壮，且长，数目增多。将炼苗后的植株移栽至田间（图5-g）。为保证组培苗安全过冬，用一薄层芦苇草覆盖田间麦苗，翌年3月初组培苗正常返青，4月可发现植株分蘖，植株数量明显增多，茎干粗壮（图5-h），5月初植株开始抽穗（图5-i），待麦穗成熟后收割（图5-j），平均每颗穗约收51粒种子(图5-k)。

本发明与已有培养体系相比的优点和有益效果在于：

成熟胚为外植体诱导愈伤组织过程中遇到的主要问题是再生成苗率低下，从目前的研究结果看，成熟胚诱导的愈伤组织再生植株效率总体在20%左右，仅张东武（2011）在小麦西农928中获得了77.6%的高频再生植株；而在小麦京411中，叶兴国等（1996）以京411花药为材料进行再生研究，发现与其它材料相比，京411的花药诱导愈伤组织较难，或很难再生植株；后猛等（2008）利用京411成熟胚诱导愈伤组织其出苗率仅为7.25%，远远不能达到遗传转化的需求。

栽培小麦京411是华北地区广泛种植的小麦优良品种，但对白粉菌敏感，建立京411成熟胚再生体系，将对该品种进行基因转化、抗病基因的聚集以及品种改良有重要意义。本发明对京411、Brock、春麦S10鉴-6和春麦津强5号共4个不同遗传背景的小麦品种的再生体系进行研究。设计了6种诱导培养基，并用这6种培养基分别诱导培养4个小麦品种，发现基因型和诱导培养基是小麦成熟胚出愈率的重要影响因素。本发明构建的诱导培养体系，以京411成熟胚为外植体，用MS1培养基诱导愈伤组织、用添加10mg·L^-1ZT+0.1mg·L^-1IAA的MS培养基分化再生，最终使京411成熟胚再生出苗率高达49.33%，比后猛等（2008）利用京411成熟胚再生出苗率（7.25%）高出近7倍。

张东武等（2011）用纵半切、纵全切、横切、刮碎的方式对小偃216成熟胚进行脱分化培养，发现用纵半切全胚接种，几乎完全抑制了胚萌发的现象，形成的愈伤组织状态最佳，优于纵全切胚；林国梁等（2012）还对胚完全刮碎、胚乳支撑型、完整胚三种外植体进行了诱导培养探讨。本实验结合前人的研究，但因小麦成熟胚较小，很难掌握纵半切的程度，因此采用纵全切和不切两种方式处理具胚乳支撑的成熟胚，并进行脱分化培养，结果发现纵全切与不切的脱分化频率有显著差异，纵全切的脱分化率（95.38%）高于不切（64.12%），且愈伤组织质量也有明显差异，前者诱导的愈伤组织块较大，颗粒明显，胚芽生成较少，而后者愈伤组织块较小，颗粒不明显，胚芽生成较多。这表明纵全切处理具胚乳支撑的成熟胚有效地抑制了胚芽的分化，更多的营养供给愈伤组织，更有利于愈伤组织的形成，从而提高脱分化率。

李丕军等（2005）在用银x新杨的叶外植体材料研究时，比较了BA、ZT、KT、TDZ等激素对其再生的影响时，发现这四种激素的作用效果为TDZ>ZT>BA>KT。

本发明用含相同浓度的ZT、KT分化培养基对小麦京411成熟胚愈伤组织进行再生培养，发现在分别添加10mg·L^-1ZT+0.1mg·L^-1IAA和10mg·L^-1KT+0.1mg·L^-1IAA的培养基中，京411成熟胚在前者的出苗率为49.33%，是后者的2倍多，再生苗的生根率也高于后者，进一步证明ZT诱导愈伤组织分化成苗的作用优于KT。

附图说明：

图1为四个不同品种的小麦成熟胚在MS1培养基上的出愈情况；其中：a-d依次代表小麦品种：京411、Brock、春麦S10鉴-6、春麦津强5号；

图2为小麦京411成熟胚不切与纵全切脱分化率结果；

图3为小麦京411成熟胚在不同浓度2,4-D的MS1中诱导的愈伤组织质量比较；

图4为京411的愈伤组织在F6（a）、F7（b）、F（c）8培养基分化出苗情况

注：F6、F7、F8分别为添加10mg·L^-1KT+0.1mg·L^-1IAA、10mg·L^-1ZT+0.1mg·L^-1IAA和0mg·L^-1KT/ZT+0mg·L^-1IAA的分化培养基；

图5为小麦京411愈伤组织分化再生成苗（a、b），再生苗的生根培养（c、d），炼苗培养（e、f），移栽（g）至成熟（h-k）过程。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明行进一步描述，但本发明的保护范围不仅限于此。本发明所用到的冬小麦栽培品种京411、Brock和春麦S10鉴-6、春麦津强5号均有市售。实验中所用到的各种试剂均有市售。

实施例1

一种小麦成熟胚愈伤组织诱导培养及植株再生体系的构建方法，按如下的步骤进行：

（1）植物材料：选取色泽、大小均匀的冬小麦栽培品种京411，70%(w/w)酒精处理5min，无菌水冲洗2次，用50%(w/w)次氯酸钠消毒30min，无菌水冲洗3次，4℃冷藏2h后取出再用无菌水冲洗一次；所述的冬小麦栽培品种指的是：京411；

（2）诱导和再生培养基的筛选：通过对6个诱导培养基、8个分化培养基的筛选，获得成熟胚从脱分化到再分化以及形成再生苗的系统为：愈伤组织诱导培养基为MS+2.0mg·L^-12,4-D+200mg·L^-1CH+100mg·L^-1MI+250mg·L^-1Glu，

分化和植株再生培养基为MS+10mg·L^-1ZT+0.1mg·L^-1IAA，

生根培养基为1/2MS；

以上所有培养基均添加30g·L^-1蔗糖，琼脂粉8.5g·L^-1，PH5.8，在121℃下经1.1kg/cm²高压湿热灭菌20min；

（3）成熟胚的处理和诱导：取步骤（1）中消毒并低温处理好的种子，不去掉胚乳，将胚纵向全切但胚乳不完全切开，置于诱导培养基，直径6cm的培养皿，平均每皿接种20个，25℃暗培养，在培养皿上标明品种、培养基、日期和接种外植体数，培养10d后统计出愈率，挑选胚性愈伤组织继代，每周继代一次，继代四次后转入分化培养基进行光照培养，光强2000Lux，每天光照16h，培养温度为25℃，每15d继代一次，30d后统计愈伤组织分化率及出苗率，待分化苗长至3cm时接入生根培养基进行生根培养，30d后统计植株生根率；

（4）组培苗的管理：

待试管苗的根长4cm，生长一个月后将其炼苗培养，炼苗营养土为经高压蒸汽灭菌后的泥炭土、蛭石和珍珠岩，其泥炭土：蛭石：珍珠岩的质量比为6:3:1，炼苗培养2周后将苗移栽至田间，定期管理，直至植株成熟收获；

愈伤组织继代4次后转移到分化培养基上进行再分化，大部分愈伤组织在一周后开始分化，长出绿点，15天后开始出现植株幼苗，25天后幼苗长至3-4cm高时，接入1/2MS生根培养基，生根培养30天后移栽炼苗，田间炼苗2周后植株移栽至田间，用一薄层芦苇草覆盖田间麦苗，翌年3月初组培苗正常返青，4月可发现植株分蘖，植株数量明显增多，茎干粗壮，5月初植株开始抽穗，待麦穗成熟后收割，平均每颗穗约收51粒种子。

实施例2

一种小麦成熟胚愈伤组织诱导培养及植株再生体系的构建方法，按如下的步骤进行：

（1）植物材料：选取色泽、大小均匀的冬小麦栽培品种京411，70%(w/w)酒精处理5min，无菌水冲洗2次，用50%(w/w)次氯酸钠消毒30min，无菌水冲洗3次，4℃冷藏2h后取出再用无菌水冲洗一次；所述的冬小麦栽培品种指的是：京411；

（2）诱导和再生培养基的筛选：通过对6个诱导培养基、8个分化培养基的筛选，获得成熟胚从脱分化到再分化以及形成再生苗的系统为：愈伤组织诱导培养基为MS+2.0mg·L^-12,4-D+200mg·L^-1CH+100mg·L^-1MI+250mg·L^-1Glu，

分化和植株再生培养基为MS+10mg·L^-1KT+0.1mg·L^-1IAA，

生根培养基为1/2MS；

以上所有培养基均添加30g·L^-1蔗糖，琼脂粉8.5g·L^-1，PH5.8，在121℃下经1.1kg/cm²高压湿热灭菌20min；

（3）成熟胚的处理和诱导：取步骤（1）中消毒并低温处理好的种子，不去掉胚乳，将胚纵向全切但胚乳不完全切开，置于诱导培养基，直径6cm的培养皿，平均每皿接种20个，25℃暗培养，在培养皿上标明品种、培养基、日期和接种外植体数，培养10d后统计出愈率，挑选胚性愈伤组织继代，每周继代一次，继代四次后转入分化培养基进行光照培养，光强2000Lux，每天光照16h，培养温度为25℃，每15d继代一次，30d后统计愈伤组织分化率及出苗率，待分化苗长至3cm时接入生根培养基进行生根培养，30d后统计植株生根率；

（4）组培苗的管理：

待试管苗的根长4cm，生长一个月后将其炼苗培养，炼苗营养土为经高压蒸汽灭菌后的泥炭土、蛭石和珍珠岩，其泥炭土：蛭石：珍珠岩的质量比为6:3:1，炼苗培养2周后将苗移栽至田间，定期管理，直至植株成熟收获；

愈伤组织继代4次后转移到分化培养基上进行再分化，大部分愈伤组织在一周后开始分化，长出绿点，15天后开始出现植株幼苗，25天后幼苗长至3-4cm高时，接入1/2MS生根培养基，生根培养30天后移栽炼苗，田间炼苗2周后植株移栽至田间，用一薄层芦苇草覆盖田间麦苗，翌年3月初组培苗正常返青，4月可发现植株分蘖，植株数量明显增多，茎干粗壮，5月初植株开始抽穗，待麦穗成熟后收割，平均每颗穗约收51粒种子。

Claims (3)

1.小麦成熟胚愈伤组织诱导培养及植株再生体系的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）植物材料：选取色泽、大小均匀的冬小麦栽培品种，70%(w/w)酒精处理5min，无菌水冲洗2-3次，用50%(w/w)次氯酸钠消毒30min，无菌水冲洗3次，4℃冷藏2h后取出再用无菌水冲洗一次；所述的小麦栽培品种指的是：京411；

（2）诱导和再生培养基的筛选：通过对6个诱导培养基、8个分化培养基的筛选，获得成熟胚从脱分化到再分化以及形成再生苗的系统为：愈伤组织诱导培养基为MS+2.0mg·L^-12,4-D+200mg·L^-1CH+100mg·L^-1MI+250mg·L^-1Glu，分化和植株再生培养基为MS+10mg·L^-1ZT+0.1mg·L^-1IAA，生根培养基为1/2MS；以上所有培养基均添加30g·L^-1蔗糖，琼脂粉8.5g·L^-1，PH5.8，在121℃下经1.1kg/cm²高压湿热灭菌20min；

（3）成熟胚的处理和诱导：取步骤（1）中消毒并低温处理好的种子，不去掉胚乳，将胚纵向全切但胚乳不完全切开，置于诱导培养基，直径6cm的培养皿，平均每皿接种20个，25℃暗培养，在培养皿上标明品种、培养基、日期和接种外植体数，培养10d后统计出愈率，挑选胚性愈伤组织继代，每周继代一次，继代四次后转入分化培养基进行光照培养，光强2000Lux，每天光照16h，培养温度为25℃，每15d继代一次，30d后统计愈伤组织分化率及出苗率，待分化苗长至3-4cm时接入生根培养基进行生根培养，30d后统计植株生根率；

（4）组培苗的管理：

待试管苗的根长4-5cm，生长一个月后将其炼苗培养，炼苗营养土为经高压蒸汽灭菌后的泥炭土、蛭石和珍珠岩，其泥炭土：蛭石：珍珠岩的质量比为6:3:1，炼苗培养2周后将苗移栽至田间，定期管理，直至植株成熟收获；

愈伤组织继代4次后转移到分化培养基上进行再分化，大部分愈伤组织在一周后开始分化，长出绿点，15天后开始出现植株幼苗，25天后幼苗长至3-4cm高时，接入1/2MS生根培养基，生根培养30天后移栽炼苗，田间炼苗2周后植株移栽至田间，用一薄层芦苇草覆盖田间麦苗，翌年3月初组培苗正常返青，4月可发现植株分蘖，植株数量明显增多，茎干粗壮，5月初植株开始抽穗，待麦穗成熟后收割，平均每颗穗约收51粒种子。

2.权利要求1所述小麦成熟胚愈伤组织诱导培养及植株再生体系的构建方法在提高小麦遗传转化率方面的应用。

3.权利要求1所述小麦成熟胚愈伤组织诱导培养及植株再生体系的构建方法在提高成熟胚再生出苗率方面的应用，所述的成熟胚指的是：栽培小麦品种京411的成熟胚。