CN105028212B - 藓竺竹高效再生体系的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种藓竺竹芽高效再生体系的建立方法，按下列步骤进行：1）芽愈伤组织的诱导培养；2）愈伤组织的增殖培养；3）愈伤组织的分化培养；4）试管苗的生根培养；5）再生植株的炼苗和移栽。本发明涉及一种以草本竹的芽为外植体的植物组培方法，是对以草本竹芽为外植体经愈伤组织诱导建立再生体系的有益尝试，采用本方法能够使外植体高效诱导出愈伤组织，建立高效的再生体系，扩大了竹子研究领域，也为该竹子遗传转化研究奠定了良好的基础，本方法简单易行、利于推广，实施条件宽松，效果显著。

Description

藓竺竹高效再生体系的建立方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体是以藓竺竹的芽为外植体，经过愈伤组织诱导、增殖、分化、试管苗生根、移栽，实现高效再生，为其遗传转化研究奠定基础。

背景技术

藓竺竹（Mniochloa abersend）属于禾本科（Poaceae）竹亚科（Bambusoideae）莪利竹族(Olyreae)藓竺属(Mniochloa)，属于草本竹类。世界上竹子约有88个属1400余种。其中草本竹类有28属，180余种。绝大多数草本竹属种分布在拉丁美洲。Mniochloa因其与提灯藓属(Mnium)很相似，1908年，Chase对其命名。竹类植物的组织培养起步于1968年，到现在已经先后对刚竹属（Phyllostachys）、牡竹属（Dendrocalamus）、箬竹属（Indocalamus）等20余属80 多个竹种开展了组培研究，而且应用于生产实践中。

目前关于竹子的再生体系及遗传转化体系的建立大都集中在木本丛生竹中，而且多选用种胚做为外植体，但木本竹类由于生长周期长，开花结实困难且难以预测，种子难以获得，其稳定的再生体系很难建立。本专利以草本竹为实验材料具有创新性，以芽为外植体，取材不受季节等限制，更具有可行性。另外，目前已经从竹子上克隆了很多功能基因，但这些功能基因的验证都是转入水稻或拟南芥中，与竹子亲缘关系较远，一些木本竹类因其生长周期长，开花时间难以预测，很难观察后代表型。草本竹也属于竹亚科，与木本竹子亲缘关系更近，同时藓竺竹是多年生植物，具有每年开花结实的现象，其遗传转化体系的建立为竹子功能基因的验证开辟了新的途径。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明利用藓竺竹的芽为外植体，经过愈伤组织诱导、增殖、分化、试管苗生根，移栽，建立其再生体系的方法。

本发明通过以下技术方案得以实现：

所述的藓竺竹高效再生体系的建立方法，其特征在于按下列步骤进行：

1）愈伤组织诱导培养

从温室中选生长健壮无病斑的藓竺竹植株中取芽为外植体，切下带芽的茎段1.5-2.5cm，自来水冲洗1-2h后，75%酒精浸泡30s，再用质量比浓度为1%的次氯酸钠溶液真空抽滤消毒15min，在超净工作台中用无菌水冲洗5-6次，最后在体式显微镜下剥掉叶鞘，切取带芽茎段0.4-0.6cm，每管一个芽接种于诱导培养基中：诱导基本培养基为MS(Murashige andSkoog)，添加的外源激素为2,4-D即2,4-二氯苯氧乙酸和NAA即萘乙酸，调pH为5.7；培养条件为：暗培养，25±2℃，诱导培养50±2d，愈伤组织形成；

2）愈伤组织增殖培养

取诱导的淡黄色致密愈伤组织接种于增殖培养中进行培养，增殖培养基本培养基为MS，添加浓度为0.1-1mg·L^-1的2,4-D，pH为5.7；培养条件为：暗培养，25±2℃，培养30±2d；

3）愈伤组织分化培养

将经过增殖培养的致密愈伤组织在分化培养中进行分化，分化基本培养基为MS，添加KT即激动素和NAA；pH为5.7；培养条件为：光培养，光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃；

4）分化苗生根培养

将愈伤组织分化培养出的丛生芽切割分离为单芽，选取长至1-2cm高的健壮芽接种于生根培养基中进行生根诱导，生根基本培养基为1/2 MS，添加浓度为0-0.5mg·L^-1的IBA即吲哚丁酸；pH为5.7；培养条件为：光培养，光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃；

5）再生植株的移栽

当试管苗高8-10cm，根长4-5cm且植株健壮时，将试管苗置于强度为20000lux的强光下炼苗一周，之后从试管中取出苗，用30-40℃的温水将根部的培养基清洗干净，移栽于混合培养基质中，将基质压实并进行单株套袋，一周后剪去塑料套袋两角，两周后脱去套袋，待长出新叶时移栽至温室，得到健壮的再生植株，四周左右后统计植株移栽成活率及生长状况。

所述的藓竺竹高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤1）中2,4-D浓度为1-5mg·L^-1，NAA浓度为1-2 mg·L^-1。

所述的藓竺竹高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤3）中KT的浓度为0.5-1mg·L^-1，NAA的浓度为0.5-1mg·L^-1。

所述的藓竺竹高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤5）中混合培养基质由泥炭：珍珠岩：蛭石=1:1:1混合而成。

本发明的有益效果是：采用本方法最高致密愈伤组织诱导率为73.08%；愈伤组织增殖倍数可高达8.0102倍，且增殖一年以后仍有100%的分化率；最高幼苗分化率为100%，且分化苗数量多，生长健壮；最高生根率为100%，且单芽所诱导产生根的数量较多，较健壮，移栽成活率高。本发明能够使外植体高效诱导出愈伤组织，建立高效的再生体系，为该竹子遗传转化研究奠定了良好的基础。该方法实施步骤简单易行，实施条件宽松，效果非常显著。

附图说明

图1 为芽诱导出愈伤组织的形态图；

图2-图3 为致密愈伤组织形态图；

图4 为粘性愈伤组织形态图；

图5 为愈伤组织变绿形态图；

图6 为愈伤组织分化出苗形态图；

图7 为藓竺竹试管苗生根形态图；

图8 为移栽成活后的藓竺竹植株形态图；

图9 为藓竺竹愈伤组织诱导阶段基本培养基的筛选图；

图10为藓竺竹愈伤组织诱导阶段2,4-D浓度的筛选图；

图11为藓竺竹愈伤组织诱导阶段NAA浓度的筛选图；

图12为藓竺竹愈伤组织诱导阶段BA浓度的筛选图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，并给出具体实施方式。

实施例

藓竺竹高效再生体系的建立方法，其特征在于按下列步骤进行：

1）愈伤组织诱导培养

从温室中选生长健壮无病斑的藓竺竹植株中取芽为外植体，切下带芽的茎段1.5-2.5cm，自来水冲洗1-2h后，75%酒精浸泡30s，再用质量比浓度为1%的次氯酸钠溶液真空抽滤消毒15min，在超净工作台中用无菌水冲洗5-6次，最后在体式显微镜下剥掉叶鞘，切取带芽茎段0.4-0.6cm，每管一个芽接种于诱导培养基中：诱导基本培养基为MS(Murashige andSkoog)，添加的外源激素为1-5mg·L^-12,4-D即2,4-二氯苯氧乙酸和1-2 mg·L^-1NAA即萘乙酸，调pH为5.75.7；培养条件为：暗培养，25±2℃，诱导培养50±2d，愈伤组织形成；

2）愈伤组织增殖培养

取诱导的淡黄色致密愈伤组织接种于增殖培养中进行培养，增殖培养基本培养基为MS，添加浓度为0.1-1mg·L^-1的2,4-D，pH为5.7；培养条件为：暗培养，25±2℃，培养30±2d；

3）愈伤组织分化培养

将经过增殖培养的致密愈伤组织在分化培养中进行分化，分化基本培养基为MS，添加KT即激动素和NAA；pH为5.7；培养条件为：光培养，光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃；

4）分化苗生根培养

将愈伤组织分化培养出的丛生芽切割分离为单芽，选取长至1-2cm高的健壮芽接种于生根培养基中进行生根诱导，生根基本培养基为1/2 MS，添加浓度为0-0.5mg·L^-1的IBA即吲哚丁酸；pH为5.7；培养条件为：光培养，光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃；

5）再生植株的移栽

当试管苗高8-10cm，根长4-5cm且植株健壮时，将试管苗置于强度为20000lux的强光下炼苗一周，之后从试管中取出苗，用30-40℃的温水将根部的培养基清洗干净，移栽于混合培养基质中，混合培养基质由泥炭：珍珠岩：蛭石=1:1:1混合而成，将基质压实并进行单株套袋，一周后剪去塑料套袋两角，两周后脱去套袋，待长出新叶时移栽至温室，得到健壮的再生植株，四周左右后统计植株移栽成活率及生长状况。

实验例

下面将与本发明相关的试验与附图进行介绍：

图1-图8，可以从附图以及结合各对应的说明了解其再生过程，不另作介绍。

图9为藓竺竹芽在以下五种不同基本培养基（MS、1/2 MS、WPM、N6、B5）中愈伤组织及致密良好愈伤组织诱导情况对比图(各种基本培养基配方详见：王蒂，植物组织培养，北京：中国农业出版社，2004)。将芽接种在培养基上后两周左右芽开始膨大，四周左右芽尖部位有愈伤组织出现，五十天后愈伤组织生长良好。从图中可看出，MS、1/2MS和WPM的诱导率差异不显著，分别为75.55%、77.78%、80%，但与N6、B5的诱导率(57.78%、53.33%)差异显著；但是MS诱导出的致密愈伤组织率（61.87%）显著高于WPM所诱导出的致密愈伤组织率（42.12%）和1/2MS所诱导出的致密愈伤组织率（48.48%）另外，WPM诱导出的愈伤组织多为淡绿色，透明水泡状。1/2MS诱导的愈伤组织较疏松，易水化，不利于增殖和分化。综上所述，最适宜藓竺竹芽尖愈伤组织诱导的基本培养基为MS培养基。

图10为藓竺竹芽接种到含有不同浓度2,4-D的培养基中诱导出的愈伤组织及致密良好愈伤组织情况对比图。诱导培养基中添加的2,4-D浓度分别为0、0.3、1、3、5、10 mg·L^-1。接种后两周左右芽基部开始膨大，四周左右芽基部有愈伤组织出现，五十天后芽周围愈伤组织生长良好。从图中可以看到，不添加2,4-D，没有愈伤组织产生，只产生芽。藓竺竹在较大的2,4-D浓度范围下，都可以诱导出愈伤组织。随着2,4-D浓度的增加，愈伤组织及致密愈伤组织诱导率逐渐提高。当2,4-D浓度为1 mg·L^-1时，愈伤组织诱导率为73.33%，在膨大的芽基部致密愈伤组织较小，约2-3mm。当2,4-D浓度为3mg·L^-1时，愈伤组织诱导率为82.22%，致密良好愈伤组织诱导率为64.74%，且愈伤组织直径达到5mm左右。随着2,4-D浓度的升高，愈伤组织诱导率下降，高浓度的2,4-D易造成外植体的褐化而使愈伤组织略带褐色。综上所述，最适宜藓竺竹愈伤组织诱导的2,4-D浓度为3mg·L^-1。

图11为藓竺竹芽接种到含有不同浓度NAA的培养基中诱导出的愈伤组织及致密良好愈伤组织情况对比图。诱导培养基中添加1mg·L^-1 2,4-D，添加的NAA浓度分别为0、1、2、4mg·L^-1。接种后两周左右芽基部开始膨大，四周左右芽周围愈伤组织明显，五十天后芽周围愈伤组织生长良好。从图中可以看出添加NAA对愈伤组织的诱导率没有显著变化。但是添加NAA后愈伤组织的形态有所变化，诱导出的愈伤组织淡黄色，较致密，表面同时有瘤状结构和芽状结构出现,增殖及分化能力较强。当NAA浓度为1mg·L^-1时，致密良好愈伤组织诱导率为73.08%。随着NAA浓度的升高，产生的致密愈伤组织率降低，同时产生深黄色或黄褐色，松散易碎的粘性愈伤组织，增殖和分化能力不高。综上所述，最适宜藓竺竹愈伤组织诱导的NAA浓度为1 mg·L^-1。

图12为藓竺竹芽接种到含有不同浓度6-BA即6-苄基腺嘌呤的培养基中诱导出的愈伤组织及致密良好愈伤组织情况对比图。诱导培养基中添加1mg·L^-1 2,4-D，1mg·L^-1NAA，添加的6-BA浓度分别为0、0.5、1、2mg·L^-1。在没有添加6-BA的培养基中愈伤组织诱导率以及致密愈伤组织诱导率都较高，与添加之后的诱导情况有显著差异。随着6-BA浓度的增加，愈伤组织诱导率和致密愈伤组织诱导率都下降，同时，在添加6-BA的培养基中易出现外植体褐化，愈伤组织褐化，不利于愈伤组织诱导及增殖。综上所述，6-BA的添加不利于藓竺竹的愈伤组织诱导。

表1不同浓度2,4-D对愈伤组织增殖的影响

注 a：多重比较采用 Duncan 法，同一栏中不同字母表示存在显著性差异(p＜0.05)，下同。

表1为将重量一致的黄色或淡黄色致密愈伤组织接种到含有不同2,4-D浓度的增殖培养基中，一个月后愈伤组织增殖倍数统计情况表。从表中可以看出，当2,4-D浓度为0.1mg·L^-1时增殖倍数高达8.0102倍，同时愈伤组织没有褐化，但长期处于低浓度2,4-D下会导致愈伤组织分化。随着2,4-D浓度升高，会出现愈伤组织的褐化，但仍具有较好的愈伤组织增殖能力。所以可根据愈伤组织生长状态在0.1-1mg·L^-12,4-D浓度范围内进行调整。

表2不同激素组合对藓竺竹愈伤组织分化的影响

表2 中增殖系数代表平均值±标准误；多重比较采用Duncan 法，数值后有相同字母表示差异不显著(P <0.05)，下同。X 为各因素在同一水平实验指标( 增殖系数) 的平均数，R= X_max-X_min。

表2是藓竺竹愈伤组织分化情况的三因素三水平正交实验表。选取长势一致的直径约5-8mm的淡黄色致密愈伤组织接种到不同激素组合的分化培养基中。表中可以看出致密愈伤组织分化能力较强，均为100%，另外愈伤组织在分化过程中还有不同程度的增殖现象。对芽长大于1cm的芽数进行统计，从表中可以看出当在MS培养基中添加1 mg·L^-1KT、1mg·L^-1 NAA或0.5 mg·L^-1 KT、0.5mg·L^-1 NAA时，愈伤组织分化后苗生长状态良好，芽伸长效果好，与其他处理差异显著。在添加有1 mg·L^-1 KT、1 mg·L^-1 NAA的培养基上，分化苗呈现绿色，生长效果更好。综上所述，适宜藓竺竹的分化培养基为MS+1 mg·L^-1 KT+1 mg·L^-1 NAA。

表3是不同浓度IBA诱导试管苗生根情况表。将分化出的丛生芽球分离切割成大于1cm的单芽，选取健壮的芽进行生根诱导。将其分别接种在含有不同IBA浓度的生根培养基中。第三天培养基中的单芽的根原基已突起，变黑，根开始长出。另外还伴随有节上生根的现象，这也导致了其较高的生根率。表3是不同浓度IBA对试管苗诱导生根的影响，如表中所示，IBA浓度对其生根率没有显著影响，但对其生根状况影响较大。当IBA浓度为1、2、4mg·L^-1时，虽然生根数目较多，但所诱导出的根较密集且短粗，不利于后续生根苗的移栽。当IBA浓度为0或0.5mg·L^-1时，根较长，较粗壮，生根效果较好。综上所述，最适宜藓竺竹试管苗诱导生根的培养基为1/2 MS + 0.5 mg·L^-1 IBA。

表3不同浓度IBA诱导试管苗生根情况表

Claims (2)

1.藓竺竹高效再生体系的建立方法，其特征在于按下列步骤进行：

1）愈伤组织诱导培养

从温室中选生长健壮无病斑的藓竺竹植株中取芽为外植体，切下带芽的茎段1.5-2.5cm，自来水冲洗1-2h后，75%酒精浸泡30s，再用质量浓度比为1%的次氯酸钠溶液真空抽滤消毒15min，在超净工作台中用无菌水冲洗5-6次，最后在体式显微镜下剥掉叶鞘，切取带芽茎段0.4-0.6cm，每管一个芽接种于诱导培养基中：诱导基本培养基为MS，添加的外源激素为2,4-D即2,4-二氯苯氧乙酸和NAA即萘乙酸，pH为5.7；培养条件为：暗培养，25±2℃，诱导培养50±2d，愈伤组织形成；2,4-D浓度为1-5 mg·L^-1，NAA浓度为1-2 mg·L^-1；

2）愈伤组织增殖培养

取诱导的淡黄色致密愈伤组织接种于增殖培养基中进行培养，增殖培养基本培养基为MS，添加浓度为0.1-1mg·L^-1的2,4-D，pH为5.7；培养条件为：暗培养，25±2℃，培养30±2d；

3）愈伤组织分化培养

将经过增殖培养的致密愈伤组织在分化培养基中进行分化，分化基本培养基为MS，添加KT即激动素和NAA；pH为5.7；培养条件为：光培养，光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃；KT的浓度为0.5-1mg·L^-1，NAA的浓度为0.5-1mg·L^-1；

4）分化苗生根培养

将愈伤组织分化培养出的丛生芽切割分离为单芽，选取长至1-2cm高的健壮芽接种于生根培养基中进行生根诱导，生根基本培养基为1/2 MS，添加浓度为0-0.5mg·L^-1的IBA即吲哚丁酸；pH为5.7；培养条件为：光培养，光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃；

5）再生植株的移栽

当试管苗高8-10cm，根长4-5cm且植株健壮时，将试管苗置于强度为20000lux的强光下炼苗一周，之后从试管中取出苗，用30-40℃的温水将根部的培养基清洗干净，移栽于混合培养基质中，将基质压实并进行单株套袋，一周后剪去塑料套袋两角，两周后脱去套袋，待长出新叶时移栽至温室，得到健壮的再生植株，四周左右后统计植株移栽成活率及生长状况。

2.根据权利要求1所述的藓竺竹高效再生体系的建立方法，其特征在于步骤5）中混合培养基质由泥炭：珍珠岩：蛭石=1:1:1混合而成。