KR20100026836A

KR20100026836A - 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법

Info

Publication number: KR20100026836A
Application number: KR1020080085991A
Authority: KR
Inventors: 김용욱; 문흥규; 박소영
Original assignee: 대한민국(관리부서 : 산림청 국립산림과학원장)
Priority date: 2008-09-01
Filing date: 2008-09-01
Publication date: 2010-03-10
Also published as: KR101106953B1

Abstract

본 발명은 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 소나무의 번식방법에 있어서, 소나무의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도하고 증식하는 단계; 상기의 증식된 배발생조직으로부터 체세포배를 유도하는 단계; 상기의 체세포배를 발아시키고 식물체로 분화시키는 단계; 상기의 분화된 식물체의 환경순화를 실시하는 단계; 및 상기의 환경순화된 식물체를 포지 이식하는 단계를 포함하는 체세포배발생을 이용한 소나무의 번식방법에 관한 것이다.

소나무, 미숙종자, 배발생조직, 체세포배 발생

Description

체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법{Proliferation method of Pinus densiflora using somatic embryogenesis}

본 발명은 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 소나무의 번식방법에 있어서, 소나무의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도하고 증식하는 단계; 상기의 증식된 배발생조직으로부터 체세포배를 유도하는 단계; 상기의 체세포배를 발아시키고 식물체로 분화시키는 단계; 상기의 분화된 식물체의 환경순화를 실시하는 단계; 및 상기의 환경순화된 식물체를 포지 이식하는 단계를 포함하는 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법에 관한 것이다.

체세포배(일명 인공종자배라고도 함) 유도란 정자와 난세포의 수정으로 발생되는 일반 종자배와는 달리 수정 과정 없이 접합자배(zygotic embryo)의 형태와 기능이 유사한 체세포배를 기내에서 발생시키는 기술을 뜻한다.

이러한 체세포배 발생 기술을 이용하면 동일한 유전자형을 지닌 인공종자배 를 무한정으로 생산하는 것이 가능해져 원하는 임목을 단시간 내에 대량생산이 가능해져 궁극적으로는 임목 클론화를 이룰 수 있다. 또한 이 기술은 유전 형질전환 등에도 필수적으로 적용되는데 그것은 형질전환 후 이 기술을 이용하면 형질전환체로의 재분화가 매우 용이하기 때문이기도 하다.

임목에 관한 체세포배 발생의 경우 Citrus 및 date palm종의 주심조직을 이용한 것이 최초이며 1970년과 1980년대에 이 기술의 적용대상은 주로 활엽수종에 국한되어 왔다. 활엽수종의 경우 1년생 초본식물이나 작물에 비해서 체세포배 발생이 힘든 것으로 알려져 있으며 지금까지 30가계, 60종, 80속 이상에서 기초 연구실험 결과가 보고되고 있으나 사실상 대부분 실용적인 측면보다는 기초연구에 그치고 있는 실정이다.

한편, 침엽수종의 경우 해크만(Hakman) 등이 노르웨이 전나무(Norway spruce)의 미숙배로부터 처음으로 배발생조직을 보고한 이래 침엽수종의 체세포배 발생 기술은 상당히 발전되어 현재에는 실용화뿐만 아니라 특허권 획득을 위한 연구까지 활발히 진행되고 있다. 지금까지 연구된 침엽수종은 Abies속, Picea속, Pinus속 등에서 많은 연구가 이루어졌고 그중 Picea속 수종에서 가장 발달된 체세포배 발생 기술이 개발되어 산업화 수준까지 도달해 있는 상태다.

소나무류의 체세포배 발생 연구는 타 침엽수종에 비하면 그 기술개발 정도가 매우 뒤쳐져 있다. 이러한 요인들 중 가장 큰 이유는 타 침엽수종에 비해 배발생조직 유도의 어려움, 저조한 체세포배 유도율, 발아 및 식물체로의 재분화 등의 많은 기술적장애가 많은 것이 사실이다.

현재까지 우리나라 소나무를 대상으로 한 연구는 전 세계적으로 2편만이 보고되고 있으나 우리나라의 경우 소나무의 체세포배 연구는 전혀 이루어지지 않고 있다.

본 발명은 체세포배 발생을 이용하여 소나무의 번식방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 소나무의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도 및 증식한 후 상기 배발생조직으로부터 체세포배를 유도하고 이러한 체세포배 발생을 이용하여 소나무의 번식방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 소나무의 번식방법에 있어서, 소나무의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도하고 증식하는 단계; 상기의 증식된 배발생조직으로부터 체세포배를 유도하는 단계; 상기의 체세포배를 발아시키고 식물체로 분화시키는 단계; 상기의 분화된 식물체의 환경순화를 실시하는 단계; 및 상기의 환경순화된 식물체를 포지 이식하는 단계를 포함하는 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법을 이용하여 동일한 특성을 지니는 소나무를 얻을 수 있다.

본 발명에 의해 향후 솔잎혹파리 및 재선충에 강한 내충성 소나무 육성을 위한 유전형질전환 기술 제공 및 더 나아가 우수형질의 소나무의 대량증식을 통한 클 론 임업(clonal forestry)의 확립 및 임목품종화에 크게 기여할 수 있다.

본 발명은 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법을 나타낸다.

본 발명은 소나무의 번식방법에 있어서,

소나무의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도하고 증식하는 단계;

상기의 증식된 배발생조직으로부터 체세포배를 유도하는 단계;

상기의 체세포배를 발아시키고 식물체로 분화시키는 단계;

상기의 분화된 식물체의 환경순화를 실시하는 단계;

및 상기의 환경순화된 식물체를 포지 이식하는 단계를 포함하는 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법을 나타낸다.

상기에서 소나무의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도시 배지는 LM 배지를 기본으로 하고, 상기 LM 배지에 수크로오스(sucrose) 2∼4％, 겔라이트(gelrite) 0.1∼0.3％, L-글루타민(L-glutamine) 700∼1300mg/L, 2,4-디클로로페노시에세틱산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D) 1.0∼3.0mg/L, 벤질 아데닌 퓨린(benzyl adenine purine, BAP) 0.5∼1.5mg/L 포함한 것을 사용할 수 있다.

상기에서 무의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도시 배지는 LM 배지를 기본으로 하고, 상기 LM 배지에 수크로오스 3％, 겔라이트 0.2％, L-글루타민 1000mg/L, 2,4-디클로로페노시에세틱산(2,4-D) 2.0mg/L, 벤질 아데닌 퓨린(BAP) 1.0mg/L 포함한 것을 사용할 수 있다.

상기에서 소나무의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도시 배지는 pH가 5.0∼7.0인 것을 포함한 것을 사용할 수 있다.

상기에서 소나무의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도시 배지는 pH가 5.5∼6.5인 것을 포함한 것을 사용할 수 있다.

상기에서 소나무의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도시 배지는 pH가 5.7인 것을 포함한 것을 사용할 수 있다.

상기에서 소나무의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도 후 증식은 1/2LM 배지에 수크로오스(sucrose) 15∼25g/L, 겔라이트 0.3∼0.5％, L-글루타민 800∼1200mg/L, 2,4-디클로로페노시에세틱산(2,4-D) 1.0∼3.0mg/L, 벤질 아데닌 퓨린(BAP) 0.5∼1.5mg/L를 포함하는 배지에서 실시할 수 있다.

상기에서 소나무의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직 유도 후 증식은 1/2LM 배지에 수크로오스 15∼25g/L, 겔라이트 0.3∼0.5％, L-글루타민 800∼1200mg/L, 2,4-디클로로페노시에세틱산(2,4-D) 1.0∼3.0mg/L, 벤질 아데닌 퓨린(BAP) 0.5∼1.5mg/L를 포함하는 배지에 첨가하고 20∼25℃에서 6∼10주(week) 동안 암소(暗所)의 환경하에서 배양하여 실시할 수 있다.

상기에서 소나무의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도 후 증식은 1/2LM 배지에 수크로오스(sucrose) 20g/L, 겔라이트 0.4％, L-글루타민 1000mg/L, 2,4-디클로로페노시에세틱산(2,4-D) 2.0mg/L, 벤질 아데닌 퓨린(BAP) 1.0mg/L를 포함하는 배지에 첨가하고 20∼25℃에서 6∼10주(week) 동안 암소(暗所)의 환경하에서 배양하여 실시할 수 있다.

상기에서 배발생조직으로부터 체세포배를 유도시 증식한 배발생조직을 (1)1/2LM 배지에 겔라이트(gelrite) 0.8∼1.2％, 엡시식산(abscisic acid , ABA) 50∼250μM, 말토오스(maltose) 0.1∼0.3M을 첨가한 배지 또는 (2)1/2LM 배지에 겔라이트(gelrite) 0.8∼1.2％, 엡시식산(abscisic acid , ABA) 50∼250μM, 말토오스(maltose) 0.5∼0.15M, 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG) 3.5∼4.0％를 첨가한 배지에서 배양하여 체세포배를 발생시킬 수 있다.

상기에서 배발생조직으로부터 체세포배를 유도시 상기 배발생조직으로부터 체세포배를 유도시 증식한 배발생조직을 (1)1/2LM 배지에 겔라이트 0.8∼1.2％, 엡시식산(ABA) 50∼250μM, 말토오스 0.1∼0.3M을 첨가한 배지 또는 (2)1/2LM 배지에 겔라이트(gelrite) 0.8∼1.2％, 엡시식산(ABA) 50∼250μM, 말토오스 0.5∼0.15M, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 3.5∼4.0％를 첨가한 배지에서 20∼25℃에서 6∼10주(week) 동안 암소(暗所)의 환경하에서 배양하여 배발생조직으로부터 체세포배를 발생시킬 수 있다.

상기에서 체세포배의 발아 및 식물체로의 분화는 체세포배를 1/2LM 배지에 수크로오스 15∼25g/L, 겔라이트 0.1∼0.3％가 첨가된 발아배지에 이식한 다음 이식 후 2주 동안 상기의 발아배지에서 배양하여 발아체를 얻되, 이식 후 1주 동안은 500룩스(lux) 이하, 바람직하게는 50∼500룩스의 광도에서 배양하고; 이식 2주부터 3주 동안 상기의 발아체를 2500∼3500룩스의 광도에서 배양하여 발아체의 줄기가 신장되도록 하고; 상기의 줄기가 신장된 발아체를 이식 3주 부터 4주 동안 2500∼3500룩스의 광도에서 배양하여 식물체 생장이 이루어지도록 하여 식물체를 분화할 수 있다.

상기에서 체세포배의 발아 및 식물체로의 분화는 체세포배를 1/2LM 배지에 수크로오스 15∼25g/L, 겔라이트 0.1∼0.3％ 및 활성탄 0.03∼0.07％가 첨가된 발아배지에 이식한 다음 이식 후 2주 동안 상기의 발아배지에서 배양하여 발아체를 얻되, 이식 후 1주 동안은 500룩스 이하, 바람직하게는 50∼500룩스의 광도에서 배양하고; 이식 2주부터 3주 동안 상기의 발아체를 2500∼3500룩스의 광도에서 배양하여 발아체의 줄기가 신장되도록 하고; 상기의 줄기가 신장된 발아체를 이식 3주 부터 4주 동안 2500∼3500룩스의 광도에서 배양하여 식물체 생장이 이루어지도록 하여 식물체를 분화할 수 있다.

상기에서 분화된 식물체의 환경순화는 피트모스(peat moss), 펄라이트(pearlite) 및 버미큘라이트(vermiculite)가 혼합된 인공토양에 이식하고 25±1℃, 10∼16시간 광주기의 조건으로 8∼10주(week) 동안 관수하여 실시할 수 있다.

상기에서 분화된 식물체의 환경순화는 피트모스, 펄라이트 및 버미큘라이트가 1∼8:1∼8:1∼8의 부피비, 바람직하게는 1:1:1의 부피로 혼합된 인공토양에 이식하고 25±1℃, 10∼16시간 광주기의 조건으로 8∼10주(week) 동안 관수를 실시하되, 최초 2주간은 1일 간격으로 관수하고 2주 이후부터는 3∼4일 마다 관수를 실시하여 90％ 이상의 습도, 바람직하게는 90∼95％의 습도를 유지하도록 실시할 수 있다.

상기에서 환경순화된 식물체의 포지 이식은 환경순화 과정을 거친 식물체를 20∼30℃의 온도가 유지되는 온실의 토양에 옮겨 외부환경에 적응시킬 수 있다.

본 발명의 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법에 대해 다양한 조건에 의해 그 방법을 조사한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 상기에서 언급한 조건의체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법을 제공하는 것이 바람직하다.

이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<준비예>

(1)종자의 채취

본 발명에서 소나무 배발생조직을 유도하기 위해 소나무의 미숙구과로부터 미숙종자를 채취하여 사용하였다. 상기 소나무의 미숙구과는 2005년 7월 초순경 국립산림과학원 유전자원부 구내에 서식하고 있는 6년생 소나무에서 채취하였다. 채취한 구과는 배양시까지 4℃의 냉장고에 보관하였다.

(2)배양을 위한 종자 표면살균

소나무의 구과는 먼저 전정가위로 절반을 절단한 다음 손으로 구과의 절편을 젖혀가면서 그 속에 들어있는 미숙종자를 제거 후 표면살균을 실시하였다. 종자소독은 먼저 분리한 종자를 원형 배양병에 계면활성제인 트윈 20(tween 20)을 첨가하여 흔들어 세척시킨 후 수돗물로 수차례 씻어낸 다음 무균배양대내에서 다음과 같 은 순서로 표면살균을 실시하였다. 1)70％ 에탄올로 1분간 침지하여 계속적으로 흔들어 주고 2) 트리톤X-100(TritonX-100)이 0.5ml 첨가된 1％ NaClO 용액을 첨가하여 10분간 살균한 다음 3) 멸균증류수로 3-4차례 세척하였다.

<실시예>

(1)배발생조직 유도를 위한 배지조성 및 조제

소나무의 미숙종자로부터 배발생조직을 유도하기 위한 기본배지로는 LM배지 (Litvay et al. 1985)에 수크로오스 (Sucrose) 3％, 겔라이트 (Gelrite) 0.2％, L-글루타민(L-Glutamine) 1000mg/L, 2,4-디클로로페노시에세틱산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D) 2.0mg/L, 벤질 아데닌 퓨린(benzyl adenine purine, BAP) 1.0mg/L를 첨가한 후 배지의 pH는 5.7로 맞추었다. 배지의 분주는 87ㅧ15㎜ 크기의 플라스틱 페트리디쉬(Sterline사 제품)에 20ml 정도 분주하여 하룻밤 정도 굳힌 후 사용하였다.

(2)배발생조직의 유도 및 증식

배발생조직 유도는 우선 소나무 미숙종자의 종피를 벗겨내고 미숙배가 포함된 배유조직 전체를 배양배지위로 평행되게 놓는 식으로 배양하였다. 즉, 준비예의 소나무 미숙종자의 종피를 벗겨내고 미숙배가 포함된 배유조직 전체를 상기 (1)배발생조직 유도를 위한 배지위로 평행되게 놓고 배양하였다. 이때 배양조건은 암소에서 실시하는데 배양 4주(week) 후면 배발생조직 유도가 시작되며 중간에 새로운 배지교환 없이 8주 정도 배양을 계속하였다.

배양 8주 후면 유도된 배발생 조직이 배양배지의 도움을 받아 증식을 거듭하여 새로운 배지로 옮겨줄 만큼 조직이 생장하게 된다. 이때 배발생조직의 발생 배지와는 조성을 다소 변형을 시켜 배양을 계속하게 되는데 증식배지의 조성은 1/2LM배지에 수크로오스 20g/L, 겔라이트 0.4％, 2,4-D 2.0mg/L, BAP 1.0mg/L 및 L-글루타민 1000mg/L가 첨가된 배지로 옮겨주면 된다. 그 후로는 2주 간격으로 동일조성의 배지로 계대배양하여 체세포배 발생을 위한 시험재료의 충분한 양이 될 때까지 증식하였다.

도 1에 상기의 과정을 통해 소나무 미숙종자로부터 유도된 배발생조직의 사진을 나타내었다.

(3)소나무 배발생조직으로부터 체세포배 발생

상기 (2)의 과정을 통해 소나무 미숙종자로부터 유도 및 증식된 배발생조직으로부터 체세포배를 유도하였다. 이때 체세포배 발생을 위한 배지조성은 1/2LM배지에 말토오스(Maltose) 0.2M, 엡시식산(ABA) 50-250μM, 겔라이트(Sigma사 제품) 0.8-1.2％ 가 첨가된 배지에 90mg의 배발생조직을 종이 필터페이퍼(지름 5.5cm) 위에 배양하는 방식으로 체세포배를 발생시켰다. 배양환경은 8주 내내 암소에서 실시하고 체세포배 발생 정도는 배양 8주 후에 조사하였다.

도 2에 상기의 과정을 통해 소나무 배발생조직으로부터 발생중인 체세포배(somatic embryo)의 사진을 나타내었다.

한편, 상기의 체세포배 발생을 위한 배지조성에서 말토오스(Maltose) 0.2M 대신에 말토오스 0.1M와 폴리에틸렌글리콜(PEG, 분자량 4,000) 3.75％를 혼합한 것을 사용할 수 있다.

(4)소나무 체세포배 발아

상기 (3)의 과정을 통해 유도된 체세포배는 유도 후 6∼8주(week) 후에 자엽 단계의 체세포배로 완전히 성숙되기 때문에 이때부터 체세포배 발아를 실시하였다.

필터페이퍼 위에서 성숙된 자엽단계의 체세포배를 핀셋으로 한개 씩 집어 1/2LM배지에 수크로오스 20g/L, 겔라이트 0.2％가 첨가된 발아배지로 이식하였다. 체세포배 발아의 초기 배양은 1주 정도는 500룩스(lux) 이하, 바람직하게는 50∼500룩스의 저광도에서 배양하여 암소에서 발생된 체세포배가 서서히 빛에 적응하도록 하였다. 발아 2주 후부터는 작은 자엽, 하배축신장 및 뿌리 발생이 이루어지는데 이때 발아체를 3,000룩스의 강한 빛 조건으로 옮겨 충분한 광합성이 이루어지도록 하여 줄기가 신장되도록 한다. 발아 4주의 광 조건하에서 발아배양을 계속한 후 식물체 생장이 지속적으로 이루어지면 1/2LM배지에 수크로오스 20g/L, 겔라이트 0.2％가 첨가된 조성의 발아배지를 투명 플라스틱 배양통(13ㅧ13ㅧ13cm)에 분주하여 굳힌 후 페트리디쉬에서 생장중인 소식물체를 이식시켜 더욱 생장을 촉진시켰다.

도 3에 소나무 체세포배의 발아 2주 후 사진 및 도 4에 소나무 체세포배의 발아 6주 후 사진을 나타냈었다.

(5)토양이식 및 순화

상기 (4)의 과정을 통해 소나무 체세포배로부터 발아하여 침엽, 줄기 및 뿌리 발달이 왕성한 식물체를 배양통에서 꺼내어 뿌리에 묻은 겔라이트를 수돗물로 씻어내고 피트모스:펄라이트:버미큘라이트가 각각 1:1:1(v:v:v)로 이루어진 인공토양을 담은 플라스틱 화분(높이 7cmㅧ지름 7.5cm)에 이식하였다. 이식 후에는 투명비닐을 덮고 그 위로 투명아크릴판을 덮은 후 진공 스프레이를 이용해 충분히 관수하였다.

상기의 인공토양에 이식된 식물체의 순화과정은 25±1℃, 16시간 광주기의 배양조건에서 최초 2주간은 1일 간격으로, 그 후로는 3∼4일마다 관수를 실시하여 90％ 이상의 고습도 환경을 유지하였다. 순화 6 주후부터는 비닐을 제거하고 아크릴판을 덮어 상태로 유지하였으며 그 후로는 아크릴판을 조금씩 열어 점차 습도를 낮추어 가는 식으로 외부환경에 적응토록 하였으며 순화 8주 후부터는 완전히 아크릴판을 제거하였다.

도 5에 소나무 체세포배가 발아하여 완전한 식물체로 육성되고 인공토양에 이식된 사진을 나타내었다.

(6)폿트묘 육성

상기 (5)의 순화과정을 거치고 발육과정이 좋은 순화묘는 20∼30℃ 온도로 유지되는 온실로 옮겨 외부환경에 완전히 적응토록 하였다. 온실에서 순화 4주 후 면 식물체의 줄기 및 뿌리 생장이 더욱 왕성해져서 보다 큰 화분으로 이식하는 재분화의 필요가 있는데 이때 큰 플라스틱 화분(높이 20cmㅧ지름 13cm)으로 이식시켜 더욱 생장을 촉진시켜 시험지로 이식할 크기까지 생장시켰다.

도 6에 소나무 체세포로부터 재분화된 소나무의 폿트묘 사진을 나타내었다.

<시험예 1> 배발생조직 라인별 증식율 및 체세포배 발생 효과 비교

15개의 배발생조직 라인의 생장율을 배양 3주 후 비교한 바 4번라인이 가장 높은 조직생장율 (5.3배)을 보였고 37번 라인이 1.4배로 가장 저조한 조직증식율을 보였다. 그러나 각 라인에 따라 조직 생장율은 매우 다양하게 나타났으며 조직생장율이 높을수록 비례하여 체세포배 발생량 (화살표)은 높지 않았다(도 7 참조).

<시험예 2> 엡시식산 농도에 따른 체세포배 발생 효과

침엽수종, 특히 소나무류의 체세포배 발생을 위해서는 배지에 엡시식산이 필수적으로 첨가되어야 한다. 도 8에서 보면 배발생조직 3라인을 대상으로한 엡시식산의 효과를 조사한 바 조직라인에 따라 최고의 체세포배 발생량은 달리 나타났으나 소나무의 배발생조직 으로부터 체세포배를 발생하기 위해서는 최소 50μM 이상의 엡시식산 농도를 필요로 하는 것을 알 수 있다.

6번 라인(PD 6)의 경우 50 혹은 80μM에서는 비슷한 발생량을 보였으나 150μM이상에서는 점차 증가하였고 250μM에서는 984개/g조직으로 최고의 체세포배 발생량을 보였다.

8번 라인(PD 8)의 경우 80μM에서 가장 높은 1,433개의 체세포배 발생을 보였으나 엡시식산 농도가 점차 높아질수록 체세포배 발생량은 감소하는 경향을 보였다.

9번라인(PD 9)에서는 엡시식산 무첨가구를 제외하고는 거의 농도에 상관없이 일정한 체세포배 발생량을 보였으며 최고의 발생량은 250μM에서 204개로 가장 높았지만 전체적으로는 170여개의 체세포배 발생량을 보여 별 차이를 보이지 않는 특징을 나타냈다.

<시험예 3> 겔라이트 농도에 따른 체세포배 발생 효과

배양배지의 고형제로 사용되는 겔라이트 농도에 따른 체세포배 발생 효과를 조사한 결과 0.4 및 0.6％의 겔라이트 농도에서는 전혀 체세포배가 발생되지 않았다.

0.8％ 겔라이트(374개/g당 조직) 이상의 농도에서 체세포배 발생이 가능하였는데 1.0％의 농도에서는 408개로 가장 높았지만 1.2％에서도 397개로 높은 발생율을 보였으며 0.8％이상의 경우 다른 처리구에 비해 체세포배 발생정도가 큰 차이를 보이지 않았지만 소나무 체세포배 발생을 위해서는 최소한 0.8％이상의 고농도 겔라이트 첨가가 필요하다(도 9 참조).

<시험예 4> 삼투압제 종류 및 농도에 따른 체세포배 발생 효과

침엽수종의 체세포배 발생시 삼투압제의 종류 및 농도 선택은 매우 중요한 요인으로서 다양한 처리를 통해 가장 적합한 조건을 구명할 필요가 있다.

본 실험에서는 배발생조직 라인 및 삼투압제 종류 및 농도에 따라 체세포배 발생 효과가 매우 큰 차이를 보였는데 가장 높은 체세포배 발생 수는 29번 라인에서 0.2M 말토오스 단독첨가로 321개를, 0.1M 말토오스+3.75％ PEG를 첨가 (242개) 할 때 보다는 체세포배 발생 수가 높았다.

8번 라인의 경우 218개 (0.2M 말토오스) 및 171개 (0.1M 말토오스+3.75％ PEG) 의 체세포배가 각각 발생되었으나 6번 라인의 경우 18개 (0.2M 말토오스) 및 9개 (0.1M 말토오스+3.75％ PEG) 로 매우 저조한 유도수를 보여 다른 라인에 비해 큰 차이를 나타내고 있다.

전체적으로 0.2M 말토오스의 단독 첨가가 말토오스+PEG의 혼합처리보다 체세포배 발생에 보다 효과적인 것으로 나타났다(도 10 참조).

<시험예 5> L-글루타민 농도에 따른 체세포배 유도 효과

침엽수종으로부터 체세포배 발생을 위해서는 글루타민 혹은 카제인과 같은 환원 질소원의 첨가를 필요로 한다.

소나무의 체세포배 발생시 배발생조직 라인에 따라 L-글루타민의 첨가 효과가 크게 차이를 보였는데 29번 라인의 경우 L-글루타민 무첨가시에는 359개, 1,000mg 첨가시에는 378개로 두 처리간에는 큰 차이를 보이지 않았지만, 8번 라인의 경우 L-글루타민 첨가로 199개의 발생수를 보였지만 무첨가시에는 9개만 발생되어 L-글루타민 첨가효과가 매우 큰 것으로 나타났다. 6번 라인의 경우 L-글루타민 첨가 시에는 19개 정도가 발생된 반면 무첨가시에는 11개로 그리 큰 차이를 보이질 않았다(도 11 참조).

<시험예 6> 겔라이트 농도에 따른 체세포배 발아 효과

체세포배로부터 식물체의 발아에서는 12 및 29조직 라인에서 유래한 체세포배는 0.2％ 의 겔라이트 농도에서 46 및 26％로 각각 가장 높은 발아율을 보여 저농도의 겔라이트가 가장 효과적인 것으로 나타났다. 체세포배 발생시에는 고농도(0.8-1.2％)의 겔라이트가 필요했으나 체세포배 발아시에는 반대로 저농도(0.2％)의 겔라이트가 필요함을 알 수 있다(도 12 참조).

<시험예 7> 활성탄 첨가에 따른 체세포배 발아 효과

0.05％ 활성탄 첨가와 무처리시 체세포배 발아율 효과를 알아본 결과 37번 조직라인에서 활성탄 무처리구의 경우 20.1％로 활성탄 처리구(12.8％)보다 발아율이 높았을 뿐 이외의 다른 조직 라인(12, 21, 26, 29, 50 및 56) 에서는 활성탄 첨가시에는 무첨가보다 높은 발아율(18, 26.7, 13.3, 44.4, 15 및 10％)을 각각 보여 소나무의 체세포배 발아에는 활성탄 첨가가 효과적임을 알 수 있다(도 13 참조).

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

이제 이러한 소나무의 체세포배 발생 기술의 발명으로 단시간 내에 생장 및 재질이 우수한 형질을 가진 소나무의 선택적인 대량생산이 가능해졌으며 차후에는 솔잎혹파리 및 재선충 등의 병충해 등에 강한 신품종 육종 또한 가능해졌다. 아울러 이 기술의 개발로 유전자조작 등의 첨단 생물공학 기법을 임업에 적용하는 것이 가능해져 산림수종의 품종화를 통한 산림 생산성증진 등의 산림자원화에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 소나무 미숙종자로부터 유도된 배발생조직의 사진이다.

도 2는 소나무 배발생조직으로부터 발생중인 체세포배의 사진이다.

도 3은 소나무 체세포배의 발아 2주 후 사진이다.

도 4는 소나무 체세포배의 발아 6주 후 사진이다.

도 5는 소나무 체세포배가 발아하여 완전한 식물체로 육성되고 인공토양에 이식된 사진이다.

도 6a 및 6b는 체세포배로부터 재분화된 소나무의 폿트묘 사진이다.

도 7은 배발생조직 라인별 증식율 및 체세포배 발생 효과 비교 이다.

도 8은 엡시식산 농도 및 배발생조직 라인에 따른 체세포배 발생 효과이다.

도 9는 겔라이트 농도에 따른 체세포배 발생 효과 비교이다.

도 10은 삼투압제 종류 및 농도에 따른 체세포배 발생 효과 비교이다.

도 11은 L-글루타민 첨가에 따른 체세포배 발생 효과 비교이다.

도 12는 겔라이트 농도에 따른 체세포배 발아 효과 비교이다.

도 13은 활성탄 첨가에 따른 체세포배 발아 효과 비교이다.

Claims

소나무의 번식방법에 있어서,

소나무의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도하고 증식하는 단계;

상기의 증식된 배발생조직으로부터 체세포배를 유도하는 단계;

상기의 체세포배를 발아시켜 식물체로 분화시키는 단계;

상기의 분화된 식물체의 환경순화를 실시하는 단계; 및

상기의 환경순화된 식물체를 포지 이식하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법.
제1항에 있어서, 상기 소나무의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도시 배지는 LM 배지를 기본으로 하고, 상기 LM 배지에 수크로오스(sucrose) 2∼4％, 겔라이트(gelrite) 0.1∼0.3％, L-글루타민(L-glutamine) 700∼1300mg/L, 2,4-디클로로페노시에세틱산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D) 1.0∼3.0mg/L, 벤질 아데닌 퓨린(benzyl adenine purine, BAP) 0.5∼1.5mg/L를 포함하는 것을 특징으로 하는 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법.
제1항에 있어서, 상기 소나무의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도시 배지는 pH가 5.0∼7.0인 것을 특징으로 하는 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법.
제1항에 있어서, 상기 소나무의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직을 유도 후 증식은 1/2LM 배지에 수크로오스(sucrose) 15∼25g/L, 겔라이트(gelrite) 0.3∼0.5％, L-글루타민(L-glutamine) 800∼1200mg/L, 2,4-디클로로페노시에세틱산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D) 1.0∼3.0mg/L, 벤질 아데닌 퓨린(benzyl adenine purine, BAP) 0.5∼1.5mg/L를 포함하는 배지에서 실시하는 것을 특징으로 하는 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법.
제4항에 있어서, 상기 소나무의 미숙종자배를 배양하여 배발생조직 유도 후 증식은 1/2LM 배지에 수크로오스(sucrose) 15∼25g/L, 겔라이트(gelrite) 0.3∼0.5％, L-글루타민(L-glutamine) 800∼1200mg/L, 2,4-디클로로페노시에세틱산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D) 1.0∼3.0mg/L, 벤질 아데닌 퓨린(benzyl adenine purine, BAP) 0.5∼1.5mg/L를 포함하는 배지에 첨가하고 20∼25℃에서 6∼10주(week) 동안 암소(暗所)의 환경하에서 배양하여 실시하는 것을 특징으로 하는 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법.
제1항에 있어서, 상기 배발생조직으로부터 체세포배를 유도시 증식한 배발생조직을 (1)1/2LM 배지에 겔라이트(gelrite) 0.8∼1.2％, 엡시식산(abscisic acid , ABA) 50∼250μM, 말토오스(maltose) 0.1∼0.3M을 첨가한 배지 또는 (2)1/2LM 배지에 겔라이트(gelrite) 0.8∼1.2％, 엡시식산(abscisic acid , ABA) 50∼250μM, 말 토오스(maltose) 0.5∼0.15M, 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG) 3.5∼4.0％를 첨가한 배지에서 배양하여 체세포배를 발생시키는 것을 특징으로 하는 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법.
제6항에 있어서, 상기 배발생조직으로부터 체세포배를 유도시 상기 배발생조직으로부터 체세포배를 유도시 증식한 배발생조직을 (1)배지 또는 (2)배지에서 20∼25℃에서 6∼10주(week) 동안 암소(暗所)의 환경하에서 배양하여 배발생조직으로부터 체세포배를 발생시키는 것을 특징으로 하는 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법.
제1항에 있어서, 상기 체세포배의 발아 및 식물체로의 분화는 체세포배를 1/2LM 배지에 수크로오스(sucrose) 15∼25g/L, 겔라이트(gelrite) 0.1∼0.3％가 첨가된 발아배지에 이식한 다음 이식 후 2주 동안 상기의 발아배지에서 배양하여 발아체를 얻되, 이식 후 1주 동안은 500룩스(lux) 이하의 광도에서 배양하고; 이식 2주부터 3주 동안 상기의 발아체를 2500∼3500룩스의 광도에서 배양하여 발아체의 줄기가 신장되도록 하고; 상기의 줄기가 신장된 발아체를 이식 3주 부터 4주 동안 2500∼3500룩스의 광도에서 배양하여 식물체 생장이 이루어지도록 하여 식물체를 분화하는 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법.
제1항에 있어서, 상기 체세포배의 발아 및 식물체로의 분화는 체세포배를 1/2LM 배지에 수크로오스(sucrose) 15∼25g/L, 겔라이트(gelrite) 0.1∼0.3％ 및 활성탄 0.03∼0.07％가 첨가된 발아배지에 이식한 다음 이식 후 2주 동안 상기의 발아배지에서 배양하여 발아체를 얻되, 이식 후 1주 동안은 500룩스(lux) 이하의 광도에서 배양하고; 이식 2주부터 3주 동안 상기의 발아체를 2500∼3500룩스의 광도에서 배양하여 발아체의 줄기가 신장되도록 하고; 상기의 줄기가 신장된 발아체를 이식 3주 부터 4주 동안 2500∼3500룩스의 광도에서 배양하여 식물체 생장이 이루어지도록 하여 식물체를 분화하는 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법.
제1항에 있어서, 상기 분화된 식물체의 환경순화는 피트모스(peat moss), 펄라이트(pearlite) 및 버미큘라이트(vermiculite)가 혼합된 인공토양에 이식하고 25±1℃, 10∼16시간 광주기의 조건으로 8∼10주(week) 동안 관수하여 실시하는 것을 특징으로 하는 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법.
제1항에 있어서, 상기 분화된 식물체의 환경순화는 피트모스(peat moss), 펄라이트(pearlite) 및 버미큘라이트(vermiculite)가 각각 1:1:1의 부피비로 혼합된 인공토양에 이식하고 25±1℃, 10∼16시간 광주기의 조건으로 8∼10주(week) 동안 관수를 실시하되, 최초 2주간은 1일 간격으로 관수하고 2주 이후부터는 3∼4일 마다 관수를 실시하여 90％ 이상의 습도를 유지하도록 실시하는 것을 특징으로 하는 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법.
제1항에 있어서, 상기 환경순화된 식물체의 포지 이식은 환경순화 과정을 거친 식물체를 20∼30℃의 온도가 유지되는 온실의 토양에 옮겨 외부환경에 적응시키는 것을 특징으로 하는 체세포배 발생을 이용한 소나무의 번식방법.