KR100969912B1

KR100969912B1 - 서울오갈피의 기내번식 방법

Info

Publication number: KR100969912B1
Application number: KR1020090024894A
Authority: KR
Inventors: 강호덕; 문흥규
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2009-03-24
Filing date: 2009-03-24
Publication date: 2010-07-13

Abstract

본 발명은 (1) 서울오갈피의 성숙종자로부터 배발생 캘러스를 유도하는 단계; (2) 상기의 배발생 캘러스로부터 체세포배를 유도하는 단계; (3) 어뢰형 단계의 체세포배로부터 배아 및 식물체 형성을 유도하는 단계; (4) 상기 식물체를 인공상토에 이식하여 식물체를 순화시키는 단계를 포함하는 서울오갈피의 기내번식방법에 관한 것이다.

서울오갈피, 기내번식

Description

서울오갈피의 기내번식 방법{In vitro Propagation Method of Acathopanax seoulenses}

서울오갈피는 두릅나무(Araliaceae)과 오갈피나무속(Acanthopanax)에 속하는 낙엽관목으로서 현재 우리나라 홍릉 수목원(청량리 소재 국립산림과학원)에 2그루가 자생하고 있다. 높이 2∼3m 이고 가지에 가시가 없으며 나무껍질은 회색이고 2년이 지난 가지에는 솟아 오른 피목이 있다. 잎은 어긋나고 손바닥 모양으로 갈라진 겹잎이며, 작은 잎은 3∼5개이고 길이 2.5∼8.5cm의 거꾸로 세운 바소(피침)모양이며 양면에 털이 없고 가장자리에 누운 톱니가 있다. 잎자루는 길이가 1∼11cm이다. 꽃은 8∼9월에 흰색으로 피고 가지 끝에 산형꽃차례를 이루며 달리는데, 꽃 자루가 짧아 거의 두상화(頭狀花:꽃대 끝에 꽃자루가 없는 작은 꽃이 많이 모여 피어 머리 모양을 이룬 꽃) 모양을 이룬다. 꽃대는 길이가 2∼3cm이며 처음에는 털이 있으나 점차 없어진다. 꽃받침은 갈라지지 않고 털이 약간 있다. 꽃잎은 5개이고 삼각형이며, 암술대는 끝이 3개로 갈라진다. 열매는 핵과이고 납작한 타원형으로 10월에 결실을 맺어 검은색으로 익는다. 오갈피나무와 비슷하지만 작은 잎은 거꾸로 세운 바소모양이고 잎 가장자리의 톱니가 밖으로 향하지 않았다(이유미, 1996).

서울오갈피의 증식은 종자를 이용한 실생번식과 접삽목 등을 이용한 무성번식 그리고 조직배양 기법을 이용할 수 있다. 그러나 현실적으로 서울오갈피는 개체수가 부족하여 실생번식과 무성번식법의 이용이 쉽지 않다. 따라서 조직배양기술이 가장 현실적인 대안이 될 수 있다. 여러 가지 조직배양 기술 가운데 체세포배를 이용한 식물의 증식법은 가장 이상적인 증식방법으로 평가되고 있어(Indara, 1991; Bornman, 1993) 본 발명에서는 서울오갈피의 성숙종자를 이용하여 체세포배를 통한 기내증식을 시도하였다.

서울오갈피가 속한 오갈피 속 수종의 체세포배 연구는 여러 선행연구가 보고되었다. 오가피 (Choi et al., 2002a; Lee et al., 2002a), 가시오가피 (Gui et al., 1991; Choi and Jeong, 2002a; Choi et al,. 1999a,b, 2002b), 섬오가피(Choi et al., 1997) 및 지리오가피 (Lee et al., 2002a) 등에서 체세포배 발생을 통한 식물체의 생산 가능성이 제시되었다. 그러나 서울오갈피에 대한 기내배양 연구는 아직까지 보고된 바 없다.

본 발명은 희귀 및 멸종 위기 수종으로 지정되어 보호하고 있는 서울오갈피의 효율적인 기내번식방법을 제공하는데 있다.

구체적으로, 본 발명은 서울오갈피의 기내배양 번식기술을 확립하기 위해, 1) 종자배로부터 배발생 캘러스의 유도, 2) 배발생 캘러스로부터 체세포배 유도를 위한 MS 배지 염류농도 효과, 슈크로즈(sucrose) 농도효과, 슈크로즈 및 피이지(PEG; polyethylene glycol) 혼용처리 효과 및 에브시식산(ABA; abscisic acid) 처리 효과, 3) 체세포배 발아를 위한 지지물의 종류와 농도효과 및 4) 어린 체세포배 유래 식물체를 인공상토에 이식 순화시켜 효율적인 서울오갈피의 번식 방법을 제공하고자 한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

제 1 단계: 성숙 종자로부터 배발생 캘러스의 유도

서울오갈피의 성숙 종자는 배발생 캘러스 유도에 앞서 통상의 방식에 따라 세척, 표면 살균한다. 배발생 캘러스 유도 전에 성숙 종자에 상처를 내거나, 내지 않을 수 있는데, 상처를 내는 경우 배발생 캘러스 유도 효율이 보다 높다(도 7 참조).

서울오갈피의 성숙 종자는, 탄소원으로 2~5% 슈크로즈(sucrose), 경화제로 0.1~1.0% 겔라이트(gelite), 생장조절제로 0.5~2.0 mg/L 이사디(2,4-dichlorophenoxy acetic acid)와 0.005~0.02 mg/L 티디아주론(TDZ; thidiazurone)을 포함하는 MS 배지에서 배양하여 배발생 캘러스를 유도할 수 있다. 이 단계의 배양은 22~25℃ 온도에서, 암배양으로 4-8주간 유지한다.

본 발명의 한 양태에 따라 성숙 종자로부터 유도된 서울오갈피의 배발생 캘러스를 도 1에 나타내었다.

제 2 단계: 배발생 캘러스로부터 체세포배의 유도

성숙 종자로부터 유도된 배발생 캘러스는, 탄소원으로 3~7% 슈크로즈, 경화제로 0.1~1.0% 겔라이트, 0.1~1.0 mg/L 에브시식산(ABA; abscisic acid) 및 0.01~0.05% 활성탄(activated charcoal)을 포함하는 MS 배지에서 배양하여 체세포 배를 유도할 수 있다. 상기 배지는 7~10% PEG(polyethylene glycol)를 포함할 수 있으며, 이 경우 슈크로즈의 농도는 1~3%로 조절하는 것이 바람직하다. 또한, 기본 배지인 MS 배지는 염류의 농도를 1/2 내지 2배로 조절할 수도 있다. 이 단계의 배양은 22~25℃ 온도에서, 암배양으로 4-8주간 유지한다.

본 발명의 한 양태에 따라 배발생 조직으로부터 유도된 서울오갈피의 체세포배를 도 2에 나타내었다.

제 3 단계: 체세포배로부터 식물체 형성

배발생 캘러스로부터 유도된 어뢰형(torpedo) 단계의 체세포배는, 탄소원으로 2~5% 슈크로즈, 경화제로 0.3~1.0% 겔라이트 또는 0.5~1.0% 아가(agar) 및 0.1~1.0 mg/L 지베렐릭산(GA₃: gibberellic acid)을 포함하는 MS 배지에서 배양하여 배아 및 식물체의 형성을 유도할 수 있다. 이 단계의 배양은 22~25℃ 온도에서, 명배양으로 4-6주간 유지한다.

본 발명의 한 양태에 따라 체세포배로부터 유도된 서울오갈피의 식물체를 도 3, 4 및 5에 생장 순서별로 나타내었다. 도 3은 서울오갈피의 체세포가 뿌리를 내리면서 발아한 후 식물체로 커가는 초기의 사진이고, 도 4는 서울오갈피의 체세포 발아 후 자엽이 커지고 배축이 신장하는 단계의 사진이며, 도 5는 서울오갈피의 체세포배가 발아하여 완전한 식물체로 재생된 사진이다.

제 4 단계: 식물체의 순화

체세포배로부터 형성된 식물체는 버미큘라이트(vermiculrite), 펄라이트(pelrite) 및 피트모쓰(peatmoss) 중에서 하나 또는 둘 이상을 조합한 토양에 이식하여 순화시킬 수 있다. 토양 이식 후에는 온도 22~25℃, 광도 2500~3500 룩스(lux), 1일 16시간 광주기의 배양실에서 3~5주간 활착시킨 다음 온실 및 포지에 이식이 가능한 폿트 묘로 육성시킬 수 있다.

본 발명의 한 양태에 따라 서울오갈피의 체세포배로부터 식물체를 재분화한 다음 인공상토에 이식하여 순화시킨 어린 식물체를 도 6에 나타내었다.

본 발명에 의해 희귀 및 멸종위기 식물로 지정되어 보호되고 있는 서울오갈피를 효율적으로 번식시킬 수 있어, 서울오갈피의 멸종을 억제시킬 수 있을 뿐만 아니라, 서울오갈피의 생산성 향상에 기여할 수 있다.

이하, 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실험예> 기내무균체 유도

서울 소재 국립산림과학원 홍릉수목원에서 2005년 10월 성숙종자를 채취하여 본 발명에 사용하였다. 종자 약 50립 정도를 과육을 제거한 후 200㎖의 삼각 플라스크에 넣고 트윈(tween) 20 용액을 2~3 방울 첨가하여 흔들어 주면서 수돗물로 30분 정도 세척하였다. 다음 무균상(clean bench)에서 70% 에탄올로 1분간 소독하고, 다시 2% 차아염소산나트륨(NaClO) 용액을 종자가 담기게 붓고 Triton X-100 용액 2~3 방울을 첨가하여 10분 정도 흔들어 주며 표면 살균하였다. 그 후 소독액을 버리고 멸균 증류수로 5회 세척한 다음 캘러스 유도 배지로 치상하였다. 상기 배지는 MS배지(Murashige and Skoog 1962)에 탄소원으로는 슈크로즈(sucrose) 3%, 경화제로는 겔라이트(gelrite) 0.3%를 사용하였다. 생장조절제로는 이사디(2,4-D; 2,4-dichlorophenoxy acetic acid) 1.0mg/L, 티디아주론(TDZ; thidiazurone) 0.01mg/L을 첨가하였다. 배지는 1.5x9.0cm 크기의 1회용 샤레(Petri-dish)에 20ml 씩 분주하여 상온에서 하룻밤 정도 굳힌 후 사용하였다. 배양 환경은 온도 22~25℃, 광도 약 3,000룩스(lux)의 냉백색 형광등하에서 16시간 광배양하였고, 배양 4~8주 사이에 캘러스 유도율을 조사하였다.

<실시예>

상기의 실험예의 방법에 의해 서울오갈피의 성숙 종자로부터 상처처리 후 MS 배지 (Murashige and Skoog, 1962)에 배양하여 배발생 캘러스를 유도하여 증식시켰다.

상기 증식된 배발생 캘러스로부터 체세포배 유도를 위하여 MS 배지의 염류조절, 슈크로스(sucrose) 농도조절, 슈크로즈 + 피이지(PEG; polyethylene glycol) 혼용처리 및 에브시식산(ABA; abscisic acid)의 농도별 처리로 체세포배를 유도하였다.

상기 유도된 체세포배(somatic embryo)로 어뢰형 단계의 배를 택하여 0.2mg/L 지베렐릭산(GA₃; gibberelic acid)이 포함된 두 종류의 경화제(겔라이트 및 아가) 처리로 체세포배의 발아 및 식물체를 유도하였다.

상기에서 발아된 5~7cm의 어린 식물체를 피트모쓰(peatmoss), 버미큘라이트(vermiculrite) 및 펄라이트(pelrite) 단독처리 혹은 각각의 두 가지 상토를 혼합한 상토에 이식하여 순화시킴으로서 완전한 서울오갈피의 묘목을 얻었다.

상기에서 서울오갈피의 배발생 캘러스의 유도 및 체세포배 유도시 각각의 배지에서 특별한 언급이 없는 한 탄소원은 슈크로즈(sucrose) 3%, 경화제로는 겔라이트(gelrite) 0.3%를 사용하였으며, 이 때 배지 조제 후 1.5x9.0cm의 1회용 무균사례(Petri-dish)에 20ml의 배지를 분주하여 상온에서 하룻밤 굳힌 후 사용하였다. 배양 환경은 온도 22~25℃, 3,000 룩스(lux)의 냉백색 형광등하에서 16시간 광주기 혹은 암배양으로 4주~8주(week) 간 배양하였다.

<시험예 1> 서울오갈피의 배발생 조직유도 단계

상기 실시예에서 MS 배지를 이용하여 서울오갈피 성숙종자의 상처 처리유무 를 통해 배발생 조직을 유도한 결과는 도 7과 같다. 암배양 4주 후부터 캘러스의 유도가 관찰되었으며, 배발생 캘러스는 6주 후부터 관찰되었다. 배발생 캘러스는 깨어지기 쉬운 세포덩어리로 구성되고 백색 혹은 연노랑색을 띠며 종자의 유근이 나오는 방향에서 형성되었다(도 1 참조). 8주 후의 배발생 캘러스 유도는 배양 전에 종자의 상처 처리가 배발생 캘러스 유도에 다소 효과를 보여 평균 35%, 상처 무처리의 경우는 평균 31%의 배발생 캘러스가 형성되었다(도 7 참조).

<시험예 2> 서울오갈피의 체세포배 유도 - MS 배지 염류농도 효과

서울오갈피의 배발생 캘러스로부터 체세포배 유도를 위한 MS 배지의 염류농도 효과는 도 8과 같다. 배발생 캘러스로부터 체세포배의 유도는 각각의 배지에 플레이팅(plating)한 후 2주 후부터 관찰이 가능하였으며 3주 후에는 여러 단계의 체세포배가 동일한 배지에서 유도되어 발달하였다. MS 배지의 염류농도 효과는 도 8의 결과에서 보여주는 것처럼 배지의 염류가 정상적으로 포함된 1MS 배지에서 가장 많은 체세포배가 유도되는 것으로 나타났다. 염류를 1/4 혹은 1/2로 감소시키거나 2배로 증가시킨 2MS 배지에서는 체세포배의 유도가 억제되었다. 따라서 서울오갈피의 배발생 캘러스로부터 체세포배의 유도는 정상적인 MS 배지를 사용함이 적합한 것으로 나타났다.

<시험예 3> 서울오갈피의 체세포배 유도 - 슈크로즈 농도효과

서울오갈피의 배발생 캘러스로부터 체세포배 유도를 위한 슈크로즈 농도 효 과는 도 9와 같다. 구형배의 유도는 슈크로즈 3% 및 5%에서 가장 양호하였으며, 어뢰형 배의 형성은 슈크로즈 농도 5% 까지 점차 증가되다가 그 이상의 농도에서는 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 서울오갈피의 배발생 캘러스로부터 체세포배의 유도는 슈크로즈 농도 5%를 사용함이 가장 적합한 것으로 나타났다.

<시험예 4> 서울오갈피의 체세포배 유도 - 슈크로즈 및 PEG 혼용처리효과

서울오갈피의 배발생 캘러스로부터 체세포배 유도를 위한 슈크로즈 및 PEG 혼용처리 효과는 도 10과 같다. 슈크로즈 1%에 PEG를 각각 7%, 10% 공조 처리한 경우는 서울오갈피의 체세포배 유도에 현저한 효과가 없는 것으로 나타났다. 반면, 슈크로즈 3%에 PEG 7% 및 10%를 처리한 경우는 체세포배 유도에 유의적인 효과가 있는 것으로 나타났다. PEG를 단독으로 처리한 경우는 체세포배가 전혀 유도되지 않았다. 이 같은 결과는 슈크로즈가 탄소원의 기능으로 작용을 하고 PEG는 주로 삼투기능을 하기 때문에 나타난 결과로 생각된다. 따라서 서울오갈피의 배발생 캘러스로부터 체세포배의 유도시에는 슈크로즈 3% 및 PEG 7%의 혼용 처리가 체세포배 유도에 적합한 것으로 나타났다.

<시험예 5> 서울오갈피의 체세포배 유도 - ABA 농도별 효과

서울오갈피의 배발생 캘러스로부터 체세포배 유도를 위한 에브시식산(ABA; abscisic acid)의 처리효과는 도 11과 같다. 어뢰형배의 형성은 기본배지 및 저농도 ABA(0.1mg/L) 처리시 양호하였고 그 이상의 농도에서는 점차로 억제되었다. 한 편, 구형배의 유도는 농도 0.2mg/L 까지 증가되다가 그 이상의 농도에서는 억제되었다. 에브시식산(ABA; abscisic acid)의 무처리의 경우는 대부분 체세포배가 기형을 나타내어 정상적인 체세포배 유도 및 발달을 위해서는 에브시식산(ABA; abscisic acid)의 처리가 중요한 것으로 나타났고, 적정 농도는 0.2mg/L 로 나타났다.

<시험예 6> 서울오갈피의 발아유도 - 경화제 효과

서울오갈피의 체세포배의 발아 및 식물체 재생에 미치는 경화제 및 농도별 효과는 표 1과 같다. 겔라이트(gelrite)의 농도에 따른 발아율은 유의적인 차이 없이 90~95% 까지 나타났고, 식물체 재생은 겔라이트(gelrite) 농도 0.5%에서 가장 높은 73%를 나타났다. 반면 아가(agar)의 경우는 0.5% 및 0.8% 농도에서는 95% 이상 발아되지만 1.0%에서는 86%의 발아율을 보였다. 식물체 재생에 있어서는 0.8%에서 78%로 가장 높고, 0.5%에서는 71%까지 식물체 재생을 보이지만 아가농도 1.0%에서는 65%의 식물체 재생을 나타내어 저조하였다. 전반적으로 식물체의 재생율을 기준으로 볼 때 겔라이트와 아가의 현저한 차이는 없으나, 서울오갈피 체세포배의 발아 및 식물체 재생은 겔라이트는 0.5% 수준에서, 아가는 농도 0.5% 및 0.8% 수준에서 적합한 것으로 나타났다.

<시험예 7> 서울오갈피의 어린묘목의 토양이식 - 상토별 효과

서울오갈피의 체세포배로부터 형성된 어린 식물체의 인공상토로의 이식 후 토양활착에 미치는 상토효과는 표 2와 같다. 6주 후 생존율이 가장 높은 상토는 버미큘라이트 + 피트모쓰(1:1, v/v) 상토로, 98%를 나타냈다. 피트모쓰 단독 처리와 펄라이트 + 피트모쓰 혼합 상토는 3주 후 95%, 6주 후에는 88.5% 생존율을 보였다. 대체적으로 서울오갈피의 체세포배 유래 식물체의 토양 순화는 인공상토의 단독 처리보다는 두 가지의 혼합 상토에서 생육이 좋은 것으로 나타났다. 펄라이트를 단독으로 사용한 경우는 6주 후 생존율이 91%이지만 뿌리의 생장이 불량한 것으로 관찰되었고, 피트모쓰의 단독처리는 6주 후 생존율이 75%로 가장 저조하였다. 이것은 통기성의 문제와 과습이 문제가 되는 것으로 관찰되었다. 전반적으로 6주 후의 생존율은 버미큘라이트 단독 상토에서 97%, 버미큘라이트 + 피트모쓰 혼합상토에서 98%의 생존율을 보여 서울오갈피의 체세포배 유래 어린 식물체의 토양이식 순화는 크게 문제가 없는 것으로 나타났다. 일반적으로 조직배양묘의 실용화의 가장 큰 어려움은 배양묘의 토양이식 활착율이 저조한 것이 원인이 되는데, 서울오갈피 체세포배 묘의 토양이식은 본 발명의 결과 실용화가 가능한 것으로 나타났다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 연구자라면 하기의 특허청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 크게 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

도 1은 성숙종자로부터 유도된 서울오갈피의 배발생캘러스를 나타낸 사진이다.

도 2는 배발생 조직에서 유도된 서울오갈피의 체세포배를 나타낸 사진이다.

도 3은 서울오갈피의 체세포배가 뿌리를 내리면서 발아 후 식물체로 커가는 초기의 사진을 나타낸다.

도 4는 서울오갈피의 체세포배 발아 후 자엽이 커지고 배축이 신장하는 단계의 사진이다.

도 5는 서울오갈피의 체세포배가 발아하여 완전한 식물체로 재생된 사진이다.

도 6은 서울오갈피의 체세포배로부터 식물체를 재분화 한 다음 인공상토에 이식하여 순화시킨 어린 식물체의 사진이다.

도 7은 서울오갈피 성숙 종자로부터 배발생 조직 유도에 미치는 종자의 상처 처리 효과를 나타낸 것이다.

도 8은 서울오갈피 배발생 조직에서 체세포배 유도에 미치는 MS 배지 염류 농도의 효과를 나타낸 것이다.

도 9는 서울오갈피 배발생 조직에서 체세포배 유도에 미치는 슈크로즈 농도의 효과를 나타낸 것이다.

도 10은 서울오갈피 배발생 조직에서 체세포배 유도에 미치는 슈크로즈 및 PEG 효과를 나타낸 것이다.

도 11은 서울오갈피 배발생 조직에서 체세포배 유도체 미치는 ABA의 효과를 나타낸 것이다.

Claims

(1) 서울오갈피의 성숙 종자로부터 배발생 캘러스를 유도하는 단계; (2) 상기 배발생 캘러스로부터 3~7% 슈크로즈, 0.1~1.0% 겔라이트, 0.1~1.0 mg/L 에브시식산 (ABA; abscisic acid) 및 0.01~0.05% 활성탄 (activated charcoal)을 포함하는 MS 배지로 어뢰형 체세포배를 유도하는 단계; (3) 상기 어뢰형 체세포배로부터 배아 및 식물체 형성을 유도하는 단계; (4) 상기 식물체를 인공상토에 이식하여 식물체를 순화시키는 단계를 포함하는 서울오갈피의 기내번식방법.
제 1항에 있어서,

상기 (1) 단계에서, 서울오갈피의 성숙 종자는, 2~5% 슈크로즈 (sucrose), 0.1~1.0% 겔라이트 (gelite), 0.5~2.0 mg/L 2,4-디클로로페녹시 아세트산 (2,4-dichlorophenoxy acetic acid)와 0.005~0.02 mg/L 티디아주론 (TDZ; thidiazurone)을 포함하는 MS 배지로 배발생 캘러스를 유도하는 것을 특징으로 하는 기내번식방법.
제 1항에 있어서,

상기 (2) 단계에서, 22~25℃의 온도에서 4~8주간 암배양하여 어뢰형 체세포배를 유도하는 것을 특징으로 하는 기내번식방법.
제 1항에 있어서,

상기 (2)단계에서, 상기 MS 배지는 7~10% 피이지 (PEG; polyethylene glycol)를 포함하고, 슈크로즈의 농도는 1~3%로 포함되는 것을 특징으로 하는 기내번식방법.
제 1항에 있어서,

상기 (2)단계에서, 상기 MS 배지는 염류의 농도를 1/2 내지 2배로 포함하는 것을 특징으로 하는 기내번식방법.
제 1항에 있어서,

상기 (3) 단계에서, 배발생 캘러스로부터 유도된 어뢰형 체세포배는, 2~5% 슈크로즈, 0.3~1.0% 겔라이트 또는 0.5~1.0% 아가 (agar) 및 0.1~1.0 mg/L 지베렐릭산 (GA₃: gibberellic acid)을 포함하는 MS 배지로 배아 및 식물체의 형성을 유도하는 것을 특징으로 하는 기내번식방법.
제 1항에 있어서,

상기 (4) 단계에서, 어뢰형 체세포배로부터 형성된 식물체는 버미큘라이트 (vermiculrite), 펄라이트 (pelrite) 및 피트모쓰 (peatmoss) 로 이루어진 군에서 선택된 토양을 사용하는 것을 특징으로 하는 기내번식방법.
제 2항에 있어서,

상기 (1) 단계에서, 22~25℃의 온도에서 4~8주간 암배양하여 배발생 캘러스를 유도하는 것을 특징으로 하는 기내번식방법.
제 1항에 있어서,

상기 (1) 단계에서, 상기 성숙 종자에 상처를 내어 사용하는 것을 특징으로 하는 기내번식방법.
제 6항에 있어서,

상기 (3) 단계에서, 4~6주간 명배양하여 배아 및 식물체의 형성을 유도하는 것을 특징으로 하는 기내번식방법.