CN101699992A - 一种小麦试管苗叶片反复再生的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过小麦试管苗叶片的组织培养使小麦试管苗反复再生的方法，属于植物组织培养技术领域，其步骤包括：(1)胚性愈伤组织的诱导；(2)愈伤组织的继代培养；(3)试管苗的获得；(4)试管苗叶片诱导愈伤组织；(5)二次再生苗的诱导；(6)诱导生根；(7)二次再生苗的移栽。本发明所提供的小麦试管苗幼叶反复再生的方法成功解决了小麦试管苗反复再生难的问题，是国内外首次通过小麦试管苗幼叶建立起小麦试管苗反复再生体系，使运用叶绿体转基因技术获得同质化的叶绿体转基因小麦成为可能。经试验统计：通过使用本方法试管苗叶片诱导愈伤组织的频率及二次再生苗的频率分别达到了93％和66％以上。

Description

一种小麦试管苗叶片反复再生的方法
技术领域
本发明涉及一种小麦试管苗叶片再生的方法，尤其涉及一种通过小麦试管苗叶片的组织培养使小麦试管苗反复再生的方法，属于植物组织培养技术领域。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L)是我国的重要经济作物，是粮食的主要来源之一。为了改良小麦，目前所进行的小麦转基因研究，都是将目的基因转入细胞核。与细胞核转基因相比，叶绿体转基因具有表达量高、遗传稳定、环境友好等优点。而作为作物遗传改良新方向的叶绿体基因工程并未运用于小麦遗传性状的改良。这是由于小麦等禾谷类粮食作物很难利用绿色的叶组织进行反复再生，严重限制了其叶绿体转基因工作的开展。
国外的叶绿体基因工程应用主要集中在双子叶植物(Daniell et a1.2005)，例如烟草、马铃薯、番茄和胡萝卜等。这些植物之所以能够成功获得性状稳定遗传的改良植株，一个最主要原因是最初获得的叶绿体转基因杂合体可以在筛选过程中使绿色叶片或者绿色愈伤组织反复再生，在反复再生和筛选过程中，逐渐淘汰未转化的叶绿体和未转化的细胞，最终获得同质化的转化体——即叶绿体转基因纯合体(Grevich，J.J.2005)。而单子叶的禾谷类作物，如小麦、水稻等正是由于试管苗叶组织反复再生体系的缺乏，因而无法获得叶绿体转基因的纯合体(Sa Mi Lee et al.2006)，也极大地限制了利用绿色叶片作为受体材料开展叶绿体转基因研究。
自从陈惠民等(1980)首次通过小麦种子苗叶片组织培养获得再生苗以来，Ahuja(1982)、Alfinetta(1983)、Kopertekh(2003)、Chugh(2003)、郝建国(2003)、宣云(2004)等都通过不同的配方及培养条件获得了叶片诱导的再生植株。但是，他们都是以种子苗基部做为实验材料获得的再生苗，也就是只进行了一轮的再生。目前国内外尚未见到有通过胚性愈伤组织分化的试管苗(即再生苗)幼叶反复再生试管苗的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种小麦试管苗幼叶反复再生的方法，以解决小麦试管苗反复再生难的问题。
本发明所述反复再生体系：指可以通过组织培养过程循环获得再生苗的植物组织培养体系。
本发明所述小麦试管苗叶片反复再生方法，步骤包括：(1)胚性愈伤组织的诱导(2)愈伤组织的继代培养(3)试管苗的获得(4)试管苗叶片诱导愈伤组织(5)二次再生苗的诱导(6)诱导生根(7)二次再生苗的移栽；其中：
步骤(1)胚性愈伤组织诱导的方法是：取开花后14～16天的小麦未成熟麦穗，于体积比为75％酒精中浸3～8分钟灭菌；然后将未成熟麦粒从麦穗上剥下放至无菌培养皿中，腹沟向下将其夹住，用解剖针挑出幼胚；再挑选直径0.8～1.2mm的幼胚，盾片向上接种于愈伤组织诱导培养基I上，25±1℃，黑暗培养2～3周；获得胚性愈伤组织；
步骤(2)所述愈伤组织继代培养的方法是：取步骤(1)获得的愈伤组织，先切除其上由幼胚长出的胚芽，再把愈伤组织转移到胚性愈伤组织继代培养基上，光照强度为55～65μmol·m-2·s-1，光照时间10～14h·d-1，昼温度25±1℃进行昼夜光照周期培养，2～3周继代一次；
步骤(3)所述试管苗获得的方法是：将步骤(2)所述继代一次以上的胚性愈伤组织转至分化培养基I，光照强度为75～125μmol·m-2·s-1，光照时间14～18h·d-1，昼温度25±1℃进行昼夜光照周期培养，培养2～3周形成丛生试管苗；
步骤(4)所述试管苗叶片诱导愈伤组织的方法是：待步骤(3)培养的试管苗长到2～5cm，将其从愈伤组织上切下，取其叶基部1～3mm的叶段放至愈伤组织诱导培养基II上，25±1℃条件下暗培养3～4周，在叶段的切口处有3～4mm的愈伤组织团形成；
步骤(5)所述二次再生苗诱导的方法是：将步骤(4)中诱导形成的愈伤组织从叶段上剥离，然后转至分化培养基II上，按步骤(3)所述条件下进行昼夜光照周期培养3～4周，诱导出二次再生的试管苗；
步骤(6)所述诱导生根的方法是：将步骤(5)中获得的二次再生苗转至生根培养基，按步骤(3)所述的培养条件下进行昼夜光照周期培养3～4周，得生根植株；
步骤(7)所述二次再生苗移栽的方法是：将步骤(6)中生根的二次再生试管苗转至20±1℃温室条件下，打开培养瓶盖，炼苗2～4天后用镊子将苗夹出，用自来水洗去基部残留的培养基，移栽到装有混合育苗基质花盆中，相对湿度控制在50％～60％之间，经4～7天的适应之后，移至大田；
其中所述混合育苗基质的成分以体积比计为：营养土∶蛭石＝3∶1，花盆高度为15cm，花盆中所放育苗基质厚度为12cm。所述育苗基质购于山东省农业科学研究院。
上述方法各步中采用的培养基及其配方如下(表1)：
表1小麦试管苗反复再生方法中各培养基配方
 培养基名称   配方   作用
 愈伤组织诱导培养基I   MS基本成分+B5维生素+130～170mg/L谷氨酰胺+180～220mg/L水解酪蛋白+0.5～2mg/L2，4-D+6～8g/L琼脂+25～35g/L蔗糖，pH值5.7～5.9   用于幼胚诱导愈伤组织
 胚性愈伤组织继代培养基   MS基本成分+B5维生素+130～170mg/L谷氨酰胺+1～2mg/L2，4-D+6～8g/L琼脂+25～35g/L蔗糖，pH值5.7～5.9   用于胚性愈伤组织继代
 分化培养基I   MS基本成分+B5维生素+130～170mg/L谷氨酰胺+0.8～1.2mg/L6-BA+0.45～0.55mg/L IAA+5～7g/L琼脂+15～25g/L蔗糖，pH值5.6～5.8   用于愈伤组织分化长苗
 培养基名称   配方   作用
 愈伤组织诱导培养基II   MS基本成分+B5维生素+130～170mg/L L-天冬酰胺+1.7～2.3mg/L 2，4-D+0.8～1.2mg/L NAA+7～9g/L琼脂+15～25g/L蔗糖，pH值5.7～5.9   用于试管苗叶片诱导愈伤组织
 分化培养基II   MS基本成分+B5维生素+130～170mg/L谷氨酰胺+0.4～0.6mg/LTDZ+0.8～1.2mg/L6-BA+0.45～0.55mg/LIAA+5～15mg/L AgNO3+0.5～1.5mg/L TIBA+5～7g/L   用于二次再生苗的诱导
  琼脂+15～25g/L蔗糖，pH值5.6～5.8
  生根培养基   1/2MS基本成分(基本成分中除甘氨酸外其余成分浓度减半)+MS维生素+0.1～0.3mg/L IAA+4～6g/L琼脂+15～25g/L蔗糖，pH值5.6～5.8   用于二次再生苗诱导生根
表1中MS基本成分如下(表2)：
表2MS基本成分
表1中B5维生素和MS维生素如下(表3)：
表3B5维生素和MS维生素
Figure G2009102308158D0000032
上述步骤(1)培养条件优选为：25℃，黑暗培养2周，获得胚性愈伤组织。
其中愈伤组织诱导培养基I组成优选为：MS基本成分+B5维生素+146mg/L谷氨酰胺+200mg/L水解酪蛋白+1mg/L 2，4-D+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8。
上述步骤(2)培养条件优选为：光照强度为60μmol·m-2·s-1，光照时间12h·d-1，恒温度25℃进行昼夜光照周期培养，3周继代一次。
其中胚性愈伤组织继代培养基组成优选为：MS基本成分+B5维生素+146mg/L谷氨酰胺+2mg/L 2，4-D+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8。
上述步骤(3)培养条件优选为：光照强度为100μmol·m-2·s-1，光照时间16h·d-1，恒温度25℃进行昼夜光照周期培养。
其中分化培养基I组成优选为：MS基本成分+B5维生素+146mg/L谷氨酰胺+1mg/L6-BA+0.5mg/L IAA+6g/L琼脂+20g/L蔗糖，pH值5.8。
上述步骤(4)培养条件优选为：25℃，黑暗培养4周，获得愈伤组织。取材优选为：试管苗长到4cm，将其从愈伤组织上切下，取其叶基部2.0mm的叶段放至愈伤组织诱导培养基。
其中愈伤组织诱导培养基II组成优选为：MS基本成分+B5维生素+150mg/L L-天冬酰胺+2mg/L 2，4-D+1mg/L NAA+8g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8。
上述步骤(5)培养条件优选为：光照强度为100μmol·m-2·s-1，光照时间16h·d-1，恒温度25℃进行昼夜光照周期培养。
其中分化培养基II组成优选为：MS基本成分+B5维生素+146mg/L谷氨酰胺+0.5mg/LTDZ+1mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA+10mg/L AgNO3+1mg/L TIBA+6g/L琼脂+20g/L蔗糖，pH值5.7。
上述步骤(6)培养条件优选为：光照强度为100μmol·m-2·s-1，光照时间16h·d-1，恒温度25℃进行昼夜光照周期培养，3周获得生根植株。
其中生根培养基组成优选为：1/2MS基本成分(基本成分中除甘氨酸外其余成分浓度减半)+MS维生素+0.2mg/L IAA+ 5g/L琼脂+20g/L蔗糖，pH值5.7.
上述步骤(7)二次再生苗移栽具体方法优选为：将步骤(6)中生根的二次再生试管苗移至20℃温室条件下，打开培养瓶盖，炼苗3天后用镊子将苗夹出，用清水洗去基部残留的培养基，移栽到装有混合育苗基质花盆中，保持相对湿度在60％，经6天的适应之后，移至大田。
本发明的技术方案是先通过幼胚诱导胚性愈伤组织，然后通过胚性愈伤组织诱导分化获得试管苗，再通过试管苗诱导愈伤组织并分化出二次再生苗，最后再把二次再生苗移栽获得完整植株。
经试验统计：试管苗叶片诱导愈伤组织的频率及二次再生苗的频率分别达到了93％和66％以上，比之国内外通过小麦种子苗叶片诱导愈伤组织的频率72％(郝建国.2003)及再生频率11％(宣云.2004)、20％(郝建国.2003)、36％(Kopertekh.2003)都有较大提高。
反复再生体系是获得叶绿体转基因纯合体的关键环节，本发明所提供的小麦试管苗幼叶反复再生的方法成功解决了小麦试管苗反复再生难的问题，是国内外首次通过小麦试管苗幼叶建立小麦试管苗反复再生体系，通过试管苗幼叶诱导愈伤组织并获得了二次再生苗，使运用叶绿体转基因技术获得同质化的叶绿体转基因小麦成为可能。
附图说明
图1幼胚诱导的愈伤组织。
图2愈伤组织分化的试管苗。
图3试管苗叶片诱导的愈伤组织。
图4试管苗叶片愈伤组织诱导的二次再生苗。
图5二次再生苗的移栽。
具体实施方式
下面结合实施案例对本发明作进一步说明：
实施例1
取开花后14天的济南177小麦未成熟麦穗，于体积比为75％酒精中浸5分钟灭菌。将未成熟麦粒从麦穗上剥下放至无菌培养皿中，腹沟向下将其夹住，用解剖针挑出幼胚。选择直径1mm的幼胚，盾片向上接种于MS基本成分+B5维生素+146mg/L谷氨酰胺+200mg/L水解酪蛋白+1mg/L 2，4-D+7g/L琼脂+30g/L蔗糖的愈伤组织诱导培养基I上(pH值5.8)，25℃，黑暗培养。2周获得胚性愈伤组织，诱导率达到100％。
将诱导的愈伤组织上从幼胚直接长出的胚芽切除，再把诱导产生的愈伤组织转移至MS基本成分+B5维生素+146mg/L谷氨酰胺+2mg/L 2，4-D+7g/L琼脂+30g/L蔗糖的胚性愈伤组织继代培养基上(pH值5.8)，光照强度为60μmol·m-2·s-1，光照时间12h·d-1，恒温度25℃进行昼夜光照周期培养，3周继代一次。
将继代一次的胚性愈伤组织转至MS基本成分+B5维生素+146mg/L谷氨酰胺+1mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA+6g/L琼脂+20g/L蔗糖的分化培养基I上(pH值5.8)，光照强度为100μmol·m-2·s-1，光照时间16h·d-1，恒温度25℃进行昼夜光照周期培养，培养2周形成丛生试管苗，分化率达到98％。
待培养的丛生试管苗长到4cm，将其从愈伤组织上切下，取其叶基部2mm的叶段放至MS基本成分+B5维生素+150mg/L L-天冬酰胺+2mg/L 2，4-D+1mg/L NAA+8g/L琼脂+30g/L蔗糖的愈伤组织诱导培养基II上(pH值5.8)，25℃，暗培养4周，在叶段的切口处形成4mm的愈伤组织团，试管苗叶片愈伤组织诱导率达到97％。
将试管苗叶片诱导形成的愈伤组织从叶段上剥离，然后转至MS基本成分+B5维生素+146mg/L谷氨酰胺+0.5mg/LTDZ+1mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA+10mg/L AgNO3+1mg/LTIBA+6g/L琼脂+20g/L蔗糖的分化培养基II上(pH值5.7)，光照强度为100μmol·m-2·s-1，光照时间16h·d-1，恒温度25℃进行昼夜光照周期培养，培养3周诱导出二次再生的试管苗，试管苗叶片二次再生率达到72％。
将二次再生苗转至1/2MS基本成分(基本成分中除甘氨酸外其余成分浓度减半)+MS维生素+0.2mg/L IAA+5g/L琼脂+20g/L蔗糖的生根培养基上(pH值5.7)，光照强度为100μmol·m-2·s-1，光照时间16h·d-1，恒温度25℃进行昼夜光照周期培养3周，获得生根植株。
将生根的二次再生试管苗移至20℃温室条件下，打开培养瓶盖，炼苗3天后用镊子将苗夹出，用自来水洗去基部残留的培养基，移栽到装有混合育苗基质花盆中，利用加湿器保持相对湿度在60％，经6天的适应之后，移至大田，成活率达95％。
实施例2
取开花后15天的中国春小麦未成熟麦穗，于75％酒精中浸3分钟灭菌。将未成熟麦粒从麦穗上剥下放至无菌培养皿中，腹沟向下将其夹住，用解剖针挑出幼胚。选择直径0.8mm的幼胚，盾片向上接种于MS基本成分+B5维生素+130mg/L谷氨酰胺+180mg/L水解酪蛋白+0.5mg/L 2，4-D+6g/L琼脂+25g/L蔗糖的愈伤组织诱导培养基I上(pH值5.8)，25℃，黑暗培养。2周获得胚性愈伤组织，诱导率达到99％。
将诱导的愈伤组织上从幼胚直接长出的胚芽切除，再把诱导产生的愈伤组织转移至MS基本成分+B5维生素+130mg/L谷氨酰胺+1mg/L 2，4-D+6g/L琼脂+25g/L蔗糖的胚性愈伤组织继代培养基上(pH值5.8)，光照强度为60μmol·m-2·s-1，光照时间12h·d-1，恒温度25℃进行昼夜光照周期培养，2周继代一次。
将继代一次的胚性愈伤组织转至MS基本成分+B5维生素+130mg/L谷氨酰胺+0.8mg/L 6-BA+0.45mg/L IAA+6g/L琼脂+20g/L蔗糖的分化培养基I上(pH值5.8)，光照强度为100μmol·m-2·s-1，光照时间16h·d-1，恒温度25℃进行昼夜光照周期培养，培养2周形成丛生试管苗，分化率达到91％。
待培养的丛生试管苗长到2cm，将其从愈伤组织上切下，取其叶基部1mm的叶段放至MS基本成分+B5维生素+130mg/L L-天冬酰胺+1.7mg/L 2，4-D+0.5mg/L NAA+7g/L琼脂+25g/L蔗糖的愈伤组织诱导培养基II上(pH值5.8)，24℃，暗培养3周，在叶段的切口处形成3mm的愈伤组织团，试管苗叶片愈伤组织诱导率达到90％。
将试管苗叶片诱导形成的愈伤组织从叶段上剥离，然后转至MS基本成分+B5维生素+130mg/L谷氨酰胺+0.4mg/LTDZ+0.8mg/L 6-BA+0.45mg/L IAA+5mg/L AgNO3+0.5mg/LTIBA+5g/L琼脂+15g/L蔗糖的分化培养基II上(pH值5.7)，光照强度为100μmol·m-2·s-1，光照时间16h·d-1，恒温度25℃进行昼夜光照周期培养，4周诱导出二次再生的试管苗，试管苗叶片二次再生率达到66％。
将二次再生苗转至1/2MS基本成分(基本成分中除甘氨酸外其余成分浓度减半)+MS维生素+0.1mg/L IAA+4g/L琼脂+15g/L蔗糖的生根培养基上(pH值5.7)，光照强度为100μmol·m-2·s-1，光照时间16h·d-1，恒温度25℃进行昼夜光照周期培养，4周获得生根植株。
将生根的二次再生试管苗移至20℃温室条件下，打开培养瓶盖，炼苗2天后用镊子将苗夹出，用自来水洗去基部残留的培养基，移栽到装有混合育苗基质花盆中，利用加湿器保持相对湿度在50％，经5天的适应之后，移至大田，成活率达90％。
实施例3
取开花后16天的核生3号小麦未成熟麦穗，于75％酒精中浸8分钟灭菌。将未成熟麦粒从麦穗上剥下放至无菌培养皿中，腹沟向下将其夹住，用解剖针挑出幼胚。选择直径1.2mm的幼胚，盾片向上接种于MS基本成分+B5维生素+170mg/L谷氨酰胺+220mg/L水解酪蛋白+2mg/L 2，4-D+8g/L琼脂+35g/L蔗糖的愈伤组织诱导培养基I上(pH值5.8)，25℃，黑暗培养。2周获得胚性愈伤组织，诱导率达到100％。
将诱导的愈伤组织上从幼胚直接长出的胚芽切除，再把诱导产生的愈伤组织转移至MS基本成分+B5维生素+170mg/L谷氨酰胺+2mg/L 2，4-D+8g/L琼脂+35g/L蔗糖的胚性愈伤组织继代培养基上(pH值5.8)，进行昼夜光照周期培养，光照强度为60μmol·m-2·s-1，光照时间12h·d-1，昼温度25℃，3周继代一次。
将继代一次的胚性愈伤组织转至MS基本成分+B5维生素+170mg/L谷氨酰胺+1.2mg/L 6-BA+0.55mg/L IAA+6g/L琼脂+25g/L蔗糖的分化培养基I上(pH值5.8)，光照强度为100μmol·m-2·s-1，光照时间16h·d-1，恒温度25℃进行昼夜光照周期培养，培养2周形成丛生试管苗，分化率达到95％。
待培养的丛生试管苗长到5cm，将其从愈伤组织上切下，取其叶基部3mm的叶段放至MS基本成分+B5维生素+170mg/L L-天冬酰胺+2.3mg/L 2，4-D+1.5mg/L NAA+9g/L琼脂+35g/L蔗糖的愈伤诱导培养基II上(pH值5.8)，25℃，暗培养4周，在叶段的切口处形成4mm的愈伤组织团，试管苗叶片愈伤组织诱导率达到87％。
将试管苗叶片诱导形成的愈伤组织从叶段上剥离，然后转至MS基本成分+B5维生+170mg/L谷氨酰胺+0.6mg/L TDZ+1.2mg/L 6-BA+0.55mg/L IAA+15mg/L AgNO3+1.5mg/LTIBA+7g/L琼脂+25g/L蔗糖的分化培养基II上(pH值5.6)，光照强度为100μmol·m-2·s-1，光照时间16h·d-1，恒温度25℃进行昼夜光照周期培养3周，诱导出二次再生的试管苗，试管苗叶片二次再生率达到70％。
将二次再生苗转至1/2MS基本成分(基本成分中除甘氨酸外其余成分浓度减半)+MS维生素+0.3mg/L IAA+5g/L琼脂+25g/L蔗糖的生根培养基上(pH值5.7)，光照强度为100μmol·m-2·s-1，光照时间16h·d-1，恒温度25℃进行昼夜光照周期培养3周，获得生根植株。
将生根的二次再生试管苗移至20℃温室条件下，打开培养瓶盖，炼苗3天后用镊子将苗夹出，用自来水洗去基部残留的培养基，移栽到装有混合育苗基质花盆中，利用加湿器保持相对湿度在60％，经7天的适应之后，移至大田，成活率达97％。
本发明方法实施中所用小麦济南177、中国春、核生3号均购自山东省农业科学院，其中中国春小麦是国际通用的实验用麦，济南177和核生3号是山东省普遍种植的小麦品种。

Claims (7)

1.一种小麦试管苗叶片反复再生方法，步骤包括：(1)胚性愈伤组织的诱导(2)愈伤组织的继代培养(3)试管苗的获得(4)试管苗叶片诱导愈伤组织(5)二次再生苗的诱导(6)诱导生根(7)二次再生苗的移栽；其特征在于：
步骤(1)胚性愈伤组织诱导的方法是：取开花后14～16天的小麦未成熟麦穗，于体积比为75％酒精中浸3～8分钟灭菌；然后将未成熟麦粒从麦穗上剥下放至无菌培养皿中，腹沟向下将其夹住，用解剖针挑出幼胚；再挑选直径0.8～1.2mm的幼胚，盾片向上接种于愈伤组织诱导培养基I上，25±1℃，黑暗培养2～3周；获得胚性愈伤组织；
步骤(2)愈伤组织继代培养的方法是：取步骤(1)获得的愈伤组织，先切除其上由幼胚长出的胚芽，再把愈伤组织转移到胚性愈伤组织继代培养基上，光照强度为55～65μmol·m-2·s-1，光照时间10～14h·d-1，昼温度25±1℃进行昼夜光照周期培养，2～3周继代一次；
步骤(3)试管苗获得的方法是：将步骤(2)所述继代一次以上的胚性愈伤组织转至分化培养基I，光照强度为75～125μmol·m-2·s-1，光照时间14～18h·d-1，昼温度25±1℃进行昼夜光照周期培养，培养2～3周形成丛生试管苗；
步骤(4)试管苗叶片诱导愈伤组织的方法是：待步骤(3)培养的试管苗长到2～5cm，将其从愈伤组织上切下，取其叶基部1～3mm的叶段放至愈伤组织诱导培养基II上，25±1℃条件下暗培养3～4周，在叶段的切口处有3～4mm的愈伤组织团形成；
步骤(5)二次再生苗诱导的方法是：将步骤(4)中诱导形成的愈伤组织从叶段上剥离，然后转至分化培养基II上，光照强度为75～125μmol·m-2·s-1，光照时间14～18h·d-1，昼温度25±1℃进行昼夜光照周期培养3～4周，诱导出二次再生的试管苗；
步骤(6)诱导生根的方法是：将步骤(5)中获得的二次再生苗转至生根培养基，光照强度为75～125μmol·m-2·s-1，光照时间14～18h·d-1，昼温度25±1℃进行昼夜光照周期培养3～4周，得生根植株；
步骤(7)所述二次再生苗移栽的方法是：将步骤(6)中生根的二次再生试管苗转至20±1℃温室条件下，打开培养瓶盖，炼苗2～4天后用镊子将苗夹出，用自来水洗去基部残留的培养基，移栽到装有混合育苗基质花盆中，相对湿度控制在50％～60％之间，经4～7天的适应，移至大田；
其中：上述混合育苗基质的成分以体积比计为：营养土∶蛭石＝3∶1，花盆高度为15cm，花盆中所放育苗基质厚度为12cm；
上述愈伤组织诱导培养基II配方是：MS基本成分+B5维生素+130～170mg/L L-天冬酰胺+1.7～2.3mg/L 2，4-D+0.8～1.2mg/L NAA+7～9g/L琼脂+15～25g/L蔗糖，pH值5.7～5.9；
上述分化培养基II配方是：MS基本成分+B5维生素+130～170mg/L谷氨酰胺+0.4～0.6mg/L TDZ+0.8～1.2mg/L 6-BA+0.45～0.55mg/L IAA+5～15mg/L AgNO3+0.5～1.5mg/LTIBA+5～7g/L琼脂+15～25g/L蔗糖，pH值5.6～5.8；
上述MS基本成分及B5维生素为：
Figure F2009102308158C0000021
2.如权利要求1所述的小麦试管苗叶片反复再生方法，其特征在于：步骤(1)培养条件为：25℃，黑暗培养2周；其中：愈伤组织诱导培养基I组成为：MS基本成分+B5维生素+146mg/L谷氨酰胺+200mg/L水解酪蛋白+1mg/L 2，4-D+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8。
3.如权利要求1所述的小麦试管苗叶片反复再生方法，其特征在于：步骤(2)培养条件为：以光照强度为60μmol·m-2·s-1，光照时间12h·d-1，昼温度25℃条件进行昼夜光照周期培养，3周继代一次；其中：胚性愈伤组织继代培养基组成为：MS基本成分+B5维生素+146mg/L谷氨酰胺+2mg/L 2，4-D+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8。
4.如权利要求1所述的小麦试管苗叶片反复再生方法，其特征在于：步骤(3)培养条件为：以光照强度为100μmol·m-2·s-1，光照时间16h·d-1，昼温度25℃进行昼夜光照周期培养；其中：分化培养基I组成为：MS基本成分+B5维生素+146mg/L谷氨酰胺+1mg/L6-BA+0.5mg/L IAA+6g/L琼脂+20g/L蔗糖，pH值5.8。
5.如权利要求1所述的小麦试管苗叶片反复再生方法，其特征在于：步骤(4)培养条件为：25℃，黑暗培养4周；其中：愈伤组织诱导培养基II组成为：MS基本成分+B5维生素+150mg/L L-天冬酰胺+2mg/L 2，4-D+1mg/L NAA+8g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8。
6.如权利要求1所述的小麦试管苗叶片反复再生方法，其特征在于：步骤(5)培养条件为：以光照强度为100μmol·m-2·s-1，光照时间16h·d-1，昼温度25℃进行昼夜光照周期培养；其中：分化培养基II组成为：MS基本成分+B5维生素+146mg/L谷氨酰胺+0.5mg/LTDZ+1mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA+10mg/L AgNO3+1mg/L TIBA+6g/L琼脂+20g/L蔗糖，pH值5.7。
7.如权利要求1所述的小麦试管苗叶片反复再生方法，其特征在于：步骤(6)培养条件为：以光照强度为100μmol·m-2·s-1，光照时间16h·d-1，昼温度25℃进行昼夜光照周期培养3周；其中：生根培养基组成优选为：1/2MS基本成分+MS维生素+0.2mg/L IAA+5g/L琼脂+20g/L蔗糖，pH值5.7；
其中：所述MS维生素配方如下：
Figure F2009102308158C0000031
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