CN102524063A - 高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法，包括：培养无菌外植体步骤，对桉树杂交品种的带腋芽茎段依次进行消毒子步骤、腋芽萌发培养子步骤、丛生芽培养子步骤、生根苗培养子步骤及白化苗培养子步骤，获得白化苗作为无菌外植体；愈伤组织的诱导步骤，将无菌外植体切段后接种到B5培养基上进行愈伤诱导，先暗培养再弱光照培养，形成愈伤组织；芽诱导培养分化不定芽步骤，将愈伤组织转移到芽诱导分化培养基上培养，每隔14-25天转移到成分相同的芽诱导分化培养基上继代培养，使愈伤组织分化不定芽。本发明以桉树白化苗茎段为无菌外植体，经愈伤组织诱导和芽诱导分化出不定芽，可用于DH32-29及其它优良杂交种无性系，高效稳定，再生效率高于70%。
Description
技术领域
本发明涉及生物组织培养育苗技术领域，尤其涉及一种高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法。
背景技术
桉树是桃金娘科（Myrtaceae）桉属（Eucalyptus）植物的统称。广泛分布于亚洲、南美洲和欧洲的一些地区，全球种植面积达二千万多公顷。桉树品种多，包括杂交品种有700多种，在这些品种当中有些品种具有重要的经济价值，如可作为纸浆、木材、纤维板材以及提取单宁和精油等原材料。桉树具有速生，丰产，适应性强，生产周期短，收获后多发芽再生等优点。目前已被多个国家和地区广泛种植。桉树人工林面具约占世界人工林总面积的三分之一。因此桉树具有广泛的开发利用价值。
由于林木生长周期长，遗传杂合性高，许多性状属于多基因控制的数量性状，传统的常规育种手段难以满足定向培育桉树新品种的要求。因此人们希望利用新兴的基因工程技术来解决桉树常规育种难以解决的问题，定向地培育出经济价值高的性状。基因工程育种是以现代分子生物学技术为基础，将目的基因通过体外重组导入受体细胞，然后再生出完整植株以培育出新品种的一种技术手段。它具有高效性和针对性，可弥补常规育种技术的不足，可以加速优质、高产、抗逆性强等桉树新品种的选育。
目前，桉树再生率低，实验材料主要以种子为基础，变异较大，很大程度上制约了桉树转基因技术的进展，完善的植物转化受体系统依赖于高效稳定的再生能力和稳定的外植体来源。对于广泛栽培的DH32-29等杂交优良无性系，实现转基因育种，筛选出优良的转基因株系，寻求高效稳定的再生率成为急需解决的技术难题。
发明内容
本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供一种高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法，以便快速、高效、稳定地繁殖并选育优良品种。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法，包括如下步骤：
培养无菌外植体步骤，以2-4年生桉树杂交品种的带腋芽茎段为培养原材料，依次进行消毒子步骤、腋芽萌发培养子步骤、丛生芽培养子步骤、生根苗培养子步骤及白化苗培养子步骤，获得白化苗作为无菌外植体；
愈伤组织的诱导步骤，将无菌外植体切段成合适的长度，接种到含0.05-2.0mg/L N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲、0.01-0.1mg/L萘乙酸、10-500mg/L腐胺和1-50mg/L亚精胺的B5培养基上进行愈伤诱导，先暗培养5-15天，再弱光照培养5-20天，形成愈伤组织；
芽诱导培养分化不定芽步骤，将愈伤组织转移到芽诱导分化培养基上培养，且每隔14-25天转移到成分相同的芽诱导分化培养基上继代培养14-100天，使愈伤组织分化不定芽，所述芽诱导分化培养基是含有10-40mg/L腐胺，0.5-3.0mg/L亚精胺的B5培养基。
进一步地，培养无菌外植体步骤中，所述消毒处理是采用酒精和升汞对培养原材料进行泡洗消毒，并用无菌水冲洗。
进一步地，腋芽萌发培养子步骤中，采用的培养基是MS培养基，培养条件是：温度22-30℃，无光照。
进一步地，丛生芽培养子步骤中，采用的培养基是含0.1-2.0mg/L细胞分裂素和0.01-1.0mg/L生长素的MS培养基，培养条件是：诱导培养21-28天，光照12-18小时/天，光照强度1500-10000lx，温度22-30℃。
进一步地，生根苗培养子步骤中，采用的培养基是含0.1-1.0mg/L生长素的1/2MS培养基，生根诱导培养的条件是，诱导培养15-30天，光照12-18小时/天，光照强度1500-10000lx，温度22-30℃。
进一步地，白化苗培养子步骤中，采用的培养基是含蔗糖30-100g/L的B5培养基，培养条件是：暗培养14-35天，温度22-30℃。
进一步地，愈伤组织的诱导步骤中，外植体的切段长度为2-10mm，培养时温度22-30℃；弱光照培养时，光照12-18小时/天，光照强度20-200lx，22-30℃。
进一步地，芽诱导培养分化不定芽步骤中，所述芽诱导分化培养基还含有0.2-2.0mg/L细胞分裂素，0.05-0.5mg/L生长素，培养条件是：光照12-18小时/天，光照强度500-3000lx，温度22-30℃。
进一步地，所述丛生芽培养子步骤以及芽诱导培养分化不定芽步骤中，所述细胞分裂素为6-苄基嘌呤，生长素为萘乙酸；而生根苗培养子步骤中使用的生长素为3-吲哚丁酸。
通过采用上述技术方案，本发明至少具有如下有益效果：本发明利用桉树白化苗的茎段为无菌外植体，经愈伤组织诱导和芽诱导途径诱导出不定芽，可以应用于DH32-29及其它优良杂交种无性系，具有高效稳定的特点，再生效率可达70%以上，为利用现代分子育种技术对桉树的遗传改良奠定了良好的基础，可以用于目的基因导入受体细胞等基因工程，具有十分重要的经济价值。
具体实施方式
下面结合实例详述描述本发明的实施方案。需要说明的是，下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。
本发明提供一种高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法，包括如下步骤：
S1、培养无菌外植体步骤，以2-4年生桉树杂交品种的带腋芽茎段为培养原材料，依次进行消毒子步骤、腋芽萌发培养子步骤、丛生芽培养子步骤、生根苗培养子步骤及白化苗培养子步骤，获得白化苗作为无菌外植体；
S2、愈伤组织的诱导步骤，将无菌外植体切段成合适的长度，接种到含0.05-2.0mg/L N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲、0.01-0.1mg/L萘乙酸、10-500mg/L腐胺和1-50mg/L亚精胺的B5培养基上进行愈伤诱导，先暗培养5-15天，再弱光照培养5-20天，形成愈伤组织；
S3、芽诱导培养分化不定芽步骤，将愈伤组织转移到芽诱导分化培养基上培养，且每隔14-25天转移到成分相同的芽诱导分化培养基上继代培养14-100天，使愈伤组织分化不定芽，所述芽诱导分化培养基是含有10-40mg/L腐胺，0.5-3.0mg/L亚精胺的B5培养基。
其中，培养无菌外植体步骤主要包括如下子步骤：
S1.1、消毒子步骤，所述消毒处理是采用酒精和升汞对培养原材料进行泡洗消毒，并用无菌水冲洗，具体可采用如下处理：先以体积百分比70%乙醇浸泡20秒，再以无菌水冲洗2次；然后，以质量百分比0.1%升汞浸泡5分钟，再倒出升汞，用无菌水冲洗4-6次；然后，再修剪成0.5-1.0cm长的带腋芽的茎段，以质量百分比0.1%升汞浸泡2分钟，倒出升汞，用无菌水冲洗4-6次。由于，对培养原材料的消毒处理在本领域中已经是相当成熟的技术手段，本发明可以直接采用本领域中现有的各种有效消毒处理手段，对于实施效果并不会产生实质性的影响。
S1.2、腋芽萌发培养子步骤中，采用的培养基是MS培养基，培养条件是：温度22-30℃，无光照。
S1.3、丛生芽培养子步骤中，采用的培养基是含0.1-2.0mg/L细胞分裂素和0.01-1.0mg/L生长素的MS培养基，所述细胞分裂素优选为6-苄基嘌呤，生长素优选为萘乙酸，培养条件是：诱导培养21-28天，光照12-18小时/天，光照强度1500-10000lx，温度22-30℃。
S1.4、生根苗培养子步骤中，采用的培养基是含0.1-1.0mg/L生长素的1/2MS培养基，本子步骤中，所述生长素为3-吲哚丁酸，生根诱导培养的条件是，诱导培养15-30天，光照12-18小时/天，光照强度1500-10000lx，温度22-30℃。
S1.5、白化苗培养子步骤中，采用的培养基是含蔗糖30-100g/L的B5培养基，培养条件是：暗培养14-35天，温度22-30℃。
而在愈伤组织的诱导步骤中，外植体的切段长度为2-10mm，培养时温度22-30℃；弱光照培养时，光照12-18小时/天，光照强度20-200lx，22-30℃。
在芽诱导培养分化不定芽步骤中，所述芽诱导分化培养基还含有0.2-2.0mg/L细胞分裂素，0.05-0.5mg/L生长素，所述细胞分裂素优选为6-苄基嘌呤，生长素优选为萘乙酸，培养条件是：光照12-18小时/天，光照强度500-3000lx，温度22-30℃。
本发明主要利用白化苗的茎段为无菌外植体，经愈伤组织再生途径和芽诱导途径分化出芽，其中，再生途径包含由分化的体细胞经脱分化形成愈伤组织和芽诱导分化形成芽。该再生途径可以用于将目的基因导入受体细胞，然后再生长出完整植株，从而可实现对桉树，特别是对杂交品种的桉树，如DH32-29及其它优良无性系，进行定向的遗传改良。
下面结合实例详述描述本发明的实施方案。需要说明的是，下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。
实例1：
具体实施时，本实例包括以下步骤：
首先，选取DH32-29三年生植株，砍掉树冠部分，保留1-1.5m高的树桩，1个月后采集新生的萌芽条，切成2.0cm长的带腋芽的茎段，体积百分比70%乙醇中浸泡20秒，无菌水冲洗2次，然后在质量百分比0.1%氯化汞中消毒5分钟，无菌水冲洗4次，修剪成1.0cm长的带腋芽的茎段，再于质量百分比0.1%氯化汞中消毒2分钟，无菌水冲洗6次，晾干后备用。
其次，将晾干的带腋芽的茎段接种在MS培养基中，每瓶接1-2颗，25℃暗培养28天，得到萌发的腋芽。
第三步，切取1.0cm长的腋芽，转移到含0.1mg/L 6-苄基嘌呤，0.01mg/L萘乙酸的MS培养基上，每隔23天转移到相同的培养基上继代培养，光照16小时/天，光照强度3000lx，温度25℃。
第四步，切取生长至1.5cm长的芽，转移到含0.5mg/L 3-吲哚丁酸的1/2MS培养基上进行生根诱导20天，光照16小时/天，光照强度3000lx，温度25℃。
第五步，将生根苗切掉顶芽，保留根和基部的2个腋芽，接种在含蔗糖70g/L的B5培养基上进行白化苗诱导培养，暗培养23天，温度25℃，从而获得白化苗。
第六步，以白化苗的3mm的茎段切段为外植体，本实例中共535块外植体，将外植体接种在含0.2mg/L N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲，0.02mg/L萘乙酸，80mg/L腐胺，15mg/L亚精胺的B5培养基上，暗培养5天，温度25℃。
第七步，转移到弱光照培养14天，光照16小时/天，光照强度50lx，温度25℃，从而获得脱分化的愈伤组织共535块。
第八步，将获得的愈伤组织，转移到含0.5mg/L 6-苄基嘌呤，0.1mg/L萘乙酸，15mg/L腐胺，1.5mg/L亚精胺的B5培养基上，每隔21天转移到相同的芽诱导分化培养基上继代培养，光照16小时/天，光照强度1500lx，温度25℃。在芽诱导分化培养基上继代培养40天产生不定芽，共454块。
实例2：
具体实施时，本实例包括以下步骤：
首先，选取DH32-29两年生植株，砍掉树冠部分，保留1-1.5m高的树桩。1个月后采集新生的萌芽条，切成2.0cm长的带腋芽的茎段，体积百分比70%乙醇中浸泡20秒，无菌水冲洗2次，然后在质量百分比0.1%氯化汞中消毒5分钟，无菌水冲洗4次，修剪成1.0cm长的带腋芽的茎段，再于质量百分比0.1%氯化汞中消毒2分钟，无菌水冲洗6次，晾干后备用。
其次，晾干的带腋芽的茎段接种在MS培养基中，每瓶接1-2颗，25℃暗培养28天，得到萌发的腋芽。
第三步，切取1.0cm长的腋芽，转移到含0.2mg/L 6-苄基嘌呤，0.02mg/L萘乙酸的MS培养基上，每隔23天转移到相同的培养基上继代培养，光照16小时/天，光照强度3000lx，温度25℃。
第四步，切取生长至1.5cm长的芽，转移到含0.5mg/L 3-吲哚丁酸的1/2MS培养基上进行生根诱导20天，光照16小时/天，光照强度3000lx，温度25℃。
第五步，将生根苗切掉顶芽，保留根和基部的2个腋芽，接种在含蔗糖50g/L的B5培养基上进行白化苗诱导培养，暗培养23天，温度25℃，从而获得白化苗。
第六步，以白化苗的3mm的茎段切段为外植体，本实例中共63块外植体，接种在含0.5mg/L N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲，0.1mg/L萘乙酸，100mg/L腐胺，30mg/L亚精胺的B5培养基上，暗培养5天，温度25℃。
第七步，转移到弱光照培养14天，光照16小时/天，光照强度50lx，温度25℃，从而获得脱分化的愈伤组织共63块。
第八步，将获得的愈伤组织，转移到含0.2mg/L 6-苄基嘌呤，0.02mg/L萘乙酸，15mg/L腐胺，1.5mg/L亚精胺的B5培养基上，每隔21天转移到相同的芽诱导培养基上继代培养，光照16小时/天，光照强度1500lx，温度25℃，最后，在芽诱导培养基上继代培养40天产生不定芽，共60块。
实例3：
结合表3所示愈伤组织分化率，本例中诱导桉树茎段产生愈伤组织并分化出芽的方法，选取广林九号两年生植株，除愈伤组织诱导培养基中N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲的含量改为0.4 mg/L之外，其余各步骤均和实例1相同。本例中，白化苗茎段外植体共110块，经脱分化形成愈伤组织110块，然后愈伤组织再分化出不定芽，共80块。
以上三个实例中，愈伤组织的分化效率分别如下表1所示：
表1 实例1~3中的愈伤组织分化率
| 序号 | 外植体总数（块） | 愈伤组织数（块） | 分化愈伤组织数（块） | 再生效率（%） |
| 实例1 | 535 | 535 | 454 | 84.9 |
| 实例2 | 63 | 63 | 60 | 95.2 |
| 实例3 | 110 | 110 | 80 | 72.7 |
由上述实例及表1的分化率数据可知，本发明利用白化苗的茎段，经愈伤组织诱导和芽诱导，再生率在70%以上，具有很好的稳定性，为能实现对桉树，特别是DH32-29及其他杂交品种进行遗传改造奠定了良好的基础。
Claims (10)
1. 一种高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法，其特征在于，包括如下步骤：
培养无菌外植体步骤，以2-4年生桉树杂交品种的带腋芽茎段为培养原材料，依次进行消毒子步骤、腋芽萌发培养子步骤、丛生芽培养子步骤、生根苗培养子步骤及白化苗培养子步骤，获得白化苗作为无菌外植体；
愈伤组织的诱导步骤，将无菌外植体切段成合适的长度，接种到含0.05-2.0mg/L N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲、0.01-0.1mg/L萘乙酸、10-500mg/L腐胺和1-50mg/L亚精胺的B5培养基上进行愈伤诱导，先暗培养5-15天，再弱光照培养5-20天，形成愈伤组织；
芽诱导培养分化不定芽步骤，将愈伤组织转移到芽诱导分化培养基上培养，且每隔14-25天转移到成分相同的芽诱导分化培养基上继代培养14-100天，使愈伤组织分化不定芽，所述芽诱导分化培养基是含有10-40mg/L腐胺，0.5-3.0mg/L亚精胺的B5培养基。
2. 根据权利要求1所述的高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法，其特征在于：培养无菌外植体步骤中，所述消毒处理是采用酒精和升汞对培养原材料进行泡洗消毒，并用无菌水冲洗。
3. 根据权利要求1所述的高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法，其特征在于：腋芽萌发培养子步骤中，采用的培养基是MS培养基，培养条件是：温度22-30℃，无光照。
4. 根据权利要求1所述的高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法，其特征在于：丛生芽培养子步骤中，采用的培养基是含0.1-2.0mg/L细胞分裂素和0.01-1.0mg/L生长素的MS培养基，培养条件是：诱导培养21-28天，光照12-18小时/天，光照强度1500-10000lx，温度22-30℃。
5. 根据权利要求1所述的高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法，其特征在于：生根苗培养子步骤中，采用的培养基是含0.1-1.0mg/L生长素的1/2MS培养基，生根诱导培养的条件是，诱导培养15-30天，光照12-18小时/天，光照强度1500-10000lx，温度22-30℃。
6. 根据权利要求5所述的高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法，其特征在于：所述生长素为3-吲哚丁酸。
7. 根据权利要求1所述的高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法，其特征在于：白化苗培养子步骤中，采用的培养基是含蔗糖30-100g/L的B5培养基，培养条件是：暗培养14-35天，温度22-30℃。
8. 根据权利要求1所述的高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法，其特征在于：愈伤组织的诱导步骤中，外植体的切段长度为2-10mm，培养时温度22-30℃；弱光照培养时，光照12-18小时/天，光照强度20-200lx，22-30℃。
9. 根据权利要求1所述的高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法，其特征在于：芽诱导培养分化不定芽步骤中，所述芽诱导分化培养基还含有0.2-2.0mg/L细胞分裂素，0.05-0.5mg/L生长素，培养条件是：光照12-18小时/天，光照强度500-3000lx，温度22-30℃。
10. 根据权利要求4或9所述的高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法，其特征在于：所述细胞分裂素为6-苄基嘌呤，所述生长素为萘乙酸。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120704 |