CN102845309B - 一种通过红姜花体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过红姜花体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法。该方法以红姜花未成熟的花丝和花药为外植体进行愈伤组织的诱导，经过优化、筛选、继代培养获得高质量的胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织进行悬浮培养，建立红姜花的胚性细胞悬浮培养系。利用胚性细胞悬浮培养物进行体胚诱导可获得大量体胚，采用SH无机盐、150μg·L-1TDZ时可获得最佳效果，其体胚发生频率可达到4429个/mL SCV；所获得的体胚在体胚萌发培养基上可萌发出带有芽、根的幼苗，当以SH为基本培养基、6-BA为0.5～1.0mg·L-1时，体胚的萌发频率可达100%。本发明为红姜花的离体快速繁殖和生物技术育种奠定基础，有利于大规模的推广应用，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于姜科（Zingiberaceae）姜花属（Hedychium）生物技术育种领域，特别涉及一种通过红姜花（Hedychium coccineum Buch.-Ham）体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法。通过该方法能够建立红姜花胚性细胞悬浮培养系（embryogenic cell suspensions,ECS），以及从胚性细胞悬浮培养系获得高效的体细胞胚胎发生频率，成功建立高效的植株再生体系。
背景技术
红姜花（Hedychium coccineum Buch.-Ham）为姜科姜花属（Hedychium）多年生草本植物，分布于我国西藏、云南和广西一带，沿喜马拉雅诸国及斯里兰卡、缅甸及越南也有分布。红姜花是姜花属中的珍品，观赏价值极高，鲜红色的穗状花序，宜做高档鲜切花或园林绿化使用；红姜花的花红色艳丽、花型美丽，似群蝶飞舞，也是极好的花卉育种材料。但红姜花主要通过无性分株进行繁殖，分生能力弱，自然状态下繁殖系数低，不耐移植，远远不能满足大规模生产的需要；红姜花鲜切花插花期只有3～5天，植株高达2米，也限制了其作为观赏花卉的商业价值。因此，提高红姜花繁殖系数、培育鲜切花瓶插期长、矮化的红姜花新品种是加快红姜花农业生产规模化和品种改良的有效措施。包括离体快繁技术、体外诱变、转基因、体细胞杂交等生物技术方式是进行红姜花大规模快繁和进行品种改良的有效手段。建立稳定的红姜花胚性细胞悬浮培养系及经体胚发生途径的高效的植株再生体系则是实现红姜花生物技术育种的有效前提条件。目前还没有关于红姜花ECS的建立以及通过ECS进行高频体胚发生再生植株的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过红姜花体细胞胚胎（体胚）发生途径高效再生植株的方法。该方法首次建立红姜花的胚性细胞悬浮培养系，并提供一种通过体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法，为红姜花的离体快速繁殖和生物技术育种奠定基础。
本发明的目的通过下述方案实现：一种通过红姜花体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法，包括如下步骤：
（1）愈伤组织的诱导和胚性愈伤组织的优化增殖：以红姜花未成熟的花丝和/或花药为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导培养出愈伤组织；将诱导出的愈伤组织继代培养在愈伤组织优化与增殖培养基上，得到黄白色粉状的胚性愈伤组织；
（2）均一稳定的胚性细胞悬浮培养系的建立：将步骤（1）的黄白色粉状的胚性愈伤组织0.5～2.0g转入液体培养基中，置于90～110rpm摇床上悬浮培养1～2个月，得到分散、均质的胚性细胞悬浮培养系；
（3）体细胞胚胎的诱导：取步骤（2）得到的胚性细胞悬浮培养系，调整细胞密度为10%SCV悬浮培养物（settled cell volume，简称SCV，是指悬浮细胞静置后所得的细胞沉淀体积），取0.5～2.0mL 10%SCV悬浮培养物接种于体胚诱导培养基中，置于28±1℃黑暗中进行体细胞胚胎诱导，得到成熟体细胞胚胎；
（4）体细胞胚胎的萌发及其植株再生：将步骤（3）诱导出的成熟体细胞胚胎转入体胚萌发培养基中，置于28±1℃黑暗培养，待叶鞘抽出后，将其转至生根壮苗培养基中继续培养，进一步发育成健壮的红姜花再生小植株；
步骤（1）中：
所述的红姜花优选为6月中旬到7月中旬的红姜花未成熟的花序小花；
所述的花序小花优选采用以下方法进行前处理：取红姜花未成熟的花序小花，用自来水冲洗30min，然后用0.1wt%HgCl2消毒8～12min，用无菌水冲洗4～6遍，剥除外部苞片，切取花药和/或花丝备用；
所述的愈伤组织诱导培养基的组成为：MS培养基+（2～4）mg·L-12,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）+（2～4）mg·L-1NAA（萘乙酸）+1mg·L-16-BA（6-苄基腺嘌呤）+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
优选的，所述的愈伤组织诱导培养基的组成为：MS培养基+4mg·L-12,4-D+4mg·L-1NAA+1mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
所述的诱导培养优选于28±1℃黑暗条件下培养4个月；
所述的愈伤组织优化与增殖培养基的组成为：MS培养基+（1～2）mg·L-12,4-D+（0.25～1）mg·L-1NAA+（0.25～1）mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
优选的，所述的愈伤组织优化与增殖培养基的组成为：MS培养基+1mg·L-12,4-D+0.25mg·L-1NAA+0.25mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
所述的高温高压灭菌的条件优选为在121℃、1.06kg/cm2灭菌15min；
所述的继代培养的时间优选为2～4个月；
步骤（2）中：
所述的液体培养基的组成为：MS培养基的无机盐+100mg·L-1麦芽水解物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+（0.02～0.25）mg·L-1NAA+（0.5～1）mg·L-12,4-D+B5培养基的维生素（Gamborg et al,1968）+45g·L-1蔗糖，pH 5.3，高温高压灭菌；
优选的，所述的液体培养基的组成为：MS培养基的无机盐+100mg·L-1麦芽水解物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+0.02mg·L-1NAA+1mg·L-12,4-D+B5培养基的维生素+45g·L-1蔗糖，pH 5.3，高温高压灭菌；
所述的高温高压灭菌的条件优选为在121℃、1.06kg/cm2灭菌15min；
所述的液体培养基的体积优选为30mL；
所述的悬浮培养的温度优选为28±1℃；
所述的悬浮培养1～2个月优选采用以下方法进行：在培养的第一个月每周吸弃2/3的旧培养液，用等体积的新鲜的液体培养基补充，同时用900μm孔径筛网过滤除去不易分散的大颗粒，其后每2周更换一次培养基，再继代一个月后，得到分散、均质的红姜花胚性细胞悬浮培养系；
步骤（3）中：
所述的10%SCV悬浮培养物优选按下述方法制备得到：吸取步骤（2）得到的胚性细胞悬浮培养系于10mL刻度管中，静置，直到获得细胞沉淀1mL，弃上清液，将所得的细胞沉淀用不含琼脂粉的体胚诱导培养基稀释至总体积10mL，得10%SCV悬浮培养物，此时细胞体积含量为总体积的10%；
所述的胚性细胞悬浮培养系的体积视胚性细胞悬浮培养系中的细胞浓度而定，只要获得细胞沉淀1mL即可；
所述的红姜花细胞接种量优选为0.5～2.0mL 10%SCV悬浮培养物；
所述的红姜花细胞接种量更优选为1.0mL 10%SCV悬浮培养物；
所述的体胚诱导培养基的组成为：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+100mg·L-1麦芽提取物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+（0.02～0.25）mg·L-1NAA+（50～250）μg·L-1TDZ（N-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲）+B5培养基的维生素+45g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
优选的，所述的体胚诱导培养基的组成为：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+100mg·L-1麦芽提取物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+0.25mg·L-1NAA+150μg·L-1TDZ+B5培养基的维生素+45g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
所述的体胚诱导培养基采用以下方法进行配制：将TDZ配制成100μg·mL-1母液，过滤灭菌后添加到pH 5.8、经高温高压灭菌后降至45℃的含有其余培养基成分的培养基中，混合均匀，得到体胚诱导培养基；
所述的含有其余培养基成分的培养基的组成为：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+100mg·L-1麦芽提取物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+（0.02～0.25）mg·L-1NAA+B5培养基的维生素+45g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
所述的含有其余培养基成分的培养基的组成优选为：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+100mg·L-1麦芽提取物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+0.25mg·L-1NAA+B5培养基的维生素+45g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
所述的不含琼脂粉的体胚诱导培养基的组成为：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+100mg·L-1麦芽提取物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+（0.02～0.25）mg·L-1NAA+（50～250）μg·L-1TDZ+B5培养基的维生素+45g·L-1蔗糖，pH 5.8，高温高压灭菌；
优选的，所述的不含琼脂粉的体胚诱导培养基的组成为：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+100mg·L-1麦芽提取物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+0.25mg·L-1NAA+150μg·L-1TDZ+B5培养基的维生素+45g·L-1蔗糖，pH 5.8，高温高压灭菌；
所述的高温高压灭菌的条件优选为在121℃、1.06kg/cm2灭菌15min；
所述的体细胞胚胎诱导的时间优选为20天；
步骤（4）中：
所述的体胚萌发培养基的组成优选为：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+（0.25～2.0）mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA+MS培养基的维生素+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
更优选的，所述的体胚萌发培养基的组成为：SH培养基的无机盐+1.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA+MS培养基的维生素+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
所述的生根壮苗培养基的组成优选为：1/2MS培养基+30g·L-1蔗糖+0.1wt%活性炭+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
所述的高温高压灭菌的条件优选为在121℃、1.06kg/cm2灭菌15min；
所述的继续培养优选为30μmol·m-2s-1光强（白色荧光灯）、16L/8D光条件下继续培养一个月；
步骤（4）所得的红姜花再生小植株可不经过驯化，直接种植到富含有机质的土壤中，在荫棚内种植成活；
本发明的机理为：本发明以红姜花未成熟的花丝和/或花药为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导培养出愈伤组织；将诱导出的愈伤组织继代培养在愈伤组织优化与增殖培养基上，优化筛选出胚性状态良好的胚性愈伤组织；通过控制培养基中激素和维生素含量，尤其是2,4-D与NAA浓度的配比关系，建立稳定的红姜花胚性细胞悬浮培养系；进行体胚诱导时，通过控制培养基中的无机盐及TDZ的含量，诱导出大量成熟的体胚；在体胚萌发过程中，通过控制培养基中的无机盐及6-BA的含量，使体胚获得高频率的萌发，进而发育成健壮的红姜花再生小植株。
本发明具有如下的优点及效果：
（1）本发明以红姜花未成熟的花丝和/或花药为外植体进行愈伤组织的诱导，经过优化、筛选、继代培养获得高质量的胚性愈伤组织。将胚性愈伤组织进行悬浮培养，建立红姜花的胚性细胞悬浮培养系。利用胚性细胞悬浮培养物进行体胚诱导可获得大量体胚，采用SH无机盐、150μg·L-1TDZ时可获得最佳效果，其体胚发生频率可达到4429个/mL SCV。
（2）所获得的体胚在体胚萌发培养基上可萌发出带有芽、根的幼苗，当以SH为基本培养基、6-BA为1.0mg·L-1时，体胚的萌发频率可达100%；幼苗转移到成苗培养基中，可获得健壮的再生小植株；所获得的再生小植株可直接移栽到装有富含有机质的培养土的花盆中，在荫棚中成活。
（3）本发明提供一种通过红姜花体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法，为红姜花的离体快速繁殖和生物技术育种奠定基础，有利于大规模的推广应用，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1红姜花胚性细胞悬浮系的建立及其经体胚发生途径再生植株的过程图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本实施例所需各种培养基如下：
愈伤组织诱导培养基：MS培养基+（2～4）mg·L-12,4-D+（2～4）mg·L-1NAA+1mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
愈伤组织筛选优化与增殖培养基：MS培养基+1～2mg·L-12,4-D+（0.25～1.0）mg·L-1NAA+（0.25～1.0）mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
液体培养基：MS培养基的无机盐+100mg·L-1麦芽水解物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+（0.02～0.25）mg·L-1NAA+（0.5～1）mg·L-12,4-D+B5培养基的维生素+45g·L-1蔗糖，pH 5.3，高温高压灭菌；
体胚诱导培养基：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+100mg·L-1麦芽提取物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+（0.02～0.25）mg·L-1NAA+（50～250）μg·L-1TDZ+B5培养基的维生素+45g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，高温高压灭菌；
体胚萌发培养基：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+（0.25～2.0）mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA+MS培养基的维生素+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
生根壮苗培养基：1/2MS培养基+30g·L-1蔗糖+0.1wt%活性炭+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
所述的高温高压灭菌为在121℃、1.06kg/cm2灭菌15min；
实施例1
建立红姜花高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，包括如下步骤：
（1）姜花品种的选取：选用的品种为开花繁密、花艳丽、花期长、可直接用于园林布置和进行花卉育种材料的红姜花（Hedychium coccineumBuch.-Ham），未成熟花序取自仲恺农业工程学院番禺试验基地；
（2）愈伤组织的诱导和胚性愈伤组织的优化增殖：于6月中旬到7月中旬取红姜花未成熟的花序小花，用自来水冲洗30min，然后用0.1wt%HgCl2消毒10min，用无菌水冲洗5遍；在超净工作台上剥除外部苞片，切取花药和花丝为0.5cm的条段，接种于愈伤组织诱导培养基上，于28±1℃黑暗条件下培养4个月，诱导出红姜花的愈伤组织；愈伤组织诱导培养基为：MS培养基+4mg·L-12,4-D+4mg·L-1NAA+1mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH5.8，高温高压灭菌；
将诱导出的愈伤组织继代接种到愈伤组织优化与增殖培养基中，经过3月的筛选，得到黄白色的粉状胚性愈伤组织；愈伤组织优化与增殖培养基为：MS培养基+0.5mg·L-12,4-D+0.5mg·L-1NAA+0.25mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
（3）均一稳定的红姜花胚性细胞悬浮系的建立：将步骤（2）得到的黄白色粉状胚性愈伤组织0.5g转入含30mL液体培养基的100mL锥形瓶中，置于28±1℃、90～110rpm摇床上黑暗培养2个月，在培养的第一个月每周吸弃2/3的培养液，用等体积的新鲜的液体培养基补充，同时用900μm孔径筛网过滤除去不易分散的大颗粒，其后每2周更换一次培养基，再继代一个月后，得到分散、均质的红姜花胚性细胞悬浮培养系；液体培养基的组成为：MS培养基的无机盐+100mg·L-1麦芽水解物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+0.25mg·L-1NAA+0.5mg·L-12,4-D+B5培养基的维生素+45g·L-1蔗糖，pH 5.3，高温高压灭菌；继代1个培养周期后，细胞增殖系数为3.1（一个培养周期（14d）结束后，细胞增殖总体积除以接种细胞体积的值为细胞增殖系数；下同。）；
（4）红姜花体细胞胚胎的诱导：吸取1mL 10%SCV悬浮培养物（取步骤（3）得到的胚性细胞悬浮培养系于10mL刻度管中，静置，直到获得细胞沉淀1mL，弃上清液，将所得的细胞沉淀用不含琼脂粉的体胚诱导培养基稀释至总体积10mL，此时细胞体积含量为总体积的10%，即为10%SCV悬浮培养物；下同。）接种于体胚诱导培养基中，置于28±1℃黑暗中进行体胚的诱导；培养20d后，得到成熟体胚，体胚发生频率达2513个/mL SCV细胞；体胚诱导培养基的组成为：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+100mg·L-1麦芽提取物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+0.25mg·L-1NAA+50μg·L-1TDZ+B5培养基的维生素+45g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉；
（5）红姜花体胚的萌发及植株再生：将步骤（4）诱导出的成熟体胚转入萌发培养基中，置于28±1℃黑暗培养，体胚萌发率为96%；待植株长到2cm后，将其转至生根壮苗培养基中，于30μmol·m-2s-1光强（白色荧光灯）、16L/8D光周期条件下继续培养一个月，进一步发育成健壮的红姜花小植株；植株转换率约为100%。体胚萌发培养基为：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+0.25mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA+MS培养基的维生素+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
（6）幼苗转移到成苗培养基中，可获得健壮的再生小植株；所获得的再生小植株不需要驯化，直接转移到装有培养土的花盆，在荫棚中成活。
图1为实施例1红姜花胚性细胞悬浮系的建立及其经体胚发生途径再生植株的过程，其中：A、红姜花花序（bar=6cm）；B、小花（bar=3cm）；C、除去苞片的小花（bar=3cm）；D、花丝和花药（bar=3cm）；E、培养4个月刚出的愈伤组织（bar=1cm）；F、筛选与优化获得的胚性愈伤组织（bar=5mm）；G、从胚性愈伤组织建立的稳定的胚性细胞悬浮系（bar=2.5cm）；H、从胚性细胞悬浮系所诱导的体胚（bar=5mm）；I、体胚萌发出苗（bar=2cm）；J、从丛生胚所诱导的丛生芽（bar=1cm）；K、再生小植株（bar=1cm）。
实施例2
建立红姜花高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，包括如下步骤：
（1）姜花品种的选取：选用的品种为开花繁密、花艳丽、花期长、可直接用于园林布置和进行花卉育种材料的红姜花（Hedychium coccineumBuch.-Ham），未成熟花序取自仲恺农业工程学院番禺试验基地；
（2）愈伤组织的诱导和胚性愈伤组织的优化增殖：于6月中旬到7月中旬取红姜花未成熟的花序小花，用自来水冲洗30min，然后用0.1wt%HgCl2消毒12min，用无菌水冲洗4遍；在超净工作台上剥除外部苞片，切取花药和花丝为0.5cm的条段，接种于愈伤组织诱导培养基上，于28±1℃黑暗条件下培养4个月，诱导出红姜花的愈伤组织；愈伤组织诱导培养基为：MS培养基+2mg·L-12,4-D+3mg·L-1NAA+1mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH5.8，高温高压灭菌；
将诱导出的愈伤组织继代接种到愈伤组织优化与增殖培养基中，经过2个月的筛选，得到黄白色的粉状胚性愈伤组织；愈伤组织优化与增殖培养基为：MS培养基+1mg·L-12,4-D+0.25mg·L-1NAA+0.5mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
（3）均一稳定的红姜花胚性细胞悬浮系的建立：将步骤（2）的黄白色粉状胚性愈伤组织1.5g转入含30mL液体培养基的100mL锥形瓶中，置于28±1℃、90～110rpm摇床上黑暗培养2个月，在培养的第一个月每周吸弃2/3的培养液，用等体积的新鲜的液体培养基补充，同时用900μm孔径筛网过滤除去不易分散的大颗粒，其后每2周更换一次培养基，再继续培养一个月，得到分散、均质的红姜花胚性细胞悬浮培养系；液体培养基的组成为：MS培养基的无机盐+100mg·L-1麦芽水解物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+0.1mg·L-1NAA+0.75mg·L-12,4-D+B5培养基的维生素+130mmol·L-1蔗糖，pH 5.3，高温高压灭菌；继代1个培养周期后，细胞增殖系数为2.3；
（4）红姜花体细胞胚胎的诱导：吸取1.5mL 10%SCV悬浮培养物接种于体胚诱导培养基中，置于28±1℃黑暗中进行体胚的诱导；培养20d后，得到成熟体胚，体胚发生频率高达3657个/mL SCV细胞；体胚诱导培养基的组成为：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+100mg·L-1麦芽提取物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+0.1mg·L-1NAA+100μg·L-1TDZ+B5培养基的维生素+45g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉；
（5）红姜花体胚的萌发及植株再生：将步骤（4）诱导出的成熟体胚转入萌发培养基中，置于28±1℃黑暗培养，体胚萌发率为100%；待植株长到2cm后，将其转至生根壮苗培养基中，于30μmol·m-2s-1光强（白色荧光灯）、16L/8D光周期条件下继续培养一个月，进一步发育成健壮的红姜花小植株；植株转换率约为100%。体胚萌发培养基为：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+0.5mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA+MS培养基的维生素+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
（6）幼苗转移到成苗培养基中，可获得健壮的再生小植株；所获得的再生小植株不需要驯化，直接转移到装有培养土的花盆，在荫棚中成活。
实施例3
建立红姜花高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，包括如下步骤：
（1）姜花品种的选取：选用的品种为开花繁密、花艳丽、花期长、可直接用于园林布置和进行花卉育种材料的红姜花（Hedychium coccineumBuch.-Ham），未成熟花序取自仲恺农业工程学院番禺试验基地；
（2）愈伤组织的诱导和胚性愈伤组织的优化增殖：于6月中旬到7月中旬取红姜花未成熟的花序小花，用自来水冲洗30min，然后用0.1wt%HgCl2消毒8min，用无菌水冲洗6遍；在超净工作台上剥除外部苞片，切取花药和花丝为0.5cm的条段，接种于愈伤组织诱导培养基上，于28±1℃黑暗条件下培养4个月，诱导出红姜花的愈伤组织；愈伤组织诱导培养基为：MS培养基+3mg·L-12,4-D+2mg·L-1NAA+1mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH5.8，高温高压灭菌；
将诱导出的愈伤组织继代接种到愈伤组织优化与增殖培养基中，经过4个月的筛选，得到黄白色的粉状胚性愈伤组织；愈伤组织优化与增殖培养基为：MS培养基+2mg·L-12,4-D+1.0mg·L-1NAA+1.0mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
（3）均一稳定的红姜花胚性细胞悬浮系的建立：将步骤（2）的黄白色粉状胚性愈伤组织2.0g，转入含30mL液体培养基的100mL锥形瓶中，置于28±1℃、90～110rpm摇床上黑暗培养2个月，在培养的第一个月每周吸弃2/3的培养液，用等体积的新鲜的液体培养基补充，同时用900μm孔径筛网过滤除去不易分散的大颗粒，其后每2周更换一次培养基，再继续培养一个月，得到分散、均质的红姜花胚性细胞悬浮培养系；液体培养基的组成为：MS培养基的无机盐+100mg·L-1麦芽水解物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+0.15mg·L-1NAA+1.0mg·L-12,4-D+B5培养基的维生素+45g·L-1蔗糖，pH 5.3，高温高压灭菌；继代1个培养周期后，细胞增殖系数为1.8；
（4）红姜花体细胞胚胎的诱导：吸取1.5mL 10%SCV悬浮培养物接种于体胚诱导培养基中，置于28±1℃黑暗中进行体胚的诱导；培养20d后，得到成熟体胚，体胚发生频率高达4429个/mL SCV细胞；体胚诱导培养基的组成为：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+100mg·L-1麦芽提取物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+0.02mg·L-1NAA+150μg·L-1TDZ+B5培养基的维生素+45g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉；
（5）红姜花体胚的萌发及植株再生：将步骤（4）诱导出的成熟体胚转入萌发培养基中，置于28±1℃黑暗培养，体胚萌发率为100%；待植株长到2cm后，将其转至生根壮苗培养基中，于30μmol·m-2s-1光强（白色荧光灯）、16L/8D光周期条件下继续培养一个月，进一步发育成健壮的红姜花小植株；植株转换率约为100%。体胚萌发培养基为：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+1.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA+MS培养基的维生素+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
（6）幼苗转移到成苗培养基中，可获得健壮的再生小植株；所获得的再生小植株不需要驯化，直接转移到装有培养土的花盆，在荫棚中成活。
实施例4
建立红姜花高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，包括如下步骤：
（1）姜花品种的选取：选用的品种为开花繁密、花艳丽、花期长、可直接用于园林布置和进行花卉育种材料的红姜花（Hedychium coccineum Buch.-Ham）未成熟花序取自仲恺农业工程学院番禺试验基地；
（2）愈伤组织的诱导和胚性愈伤组织的优化增殖：于6月中旬到7月中旬取红姜花未成熟的花序小花，用自来水冲洗30min，然后用0.1wt%HgCl2消毒12min，用无菌水冲洗6遍；在超净工作台上剥除外部苞片，切取花丝为0.5cm的条段，接种于愈伤组织诱导培养基上，于28±1℃黑暗条件下培养4个月，诱导出红姜花的愈伤组织；愈伤组织诱导培养基为：MS培养基+3mg·L-12,4-D+4mg·L-1NAA+1mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
将诱导出的愈伤组织继代接种到愈伤组织优化与增殖培养基中，经过2个月的筛选，得到黄白色的粉状胚性愈伤组织；愈伤组织优化与增殖培养基为：MS培养基+2mg·L-12,4-D+0.25mg·L-1NAA+0.25mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
（3）均一稳定的红姜花胚性细胞悬浮系的建立：将步骤（2）的黄白色粉状胚性愈伤组织1.0g转入含30mL液体培养基的100mL锥形瓶中，置于28±1℃、90～110rpm摇床上黑暗培养2个月，在培养的第一个月每周吸弃2/3的培养液，用等体积的新鲜的液体培养基补充，同时用900μm孔径筛网过滤除去不易分散的大颗粒，其后每2周更换一次培养基，再继续培养一个月，得到分散、均质的红姜花胚性细胞悬浮培养系；液体培养基的组成为：MS培养基的无机盐+100mg·L-1麦芽水解物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+0.02mg·L-1NAA+0.75mg·L-12,4-D+B5培养基的维生素+45g·L-1蔗糖，pH 5.3，高温高压灭菌；继代1个培养周期后，细胞细胞增殖系数为2.4；
（4）红姜花体细胞胚胎的诱导：吸取2.0mL 10%SCV悬浮培养物接种于体胚诱导培养基中，置于28±1℃黑暗中进行体胚的诱导；培养20d后，得到成熟体胚，体胚发生频率高达3391个/mL SCV细胞；体胚诱导培养基的组成为：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+100mg·L-1麦芽提取物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+0.15mg·L-1NAA+200μg·L-1TDZ+B5培养基的维生素+45g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉；
（5）红姜花体胚的萌发及植株再生：将步骤（4）诱导出的成熟体胚转入萌发培养基中，置于28±1℃黑暗培养，体胚萌发率为100%；待植株长到2cm后，将其转至生根壮苗培养基中，于30μmol·m-2s-1光强（白色荧光灯）、16L/8D光周期条件下继续培养一个月，进一步发育成健壮的红姜花小植株；植株转换率约为100%。体胚萌发培养基为：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+0.5mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA+MS培养基的维生素+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
（6）幼苗转移到成苗培养基中，可获得健壮的再生小植株；所获得的再生小植株不需要驯化，直接转移到装有培养土的花盆，在荫棚中成活。
实施例5
建立红姜花高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，包括如下步骤：
（1）姜花品种的选取：选用的品种为开花繁密、花艳丽、花期长、可直接用于园林布置和进行花卉育种材料的红姜花（Hedychium coccineumBuch.-Ham），未成熟花序取自仲恺农业工程学院番禺试验基地；
（2）愈伤组织的诱导和胚性愈伤组织的优化增殖：于6月中旬到7月中旬取红姜花未成熟的花序小花，用自来水冲洗30min，然后用0.1wt%HgCl2消毒12min，用无菌水冲洗6遍；在超净工作台上剥除外部苞片，切取花药为0.5cm的条段，接种于愈伤组织诱导培养基上，于28±1℃黑暗条件下培养4个月，诱导出红姜花的愈伤组织；愈伤组织诱导培养基为：MS培养基+4mg·L-12,4-D+3mg·L-1NAA+1mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
将诱导出的愈伤组织继代接种到愈伤组织优化与增殖培养基中，经过2个月的筛选，得到黄白色的粉状胚性愈伤组织；愈伤组织优化与增殖培养基为：MS培养基+1mg·L-12,4-D+0.5mg·L-1NAA+1mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
（3）均一稳定的红姜花胚性细胞悬浮系的建立：将步骤（2）的黄白色粉状胚性愈伤组织1.5g转入含30mL液体培养基的100mL锥形瓶中，置于28±1℃、90～110rpm摇床上黑暗培养2个月，在培养的第一个月每周吸弃2/3的培养液，用等体积的新鲜的液体培养基补充，同时用900μm孔径筛网过滤除去不易分散的大颗粒，其后每2周更换一次培养基，继续培养一个月，得到分散、均质的红姜花胚性细胞悬浮培养系；液体培养基的组成为：MS培养基的无机盐+100mg·L-1麦芽水解物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+0.02mg·L-1NAA+1mg·L-12,4-D+B5培养基的维生素+45g·L-1蔗糖，pH 5.3，高温高压灭菌；继代1个培养周期后，细胞增殖系数为1.6；
（4）红姜花体细胞胚胎的诱导：吸取1.0mL 10%SCV的悬浮培养物接种于体胚诱导培养基中，置于28±1℃黑暗中进行体胚的诱导；培养20d后，得到成熟体胚，体胚发生频率高达2889个/mL SCV细胞；体胚诱导培养基的组成为：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+100mg·L-1麦芽提取物+100mg·L-1谷氨酰胺+230mg·L-1脯氨酸+0.1mg·L-1NAA+250μg·L-1TDZ+B5培养基的维生素+45g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，高温高压灭菌；
（5）红姜花体胚的萌发及植株再生：将步骤（4）诱导出的成熟体胚转入萌发培养基中，置于28±1℃黑暗培养，体胚萌发率为85%；待植株长到2cm后，将其转至生根壮苗培养基中，于30μmol·m-2s-1光强（白色荧光灯）、16L/8D光周期条件下继续培养一个月，进一步发育成健壮的红姜花小植株；植株转换率约为100%。体胚萌发培养基为：SH培养基（Schenk和Hildebrandt，1972）的无机盐+2.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA+MS培养基的维生素+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
（6）幼苗转移到成苗培养基中，可获得健壮的再生小植株；所获得的再生小植株不需要驯化，直接转移到装有培养土的花盆，在荫棚中成活。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种通过红姜花体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）愈伤组织的诱导和胚性愈伤组织的优化增殖：以红姜花未成熟的花丝和/或花药为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导培养出愈伤组织；将诱导出的愈伤组织继代培养在愈伤组织优化与增殖培养基上，得到黄白色粉状的胚性愈伤组织；
（2）均一稳定的胚性细胞悬浮培养系的建立：将步骤（1）的黄白色粉状的胚性愈伤组织0.5～2.0 g转入液体培养基中，置于90～110 rpm摇床上悬浮培养1～2个月，得到分散、均质的胚性细胞悬浮培养系；
（3）体细胞胚胎的诱导：取步骤（2）得到的胚性细胞悬浮培养系，调整细胞密度为10% SCV悬浮培养物，取0.5～2.0 mL 10% SCV悬浮培养物接种于体胚诱导培养基中，置于28±1℃黑暗中进行体细胞胚胎诱导，得到成熟体细胞胚胎；
（4）体细胞胚胎的萌发及其植株再生：将步骤（3）诱导出的成熟体细胞胚胎转入体胚萌发培养基中，置于28±1℃黑暗培养，待叶鞘抽出后，将其转至生根壮苗培养基中继续培养，进一步发育成健壮的红姜花再生小植株；
所述的愈伤组织诱导培养基的组成为：MS培养基 +（2～4）mg·L-1 2, 4-D +（2～4）mg·L-1 NAA + 1 mg·L-1 6-BA + 30 g·L-1蔗糖 + 7 g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
所述的愈伤组织优化与增殖培养基的组成为：MS培养基 +（1～2）mg·L-1 2, 4-D +（0.25～1）mg·L-1 NAA +（0.25～1）mg·L-1 6-BA + 30 g·L-1蔗糖+ 7 g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
所述的液体培养基的组成为：MS培养基的无机盐+ 100 mg·L-1麦芽水解物 + 100 mg·L-1谷氨酰胺 + 230 mg·L-1脯氨酸 +（0.02～0.25）mg·L-1 NAA +（0.5～1）mg·L-1 2, 4-D + B5培养基的维生素+ 45 g·L-1蔗糖，pH 5.3，高温高压灭菌；
所述的体胚诱导培养基的组成为：SH培养基的无机盐 + 100 mg·L-1麦芽提取物 + 100 mg·L-1 谷氨酰胺 + 230 mg·L-1脯氨酸+ （0.02～0.25）mg·L-1 NAA +（50～250）μg·L-1 TDZ+ B5培养基的维生素+ 45g·L-1蔗糖 + 7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
所述的体胚萌发培养基的组成为：SH培养基的无机盐 +（0.25～2.0）mg·L-1 6-BA + 0.2 mg·L-1 NAA + MS培养基的维生素 + 30g·L-1蔗糖 + 7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
所述的生根壮苗培养基的组成为：1/2 MS培养基+ 30 g·L-1蔗糖+ 0.1 wt % 活性炭+ 7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌。
2.根据权利要求1所述的一种通过红姜花体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法，其特征在于：
所述的愈伤组织诱导培养基的组成为：MS培养基 + 4 mg·L-1 2, 4-D + 4 mg·L-1 NAA + 1 mg·L-1 6-BA + 30 g·L-1蔗糖+ 7 g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
所述的愈伤组织优化与增殖培养基的组成为：MS培养基 + 1 mg·L-1 2, 4-D + 0.25 mg·L-1 NAA + 0.25 mg·L-1 6-BA + 30 g·L-1蔗糖+ 7 g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
所述的液体培养基的组成为：MS培养基的无机盐+ 100 mg·L-1麦芽水解物 + 100 mg·L-1谷氨酰胺 + 230 mg·L-1脯氨酸 + 0.02 mg·L-1 NAA + 1 mg·L-1 2, 4-D + B5培养基的维生素+ 45 g·L-1蔗糖，pH 5.3，高温高压灭菌。
3.根据权利要求1所述的一种通过红姜花体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法，其特征在于：
所述的体胚诱导培养基的组成为：SH培养基的无机盐 + 100 mg·L-1麦芽提取物 + 100 mg·L-1 谷氨酰胺 + 230 mg·L-1脯氨酸 + 0.25 mg·L-1 NAA + 150 μg·L-1 TDZ+ B5培养基的维生素+ 45g·L-1蔗糖 + 7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；
所述的体胚萌发培养基的组成为：SH培养基的无机盐 +1.0 mg·L-1 6-BA + 0.2 mg·L-1 NAA + MS培养基的维生素 + 30 g·L-1蔗糖 + 7g·L-1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌。
4.根据权利要求1所述的一种通过红姜花体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法，其特征在于：步骤（1）中：
所述的红姜花为6月中旬到7月中旬的红姜花未成熟的花序小花；
所述的花序小花采用以下方法进行前处理：取红姜花未成熟的花序小花，用自来水冲洗30 min，然后用0.1 wt% HgCl2消毒8～12min，用无菌水冲洗4～6遍；剥除外部苞片，切取花药和/或花丝备用。
5.根据权利要求1所述的一种通过红姜花体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法，其特征在于：步骤（1）中：
所述的诱导培养为于28±1℃黑暗条件下培养4个月；所述的继代培养的时间为2～4个月。
6.根据权利要求1所述的一种通过红姜花体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法，其特征在于：步骤（2）中：
所述的液体培养基的体积为30 mL；所述的悬浮培养的温度为28±1℃；
所述的悬浮培养1～2个月采用以下方法进行：在培养的第一个月每周吸弃2/3的培养液，用等体积的新鲜的液体培养基补充，同时用900 μm孔径筛网过滤除去不易分散的大颗粒，其后每2周更换一次培养基，再继代一个月后，得到分散、均质的红姜花胚性细胞悬浮培养系。
7.根据权利要求1所述的一种通过红姜花体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法，其特征在于：步骤（3）中：
所述的10% SCV悬浮培养物按下述方法制备得到：吸取步骤（2）得到的胚性细胞悬浮培养系于10 mL刻度管中，静置，直到获得细胞沉淀1 mL，弃上清液，将所得的细胞沉淀用不含琼脂粉的体胚诱导培养基稀释至总体积10 mL，得10% SCV悬浮培养物，此时细胞体积含量为总体积的10%。
8.根据权利要求1所述的一种通过红姜花体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法，其特征在于：步骤（3）中：
所述的体胚诱导培养基采用以下方法进行配制：将TDZ配制成100 μg·mL-1母液，过滤灭菌后添加到pH 5.8、经高温高压灭菌后降至45℃的含有其余培养基成分的培养基中，混合均匀，得到体胚诱导培养基；
所述的体细胞胚胎诱导的时间为20天。
9.根据权利要求1所述的一种通过红姜花体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的继续培养为30 μmol·m-2 s-1光强、16L/8D光条件下继续培养一个月。
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| GR01 | Patent grant |