CN103444534B - 圆叶鸟巢蕨诱导绿色小球植株再生方法 - Google Patents
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Abstract
圆叶鸟巢蕨诱导绿色小球植株再生方法，属于植物培养方法技术领域。本发明以圆叶鸟巢蕨无菌苗的顶生短茎为外植体材料，在附加苯基脲类细胞分裂素CPPU1.5~2.5mg/L和吲哚丁酸IBA 0.1mg/L的MS改良培养基上诱导产生绿色小球，绿色小球的诱导频率达100%。在添加CPPU1.0 ~ 1.5mg/L和IBA0.1mg/L的MS改良培养基上进行绿色小球增殖，绿色小球每代增殖系数为5。在附加CPPU0.2~0.5mg/L和IBA0.1mg/L的MS改良培养基上绿色小球萌发形成幼苗。幼苗在附加IBA 0.2~0.4mg/L的MS改良培养基上发育成具有根、茎、叶的完整小植株，成株率达95%以上。本方法适用于鸟巢蕨试管苗工厂化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种圆叶鸟巢蕨诱导绿色小球植株再生方法，属于植物培养方法技术领域。
背景技术
截止目前，在12000种蕨类植物中，成功进行组织培养的仅占极少一部分，部分属种虽已组织培养成功，但存在繁殖周期长，增殖率低的问题(韩敬，赵莉.蕨类植物繁殖研究进展[J].安徽农业科学,2005,33(7):1261～1263)。国内鸟巢蕨组织培养技术研究是通过苗的分化和苗丛扩繁、不定芽诱导和增殖途径繁殖试管苗的。以鸟巢蕨的嫩叶为外植体材料，不定芽诱导率达85％，芽丛的增殖率为6.4倍。(秦廷豪，邹宗兰.鸟巢蕨的组织培养[J].植物生理学通讯,2004,40(3):349；陈金典.鸟巢蕨组织培养育苗技术研究[J].福建农业科技,2010,2(44～45))。在本实验室进行的重复试验中，未能从所试鸟巢蕨品种的叶片诱导产生不定芽，显示该项技术仅适用于部分品种，因而需研制鸟巢蕨不同植株再生途径的组织培养技术。
在蕨类植物上利用外植体诱导出绿色小球(green globular bodies，简称GGB)，类似于兰花的原球茎，绿色小球再经过培养获得完整的幼小植物个体(陆树刚，张光飞，苏文华，等.蕨类植物学[M].北京:高等教育出版社,2007:33～37)。国内外学者普遍认为GGB途径是蕨类植物一种高效率的繁殖途径。至今，国内外已从鹿角蕨、乌毛蕨、皱叶肾蕨、凤尾蕨等蕨类植物成功地诱导GGB，但鸟巢蕨成功报道仅国外一例(曾霞，庄南生.蕨类植物组织培养研究进展(综述)[J].亚热带植物科学,2002,31(增刊):37-43)。
Higuchi等发现BAP(6-苄基氨基嘌呤)有利于GGB的形成与增殖，并首次提出根状茎尖→苗→GGB→完整苗→移栽的植株再生和微繁殖新途径。Higuchi等以鸟巢蕨的根状茎为外植体，0.5mg/LBAP诱导产生绿色小球，绿色小球诱导率最高达50％，建立起试管苗繁殖技术(HIGUCHI H and AMAKI W.Effects of 6-Benzhlaminopurine on the organgenesis of Asplenium nidus L.through invitro propagation[J].Scientia Hortculture,1989,37:351-359)。
发明内容
技术问题本发明要解决的技术问题和提出的技术任务是：
以圆叶鸟巢蕨的无菌苗的顶生短茎为外植体材料，通过选用苯基脲类细胞分裂素CPPU诱导和增殖绿色小球，提高绿色小球的诱导率和增殖率，建立植株再生技术体系。
技术方案
圆叶鸟巢蕨诱导绿色小球植株再生方法，包括：
1)材料
选用圆叶鸟巢蕨无菌苗为材料；
2)培养基
MS改良培养基由MS大量元素、MS微量元素与B5维生素组成，添加蔗糖30g/L，活性炭质量比0.1％，8g/L的琼脂条作为固化剂；
绿色小球诱导培养基：MS改良培养基附加苯基脲类细胞分裂素CPPU 1.5～2.5mg/L和生长素IBA 0.1mg/L；
绿色小球增殖培养基：MS改良培养基附加苯基脲类细胞分裂素CPPU 1.0～1.5mg/L和生长素IBA 0.1mg/L；
绿色小球萌发培养基：MS改良培养基附加苯基脲类细胞分裂素CPPU 0.2～0.5mg/L和生长素IBA 0.1mg/L；
成苗和生根培养基：MS改良培养基附加生长素IBA 0.2～0.4mg/L；
上述各种培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；
3)方法
在超净工作台上取圆叶鸟巢蕨无菌苗的顶生短茎，接种在步骤2)所述绿色小球诱导培养基上，25d在短茎的表面诱导产生出绿色小球；绿色小球转到步骤2)所述绿色小球增殖培养基上进行继代增殖培养，30d为一个周期；经过继代增殖培养的绿色小球转移到步骤2)所述绿色小球萌发培养基上，20d左右形成幼苗；在成苗和生根培养基上，幼苗发育成具有根、茎、叶的完整小植株；
绿色小球的诱导、增殖、萌发、成苗和生根培养均在光照条件下进行，光照强度为1500lx，光照时间为12h/d；培养室温度为26℃±2℃。
有益效果本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果：
国内现有的鸟巢蕨组织培养技术是以嫩叶为外植体材料，6-苄基氨基嘌呤BAP诱导产生不定芽，不定芽诱导率达85％，芽丛的增殖率为6.4倍，但该项技术仅适用鸟巢蕨部分品种。国外鸟巢蕨组织培养技术是以根状茎为外植体材料，6-苄基氨基嘌呤BAP诱导产生绿色小球，绿色小球诱导率为50％。
本发明选用苯基脲类细胞分裂素CPPU从圆叶鸟巢蕨无菌苗的顶生短茎诱导产生绿色小球，绿色小球诱导率高达100％，绿色小球每代增殖系数为5，绿色小球的成株率达95％以上，达到实用化程度，为开展鸟巢蕨试管苗工厂化生产提供新技术。
附图说明
图1短茎诱导产生绿色小球。
图2绿色小球增殖。
图3绿色小球萌发。
图4完整再生植株。
具体实施方式
1.材料和方法
1.1试验材料
圆叶鸟巢蕨(Asplenium nidus)属铁角蕨科(Aspleniaceae)蕨类植物，种苗购自南京万博花卉市场。本实验室采集盆栽植株叶片上的成熟孢子，应用组织培养方法(秦廷豪，邹宗兰.鸟巢蕨的组织培养[J].植物生理学通讯,2004,40(3):349)获得无菌苗。
1.2培养基
MS改良培养基由MS大量元素、MS微量元素(Murashige T,Skoog F.Arevised medium from rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[J].Physiol plant,1962,15:473～497)和B5维生素(Gamborg O L,Miller R A,OjimaK.Nutrient requirements of suspension cultures of soybeanroot cells[J].Exp.Cell Res.,1968.50:151～158)组成，为植物组织培养中一种常用的培养基，蔗糖30g/L，活性炭质量比0.1％(南京助研生物技术有限公司)，琼脂条(乘风牌，福建泉州市泉港化工厂)8g/L；
绿色小球诱导培养基：MS改良培养基附加1.5～2.5mg/L的苯基脲类细胞分裂素(简称CPPU，南京生兴生物技术有限公司)和0.1mg/L生长素吲哚丁酸(简称IBA，上海源聚生物科技有限公司)；
绿色小球增殖培养基：MS改良培养基附加1.0～1.5mg/L的苯基脲类细胞分裂素(简称CPPU，南京生兴生物技术有限公司)和0.1mg/L生长素吲哚丁酸(简称IBA，上海源聚生物科技有限公司)；
绿色小球萌发培养基：MS改良培养基附加0.2～0.5mg/L的苯基脲类细胞分裂素(简称CPPU，南京生兴生物技术有限公司)和0.1mg/L生长素吲哚丁酸(简称IBA，上海源聚生物科技有限公司)；
成苗和生根培养基：MS改良培养基附加0.2～0.4mg/L生长素吲哚丁酸(简称IBA，上海源聚生物科技有限公司)；
培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8。
1.3方法
以1)圆叶鸟巢蕨无菌苗的顶生短茎为外植体材料，在2)绿色小球诱导培养基上25d左右诱导产生绿色小球；绿色小球转移到2)绿色小球增殖培养基上，30d为一个周期，绿色小球继代增殖；绿色小球转移到2)绿色小球萌发培养基上，20d左右形成幼苗；幼苗转到成苗和生根培养基上，25d左右形成具有根、茎、叶的完整再生植株；
离体培养条件：培养室温度为26±20C，光照强度为1500lx，光照时间为16h/d。
2.结果
2.1 CPPU对短茎诱导绿色小球的影响
圆叶鸟巢蕨无菌苗的顶生短茎(带叶或不带叶)，短茎的长度约为0.3-0.5cm，分别接种在附加CPPU 1.5～2.5mg/L、IBA 0.1mg/L和BAP 1.5～2.5mg/L、IBA0.1mg/L的诱导培养基上。在附加CPPU 1.5～2.5mg/L、IBA 0.1mg/L的诱导培养基上，25d左右在短茎的表面显现肉眼可见的绿色小球(图1)；在附加BAP 1.5～2.5mg/L、IBA 0.1mg/L的诱导培养基上，25d左右短茎膨大，在继续培养过程中始终未见绿色小球形成。
表1 CPPU对短茎诱导绿色小球的影响
表1结果显示：在附加1.5～2.5mg/L CPPU的绿色小球诱导培养基上，绿色小球的诱导频率达100％，在附加BAP 1.5～2.5mg/L、IBA 0.1mg/L的诱导培养基上，绿色小球的诱导频率为0％。由此可见，以鸟巢蕨无菌苗的顶生短茎为外植体材料，CPPU是一种诱导产生绿色小球的适宜细胞分裂素。
2.2 CPPU对绿色小球增殖的影响
在附加CPPU 1.0～1.5mg/L、IBA 0.1mg/L和BAP 1.0～1.5mg/L、IBA 0.1mg/L的绿色小球增殖培养基上，30d左右绿色小球密聚成堆，每代增殖系数均约为5。在附加CPPU 1.0～1.5mg/L、IBA 0.1mg/L的培养基上，球状体的体积较小，个别绿色小球萌发形成幼苗；而在附加BAP 1.0～1.5mg/L、IBA 0.1mg/L的培养基上，球状体的体积较大，约占1/4的绿色小球萌发形成幼苗。因此，CPPU是一种绿色小球增殖的适宜细胞分裂素。
表2 CPPU对绿色小球增殖的影响
2.3 CPPU对绿色小球成苗的影响
在附加CPPU 0.2～0.5mg/L、IBA 0.1mg/L和BAP 0.2～0.5mg/L、IBA 0.1mg/L的培养基上绿色小球萌发成苗(图3)。相比之下，在附加CPPU 0.2～0.5mg/L、IBA 0.1mg/L的培养基上，绿色小球萌发形成的幼苗较为健壮。
2.4 IBA对幼苗成株的影响
在附加IBA 0.2～0.4mg/L的培养基上，幼苗进一步发育，并诱导生成浅黑色根系，形成具有根、茎、叶的完整小植株，成株率达95％以上(图4)。由此可见，苯基脲类细胞分裂素CPPU不仅适宜从圆叶鸟巢蕨顶生短茎诱导产生绿色小球，也适宜绿色小球的增殖和成苗，IBA有利于最终形成完整植株。
3.结论
本发明以鸟巢蕨无菌苗的顶生短茎为外植体，苯基脲类细胞分裂素CPPU适宜于绿色小球的诱导和增殖，绿色小球的诱导率达100％，绿色小球每代增殖系数为5，绿色小球的成株率达95％以上，建立起植株再生技术体系。
Claims (1)
1.圆叶鸟巢蕨诱导绿色小球植株再生方法，其特征在于：
1） 材料
选用圆叶鸟巢蕨无菌苗为材料；
2） 培养基
MS改良培养基由MS大量元素、MS微量元素与B5培养基的维生素组成，添加蔗糖30 g/L，质量比 0.1%的活性炭，8 g/L的琼脂条作为固化剂；
绿色小球诱导培养基：MS改良培养基附加苯基脲类细胞分裂素CPPU 1.5 ~ 2.5 mg/L和生长素IBA 0.1 mg/L；
绿色小球增殖培养基：MS改良培养基附加苯基脲类细胞分裂素CPPU 1.0 ~ 1.5 mg/L和生长素IBA 0.1 mg/L；
绿色小球萌发培养基：MS改良培养基附加苯基脲类细胞分裂素CPPU 0.2 ~ 0.5 mg/L和生长素IBA 0.1 mg/L；
成苗和生根培养基：MS改良培养基附加生长素IBA 0.2 ~ 0.4 mg/L；
上述各种培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；
3） 方法
在超净工作台上取圆叶鸟巢蕨无菌苗的顶生短茎，接种在所述绿色小球诱导培养基上，25 d在短茎的表面诱导产生出绿色小球；绿色小球转到所述绿色小球增殖培养基上进行继代增殖培养，30 d为一个周期；经过继代增殖培养的绿色小球转移到所述绿色小球萌发培养基上，20 d形成幼苗；在成苗和生根培养基上，幼苗发育成具有根、茎、叶的完整小植株；
绿色小球的诱导、增殖、萌发、成苗和生根培养均在光照条件下进行，光照
强度为1500 lx，光照时间为12 h/d；培养室温度为26℃±2℃。
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