CN111771724B - 一种基于单细胞起源的番木瓜高效植株再生方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种番木瓜植株再生方法，更具体涉及一种基于单细胞起源的番木瓜植株高效再生方法。本发明所述基于单细胞起源的番木瓜植株高效再生方法，利用合适的番木瓜未成熟种子进行胚性愈伤组织诱导，进一步经继代增殖培养后，经液体继代培养和筛选获得均质的胚性细胞悬浮系；然后利用胚性细胞诱导形成体细胞胚，进而经萌发培养和生根培养后获得大量完整的再生植株。本发明所述方法可以通过单细胞起源途径获得再生，能在短时间内低成本生产出大批量种苗，具有生根容易、根系不会出现愈伤化、再生率高、周期短、所需生产空间小、生产成本低的优势，适宜于番木瓜细胞工程育种和分子育种的推广。

Description

一种基于单细胞起源的番木瓜高效植株再生方法
技术领域
本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种番木瓜植株再生方法，更具体涉及一种基于单细胞起源的番木瓜植株高效再生方法。
背景技术
番木瓜(Carica papaya L.)又称木瓜、乳瓜、万寿果，是热带、亚热带常绿软木质大型多年生草本植物，有“岭南佳果”的美誉，其营养价值排在世界十大营养水果的首位，是我国农业品种结构调整的重要经济作物。
目前，我国番木瓜产业发展面临的主要问题即为环斑花叶病毒病的侵害，造成番木瓜产量大大降低，甚至部分老产区已经无法种植番木瓜。因此，番木瓜产业亟需培育新的抗病品种以改善番木瓜的抗病性、产量和质量。但是，由于我国不是番木瓜种植的起源中心，缺乏抗病资源物种，难以通过杂交育种的途径培育优质的抗病品种。除此之外，解决番木瓜种植问题的另一可行性方案即为通过导入外源抗性基因进而获得抗性的分子育种，但该方案实施的前提是需要建立高效的植株再生技术体系，这也成为该途径改善番木瓜育种的重点和难点。
目前，番木瓜植株再生技术通常是以成年植株的茎尖或侧芽为外植体，通过消毒、分化增殖获得大量分化芽后，经生根培养获得再生植株。但是，基于该再生技术体系进行基因转化时非常容易出现嵌合体、假阳性和基因丢失的情况，进而导致转化效率较低，并且不容易达到育种的目的，这也是目前限制番木瓜培育技术发展的关键难点。
胚性细胞悬浮系是现有更适用于生物技术育种的植株再生技术，由于胚性细胞悬浮系起源于单细胞，在以胚性细胞悬浮系为受体进行基因转化时可避免再生植株出现嵌合体、假阳性和基因丢失的情况，进而转化效率也大大提高。现有技术已开发出多种植物基于胚性细胞悬浮系的植株再生技术。但是，基于单细胞起源的胚性细胞悬浮系进行番木瓜植株的再生则并未有报道，而且，如何建立理想的均质的胚性细胞悬浮系，以提高植株再生效率的方法也成为番木瓜分子育种的关键因素，引起人们的广泛关注和研究。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于单细胞起源的番木瓜植株高效再生方法，具有生产成本低、体细胞胚诱导率高、植株再生率高的优势。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种基于单细胞起源的番木瓜植株高效再生方法，包括如下步骤：
(1)胚性愈伤组织诱导和增殖培养
取未成熟果实种子剥除外层种壳，剔除未成熟幼胚种皮，获得所需外植体；随后将所述外植体未成熟幼胚置于愈伤组织诱导固体培养基(MI)中进行诱导培养，得到松散易碎的浅黄色胚性愈伤组织；并将所述胚性愈伤组织继续进行继代培养，得到增殖的胚性愈伤组织；
(2)均质胚性细胞悬浮系的建立
取增殖后的胚性愈伤组织置于愈伤组织诱导液体培养基(ML)中进行液体悬浮培养，并在每个继代周期培养结束后滤除较大颗粒培养物；随后继续进行重复液体悬浮继代培养和筛选，直到得到均质胚性细胞悬浮系；
(3)体细胞胚的诱导和成熟培养
取得到的均质胚性悬浮细胞置于体细胞胚诱导培养基(MSD1)中进行体细胞胚诱导培养，并于体细胞成熟培养基(MSD2)进行成熟培养，得到成熟体细胞胚；
(4)体细胞胚的萌发、生根和植株再生
取得到的成熟体细胞胚置于萌发培养基(MG)中进行萌发和生根培养，进一步并将萌发和生根后的小植株转移至成苗培养基(MR)中发育得到完整的小植株。
具体的，所述步骤(1)中，所述未成熟果实种子指开花坐果后发育90-120天果实的种子。
具体的，所述步骤(1)中，所述愈伤组织诱导固体培养基(MI)包括如下组分：1/2MS培养基、2-4mg/L 2,4-D、400mg/L谷氨酰胺、50-70g/L蔗糖、5-10g/L琼脂粉，调pH5.5-6.0；并优选组成为：1/2MS培养基、2--4mg/L2,4-D、400mg/L谷氨酰胺、60g/L蔗糖、7g/L琼脂粉，调pH5.8。
具体的，所述步骤(1)中：
所述诱导培养步骤中，控制反应过程为暗培养，培养温度为28±1℃，培养时间60-90天；
所述继代培养步骤中，控制反应过程为暗培养，培养温度为28±1℃，以30天为一个继代周期，继代培养2-3个周期。
具体的，所述步骤(2)中，所述愈伤组织诱导液体培养基(ML)包括如下组分：1/2MS培养基、2-4mg/L 2,4-D、350-450mg/L谷氨酰胺、50-70g/L蔗糖，调pH5.0-5.5；并优选组成为：1/2MS培养基、2-4mg/L 2,4-D、400mg/L谷氨酰胺、60g/L蔗糖，调pH5.3。
具体的，所述步骤(2)中：
所述液体悬浮培养步骤中，第一个继代周期控制反应过程为暗培养，培养温度为28±1℃，培养时间为2周，使用900μm孔径的筛网滤除较大颗粒培养物。
所述液体悬浮均质筛选和继代培养步骤中，控制反应过程为暗培养，培养温度为28±1℃，以21天为一个继代周期，使用154μm孔径的筛网滤除较大细胞团，继代培养3-5个继代周期。
具体的，所述步骤(3)中，所述体细胞胚诱导培养基(MSD1)包括如下成分：1/2MS大量元素和微量元素及其铁盐、MS维生素、40-60mg/L肌醇、300-500mg/L谷氨酰胺、25-35g/L蔗糖，调pH5.0-5.5；并优选组成为：1/2MS大量元素和微量元素及其铁盐、MS维生素、50mg/L肌醇、400mg/L谷氨酰胺、30g/L蔗糖，调pH5.3；
所述体细胞成熟培养基(MSD2)，包括如下成分：1/2MS大量元素和微量元素及其铁盐、MS维生素、40-60mg/L肌醇、300-500mg/L谷氨酰胺、25-35g/L蔗糖、8-12g/L活性炭、5-10g/L琼脂粉，调pH5.5-6.0；并优选组成为：1/2MS大量元素和微量元素及其铁盐、MS维生素、50mg/L肌醇、400mg/L谷氨酰胺、30g/L蔗糖、10g/L活性炭、7g/L琼脂粉，调pH5.8。
具体的，所述步骤(3)中，所述体细胞胚诱导和成熟培养中，控制反应过程为暗培养，培养温度为28±1℃，诱导周期为15-20天，成熟周期为30-40天，期间更新一次培养基。
具体的，所述步骤(4)中，所述萌发培养基(MG)包括如下成分：MS大量元素、微量元素、铁盐及其维生素、0.1-0.2mg/L 6-BA、0.1-0.2mg/L NAA、300-500mg/L谷氨酰胺、4-6g/L活性炭、20-40mgl/L蔗糖、5-10g/L琼脂粉，调pH5.5-6.0；优选组成为：MS大量元素、微量元素、铁盐及其维生素、0.1-0.3mg/L 6-BA、0.1-0.2mg/L NAA、400mg/L谷氨酰胺、5g/L活性炭、30mgl/L蔗糖、7g/L琼脂粉，调pH5.8。
具体的，所述步骤(4)中，所述成苗培养基(MR)包括如下成分：1/2MS大量元素、微量元素、铁盐及其维生素、0.05-0.1mg/L 6-BA、1-2mg/L IBA、4-6g/L活性炭、25-35mgl/L蔗糖、5-10g/L琼脂粉，调pH5.5-6.0；优选组成为：1/2MS大量元素、微量元素、铁盐及其维生素、0.05-0.1mg/L 6-BA、1-2mg/L IBA、5g/L活性炭、30mgl/L蔗糖、7g/L琼脂粉，调pH5.8。
具体的，所述步骤(4)中：
所述萌发培养步骤中，控制反应过程为先暗培养3天，培养温度为28±1℃，后光照培养10-12天，培养温度为28±1℃，光照强度为25-35μmol·m-2·s-1，优选为30μmol·m-2·s-1；
所述成苗培养步骤中，控制反应过程为光照培养，培养温度为28±1℃，光照强度为25-35μmol·m-2·s-1，优选为30μmol·m-2·s-1，培养30-40天。
本发明所述基于单细胞起源的番木瓜植株高效再生方法，利用合适的番木瓜未成熟种子幼胚诱导胚性愈伤组织，进一步经继代增殖培养后，经继代培养和筛选获得均质的胚性细胞悬浮系；然后利用胚性悬浮细胞诱导形成体细胞胚，进而经萌发和生根培养后获得大量完整的再生植株。本发明所述方法与常规的番木瓜组培快繁植株再生技术相比，利用胚性细胞悬浮系进行体细胞胚的诱导、成熟、萌发和生根，从而再生出完整的植株，该技术可以通过单细胞起源途径获得再生，能在短时间内低成本生产出大批量种苗，具有生根容易、根系出现愈伤化比率低、周期短、所需生产空间小、生产成本低的优势；同时，该技术为番木瓜的多倍体诱变育种、分子育种等技术的应用提供了良好的再生技术体系，避免了嵌合体的产生；再者，该方法可利用较小的空间在较短的时间内获得大量的再生植株，再生效率大大提高，适宜于番木瓜细胞工程育种和分子育种的推广。
本发明所述基于单细胞起源的番木瓜植株高效再生方法，愈伤组织诱导固体培养基(MI)中利用合适浓度的2,4-D、谷氨酰胺和蔗糖组合进行胚性愈伤组织的诱导，并调整胚性愈伤组织的生理状态，从而获得适用于液体悬浮培养的松散易碎的浅黄色胚性愈伤组织。将上述胚性愈伤组织转移到和MI组成成分相同的液体培养基(ML)后，在摇床的规律振动下，松散易碎的胚性愈伤组织容易分散成单细胞或小细胞团，ML培养基与MI培养基中相同浓度的2,4-D、谷氨酰胺和蔗糖组合能促使细胞获得快速增殖，并保持相同的胚性状态。通过3-5次继代培养滤除体细胞胚、愈伤组织和大的细胞团后可获得均质的胚性细胞悬浮系，其组成胚性细胞生理状态较为同步一致。将上述生理状态较为同步一致的胚性细胞转移到去除细胞分裂素2,4-D的体细胞胚诱导培养基(MSD1)中，可促使胚性细胞进行分化形成体细胞胚，并在成熟培养基(MSD2)中发育为成熟体细胞胚。成熟的体细胞胚被转移到含有活性炭的萌发培养基(MG)后，可在合适浓度的6-BA和NAA作用下萌发和生根。萌发和生根体细胞胚被转移至含有活性炭的成苗培养基(MR)后，合适浓度的6-BA和IBA共同作用下能促使芽和根系进一步发育，进而形成健康小植株。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为本发明所述的100天龄的未成熟番木瓜果实和种子的形态图；
图2为本发明经增殖后获得的浅黄色松散易碎的番木瓜胚性愈伤组织的形态图；
图3为本发明培养均质的胚性细胞悬浮系的形态图；
图4为本发明所述由均质的胚性细胞悬浮系第一个诱导周期在液体培养基中诱导形成的体细胞胚的形态图；
图5本发明经第二个诱导周期在固体培养基中诱导形成的成熟体细胞胚的形态图；
图6为本发明经萌发和生根培养5天后的体细胞胚的形态图；
图7为本发明经萌发和生根培养14天后的体细胞胚的形态图；
图8为本发明经成苗培养30天后形成的小植株的形态图。
具体实施方式
本发明下述实施例中：
涉及的MS基本培养基成分包括：(1)大量元素：1650mg/L NH4NO3，1900mg/L KNO3，170mg/L KH2PO4，370mg/L MgSO4，440mg/L CaCL2·2H2O，(2)微量元素：0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·H2O，10.6mg/L ZnSO4·H2O，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCL2·6H2O，(3)有机物：0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2.0mg/L甘氨酸，(4)铁盐：27.8mg/L FeSO4·7H2O，37.3mg/L Na2·EDTA。
实施例1
本实施例涉及培养基包括：
愈伤组织诱导固体培养基(MI)：1/2MS培养基+2mg/L 2,4-D+400mg/L谷氨酰胺+60g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，pH5.8；
愈伤组织悬浮培养液体培养基(ML)：1/2MS培养基+2mg/L2,4-D+400mg/L谷氨酰胺+60g/L蔗糖，pH5.3；
体细胞胚液体诱导培养基(MSD1)：1/2MS大量元素和微量元素及其铁盐、MS维生素、50mg/L肌醇、400mg/L谷氨酰胺、30g/L蔗糖，调pH5.3。
体细胞胚固体成熟培养基(MSD2)：1/2MS大量元素和微量元素及其铁盐、MS维生素、50mg/L肌醇、400mg/L谷氨酰胺、30g/L蔗糖、10g/L活性炭、7g/L琼脂粉，调pH5.8。
萌发培养基(MG)：MS大量元素、微量元素、铁盐及其维生素、0.1mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、400mg/L谷氨酰胺、5g/L活性炭、30mgl/L蔗糖、7g/L琼脂粉，调pH5.8。
成苗培养基(MR)：1/2MS大量元素、微量元素、铁盐及其维生素、0.05mg/L 6-BA、1mg/L IBA、5g/L活性炭、30mgl/L蔗糖、7g/L琼脂粉，调pH5.8。
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株高效再生的方法，应用材料为“一尺瓜”番木瓜品种，包括如下步骤：
(1)胚性愈伤组织诱导和增殖培养
取开花坐果后100天的未成熟果实，用自来水将果实外表清洗干净，然后用70％的酒精进行表面消毒，在超净工作台上纵向切开果实，挑取发育较饱满的未成熟种子，剥除外层种壳，并剔除未成熟幼胚种皮后即获得所需外植体；所述100天龄的未成熟番木瓜果实和种子的形态图见附图1所示；
将外植体未成熟幼胚置于愈伤组织诱导固体培养基(MI)中进行暗培养，培养温度为28±1℃，培养75天后，可获得松散易碎的浅黄色胚性愈伤组织；
挑取松散易碎的浅黄色胚性愈伤组织继续置于所述MI培养基中进行继代培养，控制培养条件为暗培养，培养温度为28±1℃，以30天为一个继代周期，继代2个周期，可获得大量状态较为一致的松散易碎的胚性愈伤组织，所述增殖后获得的浅黄色松散易碎的番木瓜胚性愈伤组织的形态图见附图2；
(2)均质胚性细胞悬浮系的建立
取上述增殖培养后获得的松散易碎的胚性愈伤组织约2g，加入到装有30mL愈伤组织悬浮培养液体培养基(ML)的100mL锥形瓶中进行增殖培养，置于110r/min的摇床上振荡培养，培养条件为暗培养，培养温度为28±1℃；培养2周后，用900μm孔径筛网滤除较大颗粒培养物；随后继续进行悬浮培养，以21天为一个继代周期，继代时用154μm孔径筛网过滤去除较大的细胞团；培养3-5个继代周期后可获得可得到分散、均质的胚性细胞悬浮系，经培养均质的胚性细胞悬浮系的形态图见附图3；
(3)体细胞胚的诱导和成熟
取上述悬浮培养继代后第7-10d的胚性悬浮细胞，在所述体细胞胚诱导培养基(MSD1)中诱导体细胞胚的发生，培养15天后，由均质的胚性细胞悬浮系第一个诱导周期在液体培养基中诱导形成的体细胞胚的形态图件附图4；将所获体细胞胚转移到所述体细胞胚成熟培养基(MSD2)中诱导体细胞胚的成熟，培养30天，经第二个诱导周期在固体培养基中诱导形成的成熟体细胞胚的形态图见附图5；
(4)体细胞胚的萌发、生根和植株再生
取上述培养后的成熟体细胞胚，置于装有所述萌发培养基(MG)的培养皿(直径9.0cm)中进行萌发培养，暗培养3天后，光照培养12天，经萌发和生根培养5天后的体细胞胚的形态图见附图6，经萌发和生根培养14天后的体细胞胚的形态图见附图7；随后将萌发和生根后的体细胞胚被转移到所述成苗培养基(MR)培养30天，进一步发育成为完整的小植株，经成苗培养30天后形成的小植株的形态图见附图8。
实施例2
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株高效再生的方法与实施例1相同，其区别仅在于，步骤(1)中胚性愈伤组织诱导时取开花坐果后120天的未成熟果实种子幼胚为外植体。
实施例3
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株高效再生的方法与实施例1相同，其区别仅在于，步骤(1)中愈伤组织诱导固体培养基(MI)和步骤(2)中愈伤组织悬浮培养液体培养基(ML)中2,4-D浓度均为4mg/L。
实施例4
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株高效再生的方法与实施例1相同，其区别仅在于，步骤(4)萌发培养基(MG)中6-BA浓度为0.3mg/L。
实施例5
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株高效再生的方法与实施例1相同，其区别仅在于，步骤(4)萌发培养基(MG)中NAA浓度为0.2mg/L。
实施例6
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株高效再生的方法与实施例4相同，其区别仅在于，步骤(4)萌发培养基(MG)中NAA浓度为0.2mg/L。
实施例7
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株高效再生的方法与实施例1相同，其区别仅在于，步骤(4)成苗培养基(MR)中6-BA浓度为0.1mg/L。
实施例8
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株高效再生的方法与实施例1相同，其区别仅在于，步骤(4)成苗培养基(MR)中IBA浓度为2mg/L。
实施例9
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株高效再生的方法与实施例7相同，其区别仅在于，步骤(4)萌发培养基(MG)中IBA浓度为2mg/L。
对比例1
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株再生的方法同实施例1，其区别仅在于，所述步骤(1)中，采用的外植体材料成熟度不同，即取开花坐果后140天的成熟果实，用自来水将果实外表清洗干净，然后用70％的酒精进行表面消毒，在超净工作台上纵向切开果实，挑取发育较饱满的成熟种子，剥除外层种壳，并剔除种皮后即获得所需外植体。
对比例2
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株高效再生的方法与实施例1相同，其区别仅在于，步骤(2)悬浮培养继代过程中不使用154μm孔径筛网过滤去除较大的细胞团。
对比例3
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株再生的方法同实施例1，其区别仅在于，所述步骤(1)中，所述胚性愈伤诱导固体培养基(MI)组成为：1/2MS培养基+1mg/L2,4-D+400mg/L谷氨酰胺+60g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，pH5.8。
对比例4
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株再生的方法同实施例1，其区别仅在于，所述步骤(1)中，所述胚性愈伤诱导固体培养基(MI)组成为：1/2MS培养基+5mg/L2,4-D+400mg/L谷氨酰胺+60g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，pH5.8。
对比例5
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株高效再生的方法与实施例1相同，其区别仅在于，步骤(4)萌发培养基(MG)中6-BA浓度为0.05mg/L。
对比例6
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株高效再生的方法与实施例1相同，其区别仅在于，步骤(4)萌发培养基(MG)中6-BA浓度为0.4mg/L。
对比例7
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株高效再生的方法与实施例1相同，其区别仅在于，步骤(4)萌发培养基(MG)中NAA浓度为0.3mg/L。
对比例8
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株高效再生的方法与实施例4相同，其区别仅在于，步骤(4)萌发培养基(MG)中NAA浓度为0.3mg/L。
对比例9
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株高效再生的方法与实施例1相同，其区别仅在于，步骤(4)成苗培养基(MR)中6-BA浓度为0.2mg/L。
对比例10
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株高效再生的方法与实施例1相同，其区别仅在于，步骤(4)成苗培养基(MR)中IBA浓度为0.5mg/L。
对比例11
本实施例所述基于胚性细胞悬浮系建立番木瓜植株高效再生的方法与实施例8相同，其区别仅在于，步骤(4)萌发培养基(MG)中IBA浓度为3mg/L。
实验例
分别对上述实施例1-9及对比例1-11中方法的生根情况进行检测及记录，结果记录于下表1。
表1不同处理方式番木瓜胚性细胞悬浮系建立和植株再生的效果
Figure BDA0002601608730000121
Figure BDA0002601608730000131
从上表数据可见，本发明所述的单细胞起源途径植株再生技术方法与常规的番木瓜组培快繁植株再生技术相比，一旦建立均质的胚性细胞悬浮系，即能在短时间内低成本生产出大批量种苗，具有生根容易、根系出现愈伤化比率低、周期短、所需生产空间小、生产成本低的优势；同时，由于该途径是从单细胞发育为完整植株，因此，该技术为番木瓜的多倍体诱变育种、细胞工程育种和分子育种等技术的应用提供了良好的再生技术体系，避免了嵌合体的产生，适宜于在该领域推广。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (3)

1.一种基于单细胞起源的番木瓜植株高效再生方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）胚性愈伤组织诱导和增殖培养
取未成熟种子剥除外层种壳，剔除未成熟幼胚种皮，获得所需外植体；随后将所述外植体未成熟幼胚置于愈伤组织诱导固体培养基MI中进行诱导培养，得到松散易碎的浅黄色胚性愈伤组织；并将所述胚性愈伤组织继续进行继代培养，得到增殖的胚性愈伤组织；
所述愈伤组织诱导固体培养基MI为如下组分：1/2 MS培养基、2-4mg/L 2,4-D、400mg/L谷氨酰胺、50-70g/L蔗糖、5-10g/L琼脂粉，调pH5.5-6.0；
（2）均质胚性细胞悬浮系的建立
取增殖后的胚性愈伤组织置于愈伤组织增殖液体培养基ML中进行液体悬浮培养，并在每个继代周期培养结束后滤除较大颗粒培养物；随后继续进行重复液体悬浮继代培养和筛选，直到得到均质胚性细胞悬浮系；
所述愈伤组织增殖液体培养基ML为如下组分：1/2 MS培养基、2-4mg/L 2,4-D、350-450mg/L谷氨酰胺、50-70g/L蔗糖，调pH5.0-5.5；
（3）体细胞胚的诱导和成熟培养
取得到的均质胚性悬浮细胞置于体细胞胚诱导培养基MSD1中进行体细胞胚诱导培养，并于体细胞成熟培养基MSD2进行成熟培养，得到成熟体细胞胚；
所述体细胞胚诱导培养基MSD1为如下成分：1/2MS大量元素和微量元素及其铁盐、MS维生素、40-60mg/L肌醇、300-500mg/L谷氨酰胺、25-35g/L蔗糖，调pH5.0-5.5；
所述体细胞成熟培养基MSD2为如下成分：1/2MS大量元素和微量元素及其铁盐、MS维生素、40-60mg/L肌醇、300-500mg/L谷氨酰胺、25-35g/L蔗糖、8-12g/L活性炭、5-10g/L琼脂粉，调pH5.5-6.0；
（4）体细胞胚的萌发、生根和植株再生
取得到的成熟体细胞胚置于萌发培养基MG中进行萌发和生根培养，进一步并将萌发和生根后的小植株转移至成苗培养基MR中发育得到完整的小植株；
所述萌发培养基MG为如下成分：MS大量元素、微量元素、铁盐及其维生素、0.1-0.2mg/L6-BA、0.1-0.2mg/L NAA、300-500mg/L谷氨酰胺、4-6g/L活性炭、20-40mgl/L蔗糖、5-10g/L琼脂粉，调pH5.5-6.0；
所述成苗培养基MR为如下成分：1/2MS大量元素、微量元素、铁盐及其维生素、0.05-0.1mg/L 6-BA、1-2mg/L IBA、4-6g/L活性炭、25-35mgl/L蔗糖、5-10g/L琼脂粉，调pH5.5-6.0；
所述的MS培养基成分为：
大量元素：1650mg/L NH4NO3，1900mg/L KNO3，170mg/L KH2PO4，370mg/L MgSO4，440mg/LCaCL2·2H2O；
微量元素：0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4·H2O，10.6mg/L ZnSO4 ·H2O ，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCL2·6H2O；
有机物：0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2.0mg/L甘氨酸；铁盐：27.8mg/L FeSO4 · 7H2O ，37.3mg/L Na2·EDTA；
所述步骤（1）中：
所述未成熟种子指开花坐果后发育90-120天果实的种子；
所述诱导培养步骤中，控制反应过程为暗培养，培养温度为28±1℃，培养时间60-90天；
所述继代培养步骤中，控制反应过程为暗培养，培养温度为28±1℃，以30天为一个继代周期，继代培养2-3个周期；
所述步骤（2）中：
所述液体悬浮培养步骤中，第一个继代周期控制反应过程为暗培养，培养温度为28±1℃，培养时间为2周，使用800-1000μm孔径的筛网滤除较大颗粒培养物；
所述液体悬浮均质筛选和继代培养步骤中，控制反应过程为暗培养，培养温度为28±1℃，以21天为一个继代周期，使用160-160μm孔径的筛网滤除较大细胞团，继代培养3-5个继代周期。
2.根据权利要求1所述基于单细胞起源的番木瓜植株高效再生方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述体细胞胚诱导和成熟培养中，控制反应过程为暗培养，培养温度为28±1℃，诱导周期为15-20天，成熟周期为30-40天，期间更新一次培养基。
3.根据权利要求1或2所述基于单细胞起源的番木瓜植株高效再生方法，其特征在于，所述步骤（4）中：
所述萌发培养步骤中，控制反应过程为先暗培养3天，培养温度为28±1℃，后光照培养10-12天，培养温度为28±1℃，光照强度为25-35μmol·m-2·s-1；
所述成苗培养步骤中，控制反应过程为光照培养，培养温度为28±1℃，光照强度为25-35μmol·m-2·s-1，培养30-40天。
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