CN111903517B - 一种红闭鞘姜愈伤诱导和植株再生的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红闭鞘姜愈伤诱导和植株再生的方法，包括如下步骤：1)外植体的消毒和愈伤诱导；2)愈伤增殖培养；3)丛生芽的诱导和增殖培养；4)生根壮苗培养。本发明通过选用红闭鞘姜未成熟花序苞片内的小花作为外植体，简化常规的组织培养消毒程序，选择改良MS培养基代替MS培养基，在连续光照下进行丛生芽的诱导和增殖培养及生根壮苗培养，显著提高了红闭鞘姜的愈伤诱导率，增强植株再生能力，为开展药用化合物生产和试管苗的大规模快速繁殖提供高效组织培养体系，为红闭鞘姜愈伤培养和组培苗生产开辟了道路。
Description
技术领域
本发明属于植物栽培技术领域，具体涉及一种红闭鞘姜愈伤诱导和植株再生的方法。
背景技术
红闭鞘姜(Costus woodsonii)为闭鞘姜科闭鞘姜属多年生草本植物，原产于热带美洲，近年我国广东有引种栽培。株高0.5-1.5米，地下有发达的根状茎，叶片革质，长椭圆形，长 10-20厘米，宽5-10厘米。穗状花序顶生，长5-10厘米，红色腊质苞片包覆着花序，外形似未熟的松果。黄色小花自苞片伸出，长约3厘米。红闭鞘姜株形挺拔，花序形状趣致，是优良的庭院绿化和盆栽花卉。红闭鞘姜还可药用，从根状茎和叶片中提取的薯蓣皂苷、芸香苷和槲皮素等化合物是重要的医药原料，具有抗氧化、杀菌消炎、降低血糖等功效。红闭鞘姜在观赏和药用方面均有很高的经济和市场价值，开发利用前景广阔。
红闭鞘姜的药用成分主要是从根状茎中分离提取，目前红闭鞘姜在国内的种植量很少，难以满足药用需求。其繁殖主要依靠分切根状茎进行营养繁殖，繁殖速度慢，生产成本高，种质品质易退化，导致栽培规模难以扩大。采用组织培养技术诱导愈伤组织，是开展从红闭鞘姜愈伤组织提取药用成分研究的技术基础，植株再生则可为试管苗的大规模快速繁殖开辟一条有效途径。目前，红闭鞘姜的组织培养技术未见报道。闭鞘姜科的组织培养文献也较少，唐世蓉(1981)、李宗友(1995)采用闭鞘姜(Costus speciosus)的茎或根茎片为外植体诱导愈伤组织。本发明人在进行红闭鞘姜的组织培养研究时发现，以茎和根茎片为外植体，消毒灭菌难度大，污染率高；采用文献中所使用的愈伤培养基：RT+1ppm 2,4-D和MS+0.2ppm KT+1ppm 2,4-D进行红闭鞘姜的组织培养时，出现了愈伤组织诱导和生长慢的现象，说明文献所列的培养基配方不适合红闭鞘姜的组织培养。此外，文献只报道了闭鞘姜的愈伤诱导，缺乏通过愈伤再生植株的报道。
目前，尚无红闭鞘姜乃至闭鞘姜科的专利申请件。
李宗友.1995.鉴别闭鞘姜及其组织培养物中薯蓣皂甙元的分布.国外医学中医中药分册, 17(4):50。
唐世蓉.1981.闭鞘姜根茎和茎愈伤组织中甾体皂甙元的分离鉴定.国外药学.植物药分册,2(1):35-36。
发明内容
本发明的目的是针对上述不足，提供一种红闭鞘姜愈伤诱导和植株再生的方法，本发明愈伤诱导率高，植株再生能力强，为开展药用化合物生产和试管苗的大规模快速繁殖提供高效组织培养体系。
本发明采取的技术方案如下：
一种红闭鞘姜愈伤诱导和植株再生的方法，包括以下步骤：
(1)外植体的消毒和愈伤诱导：取红闭鞘姜苞片未张开的未成熟花序，清洗消毒整枝花序，将苞片切掉，用镊子夹出小花，将整朵小花接种于愈伤诱导培养基中培养20-30天，产生愈伤组织，所述的愈伤诱导培养基组成为：改良MS培养基+TDZ 0.5-1.0mg/L+NAA 1.0-2.0mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂6-7g/L，pH 5.7-6.0；
(2)愈伤增殖培养：将愈伤组织分切成小块，转入愈伤增殖培养基中培养25-30天，所述的愈伤增殖培养基组成为：改良MS培养基+TDZ 2.0-3.0mg/L+NAA 3.0-5.0mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂6-7g/L，pH 5.7-6.0；
(3)丛生芽的诱导培养：将愈伤组织接种到分化培养基中培养25-30天，诱导丛生芽的形成和增殖，得到继代培养苗，所述的分化培养基组成为改良MS培养基+TDZ 0.1-0.5mg/L+6-BA 0.5-2.0mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂6-7g/L，pH 5.7-6.0；
(4)生根壮苗培养：待继代培养苗长出3-4片叶时，将幼苗切出转接到生根壮苗培养基中培养25-30天，得到生根幼苗，所述的生根壮苗培养基组成为改良MS培养基+TDZ0.1-0.5mg/L+IBA 0.5-1.0mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂6-7g/L，pH 5.7-6.0。
所述的改良MS培养基组成为NH4NO3 550mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、MgSO4·7H2O370mg/L、KH2PO4 170mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、 ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA·2H2O 37.3mg/L、Ca(NO3)2· 4H2O 556mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L，溶剂为水。
步骤(1)中花序的清洗消毒步骤为：花序用流水冲洗10-20分钟，然后在超净工作台上用质量分数0.1％HgCl2溶液消毒10-15分钟，用无菌水漂洗1-2次。
步骤(1)和(2)中的培养条件是：培养温度30±1℃，光照时间2-4h/d，光照强度500-1000Lux。
步骤(3)和(4)中的培养条件是：培养温度30±1℃，连续光照，光照强度1000-2000Lux。
本发明的有益效果为：
1、本发明的外植体是未成熟花序苞片内的小花，由于苞片包被着小花，既防止小花受到污染，又使小花免受消毒剂HgCl2的杀伤，和常规的采用茎或地下根茎为外植体相比，小花外植体污染率降至0，成活率达100％，愈伤诱导率也显著增加，达到93.3％。而用茎段或地下茎片为外植体，污染率分别达到43.3％和60.0％，成活率40.0％和23.3％，愈伤诱导率43.3％和50.0％。
2、本发明简化了常规的组织培养消毒程序，不需酒精消毒处理，只用HgCl2消毒，无菌水冲洗次数也减少至1-2次，节省操作时间，提高工作效率。
3、本发明使用改良MS培养基，即去掉MS培养基中的KNO3、肌醇和甘氨酸，添加 Ca(NO3)2.4H2O，降低了MS培养基中的NH4NO3浓度。该改良MS培养基的组织培养效果显著优于MS培养基，愈伤诱导率和愈伤再分化率高，每个培养周期愈伤生长量达到2.3g 以上，每块愈伤分化出4-7个芽，芽的继代增殖系数达到7-10倍，植株生长速度快，苗高超过4cm，根长超过5cm。
4、本发明在丛生芽的诱导培养和生根壮苗培养步骤中使用的光照条件为连续光照，对植株再生的效果显著优于常规组织培养的光照周期12-16h/d，芽的继代增殖系数达到7-10 倍，植株生长速度快，苗高超过4cm，根长超过5cm。
5、本发明中的外植体、消毒方法、培养基配方、培养光照条件均为闭鞘姜科首创，所用培养基易配置，成本低，操作简单，为红闭鞘姜愈伤培养和组培苗生产开辟了道路。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下述实施例中的改良MS培养基成分和配制方法如下：
大量元素母液为20倍浓缩液，配1升培养基取母液50mL。母液的具体配法为：分别称NH4NO3 11g、Ca(NO3)2· 4H2O 11.12g、CaCl2·2H2O 8.8g、MgSO4·7H2O 7.4g、KH2PO43.4g，分别加蒸馏水溶解后再混合，最后定容于1L。
微量元素母液为200倍浓缩液，配1升培养基取母液5mL。母液的具体配法为：分别称KI 0.166g、H3BO3 1.24g、MnSO4·4H2O 4.46g、ZnSO4·7H2O 1.72g、Na2MoO4·2H2O 0.05g、CuSO4·5H2O 0.005g、CoCl2·6H2O 0.005g，分别加蒸馏水溶解后再混合，最后定容于1L。
铁盐母液为200倍浓缩液，配1升培养基取母液5mL。母液的具体配法为：分别称FeSO4·7H2O 5.56g、Na2·EDTA·2H2O 7.46g，分别加蒸馏水溶解后再混合，最后定容于1L。
有机物母液为200倍浓缩液，配1升培养基取母液5mL。母液的具体配法为：分别称烟酸0.1g、盐酸吡哆醇0.1g、盐酸硫胺素0.02g，分别加蒸馏水溶解后再混合，最后定容于1L。
1L改良MS培养基的配制：取50mL大量元素母液、5mL微量元素母液、5mL铁盐母液、5mL有机物母液，混合，加水定容至1000mL，即得到改良MS培养基。
实施例1
一种红闭鞘姜愈伤诱导和植株再生的方法，包括以下步骤：
(1)外植体的消毒和愈伤诱导：剪取红闭鞘姜的苞片未张开的无病虫害的未成熟花序，用流水冲洗10分钟，然后在超净工作台上用质量分数0.1％HgCl2溶液消毒10分钟，用无菌水漂洗1次，消毒成功率为100％。将苞片切掉，用镊子夹出小花，将整朵小花接种于愈伤诱导培养基中，在培养温度30℃、光照时间2h/d，光照强度500Lux的条件下培养20 天，小花表面隆起，产生白色愈伤组织，愈伤诱导率为93.3％。所述的愈伤诱导培养基组成为：改良MS培养基+TDZ 0.5mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，pH 5.7，其配制方法是在每升改良MS培养基中添加TDZ 0.5mg+NAA 1.0mg+蔗糖20g+琼脂6g，调pH 5.7，灭菌制得。
(2)愈伤增殖培养：将上述所得到的愈伤组织分切成约0.5cm的小块，转入愈伤增殖培养基中，在培养温度30℃、光照时间2h/d，光照强度500Lux的条件下培养28天，愈伤组织的平均生长量为2.35g。所述的愈伤增殖培养基组成为：改良MS培养基+TDZ 2.0 mg/L+NAA 3.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，pH 5.7，其配制方法是在每升改良MS培养基中添加TDZ2mg+NAA 3.0mg+蔗糖20g+琼脂6g，调pH 5.7，灭菌制得。
(3)丛生芽的诱导和增殖培养：将愈伤组织接种到分化培养基中，在培养温度30℃，连续光照，光照强度1000Lux的条件下培养28天，诱导丛生芽的形成和增殖，得到继代培养苗，分化率为100％，每块愈伤组织分化出的芽数为4-6个，芽增殖系数为8.5。所述的分化培养基组成为：改良MS培养基+TDZ 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，pH 5.7，其配制方法是在每升改良MS培养基中添加TDZ 0.1mg+6-BA 0.5mg+蔗糖20g+ 琼脂6g，调pH5.7，灭菌制得。
(4)生根壮苗培养：将长出3-4片叶的继代培养苗切出转接到生根壮苗培养基中，在培养温度30℃，连续光照，光照强度1000Lux的条件下培养28天，得到生根幼苗，生根率为100％，平均根长5.7cm，平均苗高4.8cm，苗生长健壮。所述的生根壮苗培养基组成为：改良MS培养基+TDZ 0.1mg/L+IBA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，pH 5.7，其配制方法是在每升改良MS培养基中添加TDZ 0.1mg+IBA 0.5mg+蔗糖20g+琼脂6g，调pH 5.7，灭菌制得。
实施例2
一种红闭鞘姜愈伤诱导和植株再生的方法，包括以下步骤：
(1)外植体的消毒和愈伤诱导：剪取红闭鞘姜的苞片未张开的无病虫害的未成熟花序，用流水冲洗15分钟，然后在超净工作台上用质量分数0.1％HgCl2溶液消毒12分钟，用无菌水漂洗2次，消毒成功率为100％。将苞片切掉，用镊子夹出小花，将整朵小花接种于愈伤诱导培养基中，在培养温度30℃、光照时间3h/d，光照强度700Lux的条件下培养20 天，小花表面隆起，产生白色愈伤组织，愈伤诱导率为96.7％。所述的愈伤诱导培养基组成为：改良MS培养基+TDZ 0.8mg/L+NAA 1.5mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6.5g/L，pH 5.8，其配制方法是在每升改良MS培养基中添加TDZ 0.8mg+NAA 1.5mg+蔗糖25g+琼脂6.5g，调 pH 5.8，灭菌制得。
(2)愈伤增殖培养：将上述所得到的愈伤组织分切成约0.5cm的小块，转入愈伤增殖培养基中，在培养温度30℃、光照时间3h/d，光照强度700Lux的条件下培养25天，愈伤组织的平均生长量为2.30g。所述的愈伤增殖培养基组成为：改良MS培养基+TDZ 2.5 mg/L+NAA 4.0mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6.5g/L，pH 5.8，其配制方法是在每升改良MS培养基中添加TDZ 2.5mg+NAA 4mg+蔗糖25g+琼脂6.5g，调pH 5.8，灭菌制得。
(3)丛生芽的诱导和增殖培养：将愈伤组织接种到分化培养基中，在培养温度30℃，连续光照，光照强度1500Lux的条件下培养25天，诱导丛生芽的形成和增殖，得到继代培养苗，分化率为100％，每块愈伤组织分化出的芽数为4-6个，芽增殖系数为8.7。所述的分化培养基组成为：改良MS培养基+TDZ 0.3mg/L+6-BA 1.0mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6.5 g/L，pH5.8，其配制方法是在每升改良MS培养基中添加TDZ 0.3mg+6-BA 1.0mg+蔗糖25g+琼脂6.5g，调pH 5.8，灭菌制得。
(4)生根壮苗培养：将长出3-4片叶的继代培养苗切出转接到生根壮苗培养基中，在培养温度30℃，连续光照，光照强度1500Lux的条件下培养25天，得到生根幼苗，生根率为100％，平均根长5.6cm，平均苗高4.9cm，苗生长健壮。所述的生根壮苗培养基组成为：改良MS培养基+TDZ 0.3mg/L+IBA 0.8mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6.5g/L，pH 5.8，其配制方法是在每升改良MS培养基中添加TDZ 0.3mg+IBA 0.8mg+蔗糖25g+琼脂6.5g，调pH 5.8，灭菌制得。
实施例3
一种红闭鞘姜愈伤诱导和植株再生的方法，包括以下步骤：
(1)外植体的消毒和愈伤诱导：剪取红闭鞘姜的苞片未张开的无病虫害的未成熟花序，用流水冲洗20分钟，然后在超净工作台上用质量分数0.1％HgCl2溶液消毒15分钟，用无菌水漂洗2次，消毒成功率为100％。将苞片切掉，用镊子夹出小花，将整朵小花接种于愈伤诱导培养基中，在培养温度30℃、光照时间4h/d，光照强度1000Lux的条件下培养20 天，小花表面隆起，产生白色愈伤组织，愈伤诱导率为90.0％。所述的愈伤诱导培养基组成为：改良MS培养基+TDZ 1.0mg/L+NAA 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 6.0，其配制方法是在每升改良MS培养基中添加TDZ 1mg+NAA 2mg+蔗糖30g+琼脂7g，调pH 6，灭菌制得。
(2)愈伤增殖培养：将上述所得到的愈伤组织分切成约0.5cm的小块，转入愈伤增殖培养基中，在培养温度30℃、光照时间4h/d，光照强度1000Lux的条件下培养25天，愈伤组织的平均生长量为2.33g。所述的愈伤增殖培养基组成为：改良MS培养基+TDZ 3.0 mg/L+NAA 5.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 6.0，其配制方法是在每升改良MS培养基中添加TDZ3mg+NAA 5mg+蔗糖30g+琼脂7g，调pH 6，灭菌制得。
(3)丛生芽的诱导和增殖培养：将愈伤组织接种到分化培养基中，在培养温度30℃，连续光照，光照强度2000Lux的条件下培养25天，诱导丛生芽的形成和增殖，得到继代培养苗，分化率为100％，每块愈伤组织分化出的芽数为4-6个，芽增殖系数为8.4。所述的分化培养基组成为：改良MS培养基+TDZ 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L， pH6.0，其配制方法是在每升改良MS培养基中添加TDZ 0.5mg+6-BA 2.0mg+蔗糖30g+ 琼脂7g，调pH 6.0，灭菌制得。
(4)生根壮苗培养：将长出3-4片叶的继代培养苗切出转接到生根壮苗培养基中，在培养温度30℃，连续光照，光照强度2000Lux的条件下培养25天，得到生根幼苗，生根率为100％，平均根长5.8cm，平均苗高4.5cm，苗生长健壮。所述的生根壮苗培养基组成为：改良MS培养基+TDZ 0.5mg/L+IBA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 6.0，其配制方法是在每升改良MS培养基中添加TDZ 0.5mg+IBA 1.0mg+蔗糖30g+琼脂7g，调pH 6，灭菌制得。
实施例4
本实施例分别考察不同外植体的愈伤组织诱导反应，以及不同MS培养基、光照周期对红闭鞘姜组织培养的影响，具体方案如下：
1、不同外植体的愈伤组织诱导反应：参照实施例1的步骤，分别选择红闭鞘姜未成熟花序苞片内的小花、红闭鞘姜地上茎段、红闭鞘姜地下茎片作为外植体，评价不同外植体的愈伤组织诱导反应，结果见表1。
本发明的外植体是未成熟花序苞片内的小花，由于苞片包被着小花，既防止小花受到污染，又使小花免受消毒剂HgCl2的杀伤，和常规的采用地上茎段或地下茎片为外植体相比，小花外植体污染率降至0，成活率达100％，愈伤诱导率也显著增加，达到93.3％。而用地上茎段或地下茎片为外植体，污染率分别达到43.3％和60.0％，成活率为40.0％和23.3％，愈伤诱导率为46.7％和50.0％。
污染率＝(污染小花数/接种小花总数)×100％；成活率＝(成活小花数/接种小花总数)×100％；愈伤诱导率＝(产生愈伤的小花数/接种小花总数)×100％。
表1不同外植体的愈伤组织诱导反应
注：所有结果是接种4周进行统计，数值是平均值±标准误，同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
2、不同MS培养基对红闭鞘姜愈伤培养和再分化的影响:参照实施例1的步骤，分别考察使用本发明的改良MS培养基、MS培养基对红闭鞘姜愈伤诱导、增殖和再分化的影响，结果见表2。
本发明使用的改良MS培养基去掉MS培养基中的KNO3、肌醇和甘氨酸，添加 Ca(NO3)2.4H2O，降低了MS培养基中的NH4NO3浓度。该改良MS培养基的组织培养效果显著优于MS培养基，愈伤诱导率和愈伤再分化率分别为91.7％和83.3％，每个培养周期愈伤生长量达到2.3g以上。
表2不同MS培养基对红闭鞘姜愈伤培养和再分化的影响
注：所有结果是接种4周进行统计，数值是平均值±标准误，P<0.05。
3、不同MS培养基和不同光照周期对红闭鞘姜植株再生的影响:参照实施例1的步骤，设培养基和光照周期2个因素，培养基设定2个水平，分别是MS基本培养基和改良MS 培养基；光照周期设定4个水平，分别是12h/d、16h/d、20h/d、24h/d，培养基和光照周期交互共8个处理：M0L1：MS基本培养基+光照12h/d；M0L2：MS基本培养基+光照16 h/d；M0L3：MS基本培养基+光照20h/d；M0L4：MS基本培养基+光照24h/d；M1L1：改良MS培养基+光照12h/d；M1L2：改良MS培养基+光照16h/d；M1L3：改良MS培养基 +光照20h/d；M1L4：改良MS培养基+光照24h/d。分别考察使用不同培养基和不同光照周期(12h/d、16h/d、20h/d、24h/d)对丛生芽的诱导和增殖培养、以及生根壮苗培养的影响，结果见表3。
在植株再生阶段，不同培养基和光照周期对芽分化、芽增殖以及幼苗生长有着显著的影响。在相同的光照条件下，使用改良MS培养基的植株再生效果均显著优于未改良的MS 培养基；在相同的培养基条件下，光照时间的增加则有利于植株再生。在本发明丛生芽的诱导和增殖培养、生根壮苗培养的过程中使用改良MS培养基和连续光照(即24h/d)的培养条件，组织培养效果最好，每块愈伤分化出的芽数为5.1个，芽的继代增殖系数8.1，植株生长速度最快，苗高4.6cm、根长5.4cm。
表3不同培养基和光照周期对红闭鞘姜植株再生的影响
注：8个处理：M0L1：MS基本培养基+光照12h/d；M0L2：MS基本培养基+光照16 h/d；M0L3：MS基本培养基+光照20h/d；M0L4：MS基本培养基+光照24h/d；M1L1：改良MS培养基+光照12h/d；M1L2：改良MS培养基+光照16h/d；M1L3：改良MS培养基 +光照20h/d；M1L4：改良MS培养基+光照24h/d。所有结果是接种4周进行统计，数值是平均值±标准误，同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种红闭鞘姜愈伤诱导和植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)外植体的消毒和愈伤诱导：取红闭鞘姜苞片未张开的未成熟花序，清洗消毒整枝花序，将苞片切掉，用镊子夹出小花，将整朵小花接种于愈伤诱导培养基中培养20-30天，产生愈伤组织，所述的愈伤诱导培养基组成为：改良MS培养基+TDZ 0.5-1.0mg/L+NAA 1.0-2.0mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂6-7g/L，pH 5.7-6.0，所述的培养条件是：培养温度30±1℃，光照时间2-4h/d，光照强度500-1000Lux；
(2)愈伤增殖培养：将愈伤组织分切成小块，转入愈伤增殖培养基中培养25-30天，所述的愈伤增殖培养基组成为：改良MS培养基+TDZ 2.0-3.0mg/L+NAA 3.0-5.0mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂6-7g/L，pH 5.7-6.0，所述的培养条件是：培养温度30±1℃，光照时间2-4h/d，光照强度500-1000Lux；
(3)丛生芽的诱导培养：将愈伤组织接种到分化培养基中培养25-30天，诱导丛生芽的形成和增殖，得到继代培养苗，所述的分化培养基组成为改良MS培养基+TDZ 0.1-0.5mg/L+6-BA 0.5-2.0mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂6-7g/L，pH 5.7-6.0，所述的培养条件是：培养温度30±1℃，连续光照，光照强度1000-2000Lux；
(4)生根壮苗培养：待继代培养苗长出3-4片叶时，将幼苗切出转接到生根壮苗培养基中培养25-30天，得到生根幼苗，所述的生根壮苗培养基组成为改良MS培养基+TDZ0.1-0.5mg/L+IBA 0.5-1.0mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂6-7g/L，pH 5.7-6.0，所述的培养条件是：培养温度30±1℃，连续光照，光照强度1000-2000Lux；
所述的改良MS培养基组成为NH4NO3 550mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L、MgSO4·7H2O370mg/L、KH2PO4 170mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA·2H2O 37.3mg/L、Ca(NO3)2· 4H2O 556mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L，溶剂为水。
2.根据权利要求1所述的红闭鞘姜愈伤诱导和植株再生的方法，其特征在于，步骤(1)中花序的清洗消毒步骤为：花序用流水冲洗10-20分钟，然后在超净工作台上用质量分数0.1％HgCl2溶液消毒10-15分钟，用无菌水漂洗1-2次。
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