CN105724257A - 一种烟草小孢子诱导培养基及烟草小孢子培养方法 - Google Patents

一种烟草小孢子诱导培养基及烟草小孢子培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种烟草小孢子诱导培养基及烟草小孢子培养方法，所述培养基由特定成分配比和含量比例的养分、有机添加物、无机添加物、植物生长调节剂、凝固剂、活性炭等所构成。所述烟草小孢子培养方法的步骤包括：花药取材与低温预处理、培养基的灭菌、消毒与花粉提取、花粉接种与变温诱导、愈伤分化与继代培养、炼苗与移栽。该烟草小孢子诱导培养基及烟草小孢子培养方法特异性针对烟草小孢子培养的要求，诱导效率高，培养效果好，大大加快了烟草小孢子培养育种进程。

Description

一种烟草小孢子诱导培养基及烟草小孢子培养方法
技术领域
本发明涉及一种烟草小孢子诱导培养基及烟草小孢子培养方法，具体涉及一种特异性针对烟草小孢子培养的要求、诱导效率高、培养效果好的烟草小孢子诱导培养基及烟草小孢子培养方法，属于农业科学技术领域。
背景技术
烟草在植物分类学上属于双子叶植物纲、管花目、茄科、烟属，为一年生或有限多年生草本植物，其基部稍木质化，花序顶生，圆锥状，多花，蒴果卵状或矩圆状，长约等于宿存萼，夏秋季开花结果。一般把烟属分为3个亚属，即黄花烟亚属、普通烟亚属和碧冬烟亚属，共计66个种。目前可直接利用的栽培种有普通烟草种和黄花烟草种，其它为野生种。
烟草原产南美洲，大量考古发现证明，人类尚处于原始社会时，美洲印第安人就开始种植烟草，16世纪中叶烟草传入中国，并在中国迅速发展，在我国南北各省区广为栽培，在我国国民经济中具有很高的价值。现在我国烤烟种植面积、总产量和总销售额均居于世界首位，占据了全球1/3的卷烟市场、全球1/3的卷烟产量和全球1/3的烟叶产量，是名副其实的烟草大国。烟草是我国税收贡献率最高的产业之一，连续20年贡献近一成国家财政，烟草业作为第一大经济产业的地位难以动摇，不仅可以推动农业发展，提高农民生活质量，而且还能促进就业，增加地方和国家财政收入，创造大量外汇。大力提高烟草育种技术、发展烟草产业对国民经济发展具有重要的意义。
20世纪50年代初，我国的烟草品种选育工作就已经开始，先后选育出了红花大金元，云烟 87、85、202和中烟98等烤烟品种，并大面积推广种植，近年来，国内育成的烤烟品种种植面积已占全国烤烟种植面积的大半。白肋烟品种的选育也取得了较为显著的成效，鄂烟1号等6 个白肋烟品种已通过全国审定，并逐步在生产上推广应用，改变了我国白肋烟种植品种单一的问题。
然而，我国在烟草育种研究方面和生产应用中仍存在基础研究相对薄弱、优质高香气低危害品种缺乏、地方特色品种少等诸多严峻问题。常规烟草育种周期长，盲目性大，远远不能满足烟叶生产的需要。随着生物技术的快速发展，单倍体育种技术开始应用于烟草育种研究，烟草小孢子培养是单倍体技术最重要的操作手段。通过对烟草小孢子离体培养诱导单倍体或双单倍体植株从而迅速获得烟草纯合系的烟草小孢子培养育种技术不但可以缩短烟草的育种周期、加快烟草的育种进程，而且所获得的纯合系很有可能结合双亲的优点，获得更加优良的新种质，因而烟草小孢子培养技术的研究具有十分重要的理论意义和实际应用价值。
烟草小孢子培养技术虽取得很大的成功，但在理论和应用上仍存在一些问题。目前烟草小孢子胚状体或愈伤组织的诱导率和分化率还比较低，远远达不到小孢子培养育种的产业化要求。因此，加快烟草小孢子培养机理研究，开发出小孢子愈伤诱导率和分化率更高的培养基和小孢子培养方法，具有重要的现实需求。
发明内容
本发明是针对目前烟草小孢子培养中小孢子愈伤组织诱导率和分化低的现状，提供了一种烟草小孢子诱导培养基及烟草小孢子培养方法。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种烟草小孢子诱导培养基，其特征在于按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：KNO3900～1100mg/L，NH4NO3 900～1100mg/L，KH2PO4 270～330mg/L，Ca(NO3)2∙4H2O 330～360mg/L，KCl 60～70mg/L，Na2-EDTA 72～78mg/L，FeSO4∙7H2O 54～58mg/L，MnSO4∙4H2O 4.0～5.0mg/L，ZnSO4∙7H2O 2.1～2.3mg/L，H3BO3 2.3～2.7mg/L，KI 1.1～1.3mg/L，CuSO4∙5H2O0.02～0.03mg/L，CoCl∙6H2O 0.02～0.03mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.2～0.3mg/L，AgNO3 18～20mg/L，肌醇 90～110mg/L，维生素B1 0.09～0.11mg/L，维生素B6 0.09～0.11mg/L，烟酸0.45～0.55mg/L，维生素C 20～24μmol/L，胰岛素 2.3～2.7mg/L，叶酸 0.18～0.22mg/L，甘氨酸 1.8～2.2mg/L，脯氨酸 0.3～0.4mg/L，丝氨酸 0.55～0.65mg/L，甲基磺酸乙酯0.45～0.55mg/L，蔗糖 18～22g/L，果糖 15～20g/L，椰乳23～27g/L，琼脂 7～8g/L；2，4-D0.5～0.7mg/L，NAA 0.45～0.55mg/L，复酞核酸0.25～0.35mg/L，活性炭 0.25～0.35g/L，烟草提取液 35～45g/L，甘露醇25～35g/L，水解蛋白 0.25～0.35g/L。
所述的烟草小孢子诱导培养基，其特征在于按每升蒸馏水中含有以下物质配制的最佳含量为：KNO3 1000mg/L，NH4NO3 1000mg/L，KH2PO4 300mg/L，Ca(NO3)2∙4H2O 345mg/L，KCl 65mg/L，Na2-EDTA 75mg/L，FeSO4∙7H2O 56mg/L，MnSO4∙4H2O 4.5mg/L，ZnSO4∙7H2O2.2mg/L，H3BO3 2.5mg/L，KI 1.2mg/L，CuSO4∙5H2O 0.025mg/L，CoCl∙6H2O 0.025mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.25mg/L，AgNO3 19mg/L，肌醇 100mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B60.1mg/L，烟酸 0.5mg/L，维生素C 22μmol/L，胰岛素 2.5mg/L，叶酸 0.2mg/L，甘氨酸2.0mg/L，脯氨酸 0.35mg/L，丝氨酸 0.6mg/L，甲基磺酸乙酯 0.5mg/L，蔗糖 20g/L，果糖17.5g/L，椰乳25g/L，琼脂 7.5g/L；2，4-D 0.6mg/L，NAA 0.5mg/L，复酞核酸0.3mg/L，活性炭 0.3g/L，烟草提取液 40g/L，甘露醇30g/L，水解蛋白 0.3g/L。
所述的培养基配方的配制pH值为：5.4～5.8，最佳配制pH值为5.6。
一种烟草小孢子培养方法，其特征在于按如下步骤操作：
（1）花药取材与低温预处理
在大田常规栽培的烟草正常开花季节，上午9点～11点采集生长正常的花药处于单核后期或二核早期的烟草植株的花蕾，将采集的花蕾分别装入自封袋中，置于4℃冰箱低温预处理2d；
（2）培养基的灭菌
将权利要求1、2和3所述的培养基配制好后分装于200ml的三角瓶中，每瓶盛40ml～60ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固；
（3）消毒与花粉提取
取出低温预冷处理后的花蕾，剥出花药装入干净的烧杯，然后用75%的酒精灭菌30s，0.1%升汞+2滴吐温-80消毒8min，无菌水冲洗4～6次后碾碎花蕾，无菌环境下过滤除去花药组织碎片，然后将滤液分装于已灭菌的离心管，盖上离心管盖，封口膜密封，转入离心机内离心，使得花粉沉淀下来；
（4）花粉接种与变温诱导
将离心管转入无菌环境下，倒掉上清，将花粉沉淀取出，接种于权利要求1、2和3所述的诱导培养基上，然后将接种花粉后的培养基置于温度23～25℃的环境下暗培养1.5～2.5d，然后转入37～39℃高温、黑暗条件下热激处理2～3d，然后转入温度为26～28℃、湿度为75%～80%黑暗条件下诱导培养，诱导出花粉愈伤；
（5）愈伤分化与继代培养
待花粉愈伤长至直径2cm后，转接入分化培养基上进行分化培养，愈伤逐渐分化出绿苗，将苗长高于5cm的绿苗带根切下，转接入继代培养基上继代壮苗；
（6）炼苗与移栽
待试管苗长到3～5叶龄时，将三角瓶封口膜打开炼苗，7～10d后将试管苗从三角瓶中取出，将根部清洗干净，移栽入温室内，遮荫处理一周后常规大田栽培。
所述步骤（1）中采集花蕾大小合适的花蕾方法为：采集生长正常的花冠与花萼等长或花冠略长于花萼的花蕾。
所述步骤（3）中过滤除去组织碎片的方法为：用灭菌过的孔径为60-80目的网筛勺过滤，弃滤渣；所述获得花粉沉淀的离心参数设置为：离心机转速为10000～11000转/分，离心时间为20分钟。
所述步骤（5）中分化培养的培养条件为：温度25～27℃、湿度为70%～80%、光照强度2000～2500lux、光周期12h光/12h暗；所述继代培养的培养条件为：温度27～29℃、湿度为75%～80%、光照强度2500～3000lux、光周期12h光/12h暗。
所述步骤（5）中继代培养基的配方为：KNO3 100mg/L，NH4NO3 85mg/L，CaCl2∙2H2O8.8mg/L，MgSO4∙7H2O 7.5mg/L，KH2PO4 3.5mg/L，MnSO4∙4H2O 0.5mg/L，H3BO3 0.2mg/L，FeSO4∙7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA 37.3mg/L，蔗糖 10g/L，琼脂 6.5g/L，多效唑 1.5mg/L，pH值5.6。
本发明所述的烟草小孢子诱导培养基及烟草小孢子培养方法特异性针对烟草小孢子培养的要求，诱导效率高，培养效果好，大大加快了烟草小孢子培养育种进程。
具体实施方式
下面结合实施案例对本发明作进一步说明，而非限制本发明。
实施例1
（1）花药取材与低温预处理
在大田常规栽培的烟草正常开花季节，上午9点～11点采集生长正常的、花冠与花萼等长或花冠略长于花萼的花蕾，此时花蕾中花药处于单核后期或二核早期，将采集的花蕾分别装入自封袋中，置于4℃冰箱低温预处理2d；
（2）培养基的灭菌
按照最佳配方：KNO3 1000mg/L，NH4NO3 1000mg/L，KH2PO4 300mg/L，Ca(NO3)2∙4H2O345mg/L，KCl 65mg/L，Na2-EDTA 75mg/L，FeSO4∙7H2O 56mg/L，MnSO4∙4H2O 4.5mg/L，ZnSO4∙7H2O 2.2mg/L，H3BO3 2.5mg/L，KI 1.2mg/L，CuSO4∙5H2O 0.025mg/L，CoCl∙6H2O 0.025mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.25mg/L，AgNO3 19mg/L，肌醇 100mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B60.1mg/L，烟酸 0.5mg/L，维生素C 22μmol/L，胰岛素 2.5mg/L，叶酸 0.2mg/L，甘氨酸2.0mg/L，脯氨酸 0.35mg/L，丝氨酸 0.6mg/L，甲基磺酸乙酯 0.5mg/L，蔗糖 20g/L，果糖17.5g/L，椰乳25g/L，琼脂 7.5g/L；2，4-D 0.6mg/L，NAA 0.5mg/L，复酞核酸0.3mg/L，活性炭 0.3g/L，烟草提取液 40g/L，甘露醇30g/L，水解蛋白 0.3g/L配制烟草小孢子诱导培养基，pH值控制为5.6。将培养基配制好后分装于200ml的三角瓶中，每瓶盛40ml～60ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固；
（3）消毒与花粉提取
取出低温预冷处理后的花蕾，剥出花药装入干净的烧杯，然后用75%的酒精灭菌30s，0.1%升汞+2滴吐温-80消毒8min，无菌水冲洗4～6次后碾碎花蕾，无菌环境下用灭菌过的孔径为60-80目的网筛勺过滤，弃滤渣，除去花药组织碎片，然后将滤液分装于已灭菌的离心管，盖上离心管盖，封口膜密封，转入离心机内离心，离心参数设置为：离心机转速为10000～11000转/分，离心时间为20分钟，使得花粉沉淀下来；
（4）花粉接种与变温诱导
将离心管转入无菌环境下，倒掉上清，将花粉沉淀取出，接种于烟草小孢子诱导培养基上，然后将接种花粉后的培养基置于温度23～25℃的环境下暗培养1.5～2.5d，然后转入37～39℃高温、黑暗条件下热激处理2～3d，然后转入温度为26～28℃、湿度为75%～80%黑暗条件下诱导培养，诱导出花粉愈伤；
（5）愈伤分化与继代培养
待花粉愈伤长至直径2cm后，转接入分化培养基上进行分化培养，分化培养的培养条件控制为：温度25～27℃、湿度为70%～80%、光照强度2000～2500lux、光周期12h光/12h暗，愈伤逐渐分化出绿苗，将苗长高于5cm的绿苗带根切下，转接入继代培养基上继代壮苗，继代培养基的配方为：KNO3 100mg/L，NH4NO3 85mg/L，CaCl2∙2H2O 8.8mg/L，MgSO4∙7H2O 7.5mg/L，KH2PO4 3.5mg/L，MnSO4∙4H2O 0.5mg/L，H3BO3 0.2mg/L，FeSO4∙7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA37.3mg/L，蔗糖 10g/L，琼脂 6.5g/L，多效唑 1.5mg/L，pH值5.6，继代培养的培养条件控制为：温度27～29℃、湿度为75%～80%、光照强度2500～3000lux、光周期12h光/12h暗；
（6）炼苗与移栽
待试管苗长到3～5叶龄时，将三角瓶封口膜打开炼苗，7～10d后将试管苗从三角瓶中取出，将根部清洗干净，移栽入温室内，遮荫处理一周后常规大田栽培。
选择烟草品种云烟100和龙911作为小孢子培养的供体材料，2015年取大田生长的该两个烟草品种单核晚期的小孢子进行培养，采用本发明提供的烟草小孢子诱导培养基及烟草小孢子培养方法进行培养，小孢子愈伤组织产生后，统计小孢子愈伤诱导率；而后继续分化培养，待愈伤分化出的绿苗高2cm以上后，统计绿苗分化率和白化苗率。绿苗分化率（%）=分化绿苗数/转移的愈伤块数×100%；白化苗率（%）=白化苗数/转移的愈伤块数×100%，结果如下表。
由上表可以发现，本发明提供的烟草花药分化培养基对烟草品种云烟100和龙911的小孢子愈伤诱导率均值高达32.5%，愈伤绿苗分化率均值高达55.1%，而白化苗率仅23.2%，可以发现本发明的烟草小孢子诱导培养基及烟草小孢子培养方法非常适合烟草小孢子培养的要求，我们的研究结果对于进一步推广和应用烟草单倍体育种具有极大的价值。
本领域技术人员可以根据本发明公开的内容和所掌握的本领域技术对本发明内容作出替换或变型，但是这些替换或变型都不应视为脱离本发明构思的，这些替换或变型均在本发明要求保护的权利范围内。

Claims (8)

1.一种烟草小孢子诱导培养基，其特征在于按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：KNO3900～1100mg/L，NH4NO3 900～1100mg/L，KH2PO4 270～330mg/L，Ca(NO3)2∙4H2O 330～360mg/L，KCl 60～70mg/L，Na2-EDTA 72～78mg/L，FeSO4∙7H2O 54～58mg/L，MnSO4∙4H2O 4.0～5.0mg/L，ZnSO4∙7H2O 2.1～2.3mg/L，H3BO3 2.3～2.7mg/L，KI 1.1～1.3mg/L，CuSO4∙5H2O0.02～0.03mg/L，CoCl∙6H2O 0.02～0.03mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.2～0.3mg/L，AgNO3 18～20mg/L，肌醇 90～110mg/L，维生素B1 0.09～0.11mg/L，维生素B6 0.09～0.11mg/L，烟酸0.45～0.55mg/L，维生素C 20～24μmol/L，胰岛素 2.3～2.7mg/L，叶酸 0.18～0.22mg/L，甘氨酸 1.8～2.2mg/L，脯氨酸 0.3～0.4mg/L，丝氨酸 0.55～0.65mg/L，甲基磺酸乙酯0.45～0.55mg/L，蔗糖 18～22g/L，果糖 15～20g/L，椰乳23～27g/L，琼脂 7～8g/L；2，4-D0.5～0.7mg/L，NAA 0.45～0.55mg/L，复酞核酸0.25～0.35mg/L，活性炭 0.25～0.35g/L，烟草提取液 35～45g/L，甘露醇25～35g/L，水解蛋白 0.25～0.35g/L。
2.根据权利要求 1 所述的烟草小孢子诱导培养基，其特征在于按每升蒸馏水中含有以下物质配制的最佳含量为：KNO3 1000mg/L，NH4NO3 1000mg/L，KH2PO4 300mg/L，Ca(NO3)2∙4H2O 345mg/L，KCl 65mg/L，Na2-EDTA 75mg/L，FeSO4∙7H2O 56mg/L，MnSO4∙4H2O 4.5mg/L，ZnSO4∙7H2O 2.2mg/L，H3BO3 2.5mg/L，KI 1.2mg/L，CuSO4∙5H2O 0.025mg/L，CoCl∙6H2O0.025mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.25mg/L，AgNO3 19mg/L，肌醇 100mg/L，维生素B1 0.1mg/L，维生素B6 0.1mg/L，烟酸 0.5mg/L，维生素C 22μmol/L，胰岛素 2.5mg/L，叶酸 0.2mg/L，甘氨酸2.0mg/L，脯氨酸 0.35mg/L，丝氨酸 0.6mg/L，甲基磺酸乙酯 0.5mg/L，蔗糖 20g/L，果糖17.5g/L，椰乳25g/L，琼脂 7.5g/L；2，4-D 0.6mg/L，NAA 0.5mg/L，复酞核酸0.3mg/L，活性炭 0.3g/L，烟草提取液 40g/L，甘露醇30g/L，水解蛋白 0.3g/L。
3.根据权利要求 1 和2所述的烟草小孢子诱导培养基，其特征在于：所述的培养基配方的配制pH值为：5.4～5.8，最佳配制pH值为5.6。
4.一种烟草小孢子培养方法，其特征在于按如下步骤操作：
（1）花药取材与低温预处理
在大田常规栽培的烟草正常开花季节，上午9点～11点采集生长正常的花药处于单核后期或二核早期的烟草植株的花蕾，将采集的花蕾分别装入自封袋中，置于4℃冰箱低温预处理2d；
（2）培养基的灭菌
将权利要求1、2和3所述的培养基配制好后分装于200ml的三角瓶中，每瓶盛40ml～60ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固；
（3）消毒与花粉提取
取出低温预冷处理后的花蕾，剥出花药装入干净的烧杯，然后用75%的酒精灭菌30s，0.1%升汞+2滴吐温-80消毒8min，无菌水冲洗4～6次后碾碎花蕾，无菌环境下过滤除去花药组织碎片，然后将滤液分装于已灭菌的离心管，盖上离心管盖，封口膜密封，转入离心机内离心，使得花粉沉淀下来；
（4）花粉接种与变温诱导
将离心管转入无菌环境下，倒掉上清，将花粉沉淀取出，接种于权利要求1、2和3所述的诱导培养基上，然后将接种花粉后的培养基置于温度23～25℃的环境下暗培养1.5～2.5d，然后转入37～39℃高温、黑暗条件下热激处理2～3d，然后转入温度为26～28℃、湿度为75%～80%黑暗条件下诱导培养，诱导出花粉愈伤；
（5）愈伤分化与继代培养
待花粉愈伤长至直径2cm后，转接入分化培养基上进行分化培养，愈伤逐渐分化出绿苗，将苗长高于5cm的绿苗带根切下，转接入继代培养基上继代壮苗；
（6）炼苗与移栽
待试管苗长到3～5叶龄时，将三角瓶封口膜打开炼苗，7～10d后将试管苗从三角瓶中取出，将根部清洗干净，移栽入温室内，遮荫处理一周后常规大田栽培。
5.根据权利要求 4所述的烟草小孢子培养方法，其特征在于：所述步骤（1）中采集花蕾大小合适的花蕾方法为：采集生长正常的花冠与花萼等长或花冠略长于花萼的花蕾。
6.根据权利要求 4所述的烟草小孢子培养方法，其特征在于：所述步骤（3）中过滤除去组织碎片的方法为：用灭菌过的孔径为60-80目的网筛勺过滤，弃滤渣；所述获得花粉沉淀的离心参数设置为：离心机转速为10000～11000转/分，离心时间为20分钟。
7.根据权利要求 4所述的烟草小孢子培养方法，其特征在于：所述步骤（5）中分化培养的培养条件为：温度25～27℃、湿度为70%～80%、光照强度2000～2500lux、光周期12h光/12h暗；所述继代培养的培养条件为：温度27～29℃、湿度为75%～80%、光照强度2500～3000lux、光周期12h光/12h暗。
8.根据权利要求 4所述的烟草小孢子培养方法，其特征在于：所述步骤（5）中继代培养基的配方为：KNO3 100mg/L，NH4NO3 85mg/L，CaCl2∙2H2O 8.8mg/L，MgSO4∙7H2O 7.5mg/L，KH2PO4 3.5mg/L，MnSO4∙4H2O 0.5mg/L，H3BO3 0.2mg/L，FeSO4∙7H2O 27.8mg/L，Na2-EDTA37.3mg/L，蔗糖 10g/L，琼脂 6.5g/L，多效唑 1.5mg/L，pH值5.6。
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