CN113973658B - 一种辣椒高效遗传转化及植株再生方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种辣椒高效遗传转化及植株再生方法，包括载体构建、转化农杆菌及扩繁备用、制备Flamingo bill外植体并进行预培养、侵染、愈伤诱导与共培养、新茎尖形成及伸长、新生植株的切割及转移、嫁接与筛选等步骤。本发明采用的Flamingo bill外植体，不受采样季节限制，可以长年进行辣椒组织培养及遗传转化，克服了现有技术的外植体取材时间上的制约，并克服了辣椒的再生周期长的问题，大大缩短了获得转基因辣椒后代的时间；提供了采用新的侵染方式及新生植株切割方式，大大的提高了辣椒的遗传转化率以及成活率，促进芽的伸长和生根，从而获得完整可持续生长的再生植株。

Description

一种辣椒高效遗传转化及植株再生方法

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种辣椒高效遗传转化及植株再生方法。

背景技术

辣椒是一种重要的蔬菜和工业原料作物，遗传转化体系的建立是其基因工程遗传改良和功能基因组学研究的重要基础，而要进行辣椒的遗传转化，建立高效离体再生系统是重要条件之一。目前辣椒的遗传转化体系和离体再生系统还不完善，限制了基因工程在辣椒遗传改良上的有效应用和辣椒功能基因组学研究的进展。目前植物的植株再生主要通过幼苗外植体器官再生、花药培养和原生质体培养三条途径，其中通过原生质体培养来获得再生植株是植物组培苗工厂化生产和遗传转化的重要方法。

对于辣椒的植株再生，一般通过外植体直接分化成苗、脱分化形成愈伤组织并再分化成苗、Flamingo bill成苗三种方式进行。其中，以幼苗子叶、茎尖和胚轴为外植体的植株再生，是目前在建立辣椒离体再生系统中，研究的最多的一个领域，具体为，利用子叶、茎尖、胚轴等作为外植体经脱分化形成愈伤组织，通过农杆菌的介导将目的基因引入辣椒受体，再通过辣椒体细胞发生途径获得再生植株。但是目前这些辣椒植株再生技术还停留在芽诱导阶段，而对于芽的伸长、生根困难的问题长期难以解决，因而辣椒的遗传转化和离体再生难以真正实现并应用，限制了基因工程在辣椒遗传改良上的有效应用和辣椒功能基因组学研究的进展。

在辣椒的离体再生体系中，Flamingo bill外植体是一种将幼苗去掉茎尖和一片子叶的特殊的外植体，由单片子叶、下胚轴、胚根组成，其切口部位为顶端分生组织所在区域，细胞生长速度快，分化能力强，另外Flamingo bill外植体不同于一般外植体，其具有完整植株的特性，在组织培养中其根系能够吸收营养物质供应顶部分生组织的生长和分化，而一般的外植体在培养中只是靠细胞膨大所引起的被动吸收。然而经过反复试验得知，Flamingo bill外植体介导的辣椒植株再生依然存在很多的缺点：（1）同样受芽伸长困难的限制；（2）从flamingo bill外植体上切下的小苗生根困难；（3）Flamingo bill外植体在固体MS培养基中转移容易导致根部死亡；（4）农杆菌介导的遗传转化在筛选的的过程中容易使Flamingo bill的母体植株死亡；（5）根系易出现带菌污染而致死亡。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于， 提供一种能够有效提高遗传转化率，植株萌发速度快，成活率高辣椒高效遗传转化及植株再生方法。

具体技术方案如下：

一种辣椒高效遗传转化及植株再生方法，包括以下步骤：

S1.载体构建；设计目标位点引物，并通过PCR扩增获得目标序列，将获得序列进行连接 及筛选，并通过测序分析，获得最终正确的表达载体。

S2.转化农杆菌及扩繁备用；将表达载体转化LBA4404农杆菌，并扩繁备用。

S3.制备Flamingo bill外植体并进行预培养；将MS固体培养基的PH调节为5.7～6.2后灭 菌，PH值优选为5.8，把辣椒种子培养于MS固体培养基中，25～28℃，1600～2200Lux光照下 培养10～15天后得到辣椒无菌苗，取出辣椒无菌苗置于空培养皿中，在超净工作台中用消 毒的镊子和手术刀切下茎尖及一侧子叶，留下和胚轴及根系相连的另一侧子叶即得 Flamingo bill外植体，采用Flamingo bill外植体，可大大缩短辣椒遗传转化及植株再生 的周期，将制得的Flamingo bill外植体置于液体的MS培养基中，将液体的MS培养基PH调节 为5.7～6.2后灭菌，PH值优选为5.8，在25～28℃、1600～2200 Lux光照下下预培养1～2天。

还包括以下步骤：

S4. 侵染：

S41.将预培养好的Flamingo bill外植体子叶及伤口下侧茎秆上环切1-3道环切口。环切口的设置目的在于形成环形愈伤组织，环形愈伤组织组织活跃度高，便于嫁接后植株快速成活。

S42. 取吸光度OD为0.3的LBA4404农杆菌2ml于平皿中，把8mlMS液体 培养基稀释5倍，并加入0.1mol/L的乙酰丁香酮后与平皿中的LBA4404农杆菌混合，得到侵染液。

S43.将经S41预处理好的Flamingo bill外植体放入侵染液中侵染，侵染时，使Flamingo bill外植体倒置放入侵染液，使侵染液依次没过外植体子叶、伤口部分以及环切口，不接触根系部分（侵染时外植体下胚轴涂上凡士林），侵染20～30min，期间间歇轻摇；

S5.愈伤诱导与共培养：

侵染完成后，将 Flamingo bill外植体稍加晾干水分，并在环切口上涂抹细胞分裂素和生长素混合液后，将 Flamingo bill外植体转至液体共培养基在23℃黑暗条件下共培养3～4天，液体共培养基液面低于环切口，期间每隔1-2天在环切口处涂抹细胞分裂素和生长素混合液1次（受细胞分裂素和生长素混合液以及LBA4404农杆菌，环形切口处的细胞变得非常活跃）；共培养基的PH值为6.0。

S6.新茎尖形成及伸长：

共培养结束后洗菌，然后将Flamingo bill外植体转至MS固体培养基中，MS固体培养基PH为5.7～6.2，且只让Flamingo bill外植体根系接触培养基，不让其他部分如子叶接触培养基，在25～28℃、1600～2200 Lux光照下培养14～20天，新生植株便会从Flamingobill外植体伤口长出并伸长，期间只需要2～3周即可诱导新生苗的形成并伸长，与传统组培方式相比时间大大缩短；，新生植株便会从Flamingo bill外植体伤口长出并逐步伸长，同时环切口处也会相应的被进一步诱导逐渐膨大形成更大的愈伤组织。

S7.新生植株的切割及转移：当Flamingo bill外植体上的新生植株伸长至1.5～2.5cm 时，将新生植株从其基部切割下，切割新生植株时，从环切口愈伤组织处倾斜切割环切口愈伤组织分成两部。

S8. 嫁接与筛选：将新生植株环切口处的愈伤组织部位嫁接到无菌辣椒植株母体上，嫁接成功后，进行嫁接苗筛选后可直接移栽。

进一步地，步骤S41所述环切口数目为2道。

进一步地，步骤S41所述最上端一道环切口距离外植体伤口部分的距离为2-5mm。

进一步地，步骤S41所述最上端一道环切口距离外植体伤口部分的距离为3mm。

进一步地，步骤S5所述共培养基为无菌的液体MS 基本培养基，且Flamingo bill外植体在黑暗条件下共培养3～4天。

本发明通过改进新生植株的切割方式以及采用对切割部位预先活化诱导的大大提高了新生植株成活率，通过在新生植株萌发部位下方的Flamingo bill外植体上进一步设置多道环切口，同时通过采用LBA4404农杆菌浸染、激素诱导以及光诱导的方式，完全活化了环切口处的Flamingo bill外植体组织，使其快速形成愈伤组织；同时，在嫁接时，也从环切口处斜向切下新生植株并进行嫁接，由于环切口处组织活跃度非常高，故嫁接后，其很容易存活，相比于以往的辣椒植株再生而言，有效提高了新生植株存活率。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

（1）本发明采用Flamingo bill外植体，不受采样季节限制，可以长年进行辣椒组织培养及遗传转化，克服了现有技术的外植体取材时间上的制约，并克服了辣椒的再生周期长 的问题，大大缩短了获得转基因辣椒后代的时间；

（2）本发明提供了一种完整有效的遗传转化体系，通过采用新的侵染方式、新生植株切割方式、新的筛选方式和新生植株生根方式，大大提高了辣椒的遗传转化率，促进芽的伸长和生根，从而获得完整可持续生长的再生植株。

附图说明

图1为本发明Flamingo bill外植体的制备示意图；

图2为本发明中带有新茎尖的Flamingo bill外植体示意图；

图3为本发明中带有伸长新茎尖的Flamingo bill外植体示意图；

图4为本发明中带有新生植株的Flamingo bill外植体示意图；

图5为本发明中Flamingo bill外植体与新生植株连接处示意图；

图6为本发明中嫁接苗移栽入土并存活示意图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

实施例一：

一种辣椒高效遗传转化及植株再生的方法，包括以下步骤：

S1.载体构建；设计目标位点引物，并通过PCR扩增获得目标序列，将获得序列进行连接 及筛选，并通过测序分析，获得最终正确的表达载体。

S2.转化农杆菌及扩繁备用；将表达载体转化LBA4404农杆菌，并扩繁备用。

S3.制备Flamingo bill外植体并进行预培养；将MS固体培养基的PH调节为5.8后灭菌，把辣椒种子培养于MS固体培养基中，25～28℃，1600～2200 Lux光照下 培养10～15天后得到辣椒无菌苗，取出辣椒无菌苗置于空培养皿中，在超净工作台中用消 毒的镊子和手术刀切下茎尖及一侧子叶，留下和胚轴及根系相连的另一侧子叶即得 Flamingo bill外植体，采用Flamingo bill外植体，可大大缩短辣椒遗传转化及植株再生 的周期，将制得的Flamingo bill外植体置于液体的MS培养基中，将液体的MS培养基PH调节为5.8，在25～28℃、1600～2200 Lux光照下下预培养1～2天。

S4. 侵染：

S41.将预培养好的Flamingo bill外植体子叶及伤口下侧茎秆上环切2道环切口。最上端一道环切口距离外植体伤口部分的距离为3mm，相邻两环切口间距为1-2mm。环切口的设置目的在于形成环形愈伤组织，环形愈伤组织组织活跃度高，便于嫁接后植株快速成活。

S42. 取吸光度OD为0.3的LBA4404农杆菌2ml于平皿中，把8mlMS液体 培养基稀释5倍，并加入0.1mol/L的乙酰丁香酮后与平皿中的LBA4404农杆菌混合，得到侵染液。

S43.将经S41预处理好的Flamingo bill外植体放入侵染液中侵染，侵染时，使Flamingo bill外植体倒置放入侵染液，使侵染液依次没过外植体子叶、伤口部分以及环切口，不接触根系部分（侵染时外植体下胚轴涂上凡士林），侵染20～30min，期间间歇轻摇；

S5.愈伤诱导与共培养：

侵染完成后，将 Flamingo bill外植体稍加晾干水分，并在环切口上涂抹细胞分裂素和生长素混合液后，将 Flamingo bill外植体转至液体共培养基在23℃黑暗条件下共培养3～4天，所述共培养基为无菌的液体MS 基本培养基。液体共培养基液面低于环切口，期间每隔1-2天在环切口处涂抹细胞分裂素和生长素混合液1次（受细胞分裂素和生长素混合液以及LBA4404农杆菌，环形切口处的细胞变得非常活跃）；共培养基的PH值为6.0。

S6.新茎尖形成及伸长：

共培养结束后洗菌，然后将Flamingo bill外植体转至MS固体培养基中，MS固体培养基PH为6.0，且只让Flamingo bill外植体根系接触培养基，不让其他部分如子叶接触培养基，在25～28℃、1600～2200 Lux光照下培养14～20天，新生植株便会从Flamingo bill外植体伤口长出并伸长，期间只需要2～3周即可诱导新生苗的形成并伸长，与传统组培方式相比时间大大缩短；，新生植株便会从Flamingo bill外植体伤口长出并逐步伸长，同时环切口处也会相应的被进一步诱导逐渐膨大形成更大的愈伤组织。

S7.新生植株的切割及转移：当Flamingo bill外植体上的新生植株伸长至1.5～2.5cm 时，将新生植株从其基部切割下，切割新生植株时，从环切口愈伤组织处倾斜切割环切口愈伤组织分成两部。

S8. 嫁接与筛选：将新生植株环切口处的愈伤组织部位嫁接到无菌辣椒植株母体上，嫁接成功后，进行嫁接苗筛选后可直接移栽。

实施例二：

一种辣椒高效遗传转化及植株再生的方法，包括以下步骤：

S1.载体构建；设计目标位点引物，并通过PCR扩增获得目标序列，将获得序列进行连接 及筛选，并通过测序分析，获得最终正确的表达载体。

S2.转化农杆菌及扩繁备用；将表达载体转化LBA4404农杆菌，并扩繁备用。

S3.制备Flamingo bill外植体并进行预培养；将MS固体培养基的PH调节为6.1后灭 菌，把辣椒种子培养于MS固体培养基中，25～28℃，1600～2200 Lux光照下 培养10～15天后得到辣椒无菌苗，取出辣椒无菌苗置于空培养皿中，在超净工作台中用消 毒的镊子和手术刀切下茎尖及一侧子叶，留下和胚轴及根系相连的另一侧子叶即得 Flamingo bill外植体，采用Flamingo bill外植体，可大大缩短辣椒遗传转化及植株再生 的周期，将制得的Flamingo bill外植体置于液体的MS培养基中，将液体的MS培养基PH调节 为5.8后灭菌，在25～28℃、1600～2200 Lux光照下下预培养1～2天。

S4. 侵染：

S41.将预培养好的Flamingo bill外植体子叶及伤口下侧茎秆上环切3道环切口。最上端一道环切口距离外植体伤口部分的距离为2mm，相邻两环切口间距为1-2mm。环切口的设置目的在于形成环形愈伤组织，环形愈伤组织组织活跃度高，便于嫁接后植株快速成活。

S42. 取吸光度OD为0.3的LBA4404农杆菌2ml于平皿中，把8mlMS液体 培养基稀释5倍，并加入0.1mol/L的乙酰丁香酮后与平皿中的LBA4404农杆菌混合，得到侵染液。

S43.将经S41预处理好的Flamingo bill外植体放入侵染液中侵染，侵染时，使Flamingo bill外植体倒置放入侵染液，使侵染液依次没过外植体子叶、伤口部分以及环切口，不接触根系部分（侵染时外植体下胚轴涂上凡士林），侵染20～30min，期间间歇轻摇；

S5.愈伤诱导与共培养：

侵染完成后，将 Flamingo bill外植体稍加晾干水分，并在环切口上涂抹细胞分裂素和生长素混合液后，将 Flamingo bill外植体转至液体共培养基在23℃黑暗条件下共培养3～4天，所述共培养基为无菌的液体MS 基本培养基。液体共培养基液面低于环切口，期间每隔1-2天在环切口处涂抹细胞分裂素和生长素混合液1次（受细胞分裂素和生长素混合液以及LBA4404农杆菌，环形切口处的细胞变得非常活跃）；共培养基的PH值为6.0。

S6.新茎尖形成及伸长：

共培养结束后洗菌，然后将Flamingo bill外植体转至MS固体培养基中，MS固体培养基PH为6.0，且只让Flamingo bill外植体根系接触培养基，不让其他部分如子叶接触培养基，在25～28℃、1600～2200 Lux光照下培养14～20天，新生植株便会从Flamingo bill外植体伤口长出并伸长，期间只需要2～3周即可诱导新生苗的形成并伸长，与传统组培方式相比时间大大缩短；，新生植株便会从Flamingo bill外植体伤口长出并逐步伸长，同时环切口处也会相应的被进一步诱导逐渐膨大形成更大的愈伤组织。

S7.新生植株的切割及转移：当Flamingo bill外植体上的新生植株伸长至1.5～2.5cm 时，将新生植株从其基部切割下，切割新生植株时，从环切口愈伤组织处倾斜切割环切口愈伤组织分成两部。

S8. 嫁接与筛选：将新生植株环切口处的愈伤组织部位嫁接到无菌辣椒植株母体上，嫁接成功后，进行嫁接苗筛选后可直接移栽。

本发明的保护范围不限于具体实施方式所公开的技术方案，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同替换、改进等，均落入本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种辣椒高效遗传转化及植株再生方法，包括以下步骤：

S1.载体构建；

S2.转化农杆菌及扩繁备用；

S3.制备Flamingo bill外植体并进行预培养；

其特征在于，还包括以下步骤：

S4. 侵染：

S41.将预培养好的Flamingo bill外植体子叶及伤口下侧茎秆上环切2道环切口，最上端一道环切口距离外植体伤口部分的距离为3mm，相邻两环切口间距为1-2mm；

S42.取农杆菌于平皿中，把MS液体培养基进行稀释，并加入乙酰丁香酮后与平皿中的农杆菌混合，得到侵染液；

S43.将经S41预处理好的Flamingo bill外植体放入侵染液中侵染，侵染时，使Flamingo bill外植体倒置放入侵染液，使侵染液依次没过外植体子叶、伤口部分以及环切口，侵染20～30min；

S5.愈伤诱导与共培养

侵染完成后，将 Flamingo bill外植体稍加晾干水分，并在环切口上涂抹细胞分裂素和生长素混合液后，将 Flamingo bill外植体转至液体共培养基共培养3～4天，液体共培养基液面低于环切口，期间每隔1-2天在环切口处涂抹细胞分裂素和生长素混合液1次；

S6.新茎尖形成及伸长：

共培养结束后洗菌，然后将Flamingo bill外植体转至MS固体培养基中，且只让Flamingo bill外植体根系接触培养基，培养14～20天，新生植株便会从Flamingo bill外植体伤口长出并逐步伸长，同时环切口处也会逐渐膨大形成愈伤组织；

S7.新生植株的切割及转移：当Flamingo bill外植体上的新生植株伸长至1.5～2.5cm时，将新生植株从其基部切割下，切割新生植株时，从环切口愈伤组织处倾斜切割环切口愈伤组织分成两部；

S8. 嫁接与筛选：将新生植株环切口处的愈伤组织部位嫁接到无菌辣椒植株母体上，嫁接成功后，进行嫁接苗筛选后可直接移栽。

2.根据权利要求1所述一种辣椒高效遗传转化及植株再生方法，其特征在于：步骤S5所述共培养基为无菌的液体MS 基本培养基，且Flamingo bill外植体在黑暗条件下共培养3～4天。