CN116218902A - 一种辣椒高效遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种辣椒高效遗传转化方法，属于植物基因工程技术领域，本发明通过培养基、培养方法等的改进缩短了辣椒种子萌发时间，调整诱导、分化、伸长各阶段的培养基显著提高了辣椒分化效率，进而提升了转化效率，本发明用花青素基因进行了转化验证，获得了花青素高效表达的转基因植株，表明该方法可以用于辣椒转基因和基因编辑研究中的遗传转化，进一步促进辣椒转基因技术商业化。

Description

一种辣椒高效遗传转化方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种辣椒高效遗传转化方法。
背景技术
辣椒（Capsicumannuum L.）属于茄科（Solanacea）辣椒属二倍体自花授粉一年生的草本植物。原产于中南美洲，是世界上最古老的蔬菜作物之一。国际植物遗传资源委员会将其分为一年生辣椒、浆果状辣椒、分枝辣椒、中国辣椒和绒毛辣椒5个辣椒栽培种。较常规养种而言 ，转基因养种技术有着养种周期短、克服远缘杂交不亲和等优点，无疑为优良性状的导入和加快辣椒品种抗性改良提供了一条新途径，但是辣椒离体再生困难延缓了辣椒转基因技术的发展。
利用基因工程技术是改善辣椒产量和品质的重要措施之一。已有报道中，辣椒主要依靠农杆菌介导和基因枪法等构建遗传转化体系，例如，使用子叶、下胚轴、Flamingo-bill 外植体等作为外植体，试图建立农杆菌介导辣椒遗传转化体系，但是建立的遗传转化体系不稳定，或需要特定的材料才能获得再生体系。虽然前人对辣椒遗传转化成功的案例报道较多，但是辣椒遗传转化，依然存在再生周期长、基因型依赖性强、芽伸长困难、生根难等一系列问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种辣椒高效遗传转化方法，本发明的另一目的是一种辣椒高效遗传转化方法在花青素基因转化中的应用，本发明首次在辣椒中使用根癌农杆菌Gv3101菌株作为工具，采用优化的培养基及培养方法获得转基因植株，转化率达到20％；为后续进行商业化辣椒遗传转化奠定技术基础。
为解决上述技术问题，本发明提供一种辣椒高效遗传转化方法，包括以下步骤：
S1、外植体的获取：取辣椒得种子进行消毒，将消毒过后的种子置于固体MS培养基内培养，取得苗龄为7-10天的幼苗子叶作为外植体；
S2、侵染液的制备，制备含有抗性标记基因与目的基因的载体，农杆菌的质粒载体为双元质粒载体，更优选为pBWA(V)KS质粒载体，并将载体转化根癌农杆菌Gv3101，培养长出明显菌落，挑取阳性单克隆菌落，将含有质粒载体的单菌落接种于包含有抗性标记的LB液体培养基中，进行第一次振荡培养，在第二次进行接种和振荡培养，取菌液离心后保留沉淀物，将沉淀用液体MS培养基重悬浮菌体，得到侵染液；
S3、农杆菌侵染及共培养，将子叶外植体置于侵染液中浸泡，取出子叶外植体，无菌清理表面菌液后得到侵染后的外植体，将侵染后的外植体背面朝下置于共培养培养基中，暗培养2-3天，得到共培养外植体；
S4、抗性株的筛选分化，将共培养外植体移入筛选培养基内，培养2-4周，得到抗性愈伤组织，再将所述愈伤组织转入分化培养基当中，培养2-4周，得到不定芽愈伤组织；
S5、芽株的伸长与生根，将不定芽愈伤组织转入伸长培养基，筛选培养2-4周，得到不定芽，将不定芽转入生根培养基当中，培养2-4周，得到完整转基因植株。
进一步的，所述步骤S1中固体MS培养基配方为含维生素的MS基础培养基4-5g/L，蔗糖20-40g/L，琼脂粉6-10g/L。
进一步的，所述抗性标记基因为NPTⅡ。
进一步的，所述步骤S2中载体转化根癌农杆菌Gv3101于25℃-28℃条件下培养，第一次振荡培养至菌体浓度OD 600值为0.8-1.2，优选为1，第二次振荡培养后OD 600值为0.5-0.8，所述离心条件为温度4℃，离心转速3000rpm，离心时间5min，菌体侵染液的最终浓度为OD600＝0.1-0.3；
所述液体MS培养基的配方为含维生素的MS基础培养基4-5g/L+葡萄糖15-40g/L，所述液体MS培养基的pH为5.8。
进一步的，所述步骤S3子叶于侵染液中浸染3-10分钟，所述共培养培养基为MS基础培养基，所述共培养培养基包含以下浓度的各成分：
蔗糖30g/L、玉米素6mg/L、吲哚乙酸1mg/L、乙酰丁香酮20mg/L、琼脂粉10g/L、所述培养条件为18-25℃。
进一步的，所述步骤S4中筛选培养基为MS基本培养基，所述筛选培养基上还包括以下浓度的各成分：
ZT3-8mg/L、吲哚乙酸0.2-1mg/L、卡那霉素30-100 mg/L、 头孢氨苄0.1-0.3 g/L、蔗糖15-40 g/L、琼脂粉6-10 g/L；
所述筛选培养的时间为2-4周，温度为22-28℃，光照条件为每天16h光照8h黑暗，在筛选培养期间每12-14天更换一次培养基。
进一步的，所述步骤S4中分化培养基为MS基本培养基，所述分化培养基包括以下浓度的各成分：
ZT 3-8mg/L、吲哚乙酸0.1-1mg/L、卡那霉素30-100 mg/L、头孢氨苄0.1-0.3 g/L、蔗糖15-40 g/L、琼脂粉6-10 g/L；
所述分化培养的时间为2-4周，温度为22-28℃，光照条件为每天16h光照8h黑暗，在分化培养期间每12-14天更换一次培养基。
进一步的，所述步骤S5中伸长培养基为MS基本培养基，所述伸长培养基包括以下浓度的各成分：
ZT 3-8mg/L、吲哚乙酸0.1-0.5mg/L、赤霉素0.1-1mg/L、卡那霉素30-100 mg/L、头孢氨苄0.1-0.3 g/L、蔗糖15-40 g/L、琼脂粉6-10 g/L；
所述伸长培养的时间为2-4周，温度为22-28℃，光照条件为每天16h光照8h黑暗，其间每12-14天更换一次培养基。
进一步的，所述步骤S5中生根培养基包括以下浓度的各成分：
MS基本培养基2-4g/L、吲哚丁酸3-8mg/L、吲哚乙酸0.1-1mg/L、头孢氨苄0.1-0.3g/L、蔗糖15-40 g/L、琼脂粉6-10 g/L；
所述生根步骤中，所述筛选培养的时间为2-4周，温度为22-28℃，光照条件为每天16h光照8h黑暗。
进一步的，所述消毒步骤如下：
无菌水冲洗3次，75％酒精浸泡2分钟，无菌水冲洗3次，1％的次氯酸钠浸泡5-15分钟，无菌水冲洗5次。
综上所述，本申请与现有技术相比至少具有以下一种有益技术效果：
1、本发明的方法不仅包括得到转基因植株的步骤，还包括获得了具有花青素表型的转基因植株，形成了完整的转基因体系。
2、本发明可实现转基因辣椒的快速获得，为辣椒基因功能组学的研究和养种奠定基础。
3、本发明通过农杆菌Gv3101将含有目标基因的质粒转入辣椒，具有更强的可操作性。
4、本发明采用花青素基因表达后的紫色表型来验证转基因植物是否为阳性，验证结论可信度高。
5、本发明采用的各个培养基配比合理，所得辣椒转基因再生植株移栽成活率、培养过程中再生植株形成率、转基因植株阳性率均有较大提高。尤其是
培养基中加入了赤霉素、吲哚丁酸，能够进一步促进不定芽伸长及生根。
6、本发明的各个步骤和参数之间协同作用，共同进一步提高了转基因的效率。
7、本发明操作简便易行，成本低廉，适合广泛使用。
附图说明
图1为本发明辣椒转基因研究流程图；
图2为本发明实施例1中抗性筛选得到的辣椒转基因植株；
图3为本发明实施例1中抗性筛选得到的辣椒转基因植株叶片中花青素基因的PCR电泳图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图1-3，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下列所有实施例中，辣椒基因型Z1作为辣椒高效转化体系的试验材料，转化菌株为根癌农杆菌菌株Gv3101，质粒为pBWA(V)KS，均来自武汉伯远生物科技有限公司。
实施例一
本实施例所有的培养基均经过115℃灭菌15min。
具体操作过程及结果如下所述：
1、外植体制备：辣椒Z1种子无菌水冲洗3次，75％酒精浸泡2分钟，无菌水冲洗3次，1％的次氯酸钠浸泡10分钟，无菌水冲洗5次，消毒后的种子播种于固体MS培养基，固体MS培养基配方为含维生素的MS基础培养基4.5g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L，苗龄7-10d的幼苗子叶作为外植体，用于农杆菌介导的遗传转化。
2、农杆菌侵染液制备：将质粒pBWA(V)KS转化根癌农杆菌Gv3101，于28℃条件下培养48h待长出明显的菌落，挑取阳性单克隆菌落，接种在包含终浓度为50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB液体培养基中，并在28℃，200r/min摇床中培养约24h至OD 600值＝1.0，从上述菌液中取1000ul至包含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的50ml LB 液体培养基中，28℃，200r/min摇床中培养约5h至OD 600值＝0.6；
将OD 600值＝0.6的菌液在4℃，3000rpm条件下离心5min，用MS(MS basal mediumwith vitamins(伯远生物)4.4g/L+蔗糖30g/L，pH5.8)重新悬浮菌体。并调整菌悬液的最终浓度为OD 600＝0.2左右得菌体侵染液。
3、农杆菌侵染及共培养：将子叶外植体在菌体侵染液中浸泡5分钟，取出置于灭菌后的滤纸上吸干残留菌液，将子叶背面朝下整齐排布于共培养培养基中，共培养3d；
上述共培养的培养基的组成为：MS 4.4g+ZT 6mg+IAA 1mg+乙酰丁香酮20mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
4、筛选培养：共培养后的子叶放入筛选培养基中，两周后统计花青素在愈伤中的表达情况，表达花青素基因的愈伤越多代表转化效率越高；
上述筛选培养基的组成为：MS 4.4g+ZT 6mg+IAA 1mg+Kana 50mg+Cef0.2g+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
5、芽分化培养：挑选在筛选培养基上有抗性愈伤的外植体，放置于分化培养基。
上述芽分化培养基的组成为：MS 4.4g+ZT 5mg+IAA 0.5mg+Kana 50mg+Cef0.2g+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L；
本步骤中，不定芽分化率(即：本步骤中长出的用于下一步的不定芽的外植体数/共培养的外植体数)为77％。
6、芽伸长培养：挑选在筛选培养基上有幼芽分化的外植体，放置于伸长培养基；
上述芽分化培养基的组成为MS 4.4g+ZT 5mg+GAs 0.2mg+IAA 0.1mg+Kana 50mg+Cef0.2g+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
7、生根培养：将具有两到三个节间的不定芽移到生根选择培养基中3000LUX，25℃培养；
上述生根培养基的组成为：MS 2.2g+IBA 3mg+IAA 0.1mg+Cef 0.2g+蔗糖15g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
8、PCR检测：取生根幼苗的叶片，提取DNA进行PCR检测。
实施例二
本实施例改变了菌体侵染液制备过程中培养温度以及菌液OD 600的目标值，从而取得相关数据；
本实施例所有的培养基均经过115℃灭菌15min。
具体操作过程及结果如下所述：
1、外植体制备：辣椒Z1种子无菌水冲洗3次，75％酒精浸泡2分钟，无菌水冲洗3次，1％的次氯酸钠浸泡10分钟，无菌水冲洗5次，消毒后的种子播种于固体MS培养基，固体MS培养基配方为含维生素的MS基础培养基4.5g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L，苗龄7-10d的幼苗子叶作为外植体，用于农杆菌介导的遗传转化。
2、农杆菌侵染液制备：将质粒pBWA(V)KS转化根癌农杆菌Gv3101，于28℃条件下培养48h待长出明显的菌落，挑取阳性单克隆菌落，接种在包含终浓度为50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB液体培养基中，并在25℃，200r/min摇床中培养约24h至OD 600值＝1.2，从上述菌液中取1000ul至包含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的50ml LB 液体培养基中，25℃，200r/min摇床中培养约5h至OD 600值＝0.8；
将OD 600值＝0.8的菌液在4℃，3000rpm条件下离心5min，用MS(MS basal mediumwith vitamins(伯远生物)4.4g/L+蔗糖30g/L，pH5.8)重新悬浮菌体。并调整菌悬液的最终浓度为OD 600＝0.3左右得菌体侵染液。
3、农杆菌侵染及共培养：将子叶外植体在菌体侵染液中浸泡5分钟，取出置于灭菌后的滤纸上吸干残留菌液，将子叶背面朝下整齐排布于共培养培养基中，共培养3d；
上述共培养的培养基的组成为：MS 4.4g+ZT 6mg+IAA 1mg+乙酰丁香酮20mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
4、筛选培养：共培养后的子叶放入筛选培养基中，两周后统计花青素在愈伤中的表达情况，表达花青素基因的愈伤越多代表转化效率越高；
上述筛选培养基的组成为：MS 4.4g+ZT 6mg+IAA 1mg+Kana 50mg+Cef0.2g+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
5、芽分化培养：挑选在筛选培养基上有抗性愈伤的外植体，放置于分化培养基。
上述芽分化培养基的组成为：MS 4.4g+ZT 5mg+IAA 0.5mg+Kana 50mg+Cef0.2g+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L；
本步骤中，不定芽分化率(即：本步骤中长出的用于下一步的不定芽的外植体数/共培养的外植体数)为82％。
6、芽伸长培养：挑选在筛选培养基上有幼芽分化的外植体，放置于伸长培养基；
上述芽分化培养基的组成为MS 4.4g+ZT 5mg+GAs 0.2mg+IAA 0.1mg+Kana 50mg+Cef0.2g+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
7、生根培养：将具有两到三个节间的不定芽移到生根选择培养基中3000LUX，25℃培养；
上述生根培养基的组成为：MS 2.2g+IBA 3mg+IAA 0.1mg+Cef 0.2g+蔗糖15g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
8、PCR检测：取生根幼苗的叶片，提取DNA进行PCR检测。
实施例三
本实施例改变了筛选培养基的组成，从而取得相关数据；
本实施例所有的培养基均经过115℃灭菌15min。
具体操作过程及结果如下所述：
1、外植体制备：辣椒Z1种子无菌水冲洗3次，75％酒精浸泡2分钟，无菌水冲洗3次，1％的次氯酸钠浸泡10分钟，无菌水冲洗5次，消毒后的种子播种于固体MS培养基，固体MS培养基配方为含维生素的MS基础培养基4.5g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L，苗龄7-10d的幼苗子叶作为外植体，用于农杆菌介导的遗传转化。
2、农杆菌侵染液制备：将质粒pBWA(V)KS转化根癌农杆菌Gv3101，于28℃条件下培养48h待长出明显的菌落，挑取阳性单克隆菌落，接种在包含终浓度为50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB液体培养基中，并在28℃，200r/min摇床中培养约24h至OD 600值＝1.0，从上述菌液中取1000ul至包含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的50ml LB 液体培养基中，28℃，200r/min摇床中培养约5h至OD 600值＝0.6；
将OD 600值＝0.6的菌液在4℃，3000rpm条件下离心5min，用MS(MS basal mediumwith vitamins(伯远生物)4.4g/L+蔗糖30g/L，pH5.8)重新悬浮菌体。并调整菌悬液的最终浓度为OD 600＝0.2左右得菌体侵染液。
3、农杆菌侵染及共培养：将子叶外植体在菌体侵染液中浸泡5分钟，取出置于灭菌后的滤纸上吸干残留菌液，将子叶背面朝下整齐排布于共培养培养基中，共培养3d；
上述共培养的培养基的组成为：MS 4.4g+ZT 6mg+IAA 1mg+乙酰丁香酮20mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
4、筛选培养：共培养后的子叶放入筛选培养基中，两周后统计花青素在愈伤中的表达情况，表达花青素基因的愈伤越多代表转化效率越高；
上述筛选培养基的组成为：MS 4.4g+ZT 3.5mg+IAA 0.5mg+Kana 80mg+Cef0.3g+蔗糖20g+琼脂粉7g，蒸馏水定容至1L。
5、芽分化培养：挑选在筛选培养基上有抗性愈伤的外植体，放置于分化培养基。
上述芽分化培养基的组成为：MS 4.4g+ZT 5mg+IAA 0.5mg+Kana 50mg+Cef0.2g+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L；
本步骤中，不定芽分化率(即：本步骤中长出的用于下一步的不定芽的外植体数/共培养的外植体数)为79％。
6、芽伸长培养：挑选在筛选培养基上有幼芽分化的外植体，放置于伸长培养基；
上述芽分化培养基的组成为MS 4.4g+ZT 5mg+GAs 0.2mg+IAA 0.1mg+Kana 50mg+Cef0.2g+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
7、生根培养：将具有两到三个节间的不定芽移到生根选择培养基中3000LUX，25℃培养；
上述生根培养基的组成为：MS 2.2g+IBA 3mg+IAA 0.1mg+Cef 0.2g+蔗糖15g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
8、PCR检测：取生根幼苗的叶片，提取DNA进行PCR检测。
实施例四
本实施例改变了芽分化培养基的组成，从而取得相关数据；
本实施例所有的培养基均经过115℃灭菌15min。
具体操作过程及结果如下所述：
1、外植体制备：辣椒Z1种子无菌水冲洗3次，75％酒精浸泡2分钟，无菌水冲洗3次，1％的次氯酸钠浸泡10分钟，无菌水冲洗5次，消毒后的种子播种于固体MS培养基，固体MS培养基配方为含维生素的MS基础培养基4.5g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L，苗龄7-10d的幼苗子叶作为外植体，用于农杆菌介导的遗传转化。
2、农杆菌侵染液制备：将质粒pBWA(V)KS转化根癌农杆菌Gv3101，于28℃条件下培养48h待长出明显的菌落，挑取阳性单克隆菌落，接种在包含终浓度为50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB液体培养基中，并在28℃，200r/min摇床中培养约24h至OD 600值＝1.0，从上述菌液中取1000ul至包含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的50ml LB 液体培养基中，28℃，200r/min摇床中培养约5h至OD 600值＝0.6；
将OD 600值＝0.6的菌液在4℃，3000rpm条件下离心5min，用MS(MS basal mediumwith vitamins(伯远生物)4.4g/L+蔗糖30g/L，pH5.8)重新悬浮菌体。并调整菌悬液的最终浓度为OD 600＝0.2左右得菌体侵染液。
3、农杆菌侵染及共培养：将子叶外植体在菌体侵染液中浸泡5分钟，取出置于灭菌后的滤纸上吸干残留菌液，将子叶背面朝下整齐排布于共培养培养基中，共培养3d；
上述共培养的培养基的组成为：MS 4.4g+ZT 6mg+IAA 1mg+乙酰丁香酮20mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
4、筛选培养：共培养后的子叶放入筛选培养基中，两周后统计花青素在愈伤中的表达情况，表达花青素基因的愈伤越多代表转化效率越高；
上述筛选培养基的组成为：MS 4.4g+ZT 6mg+IAA 1mg+Kana 50mg+Cef0.2g+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
5、芽分化培养：挑选在筛选培养基上有抗性愈伤的外植体，放置于分化培养基。
上述芽分化培养基的组成为：MS 4.4g+ZT 7mg+IAA 0.8mg+Kana 90mg+Cef0.3g+蔗糖200g+琼脂粉7g，蒸馏水定容至1L；
本步骤中，不定芽分化率(即：本步骤中长出的用于下一步的不定芽的外植体数/共培养的外植体数)为65％。
6、芽伸长培养：挑选在筛选培养基上有幼芽分化的外植体，放置于伸长培养基；
上述芽分化培养基的组成为MS 4.4g+ZT 5mg+GAs 0.2mg+IAA 0.1mg+Kana 50mg+Cef0.2g+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
7、生根培养：将具有两到三个节间的不定芽移到生根选择培养基中3000LUX，25℃培养；
上述生根培养基的组成为：MS 2.2g+IBA 3mg+IAA 0.1mg+Cef 0.2mg+蔗糖15g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
8、PCR检测：取生根幼苗的叶片，提取DNA进行PCR检测。
实施例五
本实施例改变了芽伸长培养基的组成，从而取得相关数据；
本实施例所有的培养基均经过115℃灭菌15min。
具体操作过程及结果如下所述：
1、外植体制备：辣椒Z1种子无菌水冲洗3次，75％酒精浸泡2分钟，无菌水冲洗3次，1％的次氯酸钠浸泡10分钟，无菌水冲洗5次，消毒后的种子播种于固体MS培养基，固体MS培养基配方为含维生素的MS基础培养基4.5g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L，苗龄7-10d的幼苗子叶作为外植体，用于农杆菌介导的遗传转化。
2、农杆菌侵染液制备：将质粒pBWA(V)KS转化根癌农杆菌Gv3101，于28℃条件下培养48h待长出明显的菌落，挑取阳性单克隆菌落，接种在包含终浓度为50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB液体培养基中，并在28℃，200r/min摇床中培养约24h至OD 600值＝1.0，从上述菌液中取1000ul至包含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的50ml LB 液体培养基中，28℃，200r/min摇床中培养约5h至OD 600值＝0.6；
将OD 600值＝0.6的菌液在4℃，3000rpm条件下离心5min，用MS(MS basal mediumwith vitamins(伯远生物)4.4g/L+蔗糖30g/L，pH5.8)重新悬浮菌体。并调整菌悬液的最终浓度为OD 600＝0.2左右得菌体侵染液。
3、农杆菌侵染及共培养：将子叶外植体在菌体侵染液中浸泡5分钟，取出置于灭菌后的滤纸上吸干残留菌液，将子叶背面朝下整齐排布于共培养培养基中，共培养3d；
上述共培养的培养基的组成为：MS 4.4g+ZT 6mg+IAA 1mg+乙酰丁香酮20mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
4、筛选培养：共培养后的子叶放入筛选培养基中，两周后统计花青素在愈伤中的表达情况，表达花青素基因的愈伤越多代表转化效率越高；
上述筛选培养基的组成为：MS 4.4g+ZT 6mg+IAA 1mg+Kana 50mg+Cef0.2g+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
5、芽分化培养：挑选在筛选培养基上有抗性愈伤的外植体，放置于分化培养基。
上述芽分化培养基的组成为：MS 4.4g+ZT 5mg+IAA 0.5mg+Kana 50mg+Cef0.2g+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L；
本步骤中，不定芽分化率(即：本步骤中长出的用于下一步的不定芽的外植体数/共培养的外植体数)为72％。
6、芽伸长培养：挑选在筛选培养基上有幼芽分化的外植体，放置于伸长培养基；
上述芽伸长培养基的组成为MS 4.4g+ZT 7mg+GAs 0.2mg+IAA 0.1mg+Kanaa 50mg+Cef0.2g+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
7、生根培养：将具有两到三个节间的不定芽移到生根选择培养基中3000LUX，25℃培养；
上述生根培养基的组成为：MS 2.2g+IBA 3mg+IAA 0.1mg+Cef 0.2g+蔗糖15g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
8、PCR检测：取生根幼苗的叶片，提取DNA进行PCR检测。
实施例六
本实施例改变了生根培养基的组成，从而取得相关数据；
本实施例所有的培养基均经过115℃灭菌15min。
具体操作过程及结果如下所述：
1、外植体制备：辣椒Z1种子无菌水冲洗3次，75％酒精浸泡2分钟，无菌水冲洗3次，1％的次氯酸钠浸泡10分钟，无菌水冲洗5次，消毒后的种子播种于固体MS培养基，固体MS培养基配方为含维生素的MS基础培养基4.5g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L，苗龄7-10d的幼苗子叶作为外植体，用于农杆菌介导的遗传转化。
2、农杆菌侵染液制备：将质粒pBWA(V)KS转化根癌农杆菌Gv3101，于28℃条件下培养48h待长出明显的菌落，挑取阳性单克隆菌落，接种在包含终浓度为50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB液体培养基中，并在28℃，200r/min摇床中培养约24h至OD 600值＝1.0，从上述菌液中取1000ul至包含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的50ml LB 液体培养基中，28℃，200r/min摇床中培养约5h至OD 600值＝0.6；
将OD 600值＝0.6的菌液在4℃，3000rpm条件下离心5min，用MS(MS basal mediumwith vitamins(伯远生物)4.4g/L+蔗糖30g/L，pH5.8)重新悬浮菌体。并调整菌悬液的最终浓度为OD 600＝0.2左右得菌体侵染液。
3、农杆菌侵染及共培养：将子叶外植体在菌体侵染液中浸泡5分钟，取出置于灭菌后的滤纸上吸干残留菌液，将子叶背面朝下整齐排布于共培养培养基中，共培养3d；
上述共培养的培养基的组成为：MS 4.4g+ZT 6mg+IAA 1mg+乙酰丁香酮20mg+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
4、筛选培养：共培养后的子叶放入筛选培养基中，两周后统计花青素在愈伤中的表达情况，表达花青素基因的愈伤越多代表转化效率越高；
上述筛选培养基的组成为：MS 4.4g+ZT 6mg+IAA 1mg+Kana 50mg+Cef0.2g+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
5、芽分化培养：挑选在筛选培养基上有抗性愈伤的外植体，放置于分化培养基。
上述芽分化培养基的组成为：MS 4.4g+ZT 5mg+IAA 0.5mg+Kana 50mg+Cef0.2g+蔗糖30g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L；
本步骤中，不定芽分化率(即：本步骤中长出的用于下一步的不定芽的外植体数/共培养的外植体数)为81％。
6、芽伸长培养：挑选在筛选培养基上有幼芽分化的外植体，放置于伸长培养基；
上述芽伸长培养基的组成为MS 4.4g+ZT 7mg+GAs 0.6mg+IAA 0.4mg+Kana 80mg+Cef0.3g+蔗糖20g+琼脂粉7g，蒸馏水定容至1L。
7、生根培养：将具有三个节间的不定芽移到生根选择培养基中3000LUX，25℃培养；
上述生根培养基的组成为：MS 3.2g+IBA 6mg+IAA 0.5mg+Cef 0.3mg+蔗糖15g+琼脂粉8g，蒸馏水定容至1L。
8、PCR检测：取生根幼苗的叶片，提取DNA进行PCR检测。
对比例一
本实施例使用了自留种“59”号Capsicum annuum L.的辣椒，大肠杆菌为DH5α，农杆菌为EHA105，目的片段为CapI，植物表达载体为pCAMBIA138-bar、pFGC5941；
实验试剂：
(1)播种与养苗：每个孔穴播2颗辣椒种子，以45cm宽的保鲜膜覆盖穴盘，并用透明胶布将保鲜膜固定，放入水培箱中2h，充分吸收营养液后用适量基质将种子覆盖；6d后在孔穴中间部位用刀片划开0.8～1.0cm长的口，保证种子及辣椒幼苗透气良好；观察辣椒苗的生长情况，并将未能从划口长出的幼苗用镊子夹出，使其直立生长；
(2)活化农杆菌：无菌操作台上，用接种环蘸取少量转入CapI基因的农杆菌EHA105，在固体培养基上划板，2d后，无菌条件下，蘸取单菌落于1L液体培养基，28℃及黑暗条件下，摇菌3d至OD600＝0.6～1.0，离心后用30g/L的蔗糖溶液重悬浮，备用；
(3)切割与浸染：农杆菌重悬液中加入SilwetL77(2‰～5‰)，6-BA(3～5mg/L)，且1L农杆菌悬浮液中添加200μL溶解40mg乙酰丁香酮的DMSO，混匀后倒入规格为45cm×35cm×3cm的铁盘中，用刀片切除12～15d苗龄辣椒苗的一片子叶及生长点，并将穴盘倒置，使辣椒苗伤口接触农杆菌25～35s，黑暗条件下培养24h；
(4)筛选：用棉签将加入万分之一表面活性剂(SilwetL77)，浓度为50mg/L的草铵膦(PPT)水溶液涂抹于农杆菌侵染过的辣椒叶片上，2d后将枯萎的辣椒苗从根部剪断，此后，用PPT继续涂抹4次，并剪除枯萎的辣椒苗；
(5)PCR检测：剪取长宽均为0.5cm的辣椒叶片，采用碱提法提取DNA，利用Primer软件设计引物，并使用PCR仪扩增目的片段后进行电泳检测；
(6)F1纯合体的获得：所述F1代纯合体获得过程中，遗传转化辣椒自花授粉，单果收种，并以50mg/LPPT溶液催芽，同一果实的种子均正常发芽且幼苗PCR检测结果均为阳性的视为F1代纯合体。
对比例二
一种辣椒高效遗传转化，包括以下步骤：S1.载体构建；设计目标位点引物，并通过PCR扩增获得目标序列，将获
得序列进行连接及筛选，并通过测序分析，获得最终正确的表达载体。
S2.转化农杆菌及扩繁备用；将表达载体转化LBA4404农杆菌，并扩繁备用。
S3.制备Flamingobill外植体并进行预培养；将MS固体培养基的PH调节为5.8后灭菌，把辣椒种子培养于MS固体培养基中，25～28℃，1600～2200Lux光照下培养10～15天后得到辣椒无菌苗，取出辣椒无菌苗置于空培养皿中，在超净工作台中用消毒的镊子和手术刀切下茎尖及一侧子叶，留下和胚轴及根系相连的另一侧子叶即得Flamingobill外植体，采用Flamingobill外植体，可大大缩短辣椒遗传转化及植株再生的周期，将制得的Flamingobill外植体置于液体的MS培养基中，将液体的MS培养基PH调节为5.8，在25～28℃、1600～2200Lux光照下下预培养1～2天。
S4.侵染：S41.将预培养好的Flamingobill外植体子叶及伤口下侧茎秆上环切2道环切口。最上端一道环切口距离外植体伤口部分的距离为3mm，相邻两环切口间距为1-2mm。环切口的设置目的在于形成环形愈伤组织，环形愈伤组织组织活跃度高，便于嫁接后植株快速成活。
S4.2.取吸光度OD为0.3的LBA4404农杆菌2ml于平皿中，把8mlMS液体培养基稀释5倍，并加入0.1mol/L的乙酰丁香酮后与平皿中的LBA4404农杆菌混合，得到侵染液。
S4.3.将经S41预处理好的Flamingobill外植体放入侵染液中侵染，侵染时，使Flamingobill外植体倒置放入侵染液，使侵染液依次没过外植体子叶、伤口部分以及环切口，不接触根系部分（侵染时外植体下胚轴涂上凡士林），侵染20～30min，期间间歇轻摇；S5.愈伤诱导与共培养：侵染完成后，将Flamingobill外植体稍加晾干水分，并在环切口上涂抹细胞分裂素和生长素混合液后，将Flamingobill外植体转至液体共培养基在23℃黑暗条件下共培养3～4天，所述共培养基为无菌的液体MS基本培养基。液体共培养基液面低于环切口，期间每隔1-2天在环切口处涂抹细胞分裂素和生长素混合液1次（受细胞分裂素和生长素混合液以及LBA4404农杆菌，环形切口处的细胞变得非常活跃）；共培养基的PH值为6.0。
S6.新茎尖形成及伸长：共培养结束后洗菌，然后将Flamingobill外植体转至MS固体培养基中，MS固体培养基PH为6.0，且只让Flamingobill外植体根系接触培养基，不让其他部分如子叶接触培养基，在25～28℃、1600～2200Lux光照下培养14～20天，新生植株便会从Flamingobill外植体伤口长出并伸长，期间只需要2～3周即可诱导新生苗的形成并伸长。
总结
表1为本发明不同实施例的对比数据
Figure SMS_1
表2为本发明实施例与对比例之间的对比数据
Figure SMS_2
上述数据表明本发明的方案对于辣椒高效表达有着极高的效率，高于市面上现有的转化方法。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种辣椒高效遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、外植体的获取：取辣椒的种子进行消毒，将消毒过后的种子置于固体MS培养基内培养，取幼苗子叶作为外植体；
S2、侵染液的制备，制备含有抗性标记基因与目的基因的载体，并将载体转化根癌农杆菌，培养长出明显菌落，挑取阳性单克隆菌落，并接种在包含有抗性标记的LB液体培养基中，进行第一次振荡培养，在第二次进行接种和振荡培养，取菌液离心后，将沉淀用液体MS培养基重悬浮菌体，得到侵染液；
S3、农杆菌侵染及共培养，将子叶外植体置于侵染液中浸泡，取出子叶外植体，无菌清理表面菌液后得到侵染后的外植体，将侵染后的外植体背面朝下置于共培养培养基中，暗培养2-3天，得到共培养外植体；
S4、抗性株的筛选分化，将共培养外植体移入筛选培养基内，培养2-4周，得到抗性愈伤组织，再将所述愈伤组织转入分化培养基当中，培养2-4周，得到不定芽愈伤组织；
S5、芽株的伸长与生根，将不定芽愈伤组织转入伸长培养基，筛选培养2-4周，得到不定芽，将不定芽转入生根培养基当中，培养2-4周，得到完整转基因植株。
2.如权利要求1所述的辣椒高效遗传转化方法，其特征在于：所述抗性标记基因为NPTⅡ。
3.如权利要求1所述的辣椒高效遗传转化方法，其特征在于：所述步骤S2中载体转化根癌农杆菌于25℃-28℃条件下培养，第一次振荡培养至菌体浓度OD 600值为0.8-1.2，第二次振荡培养后OD 600值为0.5-0.8，所述离心条件为温度4℃，离心转速3000rpm，离心时间5min，菌体侵染液的最终浓度为OD600＝0.1-0.3。
4.如权利要求1所述的辣椒高效遗传转化方法，其特征在于：所述步骤S3子叶于侵染液中浸染3-10分钟，所述共培养培养基为MS基础培养基，所述共培养培养基包含以下浓度的各成分：
蔗糖30g/L、玉米素6mg/L、吲哚乙酸1mg/L、乙酰丁香酮20mg/L、琼脂粉10g/L、所述培养条件为18-25℃。
5.如权利要求1所述的辣椒高效遗传转化方法，其特征在于：所述步骤S4中筛选培养基为MS基本培养基，所述筛选培养基上还包括以下浓度的各成分：
ZT3-8mg/L、吲哚乙酸0.2-1mg/L、卡那霉素30-100 mg/L、 头孢氨苄0.1-0.3 g/L、蔗糖15-40 g/L、琼脂粉6-10 g/L；
所述筛选培养的时间为2-4周，温度为22-28℃，光照条件为每天16h光照8h黑暗，在筛选培养期间每12-14天更换一次培养基。
6.如权利要求1所述的辣椒高效遗传转化方法，其特征在于：所述步骤S4中分化培养基为MS基本培养基，所述分化培养基包括以下浓度的各成分：
ZT 3-8mg/L、吲哚乙酸0.1-1mg/L、卡那霉素30-100 mg/L、头孢氨苄0.1-0.3 g/L、蔗糖15-40 g/L、琼脂粉6-10 g/L；
所述分化培养的时间为2-4周，温度为22-28℃，光照条件为每天16h光照8h黑暗，在分化培养期间每12-14天更换一次培养基。
7.如权利要求1所述的辣椒高效遗传转化方法，其特征在于：所述步骤S5中伸长培养基为MS基本培养基，所述伸长培养基包括以下浓度的各成分：
ZT 3-8mg/L、吲哚乙酸0.1-0.5mg/L、赤霉素0.1-1mg/L、卡那霉素30-100 mg/L、头孢氨苄0.1-0.3 g/L、蔗糖15-40 g/L、琼脂粉6-10 g/L；
所述伸长培养的时间为2-4周，温度为22-28℃，光照条件为每天16h光照8h黑暗，其间每12-14天更换一次培养基。
8.如权利要求1所述的辣椒高效遗传转化方法，其特征在于：所述步骤S5中生根培养基包括以下浓度的各成分：
MS基本培养基2-4g/L、吲哚丁酸3-8mg/L、吲哚乙酸0.1-1mg/L、头孢氨苄0.1-0.3 g/L、蔗糖15-40 g/L、琼脂粉6-10 g/L；
所述生根步骤中，所述筛选培养的时间为2-4周，温度为22-28℃，光照条件为每天16h光照8h黑暗。
9.如权利要求1所述的辣椒高效遗传转化方法，其特征在于，所述消毒步骤如下：
无菌水冲洗3次，75％酒精浸泡2分钟，无菌水冲洗3次，1％的次氯酸钠浸泡5-15分钟，无菌水冲洗5次。
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