CN112400691B

CN112400691B - 一种适用于作物幼胚培养的培养基及其在快速育种幼胚一步成苗中的应用

Info

Publication number: CN112400691B
Application number: CN202011286687.1A
Authority: CN
Inventors: 白斌; 陈玉梅; 郭莹; 徐银萍; 刘风
Original assignee: Wheat Research Institute Gansu Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Wheat Research Institute Gansu Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-11-17
Filing date: 2020-11-17
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2040-11-17
Also published as: CN112400691A

Abstract

本发明公开了一种适用于作物幼胚培养的培养基及其在快速育种幼胚一步成苗中的应用。本发明培养基由包括如下浓度的营养组分制成：固体MS基本培养基4.634g/L；维生素B₁0.2～0.4mg/L；微生素B₆1.0～1.8mg/L；烟酸1.0～1.7mg/L；甘氨酸4～7mg/L；肌醇200～350mg/L；蔗糖10.0～35.0g/L；过滤后的椰子原汁100～200mL/L；利用氢氧化钾溶液将上述的培养基营养组分体系的pH值调节为5.70～5.85；琼脂粉5.0～7.5g/L；溶剂为超纯水、去离子水或双蒸水。本发明利用一种MS培养基作为基本培养基就可以达到幼胚一步成苗培养，且幼胚成苗率近100％，该技术简单实用、成本低，有利于在快速育种中大量使用。

Description

一种适用于作物幼胚培养的培养基及其在快速育种幼胚一步成苗中的应用

技术领域

本发明涉及一种适用于作物幼胚培养的培养基及其在快速育种幼胚一步成苗中的应用，属于农业类农学领域。

背景技术

作物快速育种技术是利用温室或人造加强照明环境建立全天候小麦生长机制，以加快培育优良作物品种。目前已在小麦、硬粒小麦、大麦、油菜和豌豆等作物育种中得到应用，使春小麦、大麦每年生长6代以上，油菜每年生长4代。与目前与广泛使用的商业育种技术相比，显著增加了育种速度、缩短了育种年限。

幼胚培养是作物快速育种中的关键技术，通过作物籽粒成熟前就在实验室进行幼胚离体培养、成苗后移栽于土壤中进行栽培，缩短作物生长周期，有利于作物全年育繁代数的提高。因此，研发一种简单、高效、价廉的幼胚培养技术是提高作物快速育种效率的重要内容。已报道的小麦幼胚培养技术中，幼胚再生系统中通过“幼胚-愈伤组织-分化成苗”的研究较多，如川麦系、绵农系列春小麦幼胚再生技术研究中利用MSE3培养基(MS大量+MS微量+MS有机+盐酸硫胺素0.04mg/L+L-天冬酰胺150mg/L+2,4-D 2.5mg/L+蔗糖30g/L+8g/L琼脂)进行愈伤组织培养，待诱导出胚性愈伤组织后，再利用分化培养基(MS大量+MS微量+盐酸硫胺素0.04mg/L+L-天冬酰胺150mg/L+IAA 0.25mg/L+6-BA1 mg/L+蔗糖20g/L+8g/L琼脂)诱导出幼苗(伍玲、朱华忠，2007)；将杨麦9号、杨麦158利用MS基本培养基与VB1 0.5mg/L(过滤灭菌)+Asn(天冬素)150mg/L+2,4-D 1.5mg/L+蔗糖20g/L+gelrite 2.5g/L，pH 5.8，分化培养基为MSD0(即上述培养基中去掉2,4-D)，生根培养基(1/2MS大量元素+MS微量元素、铁盐及维生素+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+gelrite2.5 g/L，pH 5.8)。幼胚经愈伤组织培养后再进行分化培养成幼苗的方法多用于转基因研究中，步骤复杂，且成苗率低，而幼胚一步培养成苗技术在快速育种中优势明显。

对冬小麦幼胚一步成苗技术的研究报道中，以济麦20等小麦作为试验品种，利用MB培养基(MS大量元素+B5微量元素+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+0.5g/L水解酪蛋白)、A培养基(MB培养基+0.17mg/L KT+0.5mg/L IBA)、B培养基(MB培养基+0.05mg/L 6-BA+0.13mg/LNAA)进行幼胚培养，成苗率16.2-98.3％(高居荣等，2014)。在小麦一年五代快速繁育技术中，利用PM培养基进行幼胚培养(丁晓义等，2005)。幼胚一步成苗技术提高了成苗率，缩短了胚培养的时间，有利于缩短小麦生育周期，加速了快速育种的进程。

目前已报道的小麦幼胚培养技术较多，但培养基的选择种类不一、如MB、A、B、PM培养基等，且不同培养基的幼胚成苗率差异也大。因此，亟需开发利用一种培养基就可以达到多种作物幼胚一步成苗的培养、且成苗率高的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于作物幼胚培养的培养基及其快速育种幼胚一步成苗中的应用，本发明利用一种MS培养基作为基本培养基就可以达到幼胚一步成苗培养，且幼胚成苗率近100％，该技术简单实用、成本低，有利于在快速育种中大量使用。

本发明提供的一种适用于作物幼胚培养的培养基，它由包括如下浓度的营养组分制成：

固体MS基本培养基4.634g/L；

维生素B₁ 0.2～0.4mg/L；微生素B₆ 1.0～1.8mg/L；烟酸1.0～1.7mg/L；甘氨酸4～7mg/L；肌醇200～350mg/L；

蔗糖10.0～35.0g/L；

过滤后的椰子原汁100～200mL/L；利用氢氧化钾溶液将上述的培养基营养组分体系的pH值调节为5.70～5.85；

琼脂粉5.0～7.5g/L；

溶剂为超纯水、去离子水或双蒸水(ddH₂O)。

本发明中，氢氧化钾溶液的具体浓度可为1.0mol/L。

上述的适用于作物幼胚培养的培养基具体可由包括如下浓度的营养组分制成：

固体MS基本培养基4.634g/L；

MS培养基维生素成分：维生素B₁ 0.2～0.3mg/L、微生素B₆ 1.0～1.5mg/L、烟酸1.0～1.5mg/L、甘氨酸4～6mg/L；肌醇200～300mg/L；

蔗糖10.0～30.0g/L；过滤后的椰子原汁100～150mL/L；利用氢氧化钾溶液将上述的培养基营养组分体系的pH值调节为5.7～5.8；

琼脂粉5.0～7.0g/L；

溶剂为超纯水、去离子水或双蒸水。

上述的适用于作物幼胚培养的培养基具体可由如下浓度的营养组分制成：

固体MS基本培养基4.634g/L；

维生素B₁ 0.3mg/L、微生素B₆ 1.5mg/L、烟酸1.5mg/L、甘氨酸6mg/L；肌醇300mg/L；

蔗糖10.0g/L；

过滤后的椰子原汁120mL/L；氢氧化钾浓度1mol/L调节上述的培养基营养组分体系的pH值调节为5.8；

琼脂粉5.5g/L；溶剂为双蒸水。

上述的适用于作物幼胚培养的培养基中，所述适用于作物幼胚的MS基本培养基具体由如下质量份的组分制成：

1)大量元素：NH₄NO₃ 1650mg/L，KNO₃ 1900mg/L，CaCl₂·2H₂O 440mg/L，MgSO₄·7H₂O 370mg/L，KH₂PO₄ 170mg/L；

2)微量元素：KI 0.83mg/L，H₃BO₃ 6.2mg/L，MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O8.6mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L；

3)铁盐：FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg/L。

本发明还提供了上述适用于作物幼胚培养的培养基的制备方法，包括如下步骤：取过滤除渣后的椰汁原液、MS基本培养基、维生素B₁、微生素B₆、烟酸、甘氨酸和肌醇，蔗糖、加一部分所述溶剂混匀后采用氢氧化钾调节pH，然后加琼脂，加余量所述溶剂定容后混匀，灭菌，即得到所述适用于作物幼胚培养的培养基。

上述的制备方法中，所述过滤除渣后的椰汁原液指的是切开市售普通椰子，用筛网过滤椰汁，过滤除渣制得。

上述的制备方法中，放入高压锅进行所述灭菌；

所述灭菌的温度可为115～120℃，具体可为120℃，时间可为20～30min，具体可为20min或20～25min；

所述方法中，还包括在所述灭菌后将所述适用于作物幼胚的培养基倒入平板中的步骤；每个所述平板能适用于盛放25～35个作物幼胚。

本发明所述的适用于作物幼胚培养的培养基应用于快速育种的幼胚培养成苗中，即在快速育种幼胚一步成苗中的应用。

上述的应用中，所述作物包括冬小麦、春小麦、小黑麦、黑麦和青稞中的至少一种。

本发明进一步提供了一种采用上述的适用于作物幼胚的培养基进行快速育种的幼胚一步成苗的方法，包括如下步骤：

1)对所述作物籽粒进行灭菌，得到灭菌后的籽粒；

2)将所述灭菌后的籽粒的胚取出，将所述胚盾片向下放入所述适用于作物幼胚培养的培养基中；

3)将步骤2)中所述胚进行暗培养；

4)所述暗培养结束后，对所述胚进行光照培养，所述胚的胚芽鞘、根伸长得到幼苗；

5)将所述幼苗转入装有蒸汽灭菌后的混合土壤中，进行栽培管理，使作物幼胚培养成苗。

上述的方法中，所述作物籽粒按照如下选取：所述作物开花后12～20天的穗，取下所述穗中的籽粒，要求籽粒完整无损；具体可为所述作物开花后14天的穗；

所述灭菌的过程如下：所述作物籽粒放入70～75％的酒精中8～10分钟，用无菌纯水冲洗2～4遍，再用0.1％HgCl浸泡4～5分钟，最后用所述无菌纯水冲洗2～3遍。

上述的方法中，所述暗培养的条件如下：避光，温度可为18～22℃，具体可为20℃、18～20℃、20～22℃或19～21℃，时间可为60～84h，具体可为72h、60～72h、72～84h或65～80h；

所述光照培养的条件如下：白天：22～25℃，14～16h；夜晚：18～22℃，8～10h；具体可为白天：25℃，16h；夜晚：22℃，8h；

所述胚的胚芽鞘、根分别伸长至1.5～2.5cm。

上述的方法中，所述混合土壤为质量比3:2的腐殖质土和大田土壤混合而成；

所述栽培管理的条件如下：a)白天培养条件：温度为22～25℃，相对湿度60～70％，白天14～16h；具体可为温度25℃，相对湿度65％，白天16h；

b)晚间培养条件：温度为20～22℃，相对湿度80～85％，8～10h；温度为22℃，相对湿度85％，8h；

c)所述幼苗生长时给予水分胁迫，苗期只有当植株叶片出现枯萎时再浇水，有利于缩短作物的生育周期；

当所述作物为冬小麦时，在所述栽培管理之前包括光照低温春化处理25～30天的步骤；所述光照低温春化处理具体条件如下：3～5℃，白天12～14h，光照12000～14000lx，夜晚10～12h；更具体可为4～5℃，白天14h，光照12000lx，夜晚10h。

本发明具有以下优点：

本发明仅利用一种MS培养基作为基本培养基就可以达到作物幼胚一步成苗培养，且幼胚成苗率近100％，该技术简单实用、成本低，有利于在快速育种中大量使用。

附图说明

图1为小麦幼胚离体培养开始。

图2为小黑麦幼胚培养开始。

图3为青稞幼胚培养开始。

图4为小麦幼胚暗培养72h后。

图5为小黑麦幼胚暗培养72h后。

图6为青稞幼胚暗培养72h后。

图7为小麦幼胚光照培养48h后。

图8为小黑麦幼胚光照培养48h后。

图9为青稞幼胚光照培养48h后。

图10为小麦幼胚苗移栽进入土壤中的生长情况。

图11为青稞幼胚苗移栽入土壤中的生长情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，青稞品种来源：“青稞大麦新品种引种试验及示范研究初报”，李鹏程等，《农业与技术》，2020，Vol.40，No.17；

小黑麦品种来源：“引进CIMMYT优异麦类种质在甘肃中西部区域的适应性鉴定”，杨芳萍等，《草原与草坪2018年》，第38卷，第4期。

实施例

1.材料

试验品种：小麦品种：冬小麦兰天132、兰天575、春小麦陇春30号；青稞品种：藏青18、藏青19；小黑麦品种：XHM T-128。

胚培养基配方：

固体MS基本培养基(青岛海博生物技术有限公司)、维生素B₁(Thiamin-HCl，C₁₂H₁₇CIN₄OS·HCl)、微生素B₆(Pyridoxine-HCl，C₈H₁₁NO₃·HCl)、烟酸(Nicotinic-Acid，上海沪试)、甘氨酸(Glycine，上海沪试)、肌醇(Myo-inositol，上海沪试)、蔗糖(C₁₂H₂₂O₁₁，上海沪试)、氢氧化钾(KOH)、琼脂(Agar，德国BIOFROXX公司)。

过滤后的普通椰子原汁(100％，水果超市购买)。

杀菌剂：

70％酒精、0.1％HgCl。

2.方法与步骤

(1)培养基制备

取120mL过滤除渣后的普通椰汁原液、MS基本培养基4.634g(含大量元素：NH₄NO₃1650mg，KNO₃ 1900mg，CaCl₂·2H₂O 440mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，KH₂PO₄170mg，微量元素：KI 0.83mg，H₃BO₃6.2mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，CoCl₂·6H₂O 0.025，铁盐：FeSO₄·7H₂O 27.8mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg)、蔗糖10.0g、维生素B₁ 0.3mg、维生素B₆ 1.5mg、烟酸1.5mg、甘氨酸6.0mg、肌醇300mg，加ddH₂O(双蒸水)混匀后利用1M浓度的氢氧化钾(KOH)调PH为5.8，然后加琼脂粉5.5g，定容至1L后混匀，放入高压锅灭菌20min(120℃)。灭菌后在超净工作台倒入平板约30个，每个平板可放25～35个幼胚。

(2)幼胚培养

A：取小麦品种、小黑麦、黑麦、青稞开花后14天左右的穗(籽粒呈乳白状)。

B：在超净工作台取下麦穗中的籽粒，要求籽粒完整无损，放入70％的酒精中10分钟，用无菌纯水冲洗2-3遍，再用0.1％HgCl浸泡5分钟，最后用无菌纯水冲洗2-3遍，待剥胚用。

C：将灭菌后的籽粒用镊子轻轻将胚取出，放入已准备好的培养基平板中，胚盾片向下紧贴培养基(小麦、小黑麦和青稞幼胚培养开始的结果如图1、图2、图3所示)。

D：将放入幼胚的平板用遮光纸包裹，在光照培养箱中20℃条件下进行暗培养72小时左右(暗培养至胚开始萌动)，小麦、小黑麦幼胚在暗培养72h后部分幼胚的胚芽、胚根已经开始伸长(分别如图4、图5所示)，但青稞幼胚的胚芽和胚根在72h时才开始萌动(如图6所示)。

E：暗培养结束后，开始光照培养(白天：25℃，16小时，夜晚：22℃，8小时)，待胚芽鞘、根分别伸长至2.0-2.5cm时，进入下一阶段培养。小麦、小黑麦和青稞幼胚光照培养48h后的结果分别如图7-9所示。

F：将幼苗转入装有蒸汽灭菌混合土壤(70％腐殖质土和30％的大田土壤，体积比)的40孔塑料方盘中，每个格子体积约60cm³，每格种植1棵幼苗。培养温度白天25℃，晚间22℃，相对湿度白天65％、晚间85％，白天16h，夜晚8小时的栽培管理，其中植株生长时给予水分胁迫，苗期只有当植株出现枯萎时再浇水。

注：对于冬小麦(冬性)还需要在幼苗转入土壤后进行光照低温春化处理25-30天(4-5℃，白天14小时，光照12000lx，夜晚10小时)，之后再进入正常栽培管理。小麦、小黑麦、黑麦、青稞幼胚苗移栽入土壤中，成活率100％(如图10、11所示)。

由上述实验结果可知，本发明MS培养基作为基本培养基能达到幼胚一步成苗培养，且幼胚成苗率近100％。

Claims

1.一种采用适用于作物幼胚培养的培养基进行快速育种的幼胚一步成苗的方法，包括如下步骤：1）对作物籽粒进行灭菌，得到灭菌后的籽粒；

2）将所述灭菌后的籽粒的胚取出，将胚盾片向下放入适用于作物幼胚培养的培养基中；

所述适用于作物幼胚培养的培养基由包括如下浓度的营养组分制成：

固体MS基本培养基4.634 g/L；

维生素 B₁ 0.2~0.4 mg/L；微生素B₆ 1.0~1.8 mg/L；烟酸 1.0~1.7 mg/L；甘氨酸 4~7mg/L；肌醇 200~350 mg/L；

蔗糖 10.0~35.0 g/L；

过滤后的椰子原汁100~200 mL/L；利用氢氧化钾溶液将培养基的营养组分体系的pH值调节为5.70~5.85；

琼脂粉5.0~7.5 g/L；

溶剂为超纯水、去离子水、或者双蒸水；

MS基本培养基由如下质量份的组分制成：

a、大量元素：NH₄NO₃1650 mg/L，KNO₃1900 mg/L，CaCl₂·2H₂O 440 mg/L，MgSO₄·7H₂O370 mg/L，KH₂PO₄170 mg/L；

b、微量元素：KI 0.83 mg/L，H₃BO₃6.2 mg/L，MnSO₄·4H₂O 22.3 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L，CoCl₂·6H₂O 0. 025 mg/L；

c、铁盐：FeSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3 mg/L；

作物籽粒按照如下选取：作物开花后12~20天的穗，取下所述穗中的籽粒，要求籽粒完整无损；

3）将步骤2）中所述胚进行暗培养；

所述暗培养的条件如下：避光，温度为18~22℃，时间为60~84h；

4）所述暗培养结束后，对所述胚进行光照培养，所述胚的胚芽鞘、根伸长得到幼苗；

所述光照培养的条件如下：白天：22~25℃，14~16 h；夜晚：18~22℃，8~10 h；

5）将所述幼苗转入装有蒸汽灭菌的混合土壤中，进行栽培管理，使作物幼胚培养成苗；

所述作物为冬小麦、春小麦、小黑麦、黑麦和青稞中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述灭菌的过程如下：所述作物籽粒放入70~75%的酒精中8~10分钟，用无菌纯水冲洗2~4遍，再用0.1% HgCl₂浸泡4~5分钟，最后用所述无菌纯水冲洗2~3遍。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述胚的胚芽鞘、根分别伸长至1.5~2.5 cm。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述混合土壤为质量比3:2的腐殖质土和大田土壤混合而成；

所述栽培管理的条件如下：a）白天培养条件：温度为22~25℃，相对湿度60~70%，白天14~16h；

b）晚间培养条件：温度为20~22℃，相对湿度80~85%，8~10 h；

c）所述幼苗生长时给予水分胁迫，苗期只有当植株叶片出现枯萎时再浇水；

当所述作物为冬小麦时，在所述栽培管理之前包括光照低温春化处理25~30天的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述光照低温春化处理条件如下：3~5℃，白天12~14 h，光照12000~14000 lx，夜晚10~12 h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述适用于作物幼胚培养的培养基由包括如下浓度的营养组分制成：

固体MS基本培养基4.634 g/L；

MS培养基维生素成分：维生素B₁ 0.2~0.3 mg/L、微生素B₆ 1.0~1.5 mg/L、烟酸 1.0~1.5 mg/L、甘氨酸 4~6 mg/L；肌醇 200~300 mg/L；

蔗糖10.0~30.0 g/L；过滤后的椰子原汁100~150 mL/L；利用氢氧化钾溶液将上述的培养基营养组分体系的pH值调节为5.7~5.8；

琼脂粉5.0~7.0 g/L；

溶剂为超纯水、去离子水或双蒸水；或，所述适用于作物幼胚培养的培养基具体由如下浓度的营养组分制成：

固体MS基本培养基4.634 g/L；

维生素B₁ 0.3 mg/L、微生素B₆ 1.5 mg/L、烟酸 1.5 mg/L、甘氨酸 6 mg/L；肌醇 300mg/L；

蔗糖10.0 g/L；

过滤后的椰子原汁120 mL/L；氢氧化钾浓度1 mol/L调节上述的培养基营养组分体系的pH值调节为5.8；

琼脂粉5.5g/L；溶剂为双蒸水。

7.权利要求1所述的方法，其特征在于：所述适用于作物幼胚培养的培养基的制备方法包括如下步骤：取过滤除渣后的椰汁原液、MS基本培养基、蔗糖、琼脂、维生素B₁、微生素B₆、烟酸、甘氨酸和肌醇，加一部分所述溶剂混匀后采用氢氧化钾调节pH，然后加琼脂，加余量所述溶剂定容后混匀，灭菌，即得到所述适用于作物幼胚培养的培养基。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：放入高压锅进行所述灭菌；

所述灭菌的温度为115~120℃，时间为20~30 min；

所述方法中，还包括在所述灭菌后将所述适用于作物幼胚的培养基倒入平板中的步骤；每个所述平板能适用于盛放25~35个作物幼胚。