CN104642109B

CN104642109B - 一种以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁的方法

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Publication number: CN104642109B
Application number: CN201510056990.5A
Authority: CN
Inventors: 王振英; 任春雪; 王珍; 范宝莉; 刘晓颖; 彭永康; 陈宏�
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin Normal University
Priority date: 2015-02-04
Filing date: 2015-02-04
Publication date: 2016-11-02
Anticipated expiration: 2035-02-04
Also published as: CN104642109A

Abstract

本发明公开了一种以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁的方法。它是以大蒜鳞茎片为外植体，以MS+1.5mg/L 2,4‑D+0.5 mg/L KT为愈伤组织诱导和继代培养基、以MS+5mg/L 6‑BA+1.0mg/L NAA为诱导不定芽分化培养基、增加以MS+1.0 mg/L KT+1.0mg/L GA+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6‑BA为壮芽培养基的壮芽培养过程、以基础MS培养基为生根培养基的试管苗培养体系；试管苗经过室内和田间拱棚中两次练苗，冬前移栽到土壤中，翌年在第一代收获分瓣率高达94%再生地下鳞茎。该技术体系为优良品种大蒜种质扩繁提供了重要的保障。

Description

一种以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁的方法

本专利得到天津市农委重点项目（201302030）和天津师范大学应用开发研究基金资助。

技术领域

本发明属于蔬菜种植技术领域，涉及一种以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁的方法。

背景技术

大蒜作为无性繁殖作物，生产上多以大蒜瓣为种子进行种植，生产成本高、繁殖系数低、病毒积累、种性退化等问题严重影响大蒜生产（徐培文，2006）。寻找大蒜快繁、脱毒以及种质遗传改良技术迫在眉睫。前人工作中构建了多种大蒜快繁脱毒技术体系，如用大蒜幼叶、全展叶根尖、茎尖、花序轴等为外植体构建大蒜组织培养体系；张昌伟等（2004）通过大蒜根尖诱导不定芽得到试管苗并成功的得到了试管鳞茎；Luciani 等（2006）以大蒜茎尖为外植体诱导出再生能力较强的愈伤组织；张素芝等（2006）利用大蒜茎盘进行愈伤组织的诱导，并获得了适宜于愈伤组织增殖分化的培养基。众多研究多以获得高效试管苗为主要目标，但对由这些再生植株从苗期到大蒜成熟期的完整培养体系报道较少，尤其未见在第一代获得高分辨率大蒜的报道。实践证明，大蒜从组培苗到获得地下鳞茎需要时间较长，栽培条件要求高，更大的问题是，一般第一代组培苗，种植一个季节多收获独头蒜（Ljiljana等，2014），在某种程度上影响着大蒜的进一步扩繁。本发明通过优化愈伤组织诱导、再分化的培养条件，增加壮芽培养过程、组培苗越冬前移栽以及改善栽培过程管理等措施，成功构建了能够在第一代收获分瓣率高达94%大蒜鳞茎的技术体系，为大蒜的生产和遗传改良提供重要的技术资料。

发明内容

本发明的目的是为了获得一种大蒜快繁技术体系，解决用蒜瓣种蒜成本高、由试管苗繁殖成活率低的问题，本发明通过对愈伤组织诱导的不定芽进行壮芽培养、调整试管苗移栽方式等，构建一个在第一代收获高分瓣率大蒜新的、完整的技术体系。

为实现红色那个数目的，本发明公开了一种以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）外植体的获得：

选取生长健壮、无病虫害、自然结束休眠后的大蒜蒜头，剥去外面鳞叶，用自来水冲洗20min，用 0.1%(w/w)升汞浸泡10min，无菌水冲洗3次，再在75%(w/w)酒精中浸泡5min，杀灭表面细菌，无菌水冲洗3次，再用滤纸吸干备用；

（2）大蒜愈伤组织诱导：

在超净台上将大蒜鳞茎切2mm厚薄片，接种到愈伤组织诱导培养基中，置人工气候箱中培养：日温 25℃，夜温 20℃，光照强度为1500 Lux，光照时间 14 h/d，6-14天后在外植体上形成微小的愈伤组织颗粒，接种25-30天后外植体上已经形成大量的愈伤组织颗粒；

（3）愈伤组织继代及不定芽分化：

将生长旺盛的愈伤组织切下，接种到新鲜的继代培养基中进行继代培养，25天之后愈伤组织增殖明显，在同样培养基上再继代一次，挑选生长状况良好的愈伤组织颗粒转移到不定芽分化的培养基上进行分化培养，经过10-12天的分化培养，逐渐分化出生长健壮、颜色浓绿的不定芽；其中

所述的愈伤组织诱导培养基、继代培养基指的是：MS+1.5mg/L 2,4-D+0.5 mg/LKT；

所述的不定芽分化的培养基指的是：MS+5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA；

（4）壮芽培养：

将分化培养基中诱导出来的愈伤组织和嫩芽一起转移到壮芽培养基或生根培养基中进行30-32d壮芽培养；所述的壮芽培养基指的是：MS+1.0 mg/L KT+1.0mg/L GA+0.2mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA；

（5）生根培养：

将健壮、浓绿的不定芽转移到生根培养基中诱导生根，约4周后不定芽长出数条实生根，形成完整的试管苗；

所述的生根培养指的是不加激素的MS基础培养基；

（6）试管苗经过室内和田间拱棚中两次练苗，冬前移栽到土壤中，翌年在第一代收获再生地下鳞茎.把愈伤组织诱导的苗种植到大田土壤中，地上部分长苗，地下部分膨大形成蒜头——即地下鳞茎，由于愈伤组织苗为再生苗，所以由再生苗长成的蒜头即为地下再生鳞茎。

所述的两次练苗指的是：第一次练苗将培养瓶的盖子打开，在培养室中练苗培养一周；第二次练苗指的是将经过第一次练苗后的试管苗从培养瓶中取出，洗去根部培养基，剪掉枯黄的叶子，移栽至装有灭菌的珍珠岩、蛭石和泥炭土（1:3:6）的培养钵中，在10月初放置田间小拱棚中，晴好天气揭开小拱棚的薄膜通风，约30 d后，试管苗再次长出新根数条，这时第二次练苗结束，可以进行大田移栽；越冬前移栽到土壤中指的是：10月底，日平均气温10℃以上的时候，把经过两次练苗的试管苗移栽到大田中，这里的土壤没有其它别要求，只要是一般的土壤就行。

本发明更进一步公开了以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁方法在提高试管苗诱导率方面的应用。实验结果显示：本发明的方法为组培苗生根打下基础，提高了试管苗的诱导率。

本发明更加详细的描述如下：

一、试管苗的诱导培养体系

1、外植体的获得

供试材料为天津宝坻六瓣红大蒜（Allium sativum L.）：选取生长健壮、无病虫害、自然结束休眠后的大蒜蒜头，剥去外面鳞叶，选取个大、饱满、无病斑的大蒜蒜瓣，用自来水冲洗20min，用滤纸吸干大蒜瓣表面的水分，用 0.1%升汞浸泡10min，无菌水冲洗3次，用滤纸将大蒜表面的水分擦干，再在75%酒精中浸泡5min，杀灭表面细菌，无菌水冲洗3次，再用滤纸吸干备用。

、大蒜愈伤组织诱导

在超净台上将大蒜鳞茎切2mm厚薄片，接种到愈伤组织诱导培养基（MS+1.5mg/L2,4-D+0.5 mg/L KT）中，置人工气候箱中培养：日温 25℃，夜温 20℃，光照强度为1500Lux，光照时间 14 h/d。6天后外植体表面结构变得疏松，四周组织逐渐变得水润且呈现浅黄色。接种14天后在外植体上形成微小的愈伤组织颗粒，接种25-30天后外植体上已经形成大量的愈伤组织颗粒（图1）。观察、统计愈伤组织诱导率。大约4周左右全部外植体均可诱导出愈伤组织。

、愈伤组织继代及不定芽分化

将生长旺盛的浅黄色愈伤组织（图2a）切下，接种到新鲜的继代培养基（同愈伤组织诱导培养基）中进行继代培养（图2b），25天之后愈伤组织增殖明显，颗粒饱满有光泽（图2c），在同样培养基上再继代一次。挑选生长状况良好的愈伤组织颗粒转移到不定芽分化的培养基（MS+5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA）上进行分化培养（图2 d），经过10天左右的分化培养，在愈伤组织表面长出许多绿点和小绿芽（图2 e），随后逐渐分化出一定数目、生长健壮、颜色浓绿的不定芽（图2f- i）

4、壮芽培养

为了提高分化培养基分化出来的不定芽的利用率，本发明中增加了壮芽培养阶段。将分化培养基中诱导出来的带绿点愈伤组织和嫩芽一起转移到壮芽培养基（MS+1.0mg/L KT+1.0mg/L GA+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA）中进行壮芽培养（图3 a），经过一段时间培养，绿点也逐渐长成不定芽，原有的不定芽变健壮（图3 b、c），经过30d左右的培养，不定芽已经生长成健壮、浓绿的组培苗，可以用于生根培养，提高了试管苗的诱导率。

、不同激素配比对试管苗生根的影响

实生根的诱导对不定芽是否能形成完整植株起着至关重要的作用。本发明设置了三套生根培养基，配比如下：培养基（1）MS；培养基（2）MS+2.0mg/L NAA；培养基（3）MS+0.5mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA。从图4中可以看出，将试管苗接种到3种生根培养基中，8天左右均可以长出2-3条实生根，20天左右能长出8-10天实生根，当培养天数达到30天左右时，实生根的条数明显增多，根系变得粗壮。不同的是当试管苗在生根培养基培养40d约6周后，培养基1的生根率可达90%以上；生根培养基2的生根率为63.3%，但有小鳞茎形成；而生根培养基3的生根率仅为30%左右。因此，基础MS培养基是高效、经济且快速诱导生根培养基。

二、试管苗移栽及管理

1、试管苗的练苗及移栽

组培苗虽然具有一定的光合能力，处于高湿、弱光、低CO₂、恒温、异养条件下生长，其组织分化不完善，光合自养能力弱，适应性差，气孔多而且不易关闭、叶绿素少、根毛少，炼苗过程为逐步改变其生长条件、逐步促使其组织发育完全，以适应外界环境生活，使其叶绿素增多，改善气孔的调节功能使蒸腾下降，使根毛发育完善等，提高其对环境的适应能力。生根的试管苗，待其长到3片真叶、有3-4条实生根时，室温开瓶练苗，7-10 d后从试管中取出，洗去根部培养基，剪掉枯黄的叶子，移栽至装有灭菌的珍珠岩、蛭石和泥炭土（1:3:6）的培养钵中，在10月初放置田间小拱棚中，晴好天气揭开小拱棚的薄膜通风，约30 d后，试管苗再次长出新根数条，移栽到大田土壤中。

2、组培苗田间管理、生理指标分析及鳞茎收获

10月底练苗结束，将试管苗移栽到地里小拱棚中，浇足水，将拱棚的双层塑料膜用土封严，保温保墒。移栽到土壤中的试管苗在小拱棚中可以自行越冬，第二年3月中旬浇返青水并逐渐掀起拱棚薄膜通风练苗、除草，3月底撤掉拱棚。5月中旬，待大蒜长到第8-9片叶子时，测定以蒜瓣种植的大蒜植株（对照株，以下同）和再生植株的株高、叶夹角、叶间距、鳞茎直径和叶绿素含量等。具体方法为：随机选取田间以蒜瓣种植的大蒜植株和再生植株各30 株，将大蒜挖起，进行数据评估及理化指标测定。每10株为一组，重复三次，取平均值。

株高：植株基部到最高叶片的距离；

叶夹角：植株倒3 叶与茎的锐角角度；

叶间距：植株倒2 叶与倒3 叶之间的距离；

鳞茎直径：用游标卡尺测量植株鳞茎直径；

叶绿素含量：田间栽培16 周后，对栽培大蒜、再生植株分别进行取材，用打孔器在第3 片叶子的4-6 cm、6-8 cm 和8-10 cm 叶段分别进行打孔，将打下来的小圆片叶子分别装入管中，向每管中加入浸提液（丙酮∶乙醇=1∶1）10 mL，放置在黑暗条件下72 h，分别测量每管在663、645nm 处的分光光度值，计算叶绿素含量。

结果发现：对照株与再生株株高相差不大，均在59cm左右；对照株倒二叶和倒三叶间的叶间距平均约为1.7cm，叶互生明显，而再生植株倒二叶和倒三叶之间的叶间距平均约为1cm，叶接近于轮生；对照株倒三叶与主茎之间夹角的平均值为20°，而再生植株倒三叶与主茎之间夹角平均为11°；对照株叶绿素含量平均为0.5277，再生株比对照株略高，为0.8878。再生植株叶夹角小，上部直立，透光率高，可以为中下部叶片提供更多光照，提高植株净光合速率；再生植株叶绿素含量高，能够提高光合作用效率，利于植株生长。

图5为对照株和再生株收获的地下鳞茎，再生株鳞茎平均直径为2.2cm，比对照株低0.6cm；再生鳞茎的根须不如对照株发达，蒜瓣也较对照的小；再生鳞茎分瓣率达94%左右，其中两瓣的鳞茎约为18%，四到六瓣的约为75%，7瓣的有一颗，约占0.8%，其余为独头蒜，约为6%。

本发明的创新点主要在于：

1、壮芽培养提高了试管苗诱导率：

本发明在诱导出不定芽后增加了壮芽培养阶段，优化出壮芽培养基：MS+1.0 mg/LKT+1.0mg/L GA+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA，与诱导不定芽培养基（MS+5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA）相比，降低了6-BA和 NAA的浓度，添加了两种激素KT和GA，加速了带绿点的愈伤组织分化不定芽和已分化的不定芽生长速度快，苗壮，颜色浓绿，为组培苗生根打下基础，提高了试管苗的诱导率。

、再生植株分瓣率高提大蒜高繁殖系数：

本发明所获试管苗经过温室内短暂练苗后，10月初移栽到培养介质中转移到大田小拱棚中练苗培养，入冬前移栽到土壤中，加双层拱棚膜保水保温，植株有充足时间缓苗、春化，在第一代便可获得分瓣率高达94%的再生地下鳞茎，这些分瓣的再生地下鳞茎可以作为蒜种进行种植。

注：上面所述MS基本培养基配方：

每升培养基中含有：KNO₃1900mg,NH₄NO₃1650mg, MgSO₄∙7H₂O 370 mg, KH₂PO₄170 mg, CaCl₂∙2H₂O 440 mg, MnSO₄∙4H₂O 22.3 mg, ZnSO₄∙7H₂O 8.6 mg, H₃BO₃6.2 mg,KI 0.83 mg, Na₂MO₃∙2H₂O 0.25 mg, CuSO₄∙5H₂O 0.025 mg, CoCl₂∙6H₂O 0.025 mg, Na₂-EDTA 37.7 mg, FeSO₄∙7H₂O 27.8 mg, 甘氨酸2.0 mg, 盐酸硫胺素0.4 mg, 盐酸吡哆素0.5 mg, 烟酸0.5 mg, 肌醇100 mg。

本发明公开的以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁方法所具有的积极效果在于：

1、壮芽培养提高了试管苗诱导率

利用愈伤组织途径进行快繁，可以再短时间内获得大量的不定芽，但这些不定芽在后期的试管苗诱导及移栽过程中会出现大量的死苗现象，严重降低繁殖系数。与前人工作不同的是，我们在诱导出不定芽后增加了壮芽培养阶段。优化出壮苗培养基：MS+1.0 mg/L KT+1.0mg/L GA+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA。与诱导不定芽培养基（MS+5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA）相比，降低了6-BA和 NAA的浓度，添加了两种激素KT和GA，加速了带绿点的愈伤组织分化不定芽和已分化的不定芽生长速度快，苗壮，颜色浓绿，为组培苗生根打下基础，提高了试管苗的诱导率。

、再生植株入冬前移栽是获得分瓣地下再生鳞茎的重要保障

北方一般在“九里”种蒜，主要是大蒜可以在较低的温度下完成春化过程，利于大蒜抽薹和地下鳞茎膨大。组培苗细小苗弱，如果在“九里”移栽，虽然能够完成纯化过程，但缓苗慢，苗期长，当天气温度达到30度以上时，还没有完成地下鳞茎膨大，大蒜就停止生长，转入休眠期，因此第一代多收获小独头蒜，即使有少量分瓣蒜，也多不够成熟，晾晒后干瘪，无法作为蒜种进一步种植（数据未列出）。本发明在大蒜自然结束休眠后开始诱导愈伤组织，通过不定芽诱导、多种激素参与的壮芽培养和根诱导形成试管苗，试管苗经过温室内短暂练苗后，10月初移栽到培养介质中转移到大田小拱棚中练苗培养，入冬前移栽到土壤中，加双层拱棚膜保水保温，植株通过充足时间缓苗、春化后，来年3月撤掉拱棚，其它的田间管理与地下鳞茎收获与对照株相同，在第一代便可获得大量分瓣的再生地下鳞茎，这些分瓣的再生地下鳞茎可以作为蒜种进行种植。

附图说明：

图1 愈伤组织诱导；大蒜鳞茎片在愈伤组织诱导培养基上培养0d(a)、4d(b)、6d(c)、10d(d)、14d（e）、21d(f)、25d(g)和30d（h）；

图2 愈伤组织的继代及不定芽的分化图；a：生长30的愈伤组织；b：继代一次的愈伤组织；c：继代2次的愈伤组织；d：接到分化培养基上的愈伤组织；e：开始分化的愈伤组织；f-i：分化15d、18d、25d、30d的幼芽；

图3 壮芽培养图；在壮芽培养基上培养10d(a)、15d(b)、20d(c)、30d(d)不定芽；

图4 试管苗生根培养图；a：刚刚移栽到生根培养基中的试管苗；b：在生根培养基中生长8d的试管苗；c: 在生根培养基中生长20d的试管苗；d、e：在生根培养基中生长30d的试管苗；

图5收获的第一代大蒜鳞茎；a为对照株鳞茎；b,c, d为再生株鳞茎。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本发明所述的各种原料均有市售。特别是MS(Murashige和Skoog发明的培养基，缩写为MS)、KT(kinetin激动素，一种细胞分离素)、6-BA(6苄基腺嘌呤)、NAA(吲哚乙酸)基本培养基有市售。

实施例1

一种以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁的方法：

（1）外植体的获得：

（2）大蒜愈伤组织诱导：

在超净台上将大蒜鳞茎切2mm厚薄片，接种到愈伤组织诱导培养基中，置人工气候箱中培养：日温 25℃，夜温 20℃，光照强度为1500 Lux，光照时间 14 h/d，6天后在外植体上形成微小的愈伤组织颗粒，接种25天后外植体上已经形成大量的愈伤组织颗粒；

（3）愈伤组织继代及不定芽分化：

将生长旺盛的愈伤组织切下，接种到新鲜的继代培养基中进行继代培养，25天之后愈伤组织增殖明显，在同样培养基上再继代一次，挑选生长状况良好的愈伤组织颗粒转移到不定芽分化的培养基上进行分化培养，经过10天的分化培养，逐渐分化出生长健壮、颜色浓绿的不定芽；其中

所述的不定芽分化的培养基指的是：MS+5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA；

（4）壮芽培养：

将分化培养基中诱导出来的愈伤组织和嫩芽一起转移到壮芽培养基或生根培养基中进行30d壮芽培养；所述的壮芽培养基指的是：MS+1.0 mg/L KT+1.0mg/L GA+0.2 mg/LNAA+2.0 mg/L 6-BA；

（5）生根培养：

所述的生根培养指的是不加激素的MS基础培养基；

（6）试管苗经过室内和田间拱棚中两次练苗，冬前移栽到土壤中，翌年在第一代收获再生地下鳞茎（把愈伤组织诱导的苗种植到大田土壤中，地上部分长苗，地下部分膨大形成蒜头——即地下鳞茎，由于愈伤组织苗为再生苗，所以由再生苗长成的蒜头即为地下再生鳞茎。）。

实施例2

一种以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁的方法：

（1）外植体的获得：

（2）大蒜愈伤组织诱导：

在超净台上将大蒜鳞茎切2mm厚薄片，接种到愈伤组织诱导培养基中，置人工气候箱中培养：日温 25℃，夜温 20℃，光照强度为1500 Lux，光照时间 14 h/d， 14天后在外植体上形成微小的愈伤组织颗粒，接种30天后外植体上已经形成大量的愈伤组织颗粒；

（3）愈伤组织继代及不定芽分化：

将生长旺盛的愈伤组织切下，接种到新鲜的继代培养基中进行继代培养，25天之后愈伤组织增殖明显，在同样培养基上再继代一次，挑选生长状况良好的愈伤组织颗粒转移到不定芽分化的培养基上进行分化培养，经过12天的分化培养，逐渐分化出生长健壮、颜色浓绿的不定芽；其中

所述的不定芽分化的培养基指的是：MS+5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA；

（4）壮芽培养：

（5）生根培养：

所述的生根培养指的是不加激素的MS基础培养基；

（6）试管苗经过室内和田间拱棚中两次练苗，冬前移栽到土壤中，翌年在第一代收获再生地下鳞茎（把愈伤组织诱导的苗种植到大田土壤中，地上部分长苗，地下部分膨大形成蒜头——即地下鳞茎，由于愈伤组织苗为再生苗，所以由再生苗长成的蒜头即为地下再生鳞茎）。

实施例3

采用本发明的大蒜快繁技术体系与常规试管苗快繁方法的对比试验结果如下：

结论：与常规试管苗培养获得再生鳞茎的技术方法相比，本发明通过在试管苗诱导阶段增加壮芽培养过程；同时，试管苗经过室内和田间拱棚中两次练苗，冬前移栽到土壤中，翌年6月收获第一代再生地下鳞茎。该方法能够在第一代获得高达94%分瓣率再生地下鳞茎，为优良品种大蒜种质扩繁提供了重要的保障。

Claims

1.一种以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）外植体的获得：

（2）大蒜愈伤组织诱导：

（3）愈伤组织继代及不定芽分化：

所述的愈伤组织诱导培养基、继代培养基指的是：MS+1.5mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT；

所述的不定芽分化的培养基指的是：MS+5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA；

（4）壮芽培养：

将分化培养基中诱导出来的愈伤组织和嫩芽一起转移到壮芽培养基中进行25-30d壮芽培养；所述的壮芽培养基指的是：MS+1.0 mg/L KT+1.0mg/L GA+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L6-BA；

（5）生根培养：

将健壮、浓绿的不定芽转移到生根培养基中诱导生根，4周后不定芽长出数条实生根，形成完整的试管苗；所述的生根培养基指的是不加激素的MS基础培养基；

（6）试管苗经过室内和田间拱棚中两次炼苗，冬前移栽到土壤中，翌年在第一代收获再生地下鳞茎把愈伤组织诱导的苗种植到大田土壤中，地上部分长苗，地下部分膨大形成蒜头—即地下鳞茎，由于愈伤组织苗为再生苗，所以由再生苗长成的蒜头即为地下再生鳞茎；所述的两次炼苗指的是：第一次炼苗将培养瓶的盖子打开，在培养室中练苗培养一周；第二次炼苗指的是将经过第一次炼苗后的试管苗从培养瓶中取出，洗去根部培养基，剪掉枯黄的叶子，移栽至装有灭菌的珍珠岩、蛭石和泥炭土1:3:6的培养钵中，在10月初放置田间小拱棚中，晴好天气揭开小拱棚的薄膜通风，30 d后，试管苗再次长出新根数条，这时第二次炼苗结束，进行大田移栽；越冬前移栽到土壤中指的是：10月底，日平均气温10℃以上的时候，把经过两次炼苗的试管苗移栽到大田中，这里的土壤没有特别要求，只要是一般的土壤就行。

2.权利要求1所述以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁方法在提高试管苗诱导率方面的应用。