CN111543320B - 一种利用大蒜愈伤组织生产大蒜素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用大蒜愈伤组织高效生产大蒜素的方法。主要采用宝坻大蒜鳞茎作为外植体诱导愈伤组织，以SO2(NH2)2为诱导剂调控大蒜愈伤组织高效生产大蒜素，SO2(NH2)2浓度为300 mg/L，培养30天，经检测大蒜素含量最高达89.43μg/g，大蒜素增长率最高达126%。大蒜素生产培养基：1/2 MS+30g/L蔗糖+1.5 mg/L 2,4‑D+7.8g/L琼脂，pH=5.8。该方法为大蒜素稳定高效生产提供了新的方法和依据。

Description

一种利用大蒜愈伤组织生产大蒜素的方法
本发明得到天津市农委科技成果转化与推广项目（201302030）；天津师范大学应用开发基金项目（52XK1505，043135202-XK1707）的资助。
技术领域
本发明属于农业生物工程技术领域，涉及大蒜愈伤组织培养与大蒜素生产的方法，更具体的说是构建一种利用大蒜愈伤组织高效生产大蒜素的方
背景技术
大蒜(Allium sativum L.)是百合科葱属一年生草本植物，食药兼用，我国是大蒜主要生产国。大蒜不仅可以食用而且具有医疗保健功能，可治疗多种疾病，并可以起到降低某些疾病风险的作用。研究报道，大蒜的多种生物活性功能主要与其产生的大蒜素有关。例如大蒜素已被证明具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗癌等活性；还可降低胆固醇、抑制血小板活化、稳定血糖以及抵抗细菌、真菌的功效，还可以对不同类型的癌症可起到保护和免疫调节作用。大蒜素在促进机体生长、助消化，提高机体的免疫力等方面也发挥了重要的作用。大蒜素还具有选择性诱导癌细胞凋亡，抑制生长因子或其信号转导，抑制细胞增殖和促进癌症的血管生成，破坏肿瘤微环境等功效，未来可能有望成为癌症预防剂。除此之外，大蒜素还可防治心血管疾病；抵抗或杀死病原微生物；更能有效地杀灭一些霉菌，比如白色念珠菌、烟曲霉等，被称为植物广谱抗菌素。
目前，大蒜素的生产技术主要依靠大蒜提取和化学合成。从大蒜中提取大蒜素易受大蒜种质退化、气候、贮藏及价格等多种因素影响。化学合成则存在原料杂质多，产品纯度低等问题。随着对大蒜素生物学活性研究的不断深入，其应用范围越来越广泛，而传统方式生产大蒜素又受到诸多因素的制约，仅依靠大蒜提取或化学合成将不能完全满足市场需求。
植物愈伤组织培养技术已成为在体外条件下研究和生产植物次生代谢产物的重要手段。植物愈伤组织培养技术不仅可以作为植物物种的快速繁殖和保存的重要手段，还能够高效、稳定的获得优质植物次级代谢产物。目前，植物愈伤组织培养技术已在中药资源领域获得成功应用。利用植物愈伤组织培养技术获得次生代谢产物具有明显优势，如生产工艺全程可控性强，愈伤组织培养在控制条件下进行，为次级代谢产物的产量及品质提供了保障；避免了大田栽培中植物生长受土壤、季节、气候、地理因素等条件的制约；产品质量稳定，均一性强，便于实现产品的标准化；次级代谢产物易于提取，无农药残留问题等。
鉴于以上需求，本发明以宝坻大蒜“六瓣红”的鳞茎片作为外植体诱导的愈伤组织，以不同浓度SO2(NH2)2作为诱导剂对愈伤组织进行代谢调控，构建一种利用大蒜愈伤组织高效生产大蒜素的方法。该方法弥补了现有大蒜素生产的不足，使之更加高效、稳定。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种利用大蒜愈伤组织高效生产大蒜素的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）以大蒜鳞茎片为外植体诱导愈伤组织及继代：
选取无病斑的大蒜鳞茎剥去外皮、清洗消毒后，切成0.5 cm厚的鳞茎片，接种到诱导愈伤培养基：MS + 30g/L蔗糖 + 1.5mg/L 2,4-D + 0.5mg/L KT+7.8g/L琼脂pH=5.8，待诱导出足量黄色或淡黄色颗粒状的愈伤组织后进行3次继代培养备用；
（2）大蒜愈伤组织高产大蒜素细胞系培养：
大蒜愈伤组织进行3次继代培养后，选取生长旺盛的大蒜愈伤组织转移至大蒜素生产培养基：1/2 MS+30g/L蔗糖 + 1.5 mg/L 2,4-D+7.8g/L琼脂，pH=5.8，以浓度300 mg/LSO2(NH2)2为诱导剂，温度25 ± 1℃培养室中培养30 d后收获愈伤组织并检测大蒜素含量，其最高达89.43 μg/g；
（3）大蒜素代谢调控工艺：
大蒜愈伤组织次继代培养后，通过向大蒜素生产培养基中以无菌方式加入经0.22μm微孔滤膜过滤的不同浓度SO2(NH2)2溶液作为诱导剂对大蒜愈伤组织进行代谢调控，以SO2(NH2)2溶液浓度梯度为0、100、200、300、400mg/L设置对比试验，置于温度25 ± 1℃培养室中培养30 d后收获愈伤组织，并经高效液相色谱法检测大蒜素含量，计算大蒜素增长率。实验结果表明，不同浓度的SO2(NH2)2对大蒜愈伤组织的生长状态无明显影响，但SO2(NH2)2浓度过高和过低的均不利于大蒜素的生产。随着培养基中SO2(NH2)2浓度的增加，大蒜素的含量呈现出先上升后下降的趋势。当SO2(NH2)2浓度为300mg/L时，大蒜素增长率最高达126%。
（4）愈伤组织中大蒜素的检测：
称取2.0 g愈伤组织加入磷酸缓冲液（pH7.0）研磨，定容至10 ml，吸取愈伤组织匀浆12000r离心3 min，取上清液，经0.45 μm微孔滤膜备用，经高效液相色谱法检测大蒜素含量。
本发明所述2,4-D是2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-Dichlorophenoxyacetic acid），简称2,4-D；KT是激动素（Kinetin），简称KT；SO2(NH2)2是硫酰胺（sulfamide）；
所述的MS基本培养基配方：
每1L培养基中含有：KNO3 1900mg，NH4NO3 1650 mg，MgSO4•7H2O 370 mg，KH2PO4170 mg，CaCl2·2H2O 440 mg，MnSO4·4H2O 22.3 mg，ZnSO4·7H2O 8.6 mg，H3BO3 6.2 mg，KI0.83 mg，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg，CuSO4·5H2O 0.025 mg，CoCl2·6H2O 0.025 mg，Na2EDTA·2H2O 37.7 mg，FeSO4·7H2O 27.8 mg，甘氨酸 2.0 mg，盐酸硫胺素 0.4 mg，盐酸吡哆素 0.5 mg，烟酸 0.5 mg，肌醇 100 mg；
所述的1/2 MS基本培养基配方：
每1L培养基中含有：KNO3 950mg，NH4NO3 825 mg，MgSO4•7H2O 185 mg，KH2PO4 85mg，CaCl2·2H2O 220 mg，MnSO4·4H2O 22.3 mg，ZnSO4·7H2O 8.6 mg，H3BO3 6.2 mg，KI0.83 mg，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg，CuSO4·5H2O 0.025 mg，CoCl2·6H2O 0.025 mg，Na2EDTA·2H2O 37.7 mg，FeSO4·7H2O 27.8 mg，甘氨酸 2.0 mg，盐酸硫胺素 0.4 mg，盐酸吡哆素 0.5 mg，烟酸 0.5 mg，肌醇 100 mg。
本发明进一步公开了利用大蒜愈伤组织产生大蒜素的方法在提高大蒜愈伤组织大蒜素含量方面的应用，实验结果显示大蒜素含量最高达89.43 μg/g，大蒜素增长率最高达126%。
本发明公开的一种利用大蒜愈伤组织高效生产大蒜素的方法与现有技术相比所具有关键之处在于：
（1）本发明通过采用特定诱导剂SO2(NH2)2显著提高大蒜愈伤组织生产大蒜素的能力；
（2）所确定的大蒜愈伤组织高产大蒜素愈伤组织培养体系为以SO2(NH2)2为诱导剂的1/2 MS培养基，SO2(NH2)2浓度最优值为300mg/L，25 ± 1℃培养30 d，愈伤组织中大蒜素含量最高达89.43 μg/g。该体系既可以满足大蒜愈伤组织的快速生长，又达到了利用大蒜愈伤组织高效生产大蒜素的目的；
（3）该体系生产工艺全程可控性强，愈伤组织培养在控制条件下进行，为大蒜素的产量及品质管理提供了保障；避免了传统工艺生产中，容易因大蒜产量和品质等影响制约大蒜素生产；愈伤组织所产生的大蒜素易于提取、质量稳定、均一性强、便于实现产品的标准化以及无农药残留问题等优势。
（4）目前尚无利用大蒜愈伤组织生产大蒜素及代谢调控方面的相关报道。本专利通过对诱导剂浓度作用分析，优化了各个环节，构建了一种从愈伤组织诱导、高产大蒜素愈伤组织培养的完整方法。该方法可以显著提高大蒜愈伤组织中大蒜素生产能力，实现大蒜素高效、稳定生产。该方法在国内外尚未见相关报道。
下面本发明以典型的天津市宝坻大蒜愈伤组织生产大蒜素工艺为代表，更加具体的说明实施方案：
（1）以大蒜鳞茎片为外植体诱导愈伤组织及继代：
选取无病斑的大蒜鳞茎剥去外皮后用自来水冲洗5 min，然后于紫外灭菌后的超净工作台中用0.1%（w/w）的HgCl2浸泡20 min，无菌蒸馏水反复洗涤2 min，再用75%（w/w）乙醇浸泡10 min，无菌蒸馏水反复洗涤2 min备用；将大蒜鳞茎切成0.5 cm厚的蒜片，接种到诱导愈伤培养基：MS + 30g/L蔗糖 + 1.5mg/L 2,4-D + 0.5mg/L KT+7.8g/L琼脂pH=5.8，待诱导出足量黄色或淡黄色颗粒状的愈伤组织后进行3次继代培养备用；
（2）大蒜愈伤组织高产大蒜素细胞系培养：
大蒜愈伤组织进行3次继代培养后，选取生长旺盛的大蒜愈伤组织转移至大蒜素生产培养基：1/2 MS+30g/L蔗糖 + 1.5 mg/L 2,4-D+7.8g/L琼脂，pH=5.8，以浓度300 mg/LSO2(NH2)2为诱导剂，温度25 ± 1℃培养室中培养30 d后收获愈伤组织并检测大蒜素含量，其最高达89.43 μg/g；
（3）大蒜素代谢调控工艺：
大蒜愈伤组织次继代培养后，通过向大蒜素生产培养基中以无菌方式加入经0.22μm微孔滤膜过滤的不同浓度SO2(NH2)2溶液作为诱导剂对大蒜愈伤组织进行代谢调控，以SO2(NH2)2溶液浓度梯度为0、100、200、300、400mg/L设置对比试验，置于温度25 ± 1℃培养室中培养30 d后收获愈伤组织，并经高效液相色谱法检测大蒜素含量，计算大蒜素增长率。实验结果表明，不同浓度的SO2(NH2)2对大蒜愈伤组织的生长状态无明显影响，但SO2(NH2)2浓度过高和过低的均不利于愈伤组织中大蒜素的生产。随着培养基中SO2(NH2)2浓度的增加，愈伤组织中大蒜素的含量呈现出先上升后下降的趋势。当SO2(NH2)2浓度为300mg/L时，愈伤组织中大蒜素增长率最高达126%。
（4）愈伤组织中大蒜素的检测：
称取2.0 g愈伤组织加入磷酸缓冲液（pH7.0）研磨，定容至10 ml，吸取愈伤组织匀浆12000r离心3 min，取上清液，经0.45 μm微孔滤膜备用，经高效液相色谱法检测大蒜素含量。高效液相色谱法检测愈伤组织中大蒜素色谱体系：色谱柱为Eclipse Plus C18，5 μm，4.6×250 mm，保护柱为Eclipse Plus C18 Grd，5 μm，4.6×12.5 mm，柱温35℃，流动相为甲醇:水（含0.2%甲酸）（80:20），流速1.0 ml/min，二极管阵列检测器检测波长240 nm，进样量50 μL。
附图说明
图1为大蒜愈伤组织诱导；
图2为加入诱导剂SO2(NH2)2后大蒜愈伤组织生长状态；
图3为加入诱导剂SO2(NH2)2后大蒜素增长率。
具体实施方式
下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。其中本发明所用SO2(NH2)2，2,4-D，KT等各种原料均有市售。
实施例1
（1）以大蒜鳞茎片为外植体诱导愈伤组织及继代：
选取无病斑的大蒜鳞茎剥去外皮后用自来水冲洗5 min，然后于紫外灭菌后的超净工作台中用0.1%（w/w）的HgCl2浸泡20 min，无菌蒸馏水反复洗涤2 min，再用75%（w/w）乙醇浸泡10 min，再无菌蒸馏水反复洗涤2 min备用；将大蒜鳞茎切成0.5 cm厚的蒜片，接种到诱导愈伤培养基：MS + 30g/L蔗糖 + 1.5mg/L 2,4-D + 0.5mg/L KT+7.8g/L琼脂pH=5.8，待诱导出足量黄色或淡黄色颗粒状的愈伤组织后进行3次继代培养备用；
（2）大蒜愈伤组织高产大蒜素细胞系培养：
大蒜愈伤组织进行3次继代培养后，选取生长旺盛的大蒜愈伤组织转移至大蒜素生产培养基：1/2 MS+30g/L蔗糖 + 1.5 mg/L 2,4-D+7.8g/L琼脂，pH=5.8，以浓度300 mg/LSO2(NH2)2为诱导剂，温度25 ± 1℃培养室中培养30 d后收获愈伤组织并检测大蒜素含量，其最高达89.43 μg/g；
（3）愈伤组织中大蒜素的检测：
称取2.0 g愈伤组织加入磷酸缓冲液（pH7.0）研磨，定容至10 ml，吸取愈伤组织匀浆12000r离心3 min，取上清液，经0.45 μm微孔滤膜备用，经高效液相色谱法检测大蒜素含量。高效液相色谱法检测愈伤组织中大蒜素色谱体系：色谱柱为Eclipse Plus C18，5 μm，4.6×250 mm，保护柱为Eclipse Plus C18 Grd，5 μm，4.6×12.5 mm，柱温35℃，流动相为甲醇:水（含0.2%甲酸）（80:20），流速1.0 ml/min，二极管阵列检测器检测波长240 nm，进样量50 μL。
实施例2
（1）以大蒜鳞茎片为外植体诱导愈伤组织及继代：
选取无病斑的大蒜鳞茎剥去外皮后用自来水冲洗5 min，然后于紫外灭菌后的超净工作台中用0.1%（w/w）的HgCl2浸泡20 min，无菌蒸馏水反复洗涤2 min，再用75%（w/w）乙醇浸泡10 min，再无菌蒸馏水反复洗涤2 min备用；将大蒜鳞茎切成0.5 cm厚的蒜片，接种到诱导愈伤培养基：MS + 30g/L蔗糖 + 1.5mg/L 2,4-D + 0.5mg/L KT+7.8g/L琼脂pH=5.8，待诱导出足量黄色或淡黄色颗粒状的愈伤组织后进行3次继代培养备用；
（2）大蒜愈伤组织高产大蒜素细胞系培养及代谢调控：
大蒜愈伤组织进行3次继代培养后，选取生长旺盛的大蒜愈伤组织转移至大蒜素生产培养基：1/2 MS+30g/L蔗糖 + 1.5 mg/L 2,4-D+7.8g/L琼脂，pH=5.8，通过向大蒜素生产培养基中以无菌方式加入经0.22μm微孔滤膜过滤的不同浓度SO2(NH2)2溶液作为诱导剂对大蒜愈伤组织进行代谢调控，以SO2(NH2)2溶液浓度梯度为0、100、200、300、400mg/L设置对比试验，置于温度25 ± 1℃培养室中培养30 d后收获愈伤组织，并经高效液相色谱法检测大蒜素含量，计算大蒜素增长率。
实验结果表明，不同浓度的SO2(NH2)2对大蒜愈伤组织的生长状态无明显影响，但SO2(NH2)2浓度过高和过低的均不利于愈伤组织中大蒜素的生产。随着培养基中SO2(NH2)2浓度的增加，大蒜素的含量呈现出先上升后下降的趋势。当SO2(NH2)2浓度为300mg/L时，大蒜素增长率最高达126%（图3）。
（3）愈伤组织中大蒜素的检测：
称取2.0 g愈伤组织加入磷酸缓冲液（pH7.0）研磨，定容至10 ml，吸取愈伤组织匀浆12000r离心3 min，取上清液，经0.45 μm微孔滤膜备用，经高效液相色谱法检测大蒜素含量。高效液相色谱法检测愈伤组织中大蒜素色谱体系：色谱柱为Eclipse Plus C18，5 μm，4.6×250 mm，保护柱为Eclipse Plus C18 Grd，5 μm，4.6×12.5 mm，柱温35℃，流动相为甲醇:水（含0.2%甲酸）（80:20），流速1.0 ml/min，二极管阵列检测器检测波长240 nm，进样量50 μL。
实施例3
对比试验
利用本发明的方法，以未加入诱导剂SO2(NH2)2的1/2 MS培养基作为对照组，加入浓度为300mg/L诱导剂SO2(NH2)2的1/2 MS培养基为调控组，愈伤组织分别培养5、10、20、30d后检测大蒜素含量，经SO2(NH2)2调控后大蒜素含量最高达89.43 μg/g（表1）。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
结论：与对照组相比较，加入浓度为300mg/L诱导剂SO2(NH2)2后调控组大蒜素含量明显增加，经检测最高达89.43 μg/g，大蒜素生产能力得到显著增强。

Claims (2)

1.一种利用大蒜愈伤组织高效生产大蒜素的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）以大蒜鳞茎片为外植体诱导愈伤组织及继代：
选取无病斑的大蒜鳞茎剥去外皮、清洗消毒后，切成0.5 cm厚的鳞茎片，接种到诱导愈伤培养基：MS + 30g/L蔗糖 + 1.5mg/L 2,4-D + 0.5mg/L KT+7.8g/L琼脂pH=5.8，待诱导出足量黄色或淡黄色颗粒状的愈伤组织后进行3次继代培养备用；
（2）大蒜愈伤组织高产大蒜素细胞系培养：
选取生长旺盛的大蒜愈伤组织转移至大蒜素生产培养基：1/2 MS+30g/L蔗糖+1.5 mg/L 2,4-D+7.8g/L琼脂，pH=5.8，以浓度300 mg/L SO2(NH2)2为诱导剂，培养30 d后收获愈伤组织并检测大蒜素含量，其最高达89.43 μg/g；
（3）大蒜素代谢调控工艺：
通过向大蒜素生产培养基中以无菌方式加入经0.22μm微孔滤膜过滤的浓度100~400mg/L SO2(NH2)2溶液作为诱导剂，培养30 d后收获愈伤组织，经检测大蒜素增长率最高达126%。
2.权利要求1所述利用大蒜愈伤组织产生大蒜素的方法在提高大蒜愈伤组织大蒜素含量方面的应用。
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