JPH01222778A - パーオキシダーゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、特定の植物体から誘導されるカルスを用いた
パーオキシダーゼの製造法、および該方法により得られ
るパーオキシダーゼに関する。

（従来の技術） パーオキシダーゼは、過酸化水素の存在下において基質
の酸化を触媒する酵素であり、このような酸化反応の触
媒能を利用して、各種臨床検査試薬や化学分析試薬とし
て用いられている０例えば。

モノクローナル抗体に結合させた特異的微量物質の検出
用試薬や酵素免疫試験法における標識酵素などとして利
用される。さらに、有機化合物の酸化反応を行うための
バイオリアクターとしても利用される。

パーオキシダーゼは広く植物界に存在することが知られ
ている。例えば、イチジク、インゲンマメ、ダイコン、
小麦、カブラ、Ｂ本ワサビおよびワサビダイコンに含有
され、特にワサビダイコン根部における含有率が高い。

そのため、上記試薬などに利用されるパーオキシダーゼ
としては、はとんどがこのワサビダイコンから抽出され
たものが用いられてきた。しかし、上記ワサビダイコン
などの原料植物は、栽培条件（天候、地域による土壌や
気候の差、収穫時期など）によりその収穫量および品質
が異なる。従って、所定の品質のバ−オキシダーゼを安
定して供給することが難しい。

さらに、大量生産のためには広く肥沃な耕地を必要とす
るなどの問題点もある。

これらの問題を解消する手段として、植物組織を培養し
、その培養物からパーオキシダーゼを採取する方法が考
えられる。一般に薬用植物などの組織または細胞を培養
して、その植物に含有される特有の薬効成分を生産させ
る研究が試みられている。しかし、一部の植物を除いて
は、もとの植物で生成および蓄積されていた目的の薬効
成分は培養物中では全く生成しないか、または生成して
もその収量が極めて小さい場合が多い。このように、上
記方法を採用しても植物の種類や培養条件の差により薬
効成分の品質や生産性が異なり、もとの植物における該
薬効成分の品質や生産性をそのまま反映するとは限らな
い。

例えば、植物組織から誘導される培養細胞（カルス）中
のパーオキシダーゼの存在についてはいくつかの報告が
あり９例えば、タバコ、インゲンマメ、ナデシコ、ワサ
ビダイコン、ヨウサイなどの植物組織培養カルスにおけ
るパーオキシダーゼの存在が報告されている。しかし、
これらの培養物におけるパーオキシダーゼの生産性は、
ワサビダイコン（特開昭５９−２８４７３号）およびヨ
ウサイ（特開昭６２−１３８１８８号）の場合が比較的
良好であるのを除いては極めて低く、実用的ではない。

このように、所定の品質のパーオキシダーゼを効果的に
生産する方法はいまだに確定されていない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、上記従来の課題を解決するものであり、その
目的とするところは、所定の高品質のパーオキシダーゼ
を効果的に、かつ安定した条件下で製造する方法を提供
することにある。本発明の他の目的は、上記高品質のパ
ーオキシダーゼを細胞培養物から、効果的に製造する方
法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、
上記方法により得られる高品質のパーオキシダーゼを提
供することにある。

（課題を解決するための手段） 発明者らは９種々の植物体の組織片または細胞からカル
ス（無定形細胞塊）を誘導し、このカルスを培養するこ
とによって生産されるパーオキシダーゼについて研究を
行った。その結果、マメ科に属するカンゾウ（虹り刀Ｉ
注組　訂田徂り、　ｖａｒ）＋ヒルガオ科に属するサツ
マイモ（ｊｙ兜狙ＢａｔａｔａｓＬａｗ、　ｖａｒ、　
ｅｄｕｌｉｓ　Ｍａｋｉｎｏ）、キク科に属するステビ
ア（Ｓｔｅｖｉａ　　ｒｅｂｕｎｄｉａｎａ　Ｂｅｒｔ
ｏｎｉ）、およびセリ科に属するミシマサイコ（動態μ
＞ｒｕｍ　　ｆａｌｃａｔｕｎ＋　Ｌ、）の植物体組織
片または細胞から誘導したカルスが高い割合でパーオキ
シダーゼを生産することを見い出し２本発明を完成する
に至った。上記植物種のうち、カンゾウおよびミシマサ
イコは漢方薬として、サツマイモは食糧および食品原料
として。

ステビアは甘味料ステビオサイドを含有することから甘
味原料としてそれぞれ用いられており、比較的よく知ら
れた植物である。しかし、これらの植物体から誘導した
カルスに強力なパーオキシダーゼ活性を有する酵素が存
在することは、従来全く知られていなかった。

本発明のパーオキシダーゼ製造法は、カンゾウ（ｕ匹ｕ
並圏虹　紅畦虹り、　ｖａｒＬ　”）ツマイモ（ｎ４匹
ＬＢａｔａｔａｓ　　Ｌａｍ、　ｖａｒ、　ｅｄｕｌｉ
ｓ　Ｍａｋｉｎｏ）。

ステビア（Ｓｔｅｖｉａ　　ｒｅｂｕｎｄｉａｎａ　Ｂ
ｅｒｔｏｎｉ）、およびミシマサイコ（％　　ｆａｌｃ
ａｔｕｍＬ、）でなる群から選択される少なくとも一種
の植物体組織片または細胞を栄養培地で培養した培養物
からパーオキシダーゼを単離する工程を包含し、そのこ
とにより上記目的が達成される。

本発明のパーオキシダーゼは、上記方法により得られる
パーオキシダーゼである。

ここで、上記“培養物”とは、植物体組織片または細胞
から誘導されたカルスを固形培地または液体培地などの
栄養培地で継代培養して得られる増殖カルスおよび培地
成分の混合物を示す。

本発明方法によりパーオキシダーゼを調製するには、ま
ず、上記植物の植物体からカルスの誘導を行う。例えば
、上記植物の芽生え（幼植物）の根９杯軸、子葉；成熟
植物の根、茎１葉、花、花粉、などの細胞群または９組
織片を出発材料として採取する。上記細胞群または組織
片としていずれの部分を選択しても、カルスの誘導の難
易の差はあるが、いずれもカルスが誘導され得る。これ
らの細胞群または組織片を９例えば適当な培地を用いて
無菌的に培養することによりカルスが生じる。使用され
る培地としては、植物の培養に使用される培地がいずれ
も使用され得る。これには例えば、　ＭＳ　（Ｍｕｒａ
ｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ）培地、　ＬＳ（Ｌｉｎｓｍａ
ｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ　）培地、　Ｗｈｉｔｅの培地、　
Ｇａｓ＋ｂｏｒｇの培地。

Ｗｅｌｌｅｒの培地、　Ｎｔｔｃｈ−Ｎｉｔｃｈの培地
などがある。

固体培地、液体培地のいずれもが利用されるが。

通常、寒天を含む固体培地が好適に用いられる。

上記培地中には２通常、カルスの誘導を促進するための
植物ホルモン、特にオーキシンが含有される。オーキシ
ン類としては、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，
４−Ｄ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）　。

２．４．５−　）ジクロロフェノキシ酢酸（２，４，５
−Ｔ）。

インドール酢酸（ＩＡＡ）、インドール酪酸（ＩＢＭ）
などがある。植物ホルモンとして、サイトカイニン類が
含有されてもよく、それには、ゼアチン。

６−ベンジルアデニン、カイネチン、リボシルゼアチン
、イソペンテニルアデニンなどがある。植物ホルモンは
、上記オーキシン類が１０−　’Ｍ以下。

通常、　１０−’Ｍ〜１０−　’Ｍの割合で、サイトカ
イニン［カ１０−’Ｍ以下１通常、　１０−”Ｍ　〜１
０−’ｌ’ｌ　（７）割合で培地中に含有される。例え
ば、オーキシン類とサイトカイニン類とを含む寒天培地
上で、２０〜３０℃の暗所にて１０〜３０日間培養を行
うとカルスが形成される。

このようにしてｔｆ’ｓＨＬされたカルスは、固体もし
くは液体培地を用いて継代培養がなされる。液体培地を
用いた振盪培養が有利である。例えば、上記組成の液体
培地にカルスを加え、２０〜３０℃、好ましくは２７°
Ｃ前後で５０〜１５０ｒｐｍ、好ましくは１１０ｒｐ＋
ｍ前後の割合で振盪培養が行われる。光は照射してもし
なくてもよい。通常週１回の割合で新しい培地に植え継
ぎ、継代培養が行われる。後述の方法によりパーオキシ
ダーゼの生産性が高く、かつ増殖の速いセルラインを選
択して継代培養を行う。

このようにして継代培養されたセルラインの培養物中に
は、非常に高いパーオキシダーゼ活性が見い出される。

例えば、従来活性が高いとされていたワサビダイコン根
部のパーオキシダーゼ活性の３〜７倍もの活性が認めら
れる。パーオキシダーゼ活性は、該培養物中のカルスお
よびカルスを除く培地成分の中のいずれにも認められる
。

培養物からパーオキシダーゼを採取するには。

例えばまず、濾過または遠心分離などによりカルスと培
地成分とを分離する。このようにして分離されたカルス
からパーオキシダーゼを抽出するには、適当な溶媒中で
カルスをホモジナイズし、固形物を除去して抽出液を得
る。上記溶媒としては水系溶媒が好ましく、水またはリ
ン酸緩衝液などの適当な中性の緩衝液が用いられる。固
形物の除去は、遠心分離、濾布による濾過などにより行
われる。このようにして得られた抽出液を硫酸アンモニ
ウム（硫安）により塩析し２次いで透析により無機イオ
ンを除去することにより、パーオキシダーゼの粗酵素調
製物が得られる。培養物からカルスを除去した残りの培
地液からパーオキシダーゼを抽出するには、この液を直
接に硫安塩析に供する。硫安塩析および透析を上記カル
スの抽出液と同様にして行うことにより、パーオキシダ
ーゼの粗酵素調製物が得られる。

上記方法で得られたパーオキシダーゼの粗酵素調製物は
２通常の生化学研究で用いられる手段により単離・精製
される。例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽
イオンクロマトグラフィー。

ゲル濾過クロマトグラフィー、親水クロマトグラフィー
、疎水クロマトグラフィー、等電点電気泳動１等速電気
泳動、クロマトフオーカシングなどの一種もしくは二種
以上の組合せにより単離・精製がなされる。精製された
パーオキシダーゼは。

凍結乾燥することによりパーオキシダーゼ精製標品とさ
れる。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

１１皿上 （パーオキシダーゼ高生産性カルスの調製）カンゾウ、
サツマイモ、ステビアおよびミシマサイコの葉を採取し
、それぞれ常法に従ってエタノ−、ルおよびアンチホル
ミンで滅菌した後、　　５ｍｍ角の細片に裁断した。そ
れぞれの植物について表１に示す植物ホルモンを含有す
る寒天培地を用意し、該寒天培地に上記の葉細片をそれ
ぞれ置床し。

カルスを誘導した。誘導されたカルスを同一組成の新た
な培地を用いて３回継代培養を行った。次に、それぞれ
の植物について表２に示す植物ホルモンを含有する寒天
培地を用意し、上記カルスを移植した。これらのカルス
について、その増殖速度およびパーオキシダーゼ活性の
両者について考慮しながら選択を繰り返し、２０代にわ
たり継代培養を行なった。

（以下余白） このようにして選択されたパーオキシダーゼ高生産性カ
ルス中のパーオキシダーゼ活性（下記の方法にて測定）
は、以下のようであった。

カンゾウ　　　　５００ｕｎｉｔ／ｇカルス生重量サツ
マイモ　　　８００ｕｎｉｔ／ｇカルス生重量ステビア
　　　　９００ｕｎｉｔ／ｇカルス生重量ミシマサイコ
　　５００ｕｎｉｔ／ｇカルス生重量従来、活性が高い
とされていたワサビダイコン根部のパーオキシダーゼ活
性（下記の方法にて測定）は、１３０〜１８０ｕｎｉ　
ｔ／ｇ根部生重量であり、これと比較すると選択培養さ
れたカンゾウ、サツマイモ。

ステビアおよびミシマサイコのカルスは、約３〜７倍も
の非常に高いパーオキシダーゼ活性を有することが示さ
れた。

パーオキシダーゼ活性測定法：　０．５ｇのカルス（も
しくは植物体）を５Ｉ１１の蒸留水とともにテフロンホ
モジナイザーで十分に破砕する。この破砕液を４°Ｃに
て５０００Ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を回収して
酵素試料液とする。この酵素試料液を。

１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）の適量で希釈する。パ
ーオキシダーゼ活性が０．０８〜０．２ｕｎｉｔ／ｄ程
度となるように希釈するのが好適である。次に、　　２
１１ｄｌの２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）、ｌＩｄ
の１ｍＭオルトアミノフェノール溶液およびＩＩｄの４
ｍＭ過酸化水素溶液を混合し、２５°Ｃで５分間予備加
温する。

上記の予備加温した混合液に、上記希釈した酵素試料液
０．５ｍｌ！を添加し、２５°Ｃで３分間インキュベー
トした後、　１Ｎ塩酸０．５１１を添加して酵素反応停
止をさせる。別に、上記混合液に酵素試料液を添加せず
に同様にインキユベートし、塩酸溶液を添加した後に希
釈酵素試料液０．５ｍを添加したものを用意し、これを
盲検とする。

試料と盲検の両方の４８０ｒｕ＋＋における吸光度を分
光光度計にて測定し、以下の計算式に従ってパーオキシ
ダーゼ活性を求める。

（以下余白） パーオキシダーゼ活性（ｕｎｉｔ／ｍｊり＝〔（△０Ｄ
４８゜　ｘ　５．０）／（７，００ｘ　３．００　ｘ　
Ｏ，５））×希釈倍率 Δ０Ｄｎｓｏ　＝ＯＤ４ｓｏ　　（試料）　　０Ｄａｓ
ａ　　（盲検）上記式において、　７．００はモル吸光
係数（＋ｕ＋ｏｌ／ｃＩＩｌ）を、　５．００は反応液
ｉｉ　（ｄ）を、３．０は反応時間（ＩＩＩｉｎ）を、
そして、０．５は酵素試料液量１１１）を示す。

ト料シダーゼ活性（ｕｎｉｔ／ｇカルスまたは植物体生
重量）＝（（ｕｎｉｔ／ｄ）　Ｘ＾）／Ｂ 八へカルス（植物体）破砕液量（ｄ） Ｂ＝カルス（植物体）の生重量軸） 裏施斑又 （カルス培養物からのパーオキシダーゼの単離・精製） 実施例１で得られた。カンゾウ、サツマイモ。

ステビアおよびミシマサイコのパーオキシダーゼ高生産
性カルスそれぞれ１０ｇ採取し、培養を行なった。この
培養は、それぞれの植物について表２に示す植物ホルモ
ンを含有する液体培地を用意し。

該液体培地に上記カルスを移植することにより行った。

それぞれについて１表２に示す液体培地２００戚をそれ
ぞれ５００−のマイヤーフラスコに入れ。

上記カルスを移植し、　１１０ｒｐ＋ｍで１週間振盪培
養した。培養物を分離し、５０ｇ（生重量）のカルスお
よび１８０Ｉｄの培地液を回収した。得られたカルス１
０ｇに１０ｗＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）１００ｍを添加
し。

テフロンホモジナイザーを用いて十分に破砕した。

この破砕液を４°Ｃにて１５分間、５０００Ｘｇで遠心
分離してその上清を回収した。得られた上清液を７０％
硫酸アンモニウム（硫安）で塩析し、　５＋ｓＭリン酸
緩衝液（ｐｔ１７　）　５０ｍＭに溶解させ、　５ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐｌ（７）に対して４℃で２０時間透析
して脱塩した。この溶液を５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
）で平衡化した陽イオン交換樹脂ＣトセファロースＣＬ
−６Ｂ（ファルマシア社製）に吸着させた後、濃度勾配
溶出法によりＮａＣ１濃度を０．１〜１．０Ｍとして溶
出を行った。パーオキシダーゼ活性のある両分１００＃
ｔｇを集め、この百分をＩｎ＋Ｍリン酸緩衝波緩衝液７
）に対して４℃で１０時間透析することにより脱塩した
。

この溶液を凍結乾燥し、パーオキシダーゼ精製標品を得
た。得られた精製標品の量を表３に示す。

上記培養液からカルスを除去して得られた培地液には、
直接７０％硫安を添加して塩析した。この硫安塩析で得
られた沈澱について、上記カルスのホモジナイズ液から
得られた硫安塩析沈澱物と同様に、透析、陽イオン交換
クロマトグラフィー。

および凍結乾燥を行い、パーオキシダーゼ精製標品を得
た。得られた精製標品の量を表３に示す。

このようにしてカルスおよび培地液から得られた精製標
品のパーオキシダーゼ活性をあわせて表に３示す。

（以下余白） （発明の効果゛） 本発明によれば、カンダウ。サツマイモ、ステビアおよ
び／またはミシマサイコの植物体から誘導されたカルス
から、高品質のパーオキシダーゼが効果的に、かつ安定
的に得られる。人為的に得られたカルス培養することに
よりパーオキシダーゼの製造が行われるので、天候、地
域による土壌や気候の差、収穫時期などの植物栽培条件
に影響されず、かつ、広い耕地面積を必要とせずに大量
に高品質のパーオキシダーゼが得られる。このようにし
て得られるパーオキシダーゼは、各種臨床検査試験や化
学分析試薬として利用される。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、カンゾウ（￥Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ￥￥ｇｌａｂ
   ａ￥Ｌ．ｖａｒ）、サツマイモ（￥Ｉｐｏｍｏｅａ￥￥
   Ｂａｔａｔａｓ￥Ｌａｍ．ｖａｒ．ｅｄｕｌｉｓＭａｋ
   ｉｎｏ）、ステビア（￥Ｓｔｅｖｉａ￥￥ｒｅｂｕｎｄ
   ｉａｎａ￥Ｂｅｒｔｏｎｉ）、およびミシマサイコ（￥
   Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ￥￥ｆａｌｃａｔｕｍ￥Ｌ．）でな
   る群から選択される少なくとも一種の植物体組織片また
   は細胞を栄養培地で培養した培養物からパーオキシダー
   ゼを単離する工程を包含する、パーオキシダーゼの製造
   法。 ２、特許請求の範囲第１項に記載の製造法により得られ
   るパーオキシダーゼ。