JPH01222777A - パーオキシダーゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、シバ（ハ■凰ｎ匹虹姐）および／またはオニ
シバ（ハ■旦髭■匹田傭ｎ）の植物体から誘導されるカ
ルスを用いたパーオキシダーゼの製造法、および該方法
により得られるパーオキシダーゼに関する。

（従来の技術） パーオキシダーゼは、過酸化水素の存在下において基質
の酸化を触媒する酵素であり、このような酸化反応の触
媒能を利用して、各種臨床検査試薬や化学分析試薬とし
て用いられている。例えば。

モノクローナル抗体に結合させた特異的微量物質の検出
用試薬や酵素免疫試験法における標識酵素などとして利
用される。さらに、有機化合物の酸化反応を行うための
バイオリアクターとしても利用される。

パーオキシダーゼは広（植物界に存在することが知られ
ている。例えば、イチジク、インゲンマメ、ダイコン、
小麦、カプラ、日本ワサビおよびワサビダイコンに含有
され、特にワサビダイコン根部における含有率が高い。

そのため、上記試薬などに利用されるパーオキシダーゼ
としては、はとんどがこのワサビダイコンから抽出され
たものが用いられてきた。しかし、上記ワサビダイコン
などの原料植物は、栽培条件（天候、地域による土壌や
気候の差、収穫時期など）によりその収穫量および品質
が異なる。従って、所定の品質のパーオキシダーゼを安
定して供給することが難しい。

さらに、大量生産のためには広く肥沃な耕地を必要とす
るなどの問題点もある。

これらの問題を解消する手段として、植物組織を培養し
、その培養物からパーオキシダーゼを採取する方法が考
えられる。−触に薬用植物などの組織または細胞を培養
して、その植物に含有される特有の薬効成分を生産させ
る研究が試みられている。しかし、一部の植物を除いて
は、もとの植物で生成および蓄積されていた目的の薬効
成分は培養物中では全く生成しないか、または生成して
もその収量が極めて小さい場合が多い。このように、上
記方法を採用しても植物の種類や培養条件の差により薬
効成分の品質や生産性が異なり、もとの植物における該
薬効成分の品質や生産性をそのまま反映するとは限らな
い。

例えば、植物組織から誘導される培養細胞（カルス）中
のパーオキシダーゼの存在についてはいくつかの報告が
あり９例えば、タバコ、インゲンマメ、ナデシコ、ワサ
ビダイコン、ヨウサイなどの植物組織培養カルスにおけ
るパーオキシダーゼの存在が報告されている。しかし、
これらの培養物におけるパーオキシダーゼの生産性は、
ワサビダイコン（特開昭５９−２８４７３号）およびヨ
ウサイ（特開昭６２−１３８１８８号）の場合が比較的
良好であるのを除いては極めて低く、実用的ではない。

このように、所定の品質のパーオキシダーゼを効果的に
生産する方法はいまだに確定されていない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、上記従来の課題を解決するものであり、その
目的とするところは、所定の高品質のパーオキシダーゼ
を効果的に、かつ安定した条件下で製造する方法を提供
することにある。本発明の他の目的は、上記高品質のパ
ーオキシダーゼを細胞培養物から、効果的に製造する方
法を提供することにある０本発明のさらに他の目的は、
上記方法により得られる高品質のパーオキシダーゼを提
供することにある。

（課題を解決するための手段） 発明者らは９種々の植物体の組織片または細胞からカル
ス（無定形細胞塊）を誘導し、このカルスを培養するこ
とによって生産されるパーオキシダーゼについて研究を
行った。その結果、イネ科に属するシバ（ハｎｎ　ロ匹
蛙組）およびオニシバ（ハ■ｎ　懸肛匹旦並■）の植物
体組織片または細胞から誘導したカルスが高い割合でパ
ーオキシダーゼを生産することを見い出し９本発明を完
成するに至った。シバおよびオニシバは、芝草としてよ
く知られているが、これらの植物体から誘導したカルス
に強力なパーオキシダーゼ活性を有する酵素が存在する
ことは、従来全く知られていなかった。

本発明のパーオキシダーゼ製造法は、シバ（ｈ江１」垣
り蛙坦）および／またはオニシバ（ハ■ｉａ　　ｍａｃ
ｒｏ−ｕ匹肚針の植物体組織片または細胞を栄養培地で
培養した培養物からパーオキシダーゼを単離する工程を
包含し、そのことにより上記目的が達成される。

゛本発明のパーオキシダーゼは、上記方法により得られ
るパーオキシダーゼである。

ここで、上記“培養物”とは、植物体組織片または細胞
から誘導されたカルスを固形培地または液体培地などの
栄養培地で継代培養して得られる増殖カルスおよび培地
成分の混合物を示す。

本発明方法によりパーオキシダーゼを調製するには、ま
ず、シバおよび／またはオニシバの植物体からカルスの
誘導を行う。例えば、上記植物の芽生え（幼植物）の根
９杯軸、子葉；成熟植物の根、茎１葉、花、花粉、など
の細胞群または２組織片を出発材料として採取する。上
記細胞群または組織片としていずれの部分を選択しても
、カルスの誘導の難易の差はあるが、いずれもカルスが
１　誘導され得る。これらの細胞群または組織片を。

例えば適当な培地を用いて無菌的に培養することにより
カルスが生じる。使用される培地としては。

植物の培養に使用される培地がいずれも使用され得る。

これには例えば、　ＭＳ　（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−３ｋ
ｏｏｇ）培地、　ＬＳ　（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ−Ｓｋｏ
ｏｇ）培地、　Ｗｈｉｔｅの培地。

Ｇａｍｂｏｒｇの培地、　Ｈｅ１ｌｅｒの培地、　Ｎ１
ｔｃｈ−Ｎｉｔｃｈの培地などがある。固体培地、液体
培地のいずれもが利用されるが２通常、寒天を含む固体
培地が好適に用いられる。

上記培地中には１通常、カルスの誘導を促進するための
植物ホルモン、特にオーキシンが含有される。オーキシ
ン類としては、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，
４−Ｄ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）。

２．４．５−）ジクロロフェノキシ酢酸（２，４，５−
Ｔ）。

インドール酢酸（ＴＡＡ）、インドール酪酸（ＩＢＭ　
）などがある。植物ホルモンとして、サイトカイニン類
が含有されてもよく、それには、ゼアチン。

６−ベンジルアデニン、カイネチン、リボシルゼアチン
、イソペンテニルアデニンなどがある。植物ホルモンは
、上記オーキシン類が１０−’Ｍ以下。

通常、　１０−’Ｍ〜１０−’Ｈの割合で、サイトカイ
ニン類が１０”’Ｍ以以下９常常、１０−”Ｍ〜１０−
’Ｈの割合で培地中に含有される。例えば、オーキシン
類とサイトカイニン類とを含む寒天培地上で、　２０〜
３０°Ｃの暗所にて１０〜３０日間培養を行うとカルス
が形成される。

このようにして誘導されたカルスは、固体もしくは液体
培地を用いて継代培養がなされる。液体培地を用いた振
盪培養が有利である０例えば、上記組成の液体培地にカ
ルスを加え、　２０〜３０’Ｃ，好ましくは２７℃前後
で５０〜１５０ｒｐｍ、好ましくは１１０ｒｐｍ前後の
割合で振盪培養が行われる。光は照射してもしな（ても
よい。通常週１回の割合で新しい培地に植え継ぎ、継代
培養が行われる。後述の方法によりパーオキシダーゼの
生産性が高く、かつ増殖の速いセルラインを選択して継
代培養を行う。

このようにして継代培養されたセルラインの培養物中に
は、非常に高いパーオキシダーゼ活性が見い出される０
例えば、従来活性が高いとされていたワサビダイコン根
部のパーオキシダーゼ活性の１０倍以上もの活性が認め
られる。パーオキシダーゼ活性は、該培養物中のカルス
およびカルスを除く培地成分の中のいずれにも認められ
る。

培養物からパーオキシダーゼを採取するには。

例えばまず、濾過または遠心分離などによりカルスと培
地成分とを分離する。このようにして分離されたカルス
からパーオキシダーゼを抽出するには、適当な溶媒中で
カルスをホモジナイズし、固形物を除去して抽出液を得
る。上記溶媒としては水系溶媒が好ましく、水またはリ
ン酸緩衝液などの適当な中性の緩衝液が用いられる。固
形物の除去は、遠心分離、濾布による濾過などにより行
われる。このようにして得られた抽出液を硫酸アンモニ
ウム（硫安）により塩析し９次いで透析により無機イオ
ンを除去することにより、パーオキシダーゼの粗酵素調
製物が得られる。培養物からカルスを除去した残りの培
地液からパーオキシダーゼを抽出するには、この液を直
接に硫安塩析に供する。硫安塩析および透析を上記カル
スの抽出液と同様にして行うことにより、パーオキシダ
ーゼの粗酵素調製物が得られる。

上記方法で得られたパーオキシダーゼの粗酵素調製物は
１通常の生化学研究で用いられる手段により単離・精製
される。例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽
イオンクロマトグラフィー。

ゲル濾過クロマトグラフィー、親水クロマトグラフィー
、疎水クロマトグラフィー、等電点電気泳動１等速電気
泳動、クロマトフオーカシングなどの一種もしくは二種
以上の組合せにより単離・精製がなされる。精製された
パーオキシダーゼは。

凍結乾燥することによりパーオキシダーゼ精製標品とさ
れる。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

ｌ施■工 （パーオキシダーゼ高生産性カルスの調製）シバおよび
オニシバの葉を採取し、常法に従ってエタノールおよび
アンチホルミンで滅苗した後。

５ＩＩＩＩ１１角の細片に裁断した。２．４−Ｄを５．
０Ｘ１０−’Ｍ　。

カイネチンを５．０Ｘ１０−９Ｍの割合で含有するＭｕ
ｒａｓｈｉｇｅ−５ｋｏｏｇ（ＭＳ）の寒天培地に、上
記の葉細片をそれぞれ置床し、カルスを誘導した。誘導
されたカルスを同一組成の新たな培地を用いて３回継代
培養を行った。次に、シバのカルスは、　ＭＳ寒天培地
（２，４−Ｄを２．０Ｘ１０−’Ｍおよびカイネチンを
５．０×１０−　’Ｍ金含有に移植した。他方、オニシ
バのカルスはＬＳ寒天培地（２，４−Ｄを３．ＯＸｌｏ
−ｈＭおよびカイネチンを５．ＯＸｌ０−’Ｍ金含有に
移植した。これら、シバおよびオニシバのカルスを、そ
の増殖速度およびパーオキシダーゼ活性の両者について
考慮しながら選択を繰り返し、２０代にわたり継代培養
を行なった。

このようにして選択されたパーオキシダーゼ高生産性カ
ルス中のパーオキシダーゼ活性（下記の方法にて測定）
は、シバのカルスが１５００ｕｎｉ　ｔ／ｇカルス生重
量、オニシバのカルスが１７００ｕｎｉｔ／ｇカルス生
重量であった。従来、活性が高いとされていたワサビダ
イコン根部のパーオキシダーゼ活性（下記の方法にて測
定）は、１３０〜１８０ｕｎｉｔ／ｇ根部生重量であり
、これと比較すると選択培養されたシバおよびオニシバ
のカルスは、約１０倍もの非常に高いパーオキシダーゼ
活性を有することが示された。

パーオキシダーゼ活性測定法：　０．５ｇのカルス（も
しくは植物体）を５ｄの蒸留水とともにテフロンホモジ
ナイザーで十分に破砕する。この破砕液を４°Ｃにて５
００ＱＸｇで１０分間遠心分離し、上清を回収して酵素
試料液とする。この酵素試料液を。

１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）の適量で希釈する。パ
ーオキシダーゼ活性が０．０８〜０．２ｕｎｉ　ｔ／ｍ
ｌ！程度となるように希釈するのが好適である。次に、
２ｄの２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐｆ１７）、　　ｌｄ
の１１１Ｍオルトアミノフェノール溶液および１戚の４
１過酸化水素溶液を混合し、２５°Ｃで５分間予備加温
する。

上記の予備加温した混合液に、上記希釈した酵素試料液
０　、５　ｍｌを添加し、２５°Ｃで３分間インキュベ
ートした後、　ＩＮ塩酸０．５ｄを添加して酵素反応停
止をさせる。別に、上記混合液に酵素試料液を添加せず
に同様にインキュベートし、塩酸溶液を添加した後に希
釈酵素試料液０．５１１Ｉｉを添加したものを用意し、
これを盲検とする。

試料と盲検の両方の４８０ｎｍにおける吸光度を分光光
度計にて測定し、以下の計算式に従うてパーオキシダー
ゼ活性を求める。

（以下余白） パーオキシダーゼ活性（ｕｎｉｔ／ａｄり＝〔（ΔＯＤ
４．。ｘ５．Ｏ）／（７，０Ｏｘ３．０Ｏｘ０．５）　
）×希釈倍率 ΔＯＤ４．。＝ＯＤ４ｅ。（試料）　　００４１１゜（
盲検）上記式において、　７．００はモル吸光係数（ｍ
ｎ＋ｏｌ／ｃｍ）を、　５．００は反応液量（ｄ）を、
３．０は反応時間（ｎ＋ｉｎ）を、そして、０．５は酵
素試料液量（−）を示す。

パー料シダーゼ活性（ｕｎｉｔ／ｇカルスまたは植物体
生重量）＝　（（ｕｎｉｔ／５ｄｉ）　ＸＡ　）　／Ｂ
＾＝カルス（植物体）破砕液ｉｔ（威）Ｂ＝カルス（植
物体）の生型１　（ｇ）尖詣皿ｌ （カルス培養物からのパーオキシダーゼの単離・精製） 実施例１で得られた。シバおよびオニシバのパーオキシ
ダーゼ高生産性カルスそれぞれ１０ｇ採取し、培養を行
なった。この培養は、シバのカルスについてはＭＳ液体
培地（２，４−Ｄを２．ＯＸＩＯ−ｈＭの割合で、そし
て、カイネチンを５．０Ｘ１０−’Ｍの割合で含有）、
オニシバのカルスについてはＬＳｉＳ培体（２，４−Ｄ
を３．０Ｘ１０−’Ｈの割合で、そして。

カイネチンを５．ＯＸＩＯ′″７Ｍの割合で含有）を用
いて行った。上記液体培地２００−をそれぞれ５００Ｉ
ｄのマイヤーフラスコに入れ、上記カルスを移植し。

１１０ｒｐａ＋で１週間振盪培養した。培養物を分離し
。

５０ｇ（生型Ｉ）のカルスおよび１８０ａｄ！の培地液
を回収した。得られたカルス１０ｇに１抛Ｈリン酸緩衝
液（ｐＨ７）ＩＱＱｍｇを添加し、テフロンホモジナイ
ザーを用いて十分に破砕した。この破砕液を４℃にて１
５分間、　５０００ｘ　ｇで遠心分離してその上清を回
収した。得られた上清液を７０χ硫酸アンモニウム（硫
安）テ塩析り、　５１１１Ｍ　’）　７酸緩衝液（ｐＨ
７）　５０ｄに溶解させ、　５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７）に対して４℃で２０時間透析して脱塩した。この溶
液を５１リン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した陽イオン
交換樹脂ＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂ　　（ファルマ
シア社製）に吸着させた後、濃度勾配溶出法によりＮａ
Ｃ１濃度を０．１〜１．０Ｍとして溶出を行った。パー
オキシダーゼ活性のある画分１００Ｉｎ１を集め、この
両分を１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に対して４°Ｃで
１０時間透析することにより脱塩した。この溶液を凍結
乾燥し、パーオキシダーゼ精製標品を得た。得られた精
製標品の量は、シバのカルスを用いた場合カ４５ｍｇ、
オニシバのカルスを用いた場合が５０Ｂであった。

上記培養液からカルスを除去して得られた培地液には、
直接７０％硫安を添加して塩析した。この硫安塩析で得
られた沈澱について、上記カルスのホモジナイズ液から
得られた硫安塩析沈澱物と同様に、透析、陽イオン交換
クロマトグラフィー。

および凍結乾燥を行い、パーオキシダーゼ精製標品を得
た。得られた精製標品の量は、シバの培地液を用いた場
合が５■、オニシバの培地液を用いた場合が１０ｍｇあ
った。

このようにして得られた精製標品のパーオキシダーゼ活
性は、シバおよびオニシバのいずれの場合にもカルスか
らの標品については５０Ｑｕｎｉｔ／■。

そして培養液からの標品については４００ｕｎｉｔ／＋
ｍｇあった。

（発明の効果） 本発明によれば、シバおよび／またはオニシバの植物体
から誘導されたカルスから、高品質のパーオキシダーゼ
が効果的に、かつ安定的に得られる。人為的に得られた
カルス培養することによりパーオキシダーゼの製造が行
われるので、天候。

地域による土壌や気候の差、収穫時期などの植物栽墳条
件に影響されず、かつ、広い耕地面積を必要とせずに大
量に高品質のパーオキシダーゼが得られる。このように
して得られるパーオキシダーゼは、各種臨床検査試験や
化学分析試薬として利用される。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、シバ（￥Ｚｏｙｓｉａ￥￥ｊａｐｏｎｉｃａ￥）お
   よび／またはオニシバ（￥Ｚｏｙｓｉａ￥￥ｍａｃｒｏ
   ｓｔａｃｈａ￥）の植物体組織片または細胞を栄養培地
   で培養した培養物からパーオキシダーゼを単離する工程
   を包含する、パーオキシダーゼの製造法。 ２、特許請求の範囲第１項に記載の製造法により得られ
   るパーオキシダーゼ。