JPS62138188A - パ−オキシダ−ゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

パーオキシダーゼは、過酸化水素などの存在干て有機化
合物を酸化」−る酵素であり、酵素反応が鋭敏なことか
ら、臨床検査用試薬や化学分（１７用試・す３．３Ｓら
（、冒よモノクロナール抗体と結合させた特５°４的ム
゛Ｒ；ｊ’（物質の検出用試薬、あるい！Ｊ：　ｒＪ゛
機化金化合物化反応を・行なう］＼イオリアクターなど
に使用される１１’ｉ、要な酵素てある。　土ノニ、酵
素免疫試験法におｉする標識酵素と１−２てち使用さイ
１ている。 本発明は、植物組織培谷法を参り用したパーオキシダー
ゼの製造法に関するｔ）のである３、

【従来の技術】

従来、旧訳の如き試薬等に使用されるパーオキシダーゼ
としては、その給椋としてｉ、＋７ら１フサビダイコン
が用いられ、通常に栽培された該植物体から抽出するこ
とにより製造されていた。　　また、ル１！ネレ−ノサ
ピダイコンか通常の農業的栽培法によると、天候、地域
、収穫、時期等によりその生産性及び品質が不安定にな
り、多量生産のためには広い農地を必要とするという問
題点があったが、これを解消するため、ワサビダイコン
属に属する植物を起源とし、この組織片を組織培養して
得た培養物からパーオキシダーゼを採取４゛る方法（特
開昭５９、−、２８４７３号）も知られている。

【発明が解決しようとする問題点】

パーオキシダーゼはワサビダイコン、ダイコン、カブな
ど植物界に広く存在するが、工業的生産には、パーオキ
シダーゼ含晴が高いことから専らワサビダイコンを使用
し、これに依存している。 本発明者らは、ワサビダイコン以外の植物体から高収率
でパーオキシダーゼを生産する方法を提供することを目
的とするものであり、しかも、天候・地域・収穫・時期
等に左右され４ゞ、栽培のための広い農地を必要とせず
、人為的に管理された条件下で、生産性及び品質が常に
安定的に生産されるパーオキシダーゼ及びその製造法を
提供オろことを目的と一４′るちのである５、

【問題点
を解決４゛ろ八めの丁・没】 本発明者らは、植物体のパーオキシダーゼ生産効率を改
善するため、植物体の組織ｊ１１または細胞からカルス
（無定形細胞塊）を誘導し、カルスを培養−４゛ろこと
によって生産されるパーオキシダーゼに９いて研究を行
ったところ、多種の植物体のうち、ヨ・”Ｊ　４１゛イ
（益菜、学名；ｌｐ。 ｍｏｅａ　ａｑｕａＬｉｃａ　Ｆｏｒｓｋ）の植物体組
織片または細胞から誘導したカルスが、培養によ−、て
パーオキシダーゼを高率で生産することを１）シい出（
−７、本発明を完成するに〒−）たものである。 すなわち、本発明は、ヨウサイ（４菜、学名；Ｔｐｏｍ
□ｅａ　ａｑｕａｔｉｅａ　Ｆｏｒｓｋ）の植物体から
分離１．た組織片または細胞を栄養培地に培養し、得ら
れた培養物からバーオギンダーゼを採取することを特徴
とするパーオキシダーゼの製造法であり、また、ヨウサ
イ（維菜）の植物体から分離した組織片または細胞を栄
養培地に培養し、得られた培養物から採取されるパーオ
キシダーゼである。 本発明で用いられるヨウサイ（＃ｌ菜、学名；　Ｉｐｏ
ｍｏｅａａｑｕａｔｉｃａ　Ｆｏｒｓｋ）は、ヒルガオ
科に属４″ろ植物であり、アザガオナ、竹葉菜などども
呼ばれ、英名をウォーター・コンポルプラス（Ｗａｔｅ
ｒ−Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ）という１−例えば、「食
用植物図説Ｊ（１９７０，６，１５）、女子栄養大学出
版部、ｐ、１１７］。 呼ばれている。　専ら、東南アジア諸国（特にタイ国）
や中国においてｌ］常の食用に供されている野菜の一種
であるが、この植物体にパーオキシダーゼ活性を有する
酵素が含まれていることは、従来、全く知られていなか
った。 ４一 本発明者らは、更にこのヨウサイの芽ばえ植物体につい
ても研究を進めたところ、茎部、条部にはパーオキシダ
ーゼ活性は認められなかったが、根部に微ｔｉ１のパー
オキシダーゼ活性が認められ、ま人−ヨウサイの植物体
の各部位から誘導して得たカルスには強））なパーオキ
シダーゼ活性を有する酵素が含（了されていることを発
見ｊ、た３、本発明は、かかる新発見に１１（、づくち
のである。 本発明で述べろ組織片または細胞を栄養培地に培養し得
られた培養物とは、以下に述べるように、植物体の組培
地成分の混合物を示すものである。 本発明において、ヨウサイの植物体からカルスを誘導す
るには、通常の植物組織培養法によ−）で実施−４゛る
こと　１ができる。　例えば栄養培地としては、１表　
１−１に示した組成の培地を使用することができる。 植物ホルモンとしては、インドール酢酸、インドール酪
酸、ナフタレン酢酸、２．４ジクロロフエノキシ酢酸な
どが適宜利用される１、　」［た、−’、ｌ゛、ｒ　ｌ
・カイ、〕−ンとしては、カイネチン、ペンヂルアデー
ンなとが使用できる。 また、これらの植物ホルモンやサイ）・カイエンの組合
わせによって、増殖ヤ１をもったカルスを誘導するごと
ができる。　増殖性のカルスの培養には、［−表　１］
に示した組成の培地で６．１；いか、史に増殖性を改善
−・１゛るためには、ジャカイモ抽出液、麦牛抽出液、
酵母抽出液、カゼイン加水分解物などの天然イー＋’［
栄負隙を添加−４゛ろことか有効である。　主人二る炭
素源と１−２では、ブドウ糖、ソー１糖などが用いられ
、窒素源にはアンモニア態窒累、硝酸態窒素が植物細胞
に、１：り効率的に吸収される。　培養温度は２０〜３
５℃で操作できるが、好ましくは２８〜３２°Ｃてあ培
養してｉすたカルス等の培養物から、酵素の抽出には、
機械的、あるいは超音波によって細胞を破砕し、水溶液
として抽出することで回収される。　抽出液からの酵素
の精製は、通常の生化学研究で用いられている手段、す
なわち、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー、等電点電気泳動クロマトグラフィー
などの組合わせによって行うことがｉｉＪ能である。 次に、本発明の方法を工程を追って説明する。 ａ、無菌的な状態で成育した植物体芽ばえの調製。 ７５％エタノール水溶液に数秒浸漬したヨウサイの種子
を、殺菌水で洗浄し、ペトリディッンコ中の殺菌水に−
・夜浸漬して水を吸収させる。　この処理により、種子
は膨潤し、発芽が迅速に行なわれるようになる。　つい
で種子を０１％ベンザルコニウムクロライド（市販の殺
菌剤）液に２分間浸漬して、種子に４＝１着している微
生物を殺菌する。　ごれを殺菌水でよく洗浄ｊ、への」
Ｃ１史に１％次＋１１１塩累酸すトリウムに０８１％の
界面活性剤ツイーン２０を加えた殺菌剤液によ−て３０
分間処理１２、種ｒ−を完全に殺菌する。 あらかじめ、ふた（＝１広［−１ヒンし１表・１］の組
成の培地に０．８％寒天を加えて殺菌調製した寒天培地
を作成しておき、無菌的操作によ−）て、殺菌処理をし
たヨウサイの種子を播種する９、　こＡ１を２８℃の恒
温室で蛍光灯のもとて１週間放置４゛るごとによ−）で
、無菌的にヨウサイの飼ばえを調製することができる。 ｂ、植物由来のカルスの誘導 表１に示した組成の培地に、植物ポル佇ンとして、ナフ
タレン酊Ｉ酸Ｉ　ＸＩＦ”Ｍ、サイ！・カイエンと１７
で、ペンデル）′アニンｌＸｌ０−’ た培地をべｌ・リディソンコに分注１〜て固化し２、こ
れに無菌的に；Ｊ．’Ｊ製し１人Ｚ　Ｒ　−、’ｔ　４
１°イの牛ばえの切断片を移殖したのち、温度２８°Ｃ
の恒温室において暗所で培養を行う。　　１週間から１
０日後に、植物切片の切り口より、細胞が増殖し、カル
スを形成する。　このカルスを、適宜、同じ組成の培地
に継代ずれば、カルスを大きく育てることが可能である
。 Ｃ，カルスの増殖培養 誘導したカルスを［表・ｌ］に示した組成の培地にナフ
タレン酢酸ｌＸｌ０−５〜Ｉ　Ｘ　ｔｏ−’Ｍ、ペンデ
ルアデニンｌＸ１０”−５〜ＩｘｌＯ−６Ｍ、寒天０．
８％を含む培地に移植し、暗所にて、温度２５〜３２℃
、好ましくは、２８℃で培養を行うことによって、カル
スの増殖培養ができる。 ｄ、パーオキノダーゼ含有カルスの調製カルスの増殖培
養を行ったのら、更に培養を継続すると、カルスの増殖
は次第に低下すると共に、カルスは淡い褐色のやや固い
細胞集塊に分化する。 このようにして分化した細胞集塊中に（」、パーオキシ
ダーゼの活性が生成している。 ｅ、パーオキシダーゼの分析 淡い褐色の細胞集塊をブレンダーなどによって機械的に
破砕したの１″）、石英砂と共に磨砕する。　これを５
０ｍＭリン酸緩衝液（１１１１１６，７）によって抽出
したのち遠心分離法によ−）で細胞抽出液を採取オろ。 　パーオキシダーゼ活性の測定法は、常法［例えば、山
田原２編著「植物細胞培養マユ５アルＪ、（１９８４，
１０，１）講談社、　ｐ、８５］により行うことができ
る。　研究用試薬として市販されているパーオキシダー
ゼ標品（ノグマ社製）を標べ「（とじて、濃度を算出す
る。 ｆ、パーオキソダーゼの単離精製 培養して得た細胞集塊をブレンダーで破砕したのち、石
英砂と共に磨砕し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６゜７
）により抽出する。　これを硫安塩析法により８０％硫
安沈澱分画を遠心分離法により調製する。　少量の水に
溶解し、５０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析して脱塩す
る。　これを陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフ
ィーにかけてパーオキシダーゼの活性分画を採取し、更
に濃縮した後に、ゲル濾過クロマトグラフィーにより精
製を行い、パーオキシダーゼ活性の濃縮された分画を取
得する。　これらの操作は、酵素や蛋白質の精製の常法
に、につで行うことができる。 以」二の如くして、ヨウサイの芽ばえ植物体の各部位か
ら誘導・培養されたカルスについて、採取された各パー
オキシダーゼ（ＰＯと略記）含有量を１表・２］に示す
。 以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、
この実施例、および−１−述の説明「ａ〜１′」らは単
なる例示であって、本発明を限定４−るものでｉＪ：　
ｊ＊：い。

【実施例】

実施例１゜ 前年度に採取したヨウサイの種子１０個を用意した。 ７５％エタノール液に数秒間浸漬したのち、殺菌した蒸
留水で２回水洗いした。　別に用きした０１％ベンザル
コニウムクロライド液（ＩＪ゛糟化学産業株式会社製品
）に２分間浸ｔδした。　殺菌した水で３回水洗いした
のち、１％次亜塩素酸すトリウム（和光純薬製）、０．
１％ツイーン２０（和光純薬製）を含む殺菌剤液に３０
分間浸漬し、更に、種子を殺菌水で３回洗浄した。　３
０ｃｍ夕の広［］ビンに「表・Ｉ」の組成の培地に０８
％寒天を加えた培地を調製し、１２０℃１５分殺菌した
のち、冷却して固化させた。　　これに、前記の殺菌し
た種子１０個を播種したのち２８°Ｃの恒温室で２０ワ
ツトの蛍光灯の光のもとて７日間培養したところ、長さ
５〜３ｃｍの才ばえ８本が得られた。 ［表　１］に示した組成の培地を１，２ρ調製した。　
　これを６等分し、それぞれの２００１に０，８％寒天
と、［表３１に示した実験条件のナフタレン酢酸、ヘン
デルアデニンを添加したのら、］２０℃１５分間殺閑１
ｊこ。殺菌かいうちに、それぞれの培地を、直径１０ｃ
ｍのガラス製ペトリディッンコに６枚に３０７７（！充
分注し、固化させた。　　１．述の如くして予め調製し
たヨウサイの芽ばえを無菌操作によって、５〜７ｘａの
切片に切断し、こわを６種類の寒天培地の−にに移植し
た。　２８℃に維持（、へ恒温室の暗所に１０Ｆ１間置
いて、植物切片からのカルスの誘導を行−３た結果、［
表・３コの結果を得た。 予め、１表　四の組成の培地にベンジルアデニンをＩＸ
　１０−５Ｍ、ナフタレン酢酸をｌ　ｘ　１０−’Ｍ、
寒天を０．８％を含む培地２０ｈ＋（７を殺菌；１ｌｌ
Ｊ製し、直径１０ｃｍのガラス製ぺ）・リディッンコに
分注同化させた。　これに、１−述の如くして誘導した
カルス５個（［表・３］大実験号Ｃ）を各１ケ宛、ペト
リディッシコの培地に移植乙だ。　２８℃の恒温室の暗
所にて１４　（’］間培養を行なった。　最初の７日間
はカルスの増殖が観察されたが、次第にカルスは淡い褐
色の細胞集塊に分化した。　１４日後に５個のカルスを
秤量した。　カルスを乳ばちに取り、１ｇの石英砂を加
えて５分間磨砕したのち、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ＋
１６１）を５屑ρ加えてパーオキシダーゼを抽出した。 　これを３，０００４（１１定した結果、「表・４］の
結果を得た。 −Ｌ述の如くして、調製したパーオギンダーゼ含（Ｊ゛
の抽出液１５ｍＱ（パーオキソグーゼＩａ１９．４朽）
を８０％硫安塩折した後ｇ、ｏｏｏ回転／分で沈澱を回
収した３、　　５ｍ１７の蒸留水に溶解したのら、５．
０ｍＭのリン酸緩衝液に対して３０時間の透析を４°（
ｊにおいて行った。　　ｒ・め準備ｊ−た陰イオン交換
樹脂（１）ＥＡＥセファロースＣＩ、−６Ｂ、ファルマ
シア社製）のカラノ・（長さ３０ｃｍ）に吸首さＵだの
ち、５０ｍＭリン酸バッファーを用いる食塩濃度勾配溶
出法によって溶出した。　パーオギンダーゼ活性を分析
１５、活性を含む分画を集め２１ｍ１ｊを得た。　ごの
液中にはパーオキシダーゼが１５．１ｍｇ含まれていた
。

【発明の効果】

本発明によれば、非特異的パーオキシダーゼの大川生産
において、従来は（１ｊ、らワザヒダイ：Ｉンに依存し
ていたのに対し、ワザヒダイコン以外の植物体から高収
率でパ−オキシダーゼを生産することができる。　　し
かも、人為的に誘導・培養したカルス培養物から採取す
るので、天候・栽培地域・収穫・時期等に左右されず、
栽培のための広い農地を必要とせず、生産性及び品質が
常に一定の均質なパーオキソダーゼを得ることができる
。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヨウサイ（■菜、学名；Ｉｐｏｍｏｅａ　ａｑｕ
   ａｔｉｃａ　Ｆｏｒｓｋ）の植物体から分離した組織片
   または細胞を栄養培地に培養し、得られた培養物から採
   取されるパーオキシダーゼ。
2. （２）ヨウサイ（■菜、学名；Ｉｐｏｍｏｅａ　ａｑｕ
   ａｔｉｃａ　Ｆｏｒｓｋ）の植物体から分離した組織片
   または細胞を栄養培地に培養し、得られた培養物からパ
   ーオキシダーゼを採取することを特徴とするパーオキシ
   ダーゼの製造法。