CN102283112B

CN102283112B - 班克木培养基及组织培养与快速繁殖方法

Info

Publication number: CN102283112B
Application number: CN 201110164827
Authority: CN
Inventors: 潘会堂; 马琳; 张启翔; 王佳; 程堂仁; 孙明
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2011-06-17
Filing date: 2011-06-17
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2031-06-17
Also published as: CN102283112A

Abstract

本发明提供了用于班克木的培养基，以及班克木的组织培养与快速繁殖方法。所述班克木专用培养基为改良WPM培养基，包含下列元素成分：NH₄NO₃，200～400mg/L；Ca(NO₃)₂₄H₂O，250～600mg/L；KCl，400～900mg/L；CaCl₂₂H₂O，90～200mg/L；MgSO₄，180～400mg/L；所述班克木组织培养与快速繁殖方法，包括外植体的消毒和无菌苗的获得，腋芽诱导和继代培养，生根培养和试管苗移栽。本发明提供的班克木培养基和组织培养方法极大地提高了班克木的繁殖系数和生根率，建立了一套完整的快速繁殖技术体系，为班克木的大面积推广应用提供了技术支持。

Description

班克木培养基及组织培养与快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养的培养基，具体地，涉及用于班克木的培养基，以及班克木的组织培养与快速繁殖方法。

背景技术

班克木是山龙眼科的灌木或小乔木，主要分布于澳大利亚东南及西南沿海地区，适于生长在沙土、沙壤土或者覆沙的沙岩上。它是一种新型木本花卉，其叶、花和球果都是做干花的极好材料。关于班克木的繁殖方法，目前主要为播种繁殖和扦插繁殖，但受季节和气候条件的限制，繁殖系数很低，在资源有限的条件下不能在生产中大量推广。而组织培养是快速繁殖优良植物品种的一条重要途径，尤其是繁殖某些稀有植物或有较大经济价值的植物，对于植物种质资源的保存，有很大的优势。

如果采用组织培养的方法繁殖班克木，由于该植物特殊的生长环境，对温度、光照和营养元素的需求均较高，温度过高或光照强度过低都会导致组织培养苗的生长不良。迄今尚未发现适用于班克木的培养基，更没有见到文献报道运用组织培养方法对班克木进行快速繁殖，尤其是其种苗的继代，腋芽的诱导和生根。

因此需要研究班克木的专用培养基，以及它的组织培养方法，提供一套完整的快速繁殖技术体系。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术空白，提供用于班克木的培养基，能够完成班克木的组织培养，建立一套完整的快速繁殖技术体系。

为了实现本发明的目的，本发明所提供一种班克木专用培养基，可用来进行组织培养，它是一种改良WPM培养基，即在WPM基本培养基的基础上对各大元素进行调整，具体包含下列元素成分：NH₄NO₃，200～400mg/L；Ca(NO₃)₂₄H₂O，250～600mg/L；KCl，400～900mg/L；CaCl₂₂H₂O，90～200mg/L；MgSO₄，180～400mg/L。

优选地，所述改良WPM培养基包含下列元素成分：NH₄NO₃，400mg/L；Ca(NO₃)₂4H₂O，556mg/L；KCl，894.5mg/L；CaCl₂2H₂O，192mg/L；MgSO₄，370mg/L。

优选地，所述改良WPM培养基包含下列元素成分：NH₄NO₃，200mg/L；Ca(NO₃)₂4H₂O，278mg/L；KCl，447.25mg/L；CaCl₂2H₂O，96mg/L；MgSO₄，185mg/L。

所述改良WPM培养基具体可用作班克木接种后的继代培养。

本发明的还提供了一种用于班克木组织培养的腋芽诱导培养基，其元素成分包括：在所述改良WPM培养基的基础上添加生长调节剂。

其中，所述班克木腋芽诱导培养基中添加的生长调节剂选自：0.5～1.5mg/l IBA(乙哚丁酸)、0.5～1.5mg/l 6-BA(6-苄基腺嘌呤)、0.5～1.5mg/l NAA(萘乙酸)、0.05～0.15mg/l 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和0.1～0.3mg/l TDZ(苯基噻二唑基脲)中的任一种或多种。

本发明还提供了一种用于班克木组织培养的生根培养基，其元素成分包括：在所述改良WPM培养基的基础上添加生长调节剂和活性炭(AC)。

其中，所述班克木生根培养基中添加的生长调节剂选自：0.5～1.5mg/l IAA(吲哚-3-乙酸)、0.5～1.5mg/l IBA(乙哚丁酸)、0.5～1.5mg/l KT(激动素)和0.5～1.5mg/l NAA(萘乙酸)中的任一种或多种。

本发明的另一目的是提供了一种班克木组织培养与快速繁殖方法，包括如下步骤：外植体的消毒和无菌苗的获得，腋芽诱导和继代培养，生根培养和试管苗移栽。在无菌苗的获得，腋芽诱导和继代培养及生根培养阶段中使用的培养基包括所述改良WPM培养基。

其中，班克木组织培养的光照条件为自然散射光2500～3000Lux加人工辅助光2000～2500Lux，光照时间为14h/d。该光照条件和光照时间应用于班克木组织培养的每一个培养阶段(除外植体的消毒不需要光照之外)。

其中，班克木组织培养的培养温度为20～23℃，该温度应用于所述无菌苗的获得，腋芽诱导和继代培养及生根培养阶段；试管苗移栽的移栽温度为18～25℃。温度过高或过低都不利于试管苗的成活，夏季不宜进行试管苗的移栽。

其中，所述外植体的消毒和无菌苗的获得包括：选用种子为外植体，在无菌条件下用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗5～6次，再用质量比为0.1％的升汞溶液消毒4～10min(不同种的消毒时间不同)。接种至MS培养基中；1个月后移至所述改良WPM培养基中继代。

其中，所述的腋芽诱导和继代培养的具体步骤为：在所述改良WPM培养基中继代1个月后，取无菌苗茎段在所述班克木腋芽诱导培养基或添加生长调节剂的MS培养基中。之后移至相同培养基(腋芽诱导过程中所用培养基)中增殖，继代2～3次。

其中，添加于MS培养基中的生长调节剂同班克木腋芽诱导培养基中所述生长调节剂。

其中，所述的生根培养和试管苗移栽的具体步骤为：将腋芽转移至所述班克木生根培养基中进行生根。生根30～40天后，炼苗3～4天后，移栽至珍珠岩、草炭基质中培养，保持湿度高于80％，每天喷水2～3次。

其中，珍珠岩与草炭的体积比为1∶1～3∶1，优选1∶1。

其中，班克木组织培养过程中所用培养基pH值均为5.9～6.0，优选5.95。

本发明提供的班克木培养基，其优点在于：第一，针对班克木对磷元素极为敏感的特点，所用培养基中不含磷元素，有效提高了种苗质量；第二，钙离子加倍，极大缓解了种苗枯梢现象。

用本发明的组织培养与快速繁殖方法培养班克木，营养元素、光照和温度条件都非常适宜，1个月内的增殖系数就能够达到3以上，2个月的增殖系数最高更是达到了6～7；生根率最高可以达到87％以上，最低也超过了53％，移栽成活率为100％，极大地提高了班克木的繁殖系数，缩短成苗周期，又可降低成本，为今后大面积园林应用和工厂化育苗提供了有效的方法；同时，以茎段为材料进行快速繁殖对植株的破坏性不大，而且可以在短时间内获得大量的再生植株；通过诱导腋芽再生的试管苗生长健壮，对后期的生长观察发现，基本能保持班克木的优良种性不变，为稀有品种的培育提供了保障。

与传统的班克木扦插和种子繁殖方法相比，本发明班克木组织培养和快速繁殖方法的优点在于：

1.极大地提高了班克木的繁殖系数和生根率(传统繁殖方法的繁殖系数小于1.0，生根率国际水平为30％左右，国内水平为20％左右)，并且繁殖周期缩短，方法快速有效，为科研研究和生产栽培提供了技术支持。

2.通过组织培养与快速繁殖得到的幼苗生长健壮，叶色浓绿，一致性强，成苗容易，适应性强，病虫害少，品质优质，易于管理；

3.利用组织培养与快速繁殖方法繁育班克木，不受季节与气候的限制，从而缩短了育苗周期，增加了繁育量，为班克木的大面积推广应用提供了技术支持。

附图说明

图1是培养温度为20～23℃，班克木在接种种子1个月后长成的无菌苗。

图2是培养温度为20～23℃，班克木接种茎段2个月后腋芽在继代培养基中的情况。

图3是培养温度为20～23℃，班克木在生根培养基中的生根情况。

图4是移栽温度为18～25℃，班克木再生植株移栽后的生长情况正上方拍摄照片。

图5是移栽温度为18～25℃，班克木再生植株移栽后的生长情况侧面拍摄照片。

图6是培养温度为18～20℃以及23～27℃，班克木在接种种子1个月后长成的无菌苗。

图7是培养温度为18～20℃以及23～27℃，班克木接种茎段2个月后腋芽在继代培养基中的情况。

图8是培养温度为18～20℃以及23～27℃，班克木在生根培养基中的生根情况。

图9是移栽温度为25～29℃以及18℃以下，班克木再生植株移栽后的生长情况正上方拍摄图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

配制1号改良WPM培养基，所用的大量元素成分包括：NH₄NO₃，400mg/L；Ca(NO₃)₂4H₂O，556mg/L；KCl，894.5mg/L；CaCl₂2H₂O，192mg/L；MgSO₄，370mg/L。

配制2号改良WPM培养基，所用的大量元素成分包括：NH₄NO₃，200mg/L；Ca(NO₃)₂4H₂O，278mg/L；KCl，447.25mg/L；CaCl₂2H₂O，96mg/L；MgSO₄，185mg/L。

光照条件为自然散射光2500～3000Lux加人工辅助光2000～2500Lux，光照时间为14h/d。该光照条件和光照时间应用于班克木组织培养的每一个培养阶段(除外植体的消毒不需要光照之外)。

班克木组织培养的培养温度为20～23℃，该温度应用于下述无菌苗的获得，腋芽诱导和继代培养及生根培养阶段；试管苗移栽的移栽温度为18～25℃。

温度和光照对于腋芽的诱导和组织培养苗的生长起到非常关键的作用，温度过高或光照强度过低都会导致组织培养苗生长不良。

组织培养苗在20～23℃条件下生长健壮，真叶较多且叶色浓绿，下胚轴短而粗，根粗壮，根毛多(如说明书附图中图1～图3所示)。18～20℃以及23～27℃条件下生长状况不良，不易出真叶且叶色淡绿或发黄柔弱，下胚轴细而长，根细弱且根毛较少(如说明书附图中图6～图8所示)。

移栽苗在18～25℃条件下长势良好，生长迅速，叶色浓绿，根系健壮(如说明书附图中图4、图5所示)。25～29℃条件下叶片发黄、干枯直至死亡，18℃以下没有生长迹象(如说明书附图中图9所示)。

下述班克木组织培养过程中所用培养基pH值均为5.95。

取班克木种子为外植体，在无菌条件下先用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗5～6次，再用0.1％升汞溶液消毒6～10min，无菌水冲洗5～6次，升汞消毒时间梯度：6min、8min、10min；接种至MS培养基中，每瓶接种1个；1个月后移至2号改良WPM培养基中继代，每瓶接种3个。统计结果显示，升汞溶液消毒时间为10min时污染最低，可降至1.3％，时间过长会使种子致死，时间过短污染率较高。具体统计数值请见下表：

试验编号	处理方法	污染率(％)
			1	75％酒精+0.1％升汞6min	10
2	75％酒精+0.1％升汞8min	9.1
			3	75％酒精+0.1％升汞10min	1.3

以获得的无菌茎段为外植体进行腋芽诱导和继代培养：选取生长健壮的1.5cm左右的茎段，接种在添加1.0mg/l IBA(乙哚丁酸)和1.5mg/l 6-BA(6-苄基腺嘌呤)的班克木腋芽诱导培养基上，每瓶接种3个。培养20天，腋芽不断出现并迅速长大，30天后腋芽逐渐健壮并长成1cm左右的茎段。统计结果显示，在添加1.0mg/l IBA和1.5mg/l 6-BA的培养基上接种2个月后，平均每个茎段能诱导出10～20个腋芽，其中有5～6个腋芽长成可切取继续在相同的培养基中增殖和继代的茎段。在这样的培养条件下，试管苗2个月的增殖系数达到6～7。具体统计数值请见下表：

注：+：丛生芽发育较好；++丛生芽发育良好；+++：丛生芽发育很好；增殖培养1个月后统计数据。

当腋芽在上述增殖培养基上长出15～20片叶子，高度达到1.5cm左右时，切去基部褐色部分，转移至添加1.5mg/l IAA(吲哚-3-乙酸)和1.0g/l AC(活性炭)的班克木生根培养基上。20天后开始有根逐渐出现，接种30天后生根率可达87.4％。

组织培养苗平均每株生根5～6条，根长达到1cm时，即可开始为移栽作准备。试管苗炼苗3～4天后，移栽至珍珠岩∶草炭为1∶1(体积比)的基质中，试管苗移栽后保持湿度80％以上，每天喷水2～3次，2周以后即可逐步进行正常管理。

实施例2

配制2号改良WPM培养基，所用的大量元素成分包括：NH₄NO₃，200mg/L；Ca(NO₃)₂₄H₂O，278mg/L；KCl，447.25mg/L；CaCl₂₂H₂O，96mg/L；MgSO₄，185mg/L。

培养光照条件为自然散射光2500～3000Lux加人工辅助光2000～2500Lux，光照时间为14h/d。该光照条件和光照时间应用于班克木组织培养的每一个培养阶段(除外植体的消毒不需要光照之外)。

下述班克木组织培养过程中所用培养基pH值均为5.95。

取班克木种子为外植体，在无菌条件下先用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗5～6次，再用0.1％升汞溶液消毒4～8min，无菌水冲洗5～6次，升汞消毒时间梯度：4min、6min、8min；接种至MS培养基中，每瓶接种1个；1个月后移至2号改良WPM培养基中继代，每瓶接种3个。统计结果显示，升汞溶液消毒时间为8min时污染可降为0，时间过长会使种子致死，时间过短污染率较高。具体统计数值请见下表：

试验编号	处理方法	污染率(％)
			1	75％酒精+0.1％升汞4min	6.2
2	75％酒精+0.1％升汞6min	3.3
			3	75％酒精+0.1％升汞8min	0

以获得的无菌茎段为外植体进行腋芽诱导和继代培养：选取生长健壮的1.5cm左右的茎段，接种在添加1.5mg/l NAA(萘乙酸)的班克木腋芽诱导培养基上，每瓶接种3个。茎段接种在诱导培养基上20天开始，有腋芽不断出现并迅速长大，30天后腋芽逐渐健壮并长成1cm左右新的茎段。统计结果显示，在添加1.5mg/l NAA的培养基上接种2个月后，平均每个茎段能诱导出5～10个腋芽，其中有3～4个腋芽长成可切取继续增殖和生根的茎段。在这样的培养条件下，试管苗2个月的增殖系数达到4～5。具体统计数值请见下表：

当腋芽在增殖培养基上长出5～6片叶子，高度达到1.5cm左右时，切去基部褐色部分，转移至添加1.0mg/l IBA、0.5mg/l KT(激动素)和1.0g/l AC的班克木生根培养基上。20天后开始有根逐渐出现，30天后生根率达53.3％。

组织培养苗平均每株生根5～6条，根长达到1cm时，即可开始为移栽作准备。试管苗炼苗3～4天后，移栽至珍珠岩∶草炭为1∶1(体积比)的基质中，移栽后保持湿度80％以上，每天喷水2～3次，2周以后即可逐步进行正常管理。

以上实施例可以用来培养Banksia ericifolia var.macrantha(欧石楠叶班克木的变种)和Banksia Robur(强力班克木)这两个不同的种。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种改良WPM培养基，其是在WPM基本培养基的基础上对大量元素进行调整，所用的大量元素为：NH₄NO₃，200～400mg/L；Ca(NO₃)₂·4H₂O，250～600mg/L；KCl，400～900mg/L；CaCl₂·2H₂O，90～200mg/L；MgSO₄，180～400mg/L。

2.一种用于班克木组织培养的腋芽诱导培养基，其元素成分包括：在权利要求1所述改良WPM培养基的基础上添加生长调节剂；所述生长调节剂为：0.5～1.5mg/l IBA和0.5～1.5mg/l6-BA，或者0.5～1.5mg/l6-BA和0.5～1.5mg/l NAA。

3.一种用于班克木组织培养的生根培养基，其元素成分包括：在权利要求1所述改良WPM培养基的基础上添加生长调节剂和1.0g/l活性炭；所述生长调节剂为：0.5～1.5mg/l IAA，或者0.5～1.5mg/l IBA和0.5～1.5mg/l KT。

4.一种班克木组织培养与快速繁殖方法，包括如下步骤：班克木种子外植体的消毒和无菌苗的获得，腋芽诱导和继代培养，生根培养和试管苗移栽；其中无菌苗的获得，腋芽诱导和继代培养及生根培养阶段所用培养基包括权利要求1所述的改良WPM培养基；

腋芽诱导和继代培养阶段，在权利要求1所述改良WPM培养基的基础上添加生长调节剂：0.5～1.5mg/l IBA和0.5～1.5mg/l6-BA，或者0.5～1.5mg/l6-BA和0.5～1.5mg/l NAA；

生根培养阶段，在权利要求1所述改良WPM培养基的基础上添加1.0g/l活性炭以及生长调节剂：0.5～1.5mg/l IAA，或者0.5～1.5mg/l IBA和0.5～1.5mg/l KT。

5.根据权利要求4所述的班克木组织培养与快速繁殖方法，其特征在于，在每个步骤中：光照条件为自然散射光2500～3000Lux加人工辅助光2000～2500Lux，光照时间为14h/d。

6.根据权利要求4所述的班克木组织培养与快速繁殖方法，其特征在于，所述无菌苗的获得，腋芽诱导和继代培养及生根培养阶段的培养温度为20～23℃，试管苗移栽的移栽温度为18～25℃。

7.根据权利要求4所述的班克木组织培养与快速繁殖方法，其特征在于，无菌苗的获得包含班克木种子外植体的接种和接种后的继代培养，接种所用培养基为MS培养基；接种后继代培养所用培养基为权利要求1所述改良WPM培养基；所用每个培养基的pH值均为5.9～6.0。

8.根据权利要求4所述的班克木组织培养与快速繁殖方法，其特征在于，腋芽诱导和继代培养所用培养基为添加生长调节剂的MS培养基；所用每个培养基的pH值均为5.9～6.0；添加在MS培养基中的生长调节剂为0.5～1.5mg/l IBA和0.5～1.5mg/l6-BA，或者0.5～1.5mg/l6-BA和0.5～1.5mg/l NAA。

9.根据权利要求4～8任一项所述的班克木组织培养与快速繁殖方法，其特征在于，所述班克木种子外植体的消毒包括：选用班克木种子为外植体，在无菌条件下用75%酒精消毒30s，无菌水冲洗5～6次，再用质量比为0.1%的升汞溶液消毒4～10min。

10.根据权利要求4～8任一项所述的班克木组织培养与快速繁殖方法，其特征在于，所述移栽是进行生根培养30～40天后，炼苗3～4天移栽至珍珠岩和草炭混合成的基质中培养，移栽温度为18～25℃。