CN109832193A

CN109832193A - 鹅观草成熟胚愈伤组织诱导和再生的培养方法

Info

Publication number: CN109832193A
Application number: CN201711212989.2A
Authority: CN
Inventors: 赵彦; 胡有林; 高翠萍; 云岚; 石凤翎; 解继红
Original assignee: Inner Mongolia Agricultural University
Current assignee: Inner Mongolia Agricultural University
Priority date: 2017-11-28
Filing date: 2017-11-28
Publication date: 2019-06-04
Anticipated expiration: 2037-11-28
Also published as: CN109832193B

Abstract

本发明公开了一种鹅观草成熟胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其包括如下步骤：(1)外植体的消毒灭菌处理，(2)诱导愈伤组织的培养，(3)愈伤组织的分化培养，(4)诱导分化芽的生根培养，(5)移栽培养。本发明的优点在于，鹅观草成熟时收获的每粒种子中都包含1个成熟胚，种子可以保存多年，只要有种子可以随时诱导愈伤，解除了取材时间限制；成熟胚诱导愈伤组织时，不需要将成熟胚剥离出来，直接用消毒灭菌处理后的种子即可，简化了操作步骤，降低了操作难度；通过添加一定配比的2，4‑D、KT，可将愈伤组织的诱导率提高到78％；在分化培养到再生培养过程中，通过添加一定浓度配比的6‑BA、KT，使愈伤组织分化率达90％以上，分化苗生根率达97％以上。

Description

鹅观草成熟胚愈伤组织诱导和再生的培养方法

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种鹅观草成熟胚愈伤组织诱导和再生的培养方法。

背景技术：

鹅观草为禾本科鹅观草属下的一个种，是一种常见的草本植物，可作牲畜的饲料，产草量大，可食性高，且其拥有小麦等粮食作物所需的高产、抗病虫害、抗逆等优良基因，可作为麦类作物培育新品种的宝贵资源。

作为具有重要应用价值的优良草种，高效再生体系的构建对建立分子遗传系统至关重要，也是利用基因编辑技术研究基因功能和转基因研究的技术基础。目前，对鹅观草再生方面的研究报道仅有一例，一种高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法(公告号CN103210843A)，首次公开以鹅观草的幼胚为材料诱导愈伤组织，建立了一套高频的幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法。但是，以幼胚为外植体进行愈伤组织诱导和再生的培养存在以下问题：1、取材时间受生育期限制，鹅观草幼胚只能在鹅观草孕穗后期和抽穗初期从活的植物体上取材，不能一年四季随时获得外植体，取材适宜时间仅可持续20天左右，这极其不利于鹅观草高效再生体系构建的研究；2、鹅观草幼胚很小，大约0.5mm×0.5mm，需要借助解剖镜在无菌条件下从未成熟的种子中将其剥离出来，且不能损伤幼胚，所以要求操作人员具备较高的技术水平，操作难度大，不利于大规模扩繁。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种取材不受时间限制、操作步骤简单、诱导率高、生根率高的鹅观草成熟胚愈伤组织诱导和再生的培养方法。

本发明的目的由如下技术方案实施，鹅观草成熟胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其包括如下步骤：(1)外植体的消毒灭菌处理，(2)诱导愈伤组织的培养，(3)愈伤组织的分化培养，(4)诱导分化芽的生根培养，(5)移栽培养；其中，

(1)外植体的消毒灭菌处理：选取颗粒饱满、无病虫害的鹅观草种子，去除所述鹅观草种子的内外稃，之后将所述鹅观草种子置于质量浓度为70％的乙醇中浸泡30～60s，再以无菌蒸馏水冲洗3～5次，得到预处理种子；将所述预处理种子置于种子消毒剂中浸泡2～2.5h，消毒结束后，以无菌蒸馏水冲洗3～5次，得到消毒种子；将所述消毒种子置于质量浓度为5％植物组培抗菌剂中浸泡8～12h，杀菌结束后，得到待诱导种子；

(2)诱导愈伤组织的培养：所述(1)外植体的消毒灭菌处理完成后，将所述待诱导种子置于愈伤诱导培养基上，在温度为24～26℃的条件下，黑暗培养30～60d，愈伤诱导培养结束后，得到愈伤组织；

(3)愈伤组织的分化培养：所述(2)诱导愈伤组织的培养完成后，将所述愈伤组织置于分化培养基上，在温度为24～26℃、光照强度为2200～2500Lx、光照时间为12h/d的条件下，培养至诱导产生分化芽，所述分化培养基每25～30d更换一次；

(4)诱导分化芽的生根培养：所述(3)愈伤组织的分化培养完成后，将所述分化芽置于生根培养基上，在温度为24～26℃、光照强度为2200～2500Lx、光照时间为12h/d的条件下，培养至诱导所述分化芽生根，得到鹅观草根苗，所述分化培养基每25～30d更换一次；

(5)移栽培养：所述(4)诱导分化芽的生根培养完成后，将所述鹅观草根苗移栽至混有蛭石的营养土中，在空气湿度为50～60％、避免强光照的条件下，培养5～7d。

进一步的，在所述(1)外植体的消毒灭菌处理中，所述消毒剂是在质量浓度为3％次氯酸钙添加体积百分数为≤1％的Tween80制得的混合溶液。

进一步的，在所述(2)诱导愈伤组织的培养中，所述愈伤诱导培养基包括如下MS液体培养基、2，4-D、KT、麦芽糖及结冷胶，所述2，4-D的添加浓度为2.0mg/L，所述KT的添加浓度为0.5mg/L，所述麦芽糖的添加浓度为40g/L，所述结冷胶的添加浓度为4g/L。

进一步的，在所述(3)愈伤组织的分化培养中，所述分化培养基包括MS液体培养基、6-BA、KT、蔗糖和琼脂粉，所述6-BA的添加浓度为2.0mg/L，所述KT的添加浓度为0.2mg/L，所述蔗糖的的添加浓度为30g/L，所述琼脂粉的添加浓度为7.5g/L。

进一步的，在所述(4)诱导分化芽的生根培养中，所述生根培养基1/2MS固体培养基。

本发明的优点：1、鹅观草成熟时收获的每粒种子中都包含1个成熟胚，种子可以保存多年，只要有种子可以随时诱导愈伤，解除了取材时间限制；2、成熟胚诱导愈伤组织时，不需要将成熟胚剥离出来，直接用消毒灭菌处理后的种子即可，简化了操作步骤，降低了操作难度，对操作人员技术要求低，有利于大规模扩繁；3、在导愈伤组织培养过程中，添加植物组培抗菌剂(PPM)，能有效抑制内生真菌的生长，有效避免培养污染问题的发生，通过添加一定配比的2，4-D、Kinetin可有效将愈伤组织的诱导率提高到78％；4、在分化培养到再生培养过程中，通过添加一定浓度配比的植物生长调节剂，使愈伤组织分化率达90％以上，分化苗生根率达97％以上。

附图说明：

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为鹅观草成熟胚置于愈伤诱导培养基上培养；

图2为鹅观草成熟胚诱导出的愈伤组织；

图3为愈伤组织在分化培养基上分化成苗；

图4为分化苗置于生根培养基上培养；

图5为分化苗置于生根培养基上的生根情况；

图6为生根分化苗移栽情况。

具体实施方式：

实施例1：

鹅观草成熟胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其包括如下步骤：(1)外植体的消毒灭菌处理，(2)诱导愈伤组织的培养，(3)愈伤组织的分化培养，(4)诱导分化芽的生根培养，(5)移栽培养；其中，

(1)外植体的消毒灭菌处理：选取颗粒饱满、无病虫害的鹅观草种子，去除鹅观草种子的内外稃，之后将鹅观草种子置于质量浓度为70％的乙醇中浸泡30s，再以无菌蒸馏水冲洗3次，得到预处理种子；在(1)外植体的消毒灭菌处理中，消毒剂是在质量浓度为3％次氯酸钙添加体积百分数为≤1％的Tween80制得的混合溶液；将预处理种子置于种子消毒剂中浸泡2h，消毒结束后，以无菌蒸馏水冲洗3次，得到消毒种子；将消毒种子置于质量浓度为5％植物组培抗菌剂中浸泡8h，杀菌结束后，得到待诱导种子；

在常规操作中，一般采用升汞作为消毒剂对种子进行消毒，其使用后的废液需要特殊处理，直接排放会对环境造成严重的污染；但在本实施(1)外植体的消毒灭菌处理过程中，采用次氯酸钙作为消毒剂，确保了药剂使用的安全性，消毒后次氯酸钠易去除，对鹅观草种子损伤小。而在消毒剂中添加的Tween80主要作为乳化剂和增溶剂，增加次氯酸钙在水中的溶解性，避免次氯酸钙发生沉淀，有利于次氯酸钙更好的发挥其消毒作用。同时，在(1)外植体的消毒灭菌处理过程中，采用植物组培抗菌剂杀菌种子中的真菌和霉菌，避免真菌和霉菌的污染，影响后续操作；采用5％的植物组培抗菌剂浸泡8h，后续培养过程中的污染率就可降低至1％以下，消毒杀菌效果好。

(2)诱导愈伤组织的培养：(1)外植体的消毒灭菌处理完成后，将待诱导种子置于愈伤诱导培养基上，在温度为24℃的条件下，黑暗培养30d，愈伤诱导培养结束后，得到愈伤组织；在(2)诱导愈伤组织的培养中，愈伤诱导培养基包括如下MS液体培养基、2，4-D、KT、麦芽糖及结冷胶，2，4-D的添加浓度为2.0mg/L，KT的添加浓度为0.5mg/L，麦芽糖的添加浓度为40g/L，结冷胶的添加浓度为4g/L。

(3)愈伤组织的分化培养：(2)诱导愈伤组织的培养完成后，将愈伤组织置于分化培养基上，在温度为24℃、光照强度为2200Lx、光照时间为12h/d的条件下，培养至诱导产生分化芽，分化培养基每25d更换一次；在(3)愈伤组织的分化培养中，分化培养基包括MS液体培养基、6-BA、KT、蔗糖和琼脂粉，6-BA的添加浓度为2.0mg/L，KT的添加浓度为0.2mg/L，蔗糖的的添加浓度为30g/L，琼脂粉的添加浓度为7.5g/L。

(4)诱导分化芽的生根培养：(3)愈伤组织的分化培养完成后，将分化芽置于生根培养基上，在温度为24℃、光照强度为2200Lx、光照时间为12h/d的条件下，培养至诱导分化芽生根，得到鹅观草根苗，分化培养基每25d更换一次；在(4)诱导分化芽的生根培养中，生根培养基1/2MS固体培养基。

(5)移栽培养：(4)诱导分化芽的生根培养完成后，将鹅观草根苗移栽至混有蛭石的营养土中，在空气湿度为50％、避免强光照的条件下，培养5d。

实施例2：

(1)外植体的消毒灭菌处理：选取颗粒饱满、无病虫害的鹅观草种子，去除鹅观草种子的内外稃，之后将鹅观草种子置于质量浓度为70％的乙醇中浸泡50s，再以无菌蒸馏水冲洗4次，得到预处理种子；在(1)外植体的消毒灭菌处理中，消毒剂是在质量浓度为3％次氯酸钙添加体积百分数为≤1％的Tween80制得的混合溶液；将预处理种子置于种子消毒剂中浸泡2.2h，消毒结束后，以无菌蒸馏水冲洗4次，得到消毒种子；将消毒种子置于质量浓度为5％植物组培抗菌剂中浸泡8～12h，杀菌结束后，得到待诱导种子；

在常规操作中，一般采用升汞作为消毒剂对种子进行消毒，其使用后的废液需要特殊处理，直接排放会对环境造成严重的污染；但在本实施(1)外植体的消毒灭菌处理过程中，采用次氯酸钙作为消毒剂，确保了药剂使用的安全性，消毒后次氯酸钠易去除，对鹅观草种子损伤小。而在消毒剂中添加的Tween80主要作为乳化剂和增溶剂，增加次氯酸钙在水中的溶解性，避免次氯酸钙发生沉淀，有利于次氯酸钙更好的发挥其消毒作用。同时，在(1)外植体的消毒灭菌处理过程中，采用植物组培抗菌剂杀菌种子中的真菌和霉菌，避免真菌和霉菌的污染，影响后续操作；采用5％的植物组培抗菌剂浸泡10h，后续培养过程中的污染率就可降低至1％以下，消毒杀菌效果好。

(2)诱导愈伤组织的培养：(1)外植体的消毒灭菌处理完成后，将待诱导种子置于愈伤诱导培养基上，在温度为25±1℃的条件下，黑暗培养40d，愈伤诱导培养结束后，得到愈伤组织；在(2)诱导愈伤组织的培养中，愈伤诱导培养基包括如下MS液体培养基、2，4-D、KT、麦芽糖及结冷胶，2，4-D的添加浓度为2.0mg/L，KT的添加浓度为0.5mg/L，麦芽糖的添加浓度为40g/L，结冷胶的添加浓度为4g/L。

(3)愈伤组织的分化培养：(2)诱导愈伤组织的培养完成后，将愈伤组织置于分化培养基上，在温度为25℃、光照强度为2400Lx、光照时间为12h/d的条件下，培养至诱导产生分化芽，分化培养基每27d更换一次；在(3)愈伤组织的分化培养中，分化培养基包括MS液体培养基、6-BA、KT、蔗糖和琼脂粉，6-BA的添加浓度为2.0mg/L，KT的添加浓度为0.2mg/L，蔗糖的的添加浓度为30g/L，琼脂粉的添加浓度为7.5g/L。

(4)诱导分化芽的生根培养：(3)愈伤组织的分化培养完成后，将分化芽置于生根培养基上，在温度为25℃、光照强度为2300Lx、光照时间为12h/d的条件下，培养至诱导分化芽生根，得到鹅观草根苗，分化培养基每27d更换一次；在(4)诱导分化芽的生根培养中，生根培养基1/2MS固体培养基。

(5)移栽培养：(4)诱导分化芽的生根培养完成后，将鹅观草根苗移栽至混有蛭石的营养土中，在空气湿度为55％、避免强光照的条件下，培养6d。

实施例3：

(1)外植体的消毒灭菌处理：选取颗粒饱满、无病虫害的鹅观草种子，去除鹅观草种子的内外稃，之后将鹅观草种子置于质量浓度为70％的乙醇中浸泡60s，再以无菌蒸馏水冲洗5次，得到预处理种子；在(1)外植体的消毒灭菌处理中，消毒剂是在质量浓度为3％次氯酸钙添加体积百分数为≤1％的Tween80制得的混合溶液；将预处理种子置于种子消毒剂中浸泡2.5h，消毒结束后，以无菌蒸馏水冲洗5次，得到消毒种子；将消毒种子置于质量浓度为5％植物组培抗菌剂中浸泡12h，杀菌结束后，得到待诱导种子；

在常规操作中，一般采用升汞作为消毒剂对种子进行消毒，其使用后的废液需要特殊处理，直接排放会对环境造成严重的污染；但在本实施(1)外植体的消毒灭菌处理过程中，采用次氯酸钙作为消毒剂，确保了药剂使用的安全性，消毒后次氯酸钠易去除，对鹅观草种子损伤小。而在消毒剂中添加的Tween80主要作为乳化剂和增溶剂，增加次氯酸钙在水中的溶解性，避免次氯酸钙发生沉淀，有利于次氯酸钙更好的发挥其消毒作用。同时，在(1)外植体的消毒灭菌处理过程中，采用植物组培抗菌剂杀菌种子中的真菌和霉菌，避免真菌和霉菌的污染，影响后续操作；采用5％的植物组培抗菌剂浸泡12h，后续培养过程中的污染率就可降低至1％以下，消毒杀菌效果好。

(2)诱导愈伤组织的培养：(1)外植体的消毒灭菌处理完成后，将待诱导种子置于愈伤诱导培养基上，在温度为26℃的条件下，黑暗培养60d，愈伤诱导培养结束后，得到愈伤组织；在(2)诱导愈伤组织的培养中，愈伤诱导培养基包括如下MS液体培养基、2，4-D、KT、麦芽糖及结冷胶，2，4-D的添加浓度为2.0mg/L，KT的添加浓度为0.5mg/L，麦芽糖的添加浓度为40g/L，结冷胶的添加浓度为4g/L。

(3)愈伤组织的分化培养：(2)诱导愈伤组织的培养完成后，将愈伤组织置于分化培养基上，在温度为26℃、光照强度为2500Lx、光照时间为12h/d的条件下，培养至诱导产生分化芽，分化培养基每30d更换一次；在(3)愈伤组织的分化培养中，分化培养基包括MS液体培养基、6-BA、KT、蔗糖和琼脂粉，6-BA的添加浓度为2.0mg/L，KT的添加浓度为0.2mg/L，蔗糖的的添加浓度为30g/L，琼脂粉的添加浓度为7.5g/L。

(4)诱导分化芽的生根培养：(3)愈伤组织的分化培养完成后，将分化芽置于生根培养基上，在温度为26℃、光照强度为2500Lx、光照时间为12h/d的条件下，培养至诱导分化芽生根，得到鹅观草根苗，分化培养基每30d更换一次；在(4)诱导分化芽的生根培养中，生根培养基1/2MS固体培养基。

(5)移栽培养：(4)诱导分化芽的生根培养完成后，将鹅观草根苗移栽至混有蛭石的营养土中，在空气湿度为60％、避免强光照的条件下，培养7d。

实施例4：

一、试验分组设计：

以本发明为试验组、以一种高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法(公告号CN103210843A)为对照组。

二、内生真菌抑制的对比

试验组以5％的植物组培抗菌剂浸泡8～12h杀灭鹅观草种子的内生真菌，再将鹅观草种子接种于愈伤诱导培养基上进行诱导愈伤组织的培养；对照组以添加15mg/L苯莱特(Benlate)的MSD2接种处理后的无菌鹅观草幼胚进行诱导愈伤组织的培养。试验组与对照组在诱导愈伤组织的培养过程中的污染率对比结果，如表1所示。

表1 试验组与对照组在诱导愈伤组织的培养过程中的污染率对比结果

由表1可知，本发明采用5％的植物组培抗菌剂浸泡8～12h杀灭鹅观草种子的内生真菌，在后期诱导愈伤组织的培养的平均污染率为0.5％，与对照组相比，其污染率可降低84.8％，有效避免培养污染问题的发生。

三、愈伤诱导培养基的选择

如图1所示，以鹅观草种子(即成熟胚)为外植体进行愈伤组织诱导培养，愈伤诱导培养基以MS液体培养基为基础，在MS液体培养基中添加浓度为40g/L的麦芽糖，浓度为4g/L的结冷胶；在愈伤诱导培养基中添加不同浓度组合的2，4-D和6-BA对出愈率、愈伤组织出愈状态及褐化率的影响，如表2所示；在愈伤诱导培养基添加不同浓度组合的2，4-D和KT对出愈率、愈伤组织出愈状态及褐化率的影响，如表3所示。

表2 各愈伤诱导培养基对出愈率、愈伤组织状态及褐化率的影响

表3 各愈伤诱导培养基对出愈率、愈伤组织状态及褐化率的影响

由表2可知，在愈伤诱导培养基添加浓度为2.0mg/L的2，4-D和浓度为0.5mg/L的6-BA，外植体的出愈率为56％，愈伤组织出愈状态为乳白、结构紧实，褐化率为7.1％；由表3可知，在愈伤诱导培养基添加浓度为2.0mg/L的2，4-D和浓度为0.5mg/L的KT，外植体的出愈率为78％，愈伤组织出愈状态为乳白、结构紧实，褐化率为3.8％；由表2和表3可知，鹅观草成熟胚在添加浓度为2.0mg/L的2，4-D和浓度为0.5mg/L的KT的愈伤诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养时的出愈率最高、愈伤组织出愈状态最好、同时褐化率相对较大，有利于愈伤组织的分化培养，如图2所示。

四、分化培养基的选择

如图3所示，将鹅观草种子诱导出的愈伤组织接种于分化培养基上，分化培养基以MS液体培养基为基础，在MS液体培养基中添加浓度为30g/L的蔗糖，浓度为7.5g/L的琼脂粉；在分化培养基中添加不同浓度组合的6-BA和NAA对分化率的影响，如表4所示；在分化培养基中添加不同浓度组合的6-BA和KT对分化率的影响，如表5所示。

表4 各分化培养基对分化率的影响

表5 各分化培养基对分化率的影响

由表4可知，在分化培养基添加浓度为1.5mg/L的6-BA和浓度为1.5mg/L的NAA，分化率为75％；由表5可知，在分化培养基添加浓度为2.0mg/L的6-BA和浓度为0.2mg/L的KT，分化率为90.3％；由表4和表5可知，鹅观草种子诱导出的愈伤组织在添加浓度为2.0mg/L的6-BA和浓度为0.2mg/L的KT的分化培养基上进行愈伤组织分化培养时的分化率最高，有利于分化芽的生根培养。

五、生根培养基的选择

如图4所示，将鹅观草愈伤组织分化苗接种于生根培养基上，生根培养基选择MS培养基或1/2MS培养基，生根培养基对生根率及根系生长状况的影响，如表6所示。

表6 各生根培养基对生根率及根系生长状况的影响

由表6可知，生根培养基采用1/2MS培养基的生根情况较好，生根率为97.59％，分化苗根系长且数量多，如图5所示；有利于移栽培养，如图6所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.鹅观草成熟胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)外植体的消毒灭菌处理，(2)诱导愈伤组织的培养，(3)愈伤组织的分化培养，(4)诱导分化芽的生根培养，(5)移栽培养；其中，

2.根据权利要求1所述的鹅观草成熟胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于，在所述(1)外植体的消毒灭菌处理中，所述消毒剂是在质量浓度为3％次氯酸钙添加体积百分数为≤1％的Tween80制得的混合溶液。

3.根据权利要求1所述的鹅观草成熟胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于，在所述(2)诱导愈伤组织的培养中，所述愈伤诱导培养基包括如下MS液体培养基、2，4-D、KT、麦芽糖及结冷胶，所述2，4-D的添加浓度为2.0mg/L，所述KT的添加浓度为0.5mg/L，所述麦芽糖的添加浓度为40g/L，所述结冷胶的添加浓度为4g/L。

4.根据权利要求1所述的鹅观草成熟胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于，在所述(3)愈伤组织的分化培养中，所述分化培养基包括MS液体培养基、6-BA、KT、蔗糖和琼脂粉，所述6-BA的添加浓度为2.0mg/L，所述KT的添加浓度为0.2mg/L，所述蔗糖的的添加浓度为30g/L，所述琼脂粉的添加浓度为7.5g/L。

5.根据权利要求1所述的鹅观草成熟胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于，在所述(4)诱导分化芽的生根培养中，所述生根培养基1/2MS固体培养基。