CN103210843A - 一种高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法。该方法主要步骤包括以鹅观草未成熟种子为材料，消毒灭菌后剥离幼胚置于诱导培养基上培养获得愈伤组织，在芽分化培养基中高频诱导芽丛及在生根壮苗培养基获得再生植株。在整个培养阶段通过添加苯莱特能有效抑制内生真菌的生长。在诱导愈伤组织培养通过添加一定配比的2,4-D、Dicamba、6-BA可有效将愈伤组织的诱导率提高到75%以上。在分化培养到再生培养过程，通过改变植物生长调节剂浓度配比，芽诱导率达90%以上，植株再生率达85%以上。

Description

一种高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法。

背景技术

为了满足不断增加的人口对食物的需求，促使人们大规模种植遗传背景较为单一的小麦优良品种，这使得栽培小麦的遗传基础变窄，遗传变异减少，对病虫害的抗性及环境适应能力减弱。为解决这一突出问题，育种家们开始把目光转向有着丰富基因资源的小麦近缘物种，希望通过远缘杂交能够向栽培品种中导入不同种属植物的有利基因，提高和改进栽培品种的经济性状，尤其是提高抗生物胁迫和非生物胁迫能力，培育高产、优质、抗病虫和耐逆的作物品种。自从Barelle在1806年进行第一次小麦远缘杂交以来，在小麦远缘杂交方面的研究己经有了长足的发展(李军辉，2002).其中，鹅观草(Roegneria kamoji Ohwi)(2n=6x=42)属于小麦族中最大的属一鹅观草属，是一种六倍体多年生禾草,蕴藏着丰富的遗传多样性,具有多花多粒、耐湿、抗寒、耐旱、耐碱及高抗赤霉病等特性,是牧草育种和作物改良的天然基因库,也是一种具有较高经济价值的多年生优质牧草,吸引了众多研究者的关注。

鹅观草属Roegneria是C.Koch于1848年以高加索鹅观草R.caucasica C.Koch为模式种建立的。现知全世界130余种,主要分布在北半球的温寒地带。我国约70余个种,主要分布于西北、西南和华北地区。国外学者从18世纪就对该属植物的分类进行了研究，随后国内外对该属的工作主要集中于利用小麦、大麦等作物与鹅观草远缘杂交进行抗赤霉病育种研究（汪杏芬，1994;吴丽芳，1997)；利用形态学、细胞学、同功酶、RAPD和SSR等手段研究鹅观草及其近缘种的遗传变异、种的划分、亲缘关系和系统进化的研究上（肖海峻，小麦族鹅观草属植物研究进展，草业科学，2007，24（4）：）。但针对其穗轴脆，易倒伏，高感白粉病等不良性状，利用现代生物技术，特别是基因工程技术进行研究则少见报道，因此加强从现代生物技术角度对该属植物的研究，探讨如何有效地利用这一丰富的野生牧草资源，具有很高的生态及育种价值。而且利用现代生物技术，特别是转基因技术对植物进行遗传改良具有高效、快捷等特点，在许多植物育种中已成功应用，为鹅观草利用现代生物技术育种提供了重要的借鉴。

建立鹅观草高效稳定的组织培养再生系统是利用转基因技术对其进行遗传改良重要前提，但目前报道的鹅观草组织培养及植株再生体系均不完善，再生率偏低，不能满足转基因的需要。鹅观草种子非常小，且种皮结构致密，难以彻底消毒灭菌，特别是鹅观草未成熟种子携带大量内生真菌，主要是在那些植物体内完成其全部或部分生活史，但又不引起任何病症的微生物(Bacon&Siegel,1988)。对于鹅观草组织培养来说内生菌作为污染源，必须通过消毒灭菌和在培养基中加入杀菌剂加以抑制，否则无法获得离体培养的成功。

回顾植物体细胞培养研究的历史,人们都是从选择合适的外植体、筛选与此相应的培养条件,特别是培养基成分、激素的配比等着手,同样重要的是找到理想的外植体及其适宜的时期。小麦的体细胞培养系统的突破,最重要的是选择到了授粉后15d左右的未成熟胚和相应的培养基及培养条件。未成熟胚有其简易、方便、能大量取材、再生能力强等明显的优点,成为目前小麦基因转化的主导受体。因此，与小麦类似，本研究将从鹅观草未成熟胚的取材时期、种子消毒、诱导和分化培养基的成分及激素配比等方面入手，建立一种高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，以鹅观草未成熟种子剥取的幼胚为外植体，依次进行（1）外植体培养诱导愈伤组织；（2）愈伤组织诱导芽的分化和伸长；（3）生根壮苗获得再生植株三个阶段的培养。

阶段（1）外植体培养诱导愈伤组织的培养条件为黑暗培养，培养温度为25℃±1℃，培养时间为28天。

阶段（1）外植体培养诱导愈伤组织使用的培养基以MS为基础培养基，添加终浓度为5mg/L的2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸），或6mg/L的Dicamber（麦草畏）中的任意一种。

阶段（2）和阶段（3）1500-2000勒克斯的光培养，光照时间为12h/d，整个培养过程，培养温度为25℃±1℃，每培养28天换新鲜培养基。

阶段（2）愈伤组织诱导芽的分化和伸长使用的培养基为以大量元素减半的MS为基础培养基，添加终浓度为2mg/l的激动素（KT）以及1mg/L的萘乙酸（NAA），或者添加终浓度为1mg/l的激动素（KT）以及1mg/L的萘乙酸（NAA）。

阶段（1）中诱导得到的愈伤组织接种于阶段（2）的培养基中培养28天芽分化后用相同培养基进行一次继代培养。

阶段（3）生根壮苗获得再生植株使用的培养基是大量元素减半的MS培养基添加终浓度为1mg/L的NAA，500mg/L的活性炭以及500mg/L的多效唑。

本发明将鹅观草(Roegneria kamoji Ohwi)未成熟种子从幼穗上剥离，70%的酒精浸泡30s，，再用0.1%的升汞浸泡并振荡15min，以无菌水冲洗3-5次。无菌条件下在解剖镜下剥离幼胚接种至第（1）阶段的培养基中，黑暗培养28天后在形成白色致密的愈伤组织。在上述第（1）阶段的培养基和培养条件下培养28天，愈伤组织诱导率达到75%以上，选取其中结构较致密的白色或淡黄愈伤组织，转入第（2）阶段的培养基培养28天，芽分化后用相同培养基进行一次继代培养，芽诱导率达75%以上，将带芽的愈伤块转入第（3）阶段的培养基，在光强为1500-2000勒克斯的光照条件下培养28天，植株再生率达85%以上。将再生植株在温度为25℃、湿度75%左右的光照培养箱中揭开封口膜炼苗4-7d。之后取出再生植株，洗净根部附着培养基，移栽到基质（珍珠岩：草碳：大田土=1:1:1）中用塑料膜覆盖保湿。7d后，揭开塑料膜，成活率达95%。

有益效果：本发明从鹅观草未成熟种子的幼胚高效诱导出愈伤组织，严格抑制住内生菌污染并且不影响其分化出大量的稳定、均一的再生植株，因此此体系可用于基因工程或细胞工程育种。

附图说明：

图1鹅观草未成熟种子

图2不同大小的鹅观草未成熟胚

图3诱导出的愈伤组织

图4愈伤组织的分化

图5再生植株诱导

图6移栽成活苗

具体实施方式：

在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围：

实施例1：鹅观草幼胚诱导愈伤组织过程中内生真菌的抑制

将鹅观草开花后12-15天的未成熟种子从幼穗上剥离（图1），70%的酒精浸泡30s，，再用0.1%的升汞浸泡并振荡15min，以无菌水冲洗3-5次。无菌条件下在解剖镜下剥离幼胚分别接种至诱导培养基MSD2和添加15mg/L苯莱特（Benlate）的MSD2中，黑暗培养10天后，统计内生真菌污染数的胚数，结果表明在MSD2培养基中，污染率高达66.7%，而在添加15mg/L苯莱特（Benlate）的MSD2培养基中，污染率降至3.3%（表1）。因此在培养基中加入15mg/L苯莱特（Benlate）可有效抑制内生真菌的生长。

MSD2培养基的制备是将激素2，4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）2mg/L直接添加MS培养基的其他成分中，然后高压灭菌而制得的，苯莱特（Benlate）用少量酒精溶解后加水配成15mg/ml母液，待MSD2培养基冷却至60℃左右时加入。所用仪器设备是植物组织培养所公知的超净工作机、自动高压灭菌锅等设备。在整个再生体系培养体过程中，培养基pH值均为5.8，温度均为25±1℃。

表1鹅观草幼胚诱导愈伤组织过程中内生真菌的抑制

实施例2：不同大小的幼胚愈伤组织诱导率的差异比较

将鹅观草开花后12-15天的未成熟种子从幼穗上剥离，70%的酒精浸泡30s，，再用0.1%的升汞浸泡并振荡15min，以无菌水冲洗3-5次。无菌条件下在解剖镜下剥离幼胚，按幼胚纵轴长度分为三种（图2）：L代表长300um左右的幼胚，M代表长200um左右的幼胚，S代表长100um左右的幼胚，分别接种至诱导培养基添加15mg/L苯莱特（Benlate）的MSD2中，黑暗培养28天后，统计并比较不同大小的幼胚愈伤组织诱导率等差异，结果表明S型和M型的幼胚出愈率可达90%以上，但L型的幼胚出愈率则降低至65.4%；而且实生出芽率随着幼胚长度变大而增高，说明胚越大越容易长出实生芽，不利于愈伤组织诱导；从内生菌污染率来看，胚越大越容易产生内生菌污染。因此，综合以上因素选取长度100-200um的幼胚用于愈伤组织诱导较适宜。

表2不同大小的幼胚愈伤组织诱导率的差异比较

实施例3：诱导培养基中添加不同激素组合对幼胚愈伤组织诱导的影响

选取上述实施例2中的100-200um的鹅观草幼胚用于愈伤组织诱导，比较在MS诱导培养基中添加不同激素组合（表3）对幼胚愈伤组织诱导的影响。幼胚在添加不同激素组合的MS培养基中出愈率和直接出芽率见表4。从这两个表可以看出，在不添加激素6-BA的培养中幼胚出愈率要高于添加了激素6-BA的培养基,而添加激素麦草畏的培养基总体的幼胚出愈率要优于添加了激素2,4-D的培养基。纵观所有培养基的幼胚出愈率发现添加激素麦草畏6.0mg/l，6-BA0mg/L的培养基上幼胚的出愈率能高达82.8%是所有培养基中幼胚出愈率最高的，与其他培养基的幼胚出愈率差异显著（P≤0.1），而且愈伤出芽率为7.4%在所有激素组合培养基中出芽率为倒数第二低，较好的抑制了幼胚的出芽。通过出愈率和出芽率的综合比较确定添加激素麦草畏6.0mg/l，6-BA0mg/L组合的培养基为最佳的愈伤诱导培养基。

表3添加不同激素组合的诱导培养基

表4诱导培养基中添加不同激素组合对幼胚愈伤组织诱导的影响

因素A、B依次指不同浓度生长调节物质2,4-D和Dicamba（Dic）为一类、6-BA等为另一类，组合后添加入培养基对愈伤组织诱导的影响。a、b、c、d、e相同的字母表示在新复极差检验法中A=0.1水平下差异不显著。

实施例4：鹅观草幼胚愈伤组织在添加不同激素组合的分化培养基上的表现

分化是植物组织培养再生过程中的关键一步，本试验选择了上述实施例3中出愈率较高且愈伤质量较好的6种培养基上的愈伤组织，分别接种在添加了激动素KT0.5-2mg/L，玉米素ZT0.5-2mg/L，萘乙酸NAA1mg/L一种或两种组合起来的分化培养基上（表5），研究不同激素配比培养基对愈伤组织绿原芽分化的影响。由于鹅观草愈伤组织在分化过程中常出现较重的褐化，这与培养基中激素的添加浓度和配比模式都直接相关，因此本研究还统计了在不同激素配比培养基上愈伤组织的褐化率，从而筛选出愈伤组织分化率较高而褐化率较低的分化培养基，用于后续的大规模应用。

表5添加不同激素组合的分化培养基

4.1由添加2,4-D2mg/l,6-BA0mg/l的诱导培养基产生的愈伤组织接种在激素配比不同的培养基上分化率和褐化率的统计结果来看，添加ZT1mg/l,NAA1mg/l的分化培养基中的愈伤分化率较高达到72.1%，且褐化率低至18.6%，可见该培养基较好的适用于该类愈伤组织后续的分化培养。而提高ZT含量一倍的添加ZT2mg/l,NAA1mg/l的分化培养基中的愈伤组织的分化情况正相反，分化率仅为20.0%，且褐化率高达66.7%；同时添加KT1mg/l,NAA1mg/l的分化培养基中的愈伤组织的分化情况是分化率为42.9%，褐化率也高达42.9%；可见分化培养时细胞分裂素（KT\ZT）和生长素（NAA）的激素配比值为1时较好，且添加ZT的效果要好于KT。4.2由添加2,4-D5mg/l,6-BA0mg/l的诱导培养及产生的愈伤组织接种在激素配比不同的培养基上分化率和褐化率的统计结果来看，添加KT2mg/l,NAA1mg/l的分化培养基中的愈伤分化率较高达到90.0%，且褐化率低至10.0%，可见该培养基较好的适用于该类愈伤组织后续的分化培养。

4.3由添加Dicamber3mg/l,6-BA0mg/l的诱导培养及产生的愈伤组织接种在激素配比不同的培养基上分化率和褐化率的统计结果来看，添加ZT1mg/l,NAA1mg/l的分化培养基中的愈伤分化率较高达到65.0%，且褐化率低至0%，可见该培养基较好的适用于该类愈伤组织后续的分化培养。

4.4由添加Dicamber3mg/l,6-BA0.2mg/l的诱导培养及产生的愈伤组织接种在激素配比不同的培养基上分化率和褐化率的统计结果来看，添加ZT1mg/l和ZT0.5mg/l,NAA1mg/l的两种分化培养基中的愈伤分化率均高达100.0%，且褐化率为0%，可见这两种培养基均较好的适用于该类愈伤组织后续的分化培养。

4.5由添加Dicamber3mg/l,6-BA0.5mg/l的诱导培养及产生的愈伤组织接种在激素配比不同的培养基上分化率和褐化率的统计结果来看，添加KT0.5mg/l的分化培养基中的愈伤分化率较高达到94.8%，且褐化率低至5.2%；并且添加ZT0.5mg/l,NAA1mg/l的分化培养基中的愈伤分化率高达100.0%，且褐化率为0%，可见这两种培养基均较好的适用于该类愈伤组织后续的分化培养。

4.6由添加Dicamber6mg/l,6-BA0mg/l的诱导培养及产生的愈伤组织接种在激素配比不同的培养基上分化率和褐化率的统计结果来看，添加KT1mg/l,NAA1mg/l的分化培养基中的愈伤分化率高达89.3%，且褐化率仅为10.7%，可见该培养基较好的适用于该类愈伤组织后续的分化培养。

表6分化培养基中添加不同激素组合对幼胚愈伤组织分化的影响

由于在愈伤组织诱导的阶段使用激素的种类和浓度不同对其后续的分化效率及褐化率的影响不可忽略,从实施例3和实施例4的结果来看，在愈伤诱导阶段出愈率最高的培养基中的愈伤组织，在后续的分化培养基中的分化率并不一定是最高的，褐化率也并不一定是最低的；反之，在愈伤诱导阶段出愈率较低的培养基中的愈伤组织，在后续的分化培养基中的分化率可以是较高的，褐化率也较低。因此综合依据实施例3和实施例4结果，选取在出愈率较高的愈伤诱导培养基，同时在后续的分化培养中的分化率也较高，而褐化率较低的分化培养基，比较后选出两套适合鹅观草幼胚愈伤诱导和分化的培养基：（1）愈伤诱导培养基采用在MS培养基中只添加激素2,4-D5.0mg/l，鹅观草幼胚出愈率达64.0±6.0%,后续分化培养基采用添加KT2mg/l,NAA1mg/l的1/2MS培养基，愈伤组织分化率高达到90.0%，且褐化率低至10.0%；（2）愈伤诱导培养基采用在MS培养基中只添加激素麦草畏6.0mg/l，鹅观草幼胚出愈率达82.8±4.4%,后续分化培养基采用添加KT1mg/l,NAA1mg/l的1/2MS培养基，愈伤组织分化率高达到89.3%，且褐化率低至10.7%。

实施例5：幼胚愈伤组织分化的绿芽在生根壮苗培养基上的成苗和移栽

将上述实施案例4中的绿芽块95块，接种在以大量元素减半的MS培养基为基础培养基，并添加萘乙酸NAA1mg/L，活性炭500mg/L，多效唑500mg/L的生根壮苗培养基上，在光强为1500-2000勒克斯的光照条件下培养28天，获得再生植株83棵，植株再生率达87.4%以上。将再生植株在温度为25℃、湿度75%左右的光照培养箱中揭开封口膜炼苗4-7d。之后取出再生植株，洗净根部附着培养基，移栽到基质（珍珠岩：草碳：大田土=1:1:1）中用塑料膜覆盖保湿。7d后，揭开塑料膜，成活79棵，成活率达95.2%。

Claims (8)

1.一种高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于以鹅观草未成熟种子剥取的长度100-200um的幼胚为外植体，依次进行（1）外植体培养诱导愈伤组织；（2）愈伤组织诱导芽的分化和伸长；（3）生根壮苗获得再生植株三个阶段的培养。

2.根据权利要求1所述的高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于阶段（1）外植体培养诱导愈伤组织的培养条件为黑暗培养，培养温度为25℃±1℃，培养时间为28天。

3.根据权利要求1所述的高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于阶段（1）外植体培养诱导愈伤组织使用的培养基以MS为基础培养基，添加终浓度为2-5mg/L的2,4-D，3-6mg/L的麦草畏，0-0.5mg/L的6-BA中的任意一种或两种。

4.根据权利要求1所述的高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于阶段（1）外植体培养诱导愈伤组织使用的培养基为添加终浓度为5mg/L的2,4-D，或终浓度为6mg/L的麦草畏中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于阶段（2）和阶段（3）1500-2000勒克斯的光培养，光照时间为12h/d，整个培养过程，培养温度为25℃±1℃，每培养28天换新鲜培养基。

6.根据权利要求1所述的高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于阶段（2）愈伤组织诱导芽的分化和伸长使用的培养基为以大量元素减半的MS为基础培养基，添加终浓度为2mg/l的激动素以及1mg/L的NAA，或者添加终浓度为1mg/l的激动素以及1mg/L的萘乙酸NAA。

7.根据权利要求6所述的高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于阶段（1）中诱导得到的愈伤组织接种于阶段（2）的培养基中培养28天芽分化后用相同培养基进行一次继代培养。

8.根据权利要求1所述的高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于阶段（3）生根壮苗获得再生植株使用的培养基是大量元素减半的MS培养基添加终浓度为1mg/L的NAA，500mg/L的活性炭以及500mg/L的多效唑。

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