CN106718910A - 快速诱导繁殖偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种植物愈伤组织诱导及培养的方法，尤其是一种偏穗鹅观草无毒条件下种子消毒及快速诱导繁殖其无菌实生苗下胚轴愈伤组织的方法。一种快速诱导繁殖偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织的方法，其主要特点在于步骤如下：(1)无毒条件下无菌外植体的获得：(2)愈伤组织诱导：(3)愈伤组织增殖培养：将步骤(2)获得的颜色黄绿，质地疏松的愈伤组织切割成直径约0.1‑0.2cm的小块，然后转接到诱导愈伤组织增殖培养基中，培养25‑30d后继续转接到新的诱导愈伤组织增殖培养基中进行继代增殖，最终获得颜色黄绿，结构致密的优良愈伤组织材料。该方法能够在无毒条件下进行偏穗鹅观草的种子消毒并且快速诱导出其无菌实生苗下胚轴的愈伤组织，经过继代繁殖后，获得大量颜色黄绿，结构松脆的优良愈伤组织材料，可为偏穗鹅观草下胚轴组织培养以及细胞悬浮培养提供技术支撑。

Description

快速诱导繁殖偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织的方法

技术领域

本发明涉及一种植物愈伤组织诱导及培养的方法，尤其是一种偏穗鹅观草无毒条件下种子消毒及快速诱导繁殖其无菌实生苗下胚轴愈伤组织的方法。

背景技术

愈伤组织的培养是植物组织培养过程中的一个重要阶段，愈伤组织是幼嫩的薄壁细胞，具有潜在的分化能力，可以进一步分化形成完整植株，通过愈伤的培养也可获得不同性质的愈伤组织，可为原生质体的分离，融合或遗传转化提供优质材料。偏穗鹅观草(Roegneria komarovii(Nevski)Nevski)为禾本科鹅观草属多年生草本植物，原产于中国，除新疆、青海、西藏外，分布遍及全国。多生长在海拔100-2300米的山坡和湿润草地。此种植物可作牲畜的饲料，叶质柔软而繁盛，产草量大，可食性高。目前对无毒条件下进行种子消毒并快速诱导偏穗鹅观草无菌实生苗下胚轴愈伤组织的相关报道还比较少。当前急需一种以无升汞处理偏穗鹅观草种子并以其无菌苗下胚轴为外植体诱导愈伤从而使其增殖的方法，通过人工控制环境条件来产生大量的愈伤组织，并进一步培养使其增殖，为偏穗鹅观草与小麦体细胞杂交做准备，从而将其优良性状导入小麦，以期为小麦遗传育种及研究提供中间材料。

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种快速诱导繁殖偏穗鹅观草无菌实生苗下胚轴愈伤组织的方法，该方法简单易行，能够高效快速的获得大量偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织。

以无菌培养获得的偏穗鹅观草下胚轴为外植体，诱导愈伤组织发生，然后继代培养，使其增殖。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种快速诱导繁殖偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织的方法，其主要特点在于步骤如下：

(1)无毒条件下无菌外植体的获得：将偏穗鹅观草种子置于50％～55％的浓硫酸中,在条件为28℃～30℃，210r/min～220r/min的摇床里振荡0.9～1.2小时做脱皮催芽处理，之后用蒸馏水洗去浓硫酸并置于超净工作台，首先用无菌水清洗种子，然后用75％的酒精振荡冲洗2.5～3.5min，紧接着用无菌水将种子表面的酒精清洗干净，再用20％～25％的次氯酸钠振荡冲洗14～16min,最后用无菌水将种子表面的次氯酸钠清洗干净，获得偏穗鹅观草无菌种子，将灭菌后的种子放置于培养无菌实生苗的培养基中培养10-15d，获得无菌实生苗的下胚轴幼嫩部分作为诱导愈伤的外植体；

(2)愈伤组织诱导：将步骤(1)获得的无菌实生苗下胚轴横切为约0.3-0.5cm长的小段作为诱导愈伤的材料，接种于诱导愈伤组织培养基上培养25-30d，诱导愈伤发生；

(3)愈伤组织增殖培养：将步骤(2)获得的颜色黄绿，质地疏松的愈伤组织切割成直径为0.1-0.2cm的小块，然后转接到诱导愈伤组织增殖培养基中，培养25-30d后继续转接到新的诱导愈伤组织增殖培养基中进行继代增殖，最终获得颜色黄绿，结构致密的优良愈伤组织材料。

所述的快速诱导繁殖偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织的方法，其步骤(1)中所述的培养无菌实生苗的培养基为MS营养液、5-7g/L琼脂、20-30g/L蔗糖、0.05-0.1g肌醇组成，PH＝5.7-5.8；步骤(2)中所述的诱导愈伤组织培养基、步骤(3)中所述的诱导愈伤组织增殖培养基均为MS诱导培养基，其配比为：3.0-5.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，5-7g/L琼脂，20-30g/L蔗糖，0.05-0.1g肌醇组成，PH＝5.7-5.8。

所述的快速诱导繁殖偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织的方法，所述的步骤(1)中偏穗鹅观草发芽阶段需暗培养，发芽以后阶段及步骤(2)、(3)的下胚轴愈伤诱导和愈伤增殖均在连续光照培养，光照强度在1500-20001x之间，湿度60-70％的环境下进行。

所述的快速诱导繁殖偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织的方法，还包括有步骤(3)所述的产生的愈伤组织材料，通过称量法测定愈伤组织的生长量,其具体步骤为：

1)将盛有MS诱导培养基的锥形瓶放在天平上进行称量，得到数值a；

2)将1)中称量过的锥形瓶放入超净工作台中进行愈伤组织的转接，转接结束后对锥形瓶进行称量，得到数值b；

3)将转接后的愈伤组织培养30天后再次对锥形瓶进行称量，得到数值c；

愈伤组织的生长量为：c-(b-a)。

本发明的有益效果如下：

1.在不用升汞的无毒条件下对偏穗鹅观草种子进行消毒处理，用50％的浓硫酸对其进行脱皮催芽，继而用70％的酒精和20％的次氯酸钠依次处理。

2.以偏穗鹅观草培养10-15d的无菌实生苗根部为取材对象，保证了材料的无菌，杜绝了由材料带菌或灭菌不彻底造成的组培污染，并且此阶段其下胚轴部分十分幼嫩。

3.以无菌实生苗下胚轴组织为诱导愈伤的材料，能够高效地诱导愈伤组织的生成。

4.愈伤的诱导与继代培养所产生的愈伤组织质嫩，并且也可以通过称量法测定愈伤组织的生长量。

5.愈伤的诱导与继代培养所用培养基均以2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)为外源激素，实生苗培养、下胚轴愈伤诱导和愈伤增殖均在同一环境下进行，效果良好。实现了简单、易行、高效获得鹅观草下胚轴愈伤组织的目标。

附图说明：

图1.本发明所用的无菌实生苗；

图2.本发明所剪切的偏穗鹅观草下胚轴部分；

图3.本发明下胚轴组织培养28d后所得偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织；

图4.本发明偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织继代繁殖后的愈伤组织。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下面对本发明的内容进行详细的说明。

实施例1：一种快速诱导及繁殖偏穗鹅观草无菌实生苗下胚轴愈伤组织的方法，将偏穗鹅观草种子置于50％的浓硫酸中在条件为30℃，210r/min的摇床里振荡0.9小时做脱皮催芽处理，之后用蒸馏水洗去浓硫酸并置于超净工作台，首先用无菌水清洗种子，然后用75％的酒精处理2.5min，紧接着用无菌水将种子表面的酒精清洗干净，再用20％的次氯酸钠处理14min,最后用无菌水将种子表面的次氯酸钠清洗干净，获得偏穗鹅观草无菌种子，将灭菌后的种子放置于培养无菌实生苗的培养基中培养10d，培养基为MS营养液+5g/L琼脂+20g/L蔗糖+0.05g肌醇组成，PH＝5.7。获得无菌实生苗的下胚轴作为诱导愈伤的外植体；将无菌实生苗下胚轴横切为约0.3cm的小段作为诱导愈伤的材料，接种于诱导愈伤组织培养基上培养28d，培养基为MS诱导培养基，其配比为：3.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，5g/L琼脂，20g/L蔗糖，0.05g肌醇组成，PH＝5.7。诱导愈伤的发生，将获得的颜色黄绿，质地疏松的愈伤组织切割成小块，然后转接到增殖培养基，培养28d后继续转接到新的培养基继代增殖。诱导愈伤组织及继代繁殖所用培养基主要由1/2MS营养液4.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)7g/L琼脂20g/L蔗糖0.1g/L肌醇组成，PH＝5.8，愈伤诱导和愈伤繁殖均为连续光照培养，光照强度在1500-20001x之间，湿度70％的环境下进行。

结果：诱导愈伤率70％，诱导愈伤黄绿色，无褐变；在继代增殖过程中，愈伤组织生长迅速，最终愈伤组织呈现黄绿色。

实施例2：一种快速诱导及繁殖偏穗鹅观草无菌实生苗下胚轴愈伤组织的方法，将偏穗鹅观草种子置于55％的浓硫酸中在条件为28℃，220r/min的摇床里振荡1小时做脱皮催芽处理，之后用蒸馏水洗去浓硫酸并置于超净工作台，首先用无菌水清洗种子，然后用75％的酒精处理3min，紧接着用无菌水将种子表面的酒精清洗干净，再用22％的次氯酸钠处理15min,最后用无菌水将种子表面的次氯酸钠清洗干净，获得偏穗鹅观草无菌种子，将灭菌后的种子放置于培养无菌实生苗的培养基中培养12d，培养基为MS营养液+7g/L琼脂+30g/L蔗糖+0.1g肌醇组成，PH＝5.8。获得无菌实生苗的下胚轴作为诱导愈伤的外植体；将无菌实生苗下胚轴横切为约0.5cm的小段作为诱导愈伤的材料，接种于诱导愈伤组织培养基上培养30d，培养基为MS诱导培养基，其配比为：5.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，7g/L琼脂，30g/L蔗糖，0.1g肌醇组成，PH＝5.8。诱导愈伤的发生；将获得的颜色黄绿，质地疏松的愈伤组织切割成小块，然后转接到增殖培养基，培养28d后继续转接到新的培养基继代增殖。诱导愈伤组织及继代繁殖所用培养基主要由MS营养液3.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)7g/L琼脂25g/L蔗糖0.1g/L肌醇组成，PH＝5.8，愈伤诱导和愈伤繁殖均为连续光照培养，光照强度在1500-20001x之间，湿度60％的环境下进行。

结果：诱导愈伤率70％，诱导愈伤黄绿色，无褐变；在继代增殖过程中，愈伤组织生长迅速，最终愈伤组织呈现黄绿色。

实施例3：

一种快速诱导及繁殖偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织的方法，将偏穗鹅观草种子置于52％的浓硫酸中在条件为30℃，210r/min的摇床里振荡1.2小时做脱皮催芽处理，之后用蒸馏水洗去浓硫酸并置于超净工作台，首先用无菌水清洗种子，然后用75％的酒精处理3.5min，紧接着用无菌水将种子表面的酒精清洗干净，再用25％的次氯酸钠处理16min,最后用无菌水将种子表面的次氯酸钠清洗干净，获得偏穗鹅观草无菌种子，将灭菌后的种子放置于培养无菌实生苗的培养基中培养15d，培养基为MS营养液+6g/L琼脂+25g/L蔗糖+0.08g肌醇组成，PH＝5.8。获得无菌实生苗的下胚轴作为诱导愈伤的外植体；将无菌实生苗下胚轴横切为约0.5cm的小段作为诱导愈伤的材料，接种于诱导愈伤组织培养基上培养28d，培养基为MS诱导培养基，其配比为：4.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，6g/L琼脂，25g/L蔗糖，0.08g肌醇组成，PH＝5.8。诱导愈伤的发生，将获得的颜色黄绿，质地疏松的愈伤组织切割成小块，然后转接到增殖培养基，培养28d后继续转接到新的培养基继代增殖。诱导愈伤组织及继代繁殖所用培养基主要由MS营养液5.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)7g/L琼脂30g/L蔗糖0.1g/L肌醇组成，PH＝5.8，愈伤诱导和愈伤繁殖均为连续光照培养，光照强度1500-20001x之间，湿度70％的环境下进行。

结果：诱导愈伤率75％，诱导愈伤黄绿色，无褐变；在继代增殖过程中，愈伤组织生长迅速，最终愈伤组织呈现黄绿色。

实施例4：一种快速诱导繁殖偏穗鹅观草无菌实生苗下胚轴愈伤组织的方法，还包括有步骤(3)所述的产生的愈伤组织材料，通过称量法测定愈伤组织的生长量。其具体步骤为：

1)将盛有MS诱导培养基的锥形瓶放在天平上进行称量，得到数值a；

2)将1)中称量过的锥形瓶放入超净工作台中进行愈伤组织的转接，转接结束后对锥形瓶进行称量，得到数值b；

3)将转接后的愈伤组织培养30天后再次对锥形瓶进行称量，得到数值c；

4)愈伤组织的生长量为：c-(b-a)。

试验例：

在偏穗鹅观草无菌实生苗下胚轴愈伤组织诱导及增殖过程中，外源诱导激素的选择与配比对愈伤组织的诱导及增殖起到了关键作用，本试验通过对激素的选择与配比进行优化，最终确定了最佳的偏穗鹅观草无菌实生苗下胚轴愈伤组织诱导及其增殖的方法。

1.外源激素种类的选择

选择常用诱导愈伤组织的3种外源激素，设置六个处理，分别为处理A(0.1mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA)，处理B(0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)，处理C(1.0mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA)，处理D(5.0mg/L 2,4-D)，处理E(1.0mg/L NAA),处理F(1.0mg/L 6-BA)，其中6-BA是6-苄氨基嘌呤，NAA是萘乙酸，2,4-D是2,4-二氯苯氧乙酸。所用的基础培养基是MS培养基，30g/L蔗糖，6g/L琼脂，0.1g/L肌醇，PH＝5.8。将培养15d实生苗的下胚轴组织接种于以上六种不同诱导培养基中，3次重复，每瓶接种8块，连续光照培养25-30d，观察诱导愈伤组织情况。结果发现：处理A，B，C，E，F均无愈伤组织产生，且产生白色絮状物，处理D诱导愈伤率高达70％，且全为黄绿色的愈伤组织。因此，确定2,4-D是最佳的诱导下胚轴愈伤组织的外源激素。

然后选择使愈伤增殖的3种外源激素，设置六个处理，分别为处理A(0.1mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA)，处理B(0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)，处理C(1.0mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA)，处理D(5.0mg/L 2,4-D)，处理E(1.0mg/L NAA),处理F(1.0mg/L 6-BA)，其中6-BA是6-苄氨基嘌呤，NAA是萘乙酸，2,4-D是2,4二氯苯氧乙酸。所用的基础培养基是MS培养基，30g/L蔗糖，6g/L琼脂，0.1g/L肌醇，PH＝5.8。在诱导愈伤培养基上生长25-30d的愈伤组织转接至以上六种不同激素处理的增殖培养基中，3次重复，每瓶转接8块，连续光照培养25-30d，观察愈伤组织的增殖情况，结果发现：处理A，B，C，E，F愈伤增值不明显，并随着培养时间的延长，愈伤组织颜色逐渐变黑；处理D愈伤组织明显增大，且全为黄绿色的愈伤组织。因此，确定2,4-D是最佳的下胚轴愈伤组织增殖的外源激素。

2.外源激素用量的选择

通过试验1优选出适合诱导偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织的外源激素，在此基础上，继续对2,4-D用量进行优化，设处理A(3mg/L)、处理B(4mg/L)和处理C(5mg/L)3个梯度，所用基础培养基是MS培养基，30g/L蔗糖，6g/L琼脂，0.1g/L肌醇，PH＝5.8。将培养15d实生苗的下胚轴组织接种于以上三种不同诱导培养基中，3次重复，每瓶接种8块，连续光照培养25-30d，观察诱导愈伤组织情况。结果发现：处理A，B，C愈伤诱导率依次为50％，70％，75％，处理A的出愈速度较慢、B愈伤组织黄绿，结构松软，处理C愈伤组织黄绿，结构致密。

然后，在优选出最佳偏穗鹅观草下胚轴诱导愈伤组织2,4-D用量的基础上，继续对下胚轴愈伤组织增殖培养基中2,4-D用量进行优化，设处理A(3mg/L)、处理B(4mg/L)和处理C(5mg/L)3个梯度，所用基础培养基是MS培养基，30g/L蔗糖，6g/L琼脂，0.1g/L肌醇，PH＝5.8。在诱导愈伤组织培养基上生长25-30d的愈伤组织转接至以上三种不同的2,4-D用量的增殖培养基中，3次重复，每瓶转接8块，连续光照培养25-30d，观察愈伤组织的增殖情况，结果发现：处理A愈伤组织生长缓慢，处理B愈伤组织黄绿，结构松散，处理C明显增殖，并且愈伤组织黄绿，结构质密。

综上所述，故确定外源激素2,4-D是偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织诱导及增殖的最适激素配比，同时5.0mg/L 2,4-D是诱导偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织最适的激素用量，5.0mg/L 2,4-D是偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织增殖的最适激素用量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种快速诱导繁殖偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织的方法，其特征在于步骤如下：

(1)无毒条件下无菌外植体的获得：将偏穗鹅观草种子置于50％～55％的浓硫酸中,在条件为28℃～30℃，210r/min～220r/min的摇床里振荡0.9～1.2小时做脱皮催芽处理，之后用蒸馏水洗去浓硫酸并置于超净工作台，首先用无菌水清洗种子，然后用75％的酒精振荡冲洗2.5～3.5min，紧接着用无菌水将种子表面的酒精清洗干净，再用20％～25％的次氯酸钠振荡冲洗14～16min,最后用无菌水将种子表面的次氯酸钠清洗干净，获得偏穗鹅观草无菌种子，将灭菌后的种子放置于培养无菌实生苗的培养基中培养10-15d，获得无菌实生苗的下胚轴幼嫩部分作为诱导愈伤的外植体；

(2)愈伤组织诱导：将步骤(1)获得的无菌实生苗下胚轴横切为约0.3-0.5cm长的小段作为诱导愈伤的材料，接种于诱导愈伤组织培养基上培养25-30d，诱导愈伤发生；

(3)愈伤组织增殖培养：将步骤(2)获得的颜色黄绿，质地疏松的愈伤组织切割成直径为0.1-0.2cm的小块，然后转接到诱导愈伤组织增殖培养基中，培养25-30d后继续转接到新的诱导愈伤组织增殖培养基中进行继代增殖，最终获得颜色黄绿，结构致密的优良愈伤组织材料。

2.如权利要求1所述的快速诱导繁殖偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的培养无菌实生苗的培养基为MS营养液、5-7g/L琼脂、20-30g/L蔗糖、0.05-0.1g肌醇组成，PH＝5.7-5.8；步骤(2)中所述的诱导愈伤组织培养基、步骤(3)中所述的诱导愈伤组织增殖培养基均为MS诱导培养基，其配比为：3.0-5.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，5-7g/L琼脂，20-30g/L蔗糖，0.05-0.1g肌醇组成，PH＝5.7-5.8。

3.如权利要求1所述的快速诱导繁殖偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中偏穗鹅观草发芽阶段需暗培养，发芽以后阶段及步骤(2)、(3)的下胚轴愈伤诱导和愈伤增殖均在连续光照培养，光照强度在1500-2000lx之间，湿度60-70％的环境下进行。

4.如权利要求1所述的快速诱导繁殖偏穗鹅观草下胚轴愈伤组织的方法，其特征在于还包括有步骤(3)所述的产生的愈伤组织材料，通过称量法测定愈伤组织的生长量,其具体步骤为：

1)将盛有MS诱导培养基的锥形瓶放在天平上进行称量，得到数值a；

2)将1)中称量过的锥形瓶放入超净工作台中进行愈伤组织的转接，转接结束后对锥形瓶进行称量，得到数值b；

3)将转接后的愈伤组织培养30天后再次对锥形瓶进行称量，得到数值c；

4)愈伤组织的生长量为：c-(b-a)。