CN115976258B

CN115976258B - 抗赤霉病小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3Sc及其选育方法、分子标记和用途

Info

Publication number: CN115976258B
Application number: CN202211341530.3A
Authority: CN
Inventors: 王秀娥; 宋融融; 肖进; 孙丽; 袁春霞; 王彤; 王宗宽; 王海燕
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2022-10-28
Filing date: 2022-10-28
Publication date: 2023-12-29
Anticipated expiration: 2042-10-28
Also published as: CN115976258A

Abstract

本发明公开了抗赤霉病小麦‑纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c及其选育方法、分子标记和用途。以矮抗58为母本，中国春‑纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c为父本，F₁自交，通过3S染色体特性的分子标记和荧光原位杂交技术检测F₂中含有3S染色体的单株，然后套袋自交，获得F₃代；在F₃代中，通过GISH/FISH技术检测F₃中含有整条3S染色体且纯合的单株；对纯和合植株进行小麦赤霉病抗性鉴定。本发明选育得到的小麦‑纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c可用于小麦抗赤霉病育种；分子标记的引物可用于鉴定小麦‑纤毛鹅观草结构变异体中是否含有3S染色体，提高抗病育种效率。

Description

抗赤霉病小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3Sc及其选育方法、分子标记和用途

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及抗赤霉病小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c及其选育方法、分子标记和用途。

背景技术

小麦(Triticum aestivum L.)是中国重要的粮食作物，由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)引起的小麦赤霉病(Fusarium head blight，FHB)是危害小麦生产的最重要的真菌病害之一。赤霉病大流行年份穗部发病率可达50％-100％，造成产量下降10％-40％(马忠华等，2020)。近几年，由于气候变暖、肥水条件和耕作制度改变的影响，小麦赤霉病在发生越来越频繁，小麦赤霉病对粮食的生产安全已经构成了严重威胁(Chen et al.，2019)。同时，小麦赤霉病病菌在侵染后还会产生次级代谢产物脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)真菌毒素污染小麦及其制品，人或动物误食会引发呕吐、腹泻等疾病，对人畜的生命健康安全构成威胁，造成严重的食品安全问题(Merhej et al.，2011)。因此，挖掘新的小麦赤霉病抗性资源和选育抗小麦赤霉病新品种是实现小麦绿色安全生产急需突破的瓶颈。

小麦近缘物种是小麦遗传改良的重要基因资源宝库，富含抗病、抗逆、抗虫、大穗多粒、优质等优异基因。纤毛鹅观草(Roegneria ciliaris(Trin)Nevski，2n＝28，基因组SSYY)是鹅观草属四倍体多年生物种，具有耐寒、耐旱、耐高温高湿、多花多粒性以及抗病等优良性状。1983年，Muramatsu等以纤毛鹅观草作母本，普通小麦Inayama Komugi作父本杂交获得杂种F1，经染色体加倍育成了普通小麦-纤毛鹅观草双二倍体。翁益群等(1989)发现纤毛鹅观草对赤霉病抗性能力最强且显著高于苏麦3号。本实验室利用染色体工程，以普通小麦中国春为亲本与该双二倍体杂交和连续回交后自交，将纤毛鹅观草有益基因导入普通小麦，先后选育鉴定了多个普通小麦-纤毛鹅观草异附加系新种质(Jiang等，1993；王秀娥等，1997；Wang等，2001；Kong等，2018)。因此，纤毛鹅观草已成为改良普通小麦遗传基础、提高赤霉病抗性的重要野生近缘物种之一。

创制小麦-近缘物种异附加系，是突破小麦与近缘物种之间的染色体重组障碍、转移利用野生近缘物种优异基因的有效途径，也是外源基因育种利用的必备前提。异附加系的创制也是培育异代换系和易位系的中间材料，还可用于外源优异基因的定位、外源染色体特异分子标记的开发和筛选、研究染色体结构和基因组组成、分析染色体组间亲缘关系、物种起源与进化以及分离和克隆染色体特异DNA序列等，育种家相继选育并鉴定出大量的一系列的小麦异附加系，迄今已选育到添加有大麦、黑麦、簇毛麦、山羊草、偃麦草、鹅观草、大赖草和华山新麦草等200多种小麦近缘植物的异附加系(Du et al.，2014)。但是由于异附加系在转移有益基因的同时也将许多冗余基因带入小麦，且有时会导致细胞学上的不稳定和遗传学上的不平衡，或在后代传递过程中不稳定，所以在生产上一般难以直接利用，目前关于纤毛鹅观草添加系的应用也鲜有报道。

IT(Intron Targeting)分子标记是基于EST发展起来的新型PLUG分子标记(Ishikawa等，2007)。IT标记具有更高的多态性、扩增条带清晰、分辨率高而且在外源物种中具有很好的转移性(Poczai等，2008；Li等，2013)。Wang等根据簇毛麦4VS与普通小麦中国春4AL、4BS、4DS以及粗山羊草的4DS的内含子，开发了359个IT标记，其中232个标记可以在小麦-簇毛麦T4VS·4DL易位系上进行特异性扩增，多态率为64.62％(Wang等，2017)；Zhang等比较簇毛麦序列和小麦基因组序列，开发了841个定位到簇毛麦的1V-7V染色体的IT标记，多态率为51.79％(Zhang等，2017)，为提高簇毛麦外源染色质的鉴定效率提供了新手段。基于簇毛麦和普通小麦D亚基因组设计的IT标记，还被用于作为中间偃麦草染色体和大麦染色体特异的分子标记(Li等，2021；Yu等，2019)。基于簇毛麦和普通小麦D亚基因组设计的IT标记，筛选出纤毛鹅观草3S染色体的特异分子标记，对于纤毛鹅观草3S染色体结构变异体的准确鉴定和目的基因的挖掘具有重要意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种抗赤霉病小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c及其选育方法、分子标记和用途。

技术方案：所述的抗赤霉病小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c的选育方法，包括如下步骤：

以中国春为母本，普通小麦Ik-纤毛鹅观草双二倍体为父本，利用GISH/FISH技术从BC₁F₆中鉴定中国春-纤毛鹅观草染色体的一整套二体异附加系，连续多年多点赤霉病抗性鉴定，中国春-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c高抗小麦赤霉病；为进一步验证纤毛鹅观草3S^c的赤霉病抗性及其对农艺性状的影响，以矮抗58为母本，中国春-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c为父本，F₁自交，通过3S染色体特性的分子标记和荧光原位杂交技术检测F₂中含有3S染色体的单株，然后套袋自交，获得F₃代；在F₃代中，通过GISH/FISH技术检测F₃中含有整条3S染色体且纯合的单株；对纯和合植株进行小麦赤霉病抗性鉴定。

其中，作为亲本的中国春-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c由南京农业大学细胞遗传研究所创制，矮抗58是通过常规途径即可获得的植物材料，可以从种质库引进。

进一步地，所述用单花滴注法鉴定二体异附加系DA3S^c的赤霉病抗性的操作如下：在扬花期(4月上旬左右开始)，将赤霉菌孢子F0609菌株悬浮液采用单花滴注法接种靠近穗中部正在开花的小穗，使植株接受赤霉菌悬液的感染。

进一步地，所述禾谷镰刀菌悬液的最适浓度为5000个/mL，摇匀后使用。所述禾谷镰刀菌悬液的滴注量为每个所述小穗上滴注10μl。

进一步地，在滴注完成后，采用网室弥雾对接受赤霉菌悬液感染的每个所述小穗持续喷水保湿3天。

进一步地，在接种后21天进行赤霉病的病情调查并拍照，记录感病小穗率或病小穗数，病小穗率(PSS)＝(感染小穗数/总小穗数)×100％。

进一步地，抗赤霉病小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c中与赤霉病抗性基因紧密连锁的分子标记2个，是CIT03G053和CIT03G177，引物设计时参考的基因序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的核酸分子：(设计标记所用的基因序列)。

进一步地，提供一种检测前述与赤霉病抗性基因紧密连锁的分子标记的引物对，

CIT03G053是如下的引物对：由序列如SEQ ID NO 3(TTGTGAGGCTGTTGTTCGTG)和SEQ ID NO 4(TGCAAGGACACTCTTCTCCA)所示分子组成的引物对用于检测序列如SEQIDNO.1所示的核酸分子；

CIT03G177是如下的引物对：由序列如SEQ ID NO 5(GGCTCAGTCCGCTAATGTTT)和SEQ ID NO 6(TCCTCCAGCATCTACAAGCC)所示分子组成的引物对用于检测序列如SEQIDNO 2所示的核酸分子；

SEQ ID NO.1：对应的基因序列

SEQ ID NO.2：对应的基因序列

进一步地，该引物的用途，如鉴定小麦-纤毛鹅观草结构变异体中是否含有3S染色体的用途；

进一步地，基于上述引物的PCR方法以及该方法用于鉴定3S染色体的用途。

进一步地，抗赤霉病小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c在小麦抗病育种中的用途。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：

本发明选育得到的小麦-纤毛鹅观草易位系二体异附加系DA3S^c可用于小麦抗赤霉病育种；分子标记的引物可用于鉴定小麦-纤毛鹅观草结构变异体中是否含有3S染色体，提高抗病育种效率。

附图说明

图1小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c的分子标记鉴定，a：纤毛鹅观草染色体3S长臂扩增的156bp条带(箭头指示)；b：纤毛鹅观草染色体3S短臂扩增的542bp条带(箭头指示)。(M：分子量标记DL2000；-：F₂中无外源染色体3S的单株；+：F₂中有外源染色体3S的单株；A：矮抗58；K：DA3S^c)；

图2小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c的赤霉病抗性鉴定，左图：有外源3S染色体的添加系单株；右图：无外源染色体3S的单株；

图3小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c的细胞遗传学鉴定，a：小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c染色体DAPI染色；b：小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c根尖有丝分裂中期染色体GISH；c：小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c根尖有丝分裂中期染色体FISH；d：b和c整合的小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c的染色体详细组成。(染色体用DAPI染色，颜色为蓝色；绿色为用fluorescein-l2-dUTP标记的纤毛鹅观草基因组DNA探针的信号；红色为pAs1-1、pAs1-4、pAs1-6和pSc119.2-1寡核苷酸探针的信号)。

具体实施方式

实验材料：

普通小麦(Triticum aestivum)品种中国春和矮抗58由南京农业大学细胞遗传研究所引进和提供；纤毛鹅观草(Roegneria ciliaris，引种号W614249)引自WesternRegional Plant Introduction Station，USA；普通小麦日本小麦品种(Inayama Komugi，IK)和Inayama Komugi-纤毛鹅观草双二倍体(Inayama Komugi-R.ciliaris amphiploid，引种号TA3427)引自美国堪萨斯州立大学小麦遗传资源中心(KSU WGRC，USA)；一整套Inayama Komugi-纤毛鹅观草二体异附加系DA1S^c-DA7S^c和DA1S-DA7S由南京农业大学细胞遗传研究所创制。

实施例1矮抗58背景中添加一对纤毛鹅观草3S^c染色体植株的获得

以中国春为母本，普通小麦Ik-纤毛鹅观草双二倍体为父本，利用GISH/FISH技术从BC₁F₆中鉴定中国春-纤毛鹅观草染色体的一整套二体异附加系，连续多年多点赤霉病抗性鉴定，获得中国春-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c高抗小麦赤霉病株。

选普通小麦品种矮抗58正在开花的穗子，即穗子中部的小花花药呈淡绿色或微黄色，用中国春-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c授粉，收获F₁代种子；F₁套袋自交，通过3S染色体追踪性分子标记和荧光原位杂交技术检测F2中含有3S染色体的单株，然后套袋自交，通过GISH/FISH技术检测F₃中添加有一对纯合的3S染色体的单株。

种植鉴定出的含有纯合纤毛鹅观草3S染色体的种子，即得到二体异附加系DA3S^c植株。在扬花期，选取各植株靠近穗中部正在开花的小穗，将禾谷镰刀菌悬液滴注到小穗的基部，使植株接受赤霉菌悬液的感染，其中禾谷镰刀菌悬液的浓度为5000个/ml，禾谷镰刀菌悬液的滴注量为每个小穗上滴注10μl。在接菌完成后，连续3天，利用网室迷雾装置持续喷水保湿。在接菌21天后，检测植株的赤霉病抗性。

本实施例一共完成检测矮抗58×DA3S^cF₂待测植株样本92份，结果显示，在92份样本中，抗赤霉病的小麦-纤毛鹅观草的植株有27份，感赤霉病的小麦-纤毛鹅观草易位系有65份；含有3S的小麦-纤毛鹅观草的赤霉病抗性植株自交，F3获得40株添加有一对纯合的3S染色体的单株。

实施例2分子标记的获得

利用南京农业大学细胞遗传研究所前期开发的第3部分同源群的198个IT标记中国春、IK、纤毛鹅观草和IK-纤毛鹅观草双二倍体及DA3S^c中进行PCR扩增，筛选可以追踪纤毛鹅观草3S染色体的分子标记。最终筛选到22个分子标记。

利用本实施例一92份矮抗58×DA3S^cF₂待测植株样本(通过实施例1中方法获得)对22个分子标记进行扩增，结合赤霉病抗性，得到2个扩增条带清晰、与抗赤霉病抗性紧密连锁的分子标记CIT03G053和CIT03G177，它们的序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。

实施例3待测植株中分子标记CIT03G053和CIT03G177的检测

检测分子标记CIT03G053的引物为CIT03G053 Primer F和CIT03G053 Primer R，它们的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；CIT03G177的引物为CIT03G177PrimerF和CIT03G177 Primer R，它们的序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

检测的过程如下：

提取92份矮抗58×DA3S^cF₂待测植株的基因组DNA，以所提取的基因组DNA为模板，分别以CIT03G053 Primer F和CIT03G053 Primer R以及CIT03G177 Primer F和CIT03G177Primer R为引物对其进行PCR扩增，反应结束后，电泳检测PCR反应产物，分别能扩增出相应的156bp和542bp DNA条带，即为含有纤毛鹅观草3S染色体的植株，其中，所使用的PCR反应体系如下表1所示：

表1实施例3的PCR反应体系

涡旋混匀，离心后加一滴石蜡油，防止在PCR过程中水分蒸发。

PCR的反应程序如下表2所示：

表2实施例3的PCR扩增程序

PCR程序结束后，将扩增产物置于4℃冰箱进行保存。

PCR扩增产物的检测如下：在PCR扩增产物中加入2.0μL loading buffer，离心，取1.5-2μL PCR扩增产物加入8％聚丙烯酰胺凝胶中(39：1)进行电泳检测。电泳缓冲液1×TBE，电泳电压200V，电泳时间50min左右。电泳结束后，参照依据银染法对PCR扩增产物进行检测。银染方法：用0.1％AgNO₃溶液染10-15min，用ddH₂O冲洗30sec，在用2％NaOH和1％甲醛混合溶液染5-10min后，用自来水冲洗2-3次，拍照。

电泳检测的结果如图1所示：图1中，各泳道从左到右依次是Marker：分子量标记DL2000；-：F₂中无外源染色体3S的单株；+：F₂中有外源染色体3S的单株；A：矮抗58；K：DA3S^c。箭头指示纤毛鹅观草染色体3S长臂和短臂扩增的条带。从图1可以看出，在抗赤霉病小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c中能扩增出对应于156bp(长臂)和542bp(短臂)位置的DNA条带，而在无外源染色体的单株中则扩增不出相应条带。上述有外源3S和无外源的赤霉病抗性鉴定结果如图2所示，图2中，左图是含有小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c的材料，右图是不含有小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c的材料。从图2可以看出，含有小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c的材料对赤霉病抗性表现高抗，不含有小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c的材料对赤霉病表现高感，这与图1的检测结果一致。

实施例4：纯合的抗赤霉病小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c的细胞学检测染色体中期同步化处理

(1)小麦种子萌发：将种子放置于垫有两层滤纸的培养皿中，加ddH₂O至种子刚好浸没，之后将培养皿转移到25℃恒温箱中，恒温放置18-24h，至种子露白后将培养皿中多余的水倒掉，仅保持滤纸湿润状态，之后将培养皿转移至4℃冰箱，放置24h后，将培养皿再转移到25℃恒温箱中避光、恒温生长约18-24h(小麦种子根长约2cm)。

(2)染色体中期同步化处理：观察小麦种子的根生长状态，待根长至约1.5-2cm时，直接向培养皿中加入2μmol/LAPM(amiprophos-methyl，甲基氨草磷)溶液至根被完全浸没(2μmol/L APM溶液现配现用)，之后将培养皿置于25℃培养箱生长处理2h，最长处理时间不能超过3h。

(3)笑气处理：APM溶液处理完小麦的根之后，用流动的水冲洗根部5min，直至将APM冲洗干净，剪根，把剪下来的根放到带孔的1.5mL的离心管中，之后用压强为0.8-1.0MP笑气处理1.5-2h。

(4)固定处理：用提前放在4℃冰箱中预冷的90％冰醋酸固定根7-10min，之后用吸水纸将根上的醋酸吸取干净，再将根尖转移到70％的酒精中-20℃保存。

根尖细胞中期染色体制片

染色体制片的方法是压片法，主要参照Gill and Kimber(1974)的方法稍作改动。试验中，从70％的酒精中取出根尖，放入滴有45％醋酸的白瓷盘中解离10min以上，切除根冠，切取根尖小部分分生区组织置于干净的世泰载玻片上，滴一滴45％的醋酸，盖上18mm×18mm干净的盖玻片，先用刀片垫在盖玻片一角，再用镊子或者牙签轻敲盖玻片，待细胞分散后，用酒精灯外焰轻轻烘烤载玻片，待盖玻片处雾气散开后，垫一层干燥的滤纸，轻轻按压载玻片；之后，放在相差显微镜下进行镜检，选取染色体形态较好、数目完整且分散度较好的制片放入-70℃冰箱中冷冻过夜。用双面刀片揭去盖玻片，无水乙醇脱水半小时以上，气干后进行后续荧光原位杂交实验。

全基因组DNA探针标记：

探针标记采用缺刻平移法，具体参照Zhang等(2004)的程序。所使用的全基因组DNA探针反应体系如下表3所示：

表3实施例4的全基因组DNA探针反应体系

在冰上操作，探针混合液混匀离心后，迅速将混合液置于PCR仪中，16℃反应2h，程序结束后将探针放在-20℃保存。

寡核苷酸探针的标记：

本研究所用的寡核苷酸探针(GAA)₁₀、Oligo-pAs1-1和Oligo-pSc119.2-1(Du etal.，2017)由南京擎科生物科技有限公司合成，直接在序列5’-末端进行FAM(Carboxyfluorescein，羟基荧光素)或TAMRA(Carboxytetramethykhodamine，羧基四甲基罗丹明)修饰。

荧光原位杂交：

荧光原位杂交过程中，杂交液的配制如表4：

表4实施例4的荧光原位杂交杂交液配制

将杂交液按上述配方依次加入200μL离心管，反复涡旋、离心1-2次，混匀，在105℃条件下变性13min，之后立即放入冰水中，防止单链复性。制片变性：制片在0.15mol/L的NaOH的70％酒精溶液中变性5min；之后，依次在70％、70％和100％的两个梯度的酒精中脱水，各5min；气干备用。杂交：每张制片滴加15μL杂交液，盖上20mm×20mm盖玻片，37℃杂交至少6h。洗片：将杂交完成的制片取出，轻轻甩去盖玻片，42℃水浴条件下，用ddH₂O洗10min，气干。染色及镜检：镜检之前先用染色，即每张制片上滴加7μL含DAPI(4′，6-diamidino-2-phenylindole，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)的H1200(VECTA)防荧光淬灭剂，盖上干净的24mm×24mm盖玻片，用滤纸吸去多余的胶。染色后，将制片放在Olympus BX51型荧光显微镜下进行观察，并用OLYMPUS DP72型CCD(Cooled Color Digital，彩色数字相机)相机拍摄图像(图3)。

从图3可以看出，该二体异附加系DA3S^c的体细胞染色体数目是2n＝44＝22II(图3a)；参考普通小麦中国春的标准核型，可以看出该添加系中含有完整的小麦42条染色体及1对纯合的纤毛鹅观草3S染色体(图3b-d)。

Claims

1.一种抗赤霉病小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c中与赤霉病抗性紧密连锁的分子标记的引物在鉴定小麦-纤毛鹅观草结构变异体中是否含有3S染色体中的用途；

所述抗赤霉病小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c中与赤霉病抗性紧密连锁的分子标记，为CIT03G053和CIT03G177，基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

所述CIT03G053的引物为CIT03G053 Primer F和CIT03G053 Primer R，序列分别如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

所述CIT03G177的引物为CIT03G177 Primer F和CIT03G177 Primer R，序列分别如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：提取小麦-纤毛鹅观草二体异附加系DA3S^c待测植株的基因组DNA，以所提取的基因组DNA为模板，分别以CIT03G053 Primer F和CIT03G053 Primer R以及CIT03G177 Primer F和CIT03G177 Primer R为引物对其进行PCR扩增，反应结束，电泳检测PCR反应产物，分别扩增出相应的156bp和542bp DNA条带，即表明待测植株含有3S染色体。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：PCR反应体系为：

模板DNA1.0μL；2×Taq Mix 5.0μL；Primer F 0.2μL；Primer R 0.2μL；ddH₂O 3.6μL；总体系10.0μL。