CN112586345B - 一种萝卜与甘蓝型油菜属间杂交转移抗根肿病基因的方法 - Google Patents

一种萝卜与甘蓝型油菜属间杂交转移抗根肿病基因的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种萝卜与甘蓝型油菜属间杂交转移抗根肿病基因的方法，具体包括以下步骤：抗病萝卜的鉴定和筛选；甘蓝型油菜与抗病萝卜的远缘杂交：利用有性杂交与子房培养相结合的方法获得属间杂交种，以获得抗根肿病的桥梁材料；杂交种与甘蓝型油菜回交筛选：对F1代真杂种加倍处理得到S0，并与甘蓝型油菜回交，对BC1代进行抗性鉴定，筛选抗病植株，作为继续培育油菜抗病品种的中间材料。本发明通过抗病性鉴定、有性杂交和子房培养方法，结合形态学、细胞学及分子检测技术，将萝卜中的抗根肿病基因导入到油菜中，育种家多年选育获得高抗优质油菜品种，用于油菜根肿病发病较高的地区农户种植，提高种植收益。

Description

一种萝卜与甘蓝型油菜属间杂交转移抗根肿病基因的方法
技术领域
本发明涉及抗病植物技术领域，更具体的说是涉及一种萝卜与甘蓝型油菜属间杂交转移抗根肿病基因的方法。
背景技术
根肿病(Clubroot)俗称根瘤病，即植物的根部肿大变形，类似肿瘤状。该病主要发生在十字花科作物上，由原生生物芸薹根肿菌(P.brassicae Woron)侵染其根部引起，是一种历史久远、难于防治的世界性土传病害。芸薹根肿菌可以侵染几乎所有的十字花科作物，栽培类作物受影响更为严重，包括所有的甘蓝品种、油菜、芜菁类。植株受侵染后，初期不会表现出症状，一段时间后，根部薄壁细胞开始出现不正常分裂，细胞变得肿大，形成所谓的肿瘤，严重者主侧须根上均形成瘤状肿大。
中国是世界油菜主产国，油菜也成为我国第一大油料作物，其不仅是作为食用油使用，并且也是重要的工业原料和可再生能源的主要生物资源，因此油菜产业在我国种植业结构中占有非常重要的地位。由于我国引入甘蓝型油菜的时间并不长，生产上应用的油菜品种大多不抗根肿病。因此，根肿病已成为我国油菜产业的重大威胁因子。油菜苗期和成熟期均可感染根肿病，苗期感染率为17％，成熟期平均发病率为15％，而15％的发病率即可使产量损失达10.2％。在我国发病严重的区域，发病率要远高于15％，其产量和经济损失是巨大的。
目前传统农业防治不能取得良好的效果。化学防治是应用最多的方法，但药剂的成本较高，生产上很难承受，种植抗病品种是公认的防治根肿病最为安全有效的方式。自然甘蓝型油菜在长期的进化和驯化工程中，遗传多样性并不丰富，遗传资源越来越匮乏，大部分的抗性存在于其祖先二倍体芸薹属物种芜菁，黑芥和甘蓝中，且培育出得抗病品种通常具有生理小种特异性，加之病原菌变异迅速，使得其抗性不能持久。到目前为止，已经通过芸薹属物种的抗性基因的渐渗开发了一些抗根肿病的蔬菜品种。然而，很少有抗性油菜品种的报道。Diederichsen(2009)通过将来自芜菁(B.rapa)和羽衣甘蓝(B.oleracea)的抗性基因转移到其中培育出第一个抗性油菜品种“Mendel”。但野外抗性在田间迅速被打破，可能是由于强烈的选择压力。
因此，如何提供一种萝卜与甘蓝型油菜属间杂交转移抗根肿病基因的方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种萝卜与甘蓝型油菜属间杂交转移抗根肿病基因的方法，筛选出对多个根肿菌小种抗病的萝卜材料，并与感病甘蓝型油菜杂交，以获得抗根肿病的中间材料，用于抗病甘蓝型油菜品种的选育，既丰富抗性基因的种类，增加油菜抗根肿病的效率和抗谱。本发明通过抗病性鉴定、有性杂交和子房培养方法，结合形态学、细胞学及分子检测技术，将萝卜中的抗根肿病基因导入到油菜中，育种家多年选育获得高抗优质油菜品种，用于油菜根肿病发病较高的地区农户种植，提高种植收益。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种萝卜与甘蓝型油菜属间杂交转移抗根肿病基因的方法，具体包括以下步骤：
S1、抗病萝卜的鉴定和筛选：萝卜抗源通过接种重病区的根肿菌，再经抗病性鉴定，筛选出抗性强的萝卜品种，为油菜抗根肿病育种提供抗源材料；
S2、甘蓝型油菜与抗病萝卜的远缘杂交：利用有性杂交与子房培养相结合的方法获得属间杂交种，以获得抗根肿病的桥梁材料；
S3、杂交种与甘蓝型油菜回交筛选：对步骤(2)得到的F1代真杂种加倍处理得到S0，并与甘蓝型油菜回交，得到BC1代；
对BC1代进行抗性鉴定，筛选抗病植株，作为继续培育油菜抗病品种的中间材料。
采用上述技术方案的技术效果：根肿菌均来自于当地发病严重的新鲜肿根，以保证抗性材料的实用性。
优选地，在步骤S1中，萝卜抗源选自东北、华北、西南地区。
采用上述技术方案的技术效果：由于根肿菌生理小种具有丰富的变异多样性，我们便采集多地区的肿根进行鉴定，以筛选具有多地区，多生理小种抗性的材料。
优选地，在步骤S2中，结合形态学，细胞学，分子生物学手段检测杂交种的真实性。
优选地，在步骤S2中，以甘蓝型油菜为母本，抗病萝卜为父本，进行有性杂交。
在步骤S2中，按生长期长短种植油菜与萝卜品种，保证其花期相遇，在开花前一天将发育良好的油菜花蕾去雄，然后取父本萝卜当天开放的新鲜花粉，涂抹在甘蓝型油菜的柱头上后套袋，重复三天，授粉后一周，去除纸袋，一部分植株留在田间不再做其他处理，另一部分采集回实验室，作子房培养处理。
优选地，在步骤S2中，所述子房培养的培养基为添加水解酪蛋白的MS培养基。
优选地，所述MS培养基包括浓度为0.05-0.1％的水解酪蛋白，浓度为0.8-1.0％的琼脂，以及浓度为3.0-5.0％的蔗糖。
优选地，采用Epics Altra流式细胞仪对杂种植株及其亲本的细胞DNA含量进行测定分析。
优选地，采用分子标记开发、亲本和F1DNA提取、PCR扩增进行分子标记检测。
优选地，通过染色体制片观察、秋水仙素加倍、花粉育性检测和亲本及BC1根肿病抗性检测获得具有根肿病抗性的种子。
本发明的研究内容：萝卜作为油菜的近缘种，有研究证明其对根肿病的抗性要远高于甘蓝型油菜。本研究主要的研究内容是在前期筛选出多个根肿菌小种抗病的萝卜材料，并与感病甘蓝型油菜杂交，以获得抗根肿病的中间材料，用于抗病甘蓝型油菜品种的选育。
研究内容一：抗病萝卜的鉴定和筛选
本研究的萝卜抗源分别来自东北、华北、西南等地区，共20余材料，通过接种国内重病区的根肿菌，以鉴定筛选抗多个根肿病小种优良的种质材料。
研究内容二：甘蓝型油菜与抗病萝卜的远缘杂交
将前期实验中已经筛选得到的高抗及免疫的萝卜品种，借助远缘杂交的手段将萝卜中的抗性转移到甘蓝型油菜中，以获得抗根肿病的桥梁材料。
研究内容三：杂交种与甘蓝型油菜回交筛选
通过形态学，细胞学，分子生物学手段检测，获得F1代真杂种。进行加倍处理得到六倍体S0，并与母本甘蓝型油菜进行回交，并且对BC1代进行抗性鉴定，筛选抗病植株，作为继续培育油菜抗病品种的中间材料。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开的一种萝卜与甘蓝型油菜属间杂交转移抗根肿病基因的方法，具有如下有益效果：
(1)本发明通过抗病性鉴定，筛选出优良的抗病萝卜品种，进而通过有性杂交和子房培养方法，结合形态学、细胞学以及分子检测技术，将油菜近缘种萝卜中的抗根肿病基因导入到油菜中，以期获得具有免疫或高抗根肿病的中间材料，进而拓宽甘蓝型油菜的根肿病抗性遗传基础，对应对油菜根肿病抗性基因单一带来的抗性易丧失问题提供更多可供选择利用的物质资源。
(2)本发明公开的一种萝卜与甘蓝型油菜属间杂交转移抗根肿病基因的方法中，抗根肿病鉴定与筛选技术创新：目前我国各地的根肿菌生理小种混杂，生理小种的变异也使得研究变得困难。这一现象使得抗病育种由筛选抗某一生理小种的材料，转变为培育抗某地区病原菌的品种。因此，本研究根肿菌均来自于当地发病严重的新鲜肿根，以保证抗性材料的实用性。又由于根肿菌生理小种具有丰富的变异多样性，我们便采集多地区的肿根进行鉴定，以筛选具有多地区，多生理小种抗性的材料。
(3)本发明公开的一种萝卜与甘蓝型油菜属间杂交转移抗根肿病基因的方法中，萝卜油菜远缘杂交技术创新：以甘蓝型油菜为母本，抗性萝卜品种为父本。按生长期长短种植油菜与萝卜品种，保证其花期相遇。在开花前一天将发育良好的油菜花蕾去雄，然后取父本萝卜当天开放的新鲜花粉，涂抹柱头上后套袋，重复三天。授粉后一周，去除纸袋。一部分植株留在田间不再做其他处理，另一部分采集回实验室，作子房培养处理。
(4)本发明公开的一种萝卜与甘蓝型油菜属间杂交转移抗根肿病基因的方法中，杂交种检测技术创新：采用Epics Altra流式细胞仪对杂种植株及其亲本的细胞DNA含量进行测定分析；使用萝卜特异性引物进行PCR扩增检测，真正的F1杂交应该具有与其父本萝卜相同的条带，杂交种不存在这样的条带表明为假杂种；通过染色体制片观察、秋水仙素加倍、花粉育性检测和亲本及BC1根肿病抗性检测最终获得具有根肿病抗性的种子。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例中萝卜与甘蓝型油菜属间杂交转移抗根肿病基因的方法的流程图。
图2附图为本发明实施例中亲本及6株F1植株的分子标记检测图。
图3附图为本发明实施例中真杂交种染色体数目观察染色图。
图4附图为本发明实施例中S0及BC1植株染色体数目观察染色图。
图5附图为本发明实施例中花粉育性检测图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中，孢子悬浮液提取方法为：从-80℃冰箱取出适量病根，自然腐烂5d。待完全腐烂后，用剪刀切碎根瘤放入粉碎机(Philips，HR1811)，加适量蒸馏水粉碎至匀浆，使用8层纱布过滤。室温下，使用离心机1700rcf离心5min。之后弃上清，在沉淀中加50％蔗糖溶液悬浮，1700rcf离心10min。吸取上清，2000rcf离心10min。倒掉上清，沉淀加蒸馏水重悬、混匀，得到孢子悬浮液。用血球计数板计数孢子悬浮液浓度。
抗病性鉴定方法具体为：
根肿病的分级标准参考按照0～3级划分为四级，具体依据：0级，根系发育正常；1级，主根发育正常，1/3以下的侧根有少量肿瘤；2级，主根上或1/3～2/3侧根上形成肿瘤；3级，主根和2/3以上侧根上形成较大肿瘤。三个重复分别计算病情指数，以平均值作为筛选标准。
病情指数计算公式：DI＝∑(发病级代表值×各级病株数)/(调查总株数×最高发病级代表值)×100。
规定平均值DI＜10为抗病，DI≥10为感病，DI＝0为免疫。本实施例中以该标准为准筛选DI＜10的萝卜品种作为杂交亲本。
Epics Altra流式细胞仪对杂种植株及其亲本的细胞DNA含量的测定分析方法具体为：将采集好的新鲜叶片剪碎放入培养皿中，加入600μL的细胞核分离缓冲液，充分搅拌。之后用1000μL的吸样枪吸取样品，用400目的滤网筛过滤，过滤后离心以便进一步去除细胞碎片和黏连细胞，体积约为500μL，加入1μL筛过的1mg/ml的DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚)染色液染色。染色过后，将样品放入样品杯上机检测，加入50μLDAPI染液和50μL参比(一滴鲑鱼红细胞和600μLDAPI染液混合液，混匀后于冰上保存备用)，细胞样品需保持足够的细胞数量，约1×105至1×107个/mL。5min后检测细胞倍性。
秋水仙素加倍的方法为：MS培养基分装灭菌后，在冷却过程中抽滤加入0.01％的秋水仙碱。为避免污染和毒性，操作要在超净工作台中佩戴手套进行。鉴定出真杂种后，将带有腋芽的组培苗转移到附加了0.01％秋水仙碱的MS培养基中，置于生长间中处理10天后，在超净工作台中切除植株沾染了秋水仙碱的底部，并移栽到添加了0.2mgL-1NAA的MS培养基中，待其生根后，移出培养基，洗净根部移植到营养土中，形成完整植株。
花粉育性检测方法具体为：于天气晴朗的上午9：00-10：00取杂种植株的新鲜花粉，每个单株取两朵花各一个花药，用镊子夹住花药，在载玻片上轻轻擦拭，使花粉沾到载玻片上，滴加1％的醋酸洋红染色30s，之后盖上盖玻片，用滤纸在一侧将染液轻轻吸走，置于光学显微镜下观察，大而圆且可着色的为有活性花粉，小而瘪且不能着色的为无活性花粉。每个单株观察花粉总数在200～300个，计算花粉活性，花粉成活率(％)＝着色的花粉粒数/视野内花粉总粒数×100％，以亲本油菜为对照。
亲本及BC1根肿病抗性检测方法具体为：采集PbZJ用来检测亲本及BC1的抗病性，将菌土分装好后，同批次点播萝卜与油菜种子20粒，出苗后各留15株，45天后调查。以甘蓝型油菜与加倍后的F1正反交，共收获200多粒，挑选颗粒饱满的种子检测其抗性。
本发明的实施方案具体包括：
a、通过抗病性鉴定，筛选出抗性强的萝卜品种，为油菜抗根肿病育种提供抗源材料。
b、利用有性杂交与子房培养相结合的方法获得属间杂交种，结合形态学，细胞学，分子生物学手段检测杂交种的真实性。
c、对F1代真杂种加倍处理得到S0，并与甘蓝型油菜回交。
d、对BC1代进行抗性鉴定，筛选抗病植株，作为继续培育油菜抗病品种的中间材料。
实施例1
本实施例提供一种萝卜与甘蓝型油菜属间杂交转移抗根肿病基因的方法，如图1所示，具体包括以下步骤：
S1、抗病萝卜的鉴定和筛选：收集来自东北、华北、西南等地区萝卜品种共20余份，通过接种重病区的根肿菌，再经抗病性鉴定，筛选出抗性强的萝卜品种，为油菜抗根肿病育种提供抗源材料；
萝卜品种具体包括：501水萝卜，中国哈尔滨亚奇种苗有限责任公司；新美心樱桃萝卜，北京北农种业有限公司；满堂红心里美萝卜，北京市芳萱苑种子有限公司；象牙白萝卜，北京聚宏种苗技术有限公司；京研叶用萝卜，北京京研益农科技发展中心；渔阳408大红萝卜，天津市蓟县京津蔬菜种苗繁育站；一品翠红萝卜，天津市蓟县京津蔬菜种苗繁育站；板叶卫青，天津市蓟县京津蔬菜种苗繁育站；蓟农红小五樱萝卜，沭阳县颜集镇沭颜园林绿化苗；红脸蛋萝卜，寿光先正达种子有限公司；红心红皮萝卜，绵阳市涪城区益丰禾种子服务部。
菌种来源具体为：湖北恩施，油菜B.napus，简称：PbES；湖北枝江，油菜B.napus，简称：PbZJ4；安徽黄山，油菜B.napus，简称PbHS4；湖北黄陂油菜B.napus，检测：PbHP7；四川郫县，白菜B.rapa，简称：PbPX4；四川德阳，油菜B.napus，简称：PbDY4；辽宁沈阳，大白菜B.rapa，简称：PbSY2；云南大理，大白菜B.rapa，简称：PbDL10；山东青岛，大白菜B.rapa，简称：PbQD4。
S2、甘蓝型油菜与抗病萝卜的远缘杂交：在江苏沿海地区农业科学研究所青海试验基地按生长期长短种植油菜与萝卜品种，保证其花期相遇；云南繁殖油菜与萝卜杂交后代，并且与油菜亲本回交，利用有性杂交与子房培养相结合的方法获得属间杂交种，结合形态学，细胞学，分子生物学手段检测杂交种的真实性，以获得抗根肿病的桥梁材料；
使用九对萝卜特异性引物进行PCR扩增检测，真正的F1杂种应该具有与其父本萝卜相同的条带，杂种中不存在这样的条带表明为假杂交。其检测结果如图2所示。显示萝卜亲本和2株F1杂种(F1-1和F1-4)中检测到相同大小的条带，而油菜亲本和其他四种F1杂种条带缺失。9对引物的凝胶电泳条带显示出了相同的结果，说明真杂种中含有父本萝卜的全部染色体。萝卜特异性引物分子标记检测结果与流式细胞仪的检测结果相符。
在植株开花前，对幼嫩的雌蕊处理后观察染色体数目，结果显示，在六株F1代植株中仅有F1-1(图3A)和F1-4(图3B)两株检测到了28条染色体，其余四株均表现出与母本油菜相同的染色体条数，鉴定为假杂种。染色体数目观察结果与流式细胞仪、分子标记检测结果相符。
S3、杂交种与甘蓝型油菜回交筛选：对F1代真杂种加倍处理得到S0，并与甘蓝型油菜回交，对BC1代进行抗性鉴定，筛选抗病植株，作为继续培育油菜抗病品种的中间材料，并通过孢子悬浮液提取、实验室出苗试验、病害分级与指数计算、抗性等级最终划分等技术确定萝卜抗根肿病品种。
通过0.01％的秋水仙素处理两株真杂种，扩繁得到60多个单株。共移栽到大田23株，在花期，有3株表现出加倍性状，即S0代，观察其雌蕊细胞如图3，经过秋水仙素处理成功的S0植株的染色体数目由原来的28条加倍为56条(图4A)。而回交后，植株的染色体数目除了正常的47条外(图4B)，还存在染色体丢失现象，有一开黄花的BC1植株的染色体仅存在43条(图4C)，其对根肿菌仍具有抗性。
花粉育性观察中发现，F1植株在未加倍时均无花粉，且雄蕊败育。采集母本与S0植株的花粉粒，经醋酸洋红染色处理后，各统计了5个视野，约1000粒花粉。计算五组数据的平均值，结果显示母本油菜的花粉育性在99％左右。S0共选择了5个视野，总计904个花粉，每个视野花粉活力分别为35.9％，37.8％，38.9％，36.5％，35.8％。如图5，对母本和S0的花粉粒形态观察发现，甘蓝型油菜(图5A)与S0(图5B)的可育花粉粒大而圆，且花粉粒壁不易破碎，S0可育花粉粒要略大于油菜的花粉粒。
在杂交前对9种父本萝卜和母本同时期接种根瘤菌，45天后调查，发病严重，叶片出现萎蔫现象，而九种萝卜对于根瘤菌的抗性明显，均无发病迹象，属于高抗品种。
本实施例中在江苏沿海地区农业科学研究所青海试验基地按生长期长短种植油菜与萝卜品种，保证其花期相遇；采用Epics Altra流式细胞仪对杂种植株及其亲本的细胞DNA含量进行测定分析；采用分子标记开发、亲本和F1的DNA提取、PCR扩增等技术进行分子标记检测；通过染色体制片观察、秋水仙素加倍、花粉育性检测和亲本及BC1根肿病抗性检测最终获得具有根肿病抗性的种子。
本实施例中涉及到油菜和萝卜的秋播和南繁加代，所涉及到的基地有两个：(1)每年的9月至第二年的5月油菜和萝卜秋播种植，基地为江苏沿海地区农业科学研究所青海试验基地，该基地拥有400亩试验田、1500平方米的温室大棚、1500平方米的区试实验室和100多台(套)实验仪器。人工智能温室、智能光照培养箱等配套设施完善。(2)每年6月至10月，我所具有长期合作的云南省农科院崇明科研基地承担油菜夏繁任务，由于是南繁加代，所需田亩不多，一亩地左右即可。
本实施获得了油菜与萝卜的杂交种，F1代三倍体形态介于亲本之间，主要是营养生长，雄蕊败育。实验过程中利用秋水仙素加倍幼嫩的茎(带腋芽)的方法得到了S0代植株，并且检测S0代植株花粉具有部分育性，但与正常油菜相比有较大的差距。雌蕊压片显示，经过秋水仙素处理的植株并非完全的六倍体，有一部分侧枝，仍旧表现为单倍体性状，染色体条数为28条表明利用秋水仙素加倍的方法具有不能完全加倍以及加倍时长待优化的缺陷。利用得到的花粉在反复的自交过程中发现，将花粉人工授到去雄的甘蓝型油菜上时，收获了少量种子，且作为父本与甘蓝型油菜的回交时得到200多粒种子。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (4)

1.一种萝卜与甘蓝型油菜属间杂交转移抗根肿病基因的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、抗病萝卜的鉴定和筛选：萝卜抗源通过接种重病区的根肿菌，再经抗病性鉴定，筛选出抗性强的萝卜品种，为油菜抗根肿病育种提供抗源材料；
S2、甘蓝型油菜与抗病萝卜的远缘杂交：利用有性杂交与子房培养相结合的方法获得属间杂交种，以获得抗根肿病的桥梁材料；在步骤S2中，以甘蓝型油菜为母本，抗病萝卜为父本，进行有性杂交；
S3、杂交种与甘蓝型油菜回交筛选：对步骤S2得到的F1代真杂种加倍处理得到S0，并与甘蓝型油菜回交，得到BC1代；
对BC1代进行抗性鉴定，筛选抗病植株，作为继续培育油菜抗病品种的中间材料；
在步骤S2中，结合形态学，细胞学，分子生物学手段检测杂交种的真实性；
在步骤S2中，所述子房培养的培养基为添加水解酪蛋白的MS培养基；
所述MS培养基包括浓度为0.05-0.1％的水解酪蛋白，浓度为0.8-1.0％的琼脂，以及浓度为3.0-5.0％的蔗糖；
采用EpicsAltra流式细胞仪对杂种植株及其亲本的细胞DNA含量进行测定分析；
采用分子标记开发、亲本和F1DNA提取、PCR扩增进行分子标记检测。
2.根据权利要求1所述的一种萝卜与甘蓝型油菜属间杂交转移抗根肿病基因的方法，其特征在于，在步骤S1中，萝卜抗源选自东北、华北、西南地区。
3.根据权利要求1所述的一种萝卜与甘蓝型油菜属间杂交转移抗根肿病基因的方法，其特征在于，在步骤S2中，按生长期长短种植油菜与萝卜品种，保证其花期相遇，在开花前一天将发育良好的油菜花蕾去雄，然后取父本萝卜当天开放的新鲜花粉，涂抹在甘蓝型油菜的柱头上后套袋，重复三天，授粉后一周，去除纸袋，一部分植株留在田间不再做其他处理，另一部分采集回实验室，作子房培养处理。
4.根据权利要求1所述的一种萝卜与甘蓝型油菜属间杂交转移抗根肿病基因的方法，其特征在于，通过染色体制片观察、秋水仙素加倍、花粉育性检测和亲本及BC1根肿病抗性检测获得具有根肿病抗性的种子。
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萝卜与芸薹属远缘杂交不亲和性克服及DNA 甲基化的研究进展;郭晓灿等;《江苏农业科学》;20191231;第47卷(第22期);第12页第1节，表1 *

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