CN111357642B - 一种大白菜的育种方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种大白菜的育种方法，属于作物育种技术领域。本发明的育种方法以黄芯春大白菜、山地王2号大白菜和CR‑福将大白菜为亲本，通过杂交、筛选，得到基因型为RCrr1aCrr1aRCrr3 Crr3RCRcCRc的抗性位点纯合单株，获得白菜新品种。本发明通过基因聚合手段，将根肿病抗性基因Crr1a、Crr3和CRc聚合到大白菜中，实现持久抗性。同时本发明利用与目标基因紧密连锁的分子标记对抗病性进行选择，不受植株生长发育时期和环境条件的限制，降低了误选目的基因的可能性，显著提高了目标性状选择的准确性和抗病育种工作的效率。

Description

一种大白菜的育种方法
技术领域
本发明涉及作物育种技术领域，尤其涉及一种大白菜的育种方法。
背景技术
大白菜(Brassica rapa subsp.pekinensis)是十字花科芸薹属中的常见蔬菜，种植和分布面积广，是我国菜篮子中的重要蔬菜。近年来，由于芸薹根肿菌的侵染，大白菜根肿病频发，且在世界范围内的危害面积日益扩大，导致大白菜的品质和产量受到了极大影响。由于根肿菌在土壤中的存活时间长，携带休眠孢子的土壤很容易导致病害的持续发生，而且利用农业、化学和生物等防治手段不能从根本上解决根肿病的防治问题，所以，培育抗根肿病的大白菜新品种是防治该病的最佳方法。
目前根肿病防治中最难克服的问题之一是在种植过程中根肿菌生理小种会发生变化，多年种植单一的抗病品种，最后会使得抗病品种抗性丧失，这主要是由于根肿菌大多混生，繁殖力超强，在繁殖过程变迅速积累了一些变异，随着某一抗病品种的长期种植，土壤中优势生理小种种群数量降低，而混生的其他生理小种或变异的生理小种则逐渐成为新的优势种群。由于抗病基因与不同生理小种存在对应关系，从而造成抗病品种抗病性丧失，给抗病育种带来了极大挑战。因此，目前需要一种对根肿菌具有持久抗性的大白菜新品种。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大白菜的育种方法，本发明方法得到的大白菜对根肿菌具有持久抗性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种大白菜的育种方法，包括以下步骤：
1)对黄芯春大白菜进行游离小孢子培养，培育得到携带Crr1a纯合抗性基因的小孢子培养DH系，作为第一亲本；
对山地王2号大白菜进行游离小孢子培养，培育得到携带Crr3纯合抗性基因的小孢子培养DH系，作为第二亲本；
对CR-福将大白菜进行游离小孢子培养，培育得到携带CRc纯合抗性基因的小孢子培养DH系，作为第三亲本；
2)以第一亲本为母本，第二亲本为父本进行杂交，得到第一F1代种子；
3)将所述第一F1代种子种植后，进行自交，得到第一F2代种子，将所述第一F2代种子种植后，筛选基因型为RCrr1aRCrr1aRCrr3RCrr3的抗性位点纯合单株，得到第四亲本；
4)以第四亲本为母本，第三亲本为父本进行杂交，得到第二F1代种子；
5)将所述第二F1代种子种植后，进行自交，得到第二F2代种子，将所述第二F2代种子种植后，筛选基因型为RCrr1aCrr1aRCrr3 Crr3RCRcCRc的抗性位点纯合单株，得到白菜新品种。
优选的，步骤3)中利用PCR扩增对根肿病抗性位点检测和根肿病抗性鉴定，筛选得到基因型为RCrr1aRCrr1aRCrr3RCrr3的抗性位点纯合单株；所述根肿病抗性位点检测包括Crr1a抗性位点检测和Crr3抗性位点检测。
优选的，步骤5)中利用PCR扩增对根肿病抗性位点检测和根肿病抗性鉴定，筛选得到基因型为RCrr1aCrr1aRCrr3 Crr3RCRcCRc的抗性位点纯合单株；所述根肿病抗性位点检测包括Crr1a抗性位点检测、Crr3抗性位点检测和CRc抗性位点检测。
优选的，所述Crr1a抗性位点检测包括以下步骤：
以待检测大白菜的基因组DNA为模板，利用第一引物组进行第一PCR扩增，得到第一扩增产物；对第一扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR片段大小为950bp时，判断为抗性位点；当PCR片段大小为580bp时，判断为感病位点；
所述第一引物组包括Crr1a-F和Crr1a-R；所述Crr1a-F的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；所述Crr1a-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述第一PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：12.6μL ddH2O，2μL 10×PCRBuffer，1.6μL dNTPs，Crr1a-F和Crr1a-R各0.8μL，0.2μL AceTaq酶，2μL模板；
所述第一PCR扩增的程序为：94℃、5min；94℃、1min，55℃、2min，72℃、4min，35个循环；72℃、5min。
优选的，所述Crr3抗性位点检测包括以下步骤：
以待检测大白菜的基因组DNA为模板，利用第二引物组进行第二PCR扩增，得到第二扩增产物；对第二扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR片段大小为1500bp时，判断为抗性位点；当PCR片段大小为950bp时，判断为感病位点；
所述第二引物组包括Crr3(OPC11-2F)-F和Crr3(OPC11-2R)-R；所述Crr3(OPC11-2F)-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述Crr3(OPC11-2R)-R的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示；
所述第二PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：12.6μL ddH2O，2μL 10×PCRBuffer，1.6μL dNTPs，Crr3(OPC11-2F)-F和Crr3(OPC11-2R)-R各0.8μL，0.2μL AceTaq酶，2μL模板；
所述第二PCR扩增的程序为：94℃、5min；94℃、1min，55℃、2min，72℃、3min，35个循环；72℃、5min。
优选的，所述CRc抗性位点检测包括以下步骤：
以待检测大白菜的基因组DNA为模板，利用第三引物组进行第三PCR扩增，得到第三扩增产物；对第三扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR片段大小为800bp时，判断为抗性位点；
以待检测大白菜的基因组DNA为模板，利用第四引物组进行第四PCR扩增，得到第四扩增产物；对第四扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR片段大小为800bp时，判断为感病位点；
所述第三引物组包括CRc B50-C9-FW和CRc B50-RV；所述CRc B50-C9-FW的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述CRc B50-RV的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
所述第四引物组包括CRc B50-6R-FW和CRc B50-RV；所述CRc B50-6R-FW的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
所述第三PCR扩增的反应体系和第四PCR扩增的反应体系分别以20μL计，包括：12.6μL ddH2O，2μL 10×PCR Buffer，1.6μL dNTPs，Crr1a-F和Crr1a-R各0.8μL，0.2μLAceTaq酶，2μL模板；
所述第三PCR扩增的反应体系和第四PCR扩增的程序分别为：94℃、5min；94℃、1min，55℃、1.5min，72℃、2min，35个循环；72℃、7min。
优选的，步骤2)得到第一F1代种子、步骤3)得到第一F2代种子、步骤4)得到第二F1代种子和步骤5)得到第二F2代种子后，分别包括对种子依次进行催芽和低温处理。
优选的，所述低温处理包括以下步骤：将催芽后的种子置于4～8℃的条件下25～30d。
本发明的有益效果：本发明提供了一种大白菜的育种方法，本发明的育种方法以黄芯春大白菜、山地王2号大白菜和CR-福将大白菜为亲本，通过杂交、筛选，得到基因型为RCrr1aCrr1aRCrr3 Crr3RCRcCRc的抗性位点纯合单株，获得白菜新品种。本发明通过基因聚合手段，将根肿病抗性基因Crr1a、Crr3和CRc聚合到大白菜中，实现持久抗性。同时本发明利用与目标基因紧密连锁的分子标记对抗病性进行选择，不受植株生长发育时期和环境条件的限制，降低了误选目的基因的可能性，显著提高了目标性状选择的准确性和抗病育种工作的效率。
附图说明
图1为本发明所述育种方法的流程图；
图2为大白菜根肿病发病级别鉴定标准；
图3为聚合Crr1a,Crr3和CRc三个抗性基因纯合材料的分子辅助筛选结果，其中图3中的A为连续选择自交后代中含有Crr1a抗性基因单株、图3中的B为连续选择自交后代中含有Crr3抗性基因单株，图3中的C为连续选择自交后代中含有CRc抗性基因单株，图3中的D为连续选择自交后代中含有CRc感病位点单株；泳道9对应的样品为一株同时携带抗性基因的大白菜纯合系材料。
具体实施方式
本发明提供了一种大白菜的育种方法，包括以下步骤：
1)对黄芯春大白菜进行游离小孢子培养，培育得到携带Crr1a纯合抗性基因的小孢子培养DH系，作为第一亲本；
对山地王2号大白菜进行游离小孢子培养，培育得到携带Crr3纯合抗性基因的小孢子培养DH系，作为第二亲本；
对CR-福将大白菜进行游离小孢子培养，培育得到携带CRc纯合抗性基因的小孢子培养DH系，作为第三亲本；
2)以第一亲本为母本，第二亲本为父本进行杂交，得到第一F1代种子；
3)将所述第一F1代种子种植后，进行自交，得到第一F2代种子，将所述第一F2代种子种植后，筛选基因型为RCrr1aRCrr1aRCrr3RCrr3的抗性位点纯合单株，得到第四亲本；
4)以第四亲本为母本，第三亲本为父本进行杂交，得到第二F1代种子；
5)将所述第二F1代种子种植后，进行自交，得到第二F2代种子，将所述第二F2代种子种植后，筛选基因型为RCrr1aCrr1aRCrr3 Crr3RCRcCRc的抗性位点纯合单株，得到白菜新品种。
本发明所述育种方法的流程图参见图1。
本发明首先对黄芯春大白菜进行游离小孢子培养，培育得到携带Crr1a纯合抗性基因的小孢子培养DH系，作为第一亲本；对山地王2号大白菜进行游离小孢子培养，培育得到携带Crr3纯合抗性基因的小孢子培养DH系，作为第二亲本；对CR-福将大白菜进行游离小孢子培养，培育得到携带CRc纯合抗性基因的小孢子培养DH系，作为第三亲本；本发明对所述游离小孢子培养的方法没有特殊限制，采用本领域常规游离小孢子培养的方法即可，能够加速抗性基因纯合进程。
得到第一亲本和第二亲本后，以第一亲本为母本，第二亲本为父本进行杂交，得到第一F1代种子；所述杂交的方式优选为人工授粉杂交；所述第一F1代种子的基因型为RCrr1a-RCrr3-。
得到第一F1代种子后，本发明将所述第一F1代种子种植后，进行自交，得到第一F2代种子，将所述第一F2代种子种植后，筛选基因型为RCrr1aRCrr1aRCrr3RCrr3的抗性位点纯合单株，得到第四亲本；所述第四亲本综合性状优良。
本发明中，利用PCR扩增对根肿病抗性位点检测和根肿病抗性鉴定，筛选得到筛选基因型为RCrr1aRCrr1aRCrr3RCrr3的抗性位点纯合单株；所述根肿病抗性位点检测包括Crr1a抗性位点检测和Crr3抗性位点检测。
本发明中，所述Crr1a抗性位点检测优选的包括以下步骤：以待检测大白菜的基因组DNA为模板，利用第一引物组进行第一PCR扩增，得到第一扩增产物；对第一扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR片段大小为950bp时，判断为抗性位点；当PCR片段大小为580bp时，判断为感病位点；所述第一引物组包括Crr1a-F和Crr1a-R；所述Crr1a-F的核苷酸序列如SEQID No.1所示，具体为：GATTACCACTATGTACTGAACT；所述Crr1a-R的核苷酸序列如SEQID No.2所示，具体为：CTTTCAAAAACGATTGAAATTTCAT；所述第一PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：12.6μL ddH2O，2μL 10×PCR Buffer，1.6μL dNTPs，Crr1a-F和Crr1a-R各0.8μL，0.2μL AceTaq酶，2μL模板；所述第一PCR扩增的程序为：94℃、5min；94℃、1min，55℃、2min，72℃、4min，35个循环；72℃、5min。
本发明中，所述Crr3抗性位点检测优选的包括以下步骤：以待检测大白菜的基因组DNA为模板，利用第二引物组进行第二PCR扩增，得到第二扩增产物；对第二扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR片段大小为1500bp时，判断为抗性位点；当PCR片段大小为950bp时，判断为感病位点；所述第二引物组包括Crr3(OPC11-2F)-F和Crr3(OPC11-2R)-R；所述Crr3(OPC11-2F)-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体为：GTAACTTGGTACAGAACAGCATAG；所述Crr3(OPC11-2R)-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体为：ACTTGTCTAATGAATGATGATGG；所述第二PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：12.6μLddH2O，2μL 10×PCR Buffer，1.6μL dNTPs，Crr3(OPC11-2F)-F和Crr3(OPC11-2R)-R各0.8μL，0.2μL AceTaq酶，2μL模板；所述第二PCR扩增的程序为：94℃、5min；94℃、1min，55℃、2min，72℃、3min，35个循环；72℃、5min。
本发明中，所述根肿病抗性鉴定优选的采用以下方法进行：将待鉴定大白菜种子栽种于营养土，接种包含大白菜根肿菌的接种液，培养出苗，定苗后4周鉴定大白菜根肿病情况；所述接种液中大白菜根肿菌的有效孢子数优选为2×108个/ml；所述营养土优选的包括蛭石和草炭；所述蛭石和草炭的体积比优选为1：1；所述营养土的pH值优选为6.0，利于根肿菌发病。
本发明中，试验材料抗病性鉴定采用田间人工接种鉴定，利用灌根接种法对实验材料进行抗性鉴定，在每个小区定植株幼苗，然后制备根悬浮液，并使用灌根法对每株幼苗进行接种，接菌处理4～5周后，开始对每株材料根部发病程度进行分级调查，并认真记载发病情况。大白菜根肿病的发病级别主要是将发病植株的发病部位和肿根的大小结合一起来进行确定的。大白菜根肿病发病级别鉴定标准参见表1和图2。
表1大白菜根肿病发病级别鉴定标准
Figure BDA0002417600930000071
病株率和病情指数的计算公式如下：
Figure BDA0002417600930000072
植株的抗病性差异主要依据病情指数来进行划分，主要分类标准：高抗≤30.0；30.0<抗病≤40.0；40.0<低抗/低感≤50.0；50.0<感病≤80.0；高感>80.0。
本发明中，所述接种液优选的采用以下方法制备得到：将大白菜根肿块搅碎后，四层纱布过滤，收集滤液，于20～25℃条件下5000r/min离心10min，收集沉淀，用蒸馏水悬浮沉淀，调节接种液中大白菜根肿菌的有效孢子数为2×108个/ml。
得到第四亲本和第三亲本后，本发明以第四亲本为母本，第三亲本为父本进行杂交，得到第二F1代种子；所述第二F1代种子的基因型为RCrr1a-RCrr3-RCRc-。
得到第二F1代种子后，本发明将所述第二F1代种子种植后，进行自交，得到第二F2代种子，将所述第二F2代种子种植后，筛选基因型为RCrr1aCrr1aRCrr3Crr3RCRcCRc的抗性位点纯合单株，得到白菜新品种。
本发明利用PCR扩增对根肿病抗性位点检测和根肿病抗性鉴定，筛选得到抗性位点纯合单株；所述根肿病抗性位点检测包括Crr1a抗性位点检测、Crr3抗性位点检测和CRc抗性位点检测。根肿病抗性鉴定、Crr1a抗性位点检测和Crr3抗性位点检测的具体方法参见上述方案，不再赘述。
本发明中，所述CRc抗性位点检测包括以下步骤：以待检测大白菜的基因组DNA为模板，利用第三引物组进行第三PCR扩增，得到第三扩增产物；对第三扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR片段大小为800bp时，判断为抗性位点；以待检测大白菜的基因组DNA为模板，利用第四引物组进行第四PCR扩增，得到第四扩增产物；对第四扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR片段大小为800bp时，判断为感病位点；所述第三引物组包括CRcB50-C9-FW和CRc B50-RV；所述CRc B50-C9-FW的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体为：GATTCAATGCATTTCTCTCGAT；所述CRc B50-RV的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，具体为：CGTATTATATCTCTTTCTCCATCCC；所述第四引物组包括CRc B50-6R-FW和CRc B50-RV；所述CRcB50-6R-FW的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，具体为：AATGCATTTTCGCTCAACC；所述第三PCR扩增的反应体系和第四PCR扩增的反应体系分别以20μL计，包括：12.6μL ddH2O，2μL 10×PCR Buffer，1.6μL dNTPs，Crr1a-F和Crr1a-R各0.8μL，0.2μL AceTaq酶，2μL模板；所述第三PCR扩增的反应体系和第四PCR扩增的程序分别为：94℃、5min；94℃、1min，55℃、1.5min，72℃、2min，35个循环；72℃、7min。
本发明得到第一F1代种子、第一F2代种子、第二F1代种子和第二F2代种子后，分别优选的包括对种子依次进行催芽和低温处理，以加快育种进程。本发明对所述催芽的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。
本发明中，所述所述低温处理包括以下步骤：将催芽后的种子置于4～8℃的条件下25～30d。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.材料来源及基因聚合
1.1确定抗根肿病大白菜聚合亲本
14CR345-29(Crr1a)：来自北京中种集团的黄芯春品种的小孢子培养DH系(DoubleHaploid)，携带Crr1a纯合抗性基因，综合性状优良。
14CR420-4(Crr3)：来自韩国商品种山地王2号的小孢子培养DH系(DoubleHaploid)，携带Crr3纯合抗性基因，综合性状优良。
14CR511-1(CRc)：来自武汉桑田种业公司的大白菜商品种CR-福将的小孢子培养DH系(Double Haploid)，携带CRc纯合抗性基因，综合性状优良。
小孢子培养DH系制备方法(大白菜游离小孢子培养)
1)取材与挑蕾：取大白菜主苔及一级侧枝上健康、正常饱满花蕾(时间一般为早上8：00～9：00)，其长为2～3mm。
2)消毒：先用洗涤灵(立白集团，广州)将花蕾冲洗干净，然后将洗净的花蕾置于消过毒的样品夹中，再用75％的酒精进行表面消毒30秒，接着倒出酒精，用10％次氯酸钠(上海沪试试剂，上海)消毒15min，最后用灭菌水冲洗3次，每次3min，备用。
3)把消毒的花蕾置于无菌的研钵中，加入适量B5培养基(PhytoTechnologyLaboratories，美国)，用研钵棒轻捣花蕾挤出孢子将小孢子游离于洗涤培养基中，用400目孔径的钢丝网过滤到10ml离心管中，待离心。
4)将收集好的滤液3500r/min离心，每次3min，共离心3次，弃上清，加入NLN-13培养基(PhytoTechnology Laboratories，美国)；
5)用血球计数板检测小孢子密度，将浓度调至每毫升1×105～2×105个游离小孢子，分装于已灭菌的培养皿中，每皿2ml，用Parafilm封口膜(Bemis Company，美国)封口；同时，每皿加入2～3滴活性炭(1％)(智科生物科技有限公司，济南)。
6)将分装好的小孢子放入32～35℃的恒温培养箱中，暗培养2～3天，然后转入25℃条件下继续暗培养；
7)大约10天后，将有胚状体产生的培养皿移至组培室光照培养，光照时间12h/d，光照强度8000～10000lux；2～3天后，胚状体变绿，接种至MS分化培养基上(MS+3％蔗糖+8克琼脂糖/每升，pH5.8)。
8)将正常生长的小孢子植株接种至继代培养基上(MS+0.2mg/每升NAA+3％蔗糖+8克琼脂糖/每升，pH6.0)进行培养。
9)待根生长至2～3cm，得到小孢子培养DH系。
1.2亲本杂交组合选配
杂交获得F1代：以14CR345-29(Crr1a)亲本为母本，14CR420-4(Crr3)为父本配置杂交组合，通过人工授粉获得F1杂交种子，获得F1真杂种(基因型RCrr1a-RCrr3-)。
自交获得F2种子：将F1种子基因型(基因型RCrr1a-RCrr3-)种植，自交获得F2种子，利用分子标记结合根肿病抗性鉴定来检测抗性位点纯合单株，基因型为RCrr1aRCrr1aRCrr3RCrr3，综合性状优良。
第2次杂交：以聚合2个根肿病抗性基因纯合系基因型为RCrr1aRCrr1aRCrr3RCrr3为母本，含有纯合抗根肿病基因CRc的14CR511-1为父本，杂交获得杂合F1代，基因型为RCrr1a-RCrr3-RCRc-。
继续自交筛选：以聚合3个抗性基因的杂合F1代进行自交，结合根肿病抗性鉴定和分子标记辅助筛选，基因纯合和综合性状优良单株留下，继续自交、筛选，连续自交筛选4代，筛选出综合性状优良的纯合抗根肿病大白菜材料(基因型为RCrr1aCrr1aRCrr3Crr3RCRcCRc)。
为加快回交育种进程，利用种子春化(催芽阶段的处理：选用纯净度好的种子，用45℃水浸种2h，倒水时搅动4～5min，把种子捞出摊在纸巾晾一晾，把多余的水沥出去，湿度达到适中为宜；然后放到发芽的器皿中，下面垫上湿润的滤纸，放到25℃恒温的条件下催芽。这样经20～40h，种子全部萌动，用肉眼看到有60～70％的种子长出胚根，催芽即可结束。
低温阶段的处理：将催完芽的种子装入底部铺上滤纸的培养皿上，然后放到预先调好，温度稳定在4～8℃冰箱内，把种子摊平。处理时间25～30d。在这个时期三天检查一次种子湿度，适当补充水分，处理25～30d后通过春化阶段即可播种)对材料进行低温处理，日光温室中种植，进行每年两代人工授粉。
2.根肿菌源和抗性鉴定
2.1供试菌源
大白菜根肿菌取自河南新野，洗净于-20℃冰箱保存备用。
2.2接种液的制备
将预存于-20℃冰箱内的大白菜根肿块搅碎，四层纱布过滤，冷冻离心机5000r/min离心10min，弃上清，用蒸馏水悬浮沉淀，共重复3次，最后弃上清，取一滴休眠孢子提取液于血球计数板(上海精密仪器仪表有限公司，上海)上，盖上盖玻片，于600倍显微镜下镜检。用蒸馏水将悬浮液孢子浓度分别调至2×108个/ml。4℃保存备用。
2.3接种
以蛭石和草炭1：1(体积比)配制的营养土，用pH6.0的酸性水浇透。将种子栽于营养土中。
接种后，前两周要在苗盘下放自来水泡，靠土壤吸水力保持水分供应，2周后，撤掉底盘，喷淋浇水。定苗后4周鉴定。
3.利用PCR进行根肿病抗性位点检测
根据已发表的与大白菜根肿病抗性基因紧密连锁的分子标记合成引物Crr1(参见【Suwabe K.,Tsukazaki H.,Iketani H.,et al.(2003)Identification of two loci forresistance to clubroot(Plasmodiophora brassicae Woronin)inBrassicarapaL.Theor.Appl.Genet.,107(6):997–1002】)、Crr3(【参见(Saito M.,Kubo N.,MatsumotoS.,et al.(2006)Fine mapping of the clubroot resistance gene,Crr3,in Brassicarapa.Theor.Appl.Genet.,114:81-91】)及CRc(参见【Sakamoto K.,Saito A.,HayashidaN.,et al.(2008)Mapping of isolate-specific QTLs for clubrootresistance inChinese cabbage(Brassicarapa L.ssp.pekinensis).Theor.Appl.Genet.,117:759-767】)。
PCR反应总体积为20μL，含有12.6μl ddH2O，2μl的10×PCR Buffer(MgCl2)，1.6μldNTPs(10mM)，上下游引物各0.8μl(10μM)，0.2μL AceTaq酶(5.0U/μL)，2μL DNA模板(40ng/μL)，试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司公司。
3.1 Crr1a抗性位点检测：
检测引物：Crr1a-F：GATTACCACTATGTACTGAACT(SEQ ID No.1)；Crr1a-R：CTTTCAAAAACGATTGAAATTTCAT(SEQ ID No.2)；
PCR扩增程序：94℃变性5min；35个循环，每循环94℃变性1min，55℃退火2min，72℃延伸4min；72℃延伸5min；4℃保存。利用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物。
片段大小：抗性位点PCR片段大小为950bp，感病位点PCR片段大小为580bp。
3.2 Crr3抗性位点检测：
检测引物：Crr3(OPC11-2F)-F：GTAACTTGGTACAGAACAGCATAG(SEQ ID No.3)；Crr3(OPC11-2R)-R：ACTTGTCTAATGAATGATGATGG(SEQ ID No.4)。
PCR扩增程序：94℃变性5min；35个循环，每循环94℃变性1min，55℃退火2min，72℃延伸3min；72℃延伸5min；4℃保存。利用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物。
片段大小：抗性位点PCR片段大小为1500bp，感病位点PCR片段大小为950bp。
3.3 CRc抗性位点检测：
检测引物：CRc B50-C9-FW:GATTCAATGCATTTCTCTCGAT(SEQ ID No.5)；CRc B50-6R-FW:AATGCATTTTCGCTCAACC(SEQ ID No.7)；CRc B50-RV:CGTATTATATCTCTTTCTCCATCCC(SEQ ID No.6)。
PCR扩增程序包括：94℃变性5min；35个循环，每循环94℃变性1min，55℃退火1.5min，72℃延伸2min；72℃延伸7min；4℃保存。利用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物。
片段大小：抗性位点(引物组合CRc B50-C9-FW&CRc B50-RV)和感病位点(引物组合；CRc B50-6R-FW&CRc B50-RV)PCR片段大小均为为800bp。
4选择聚合多个抗性基因纯合大白菜材料
结合根肿病抗性鉴定、田间综合性状及分子标记筛选(参见图3，其中图3中的A为连续选择自交后代中含有Crr1a抗性基因单株、图3中的B为连续选择自交后代中含有Crr3抗性基因单株，图3中的C为连续选择自交后代中含有CRc抗性基因单株，图3中的D为连续选择自交后代中含有CRc感病位点单株，从株后代中筛选出3株同时携带抗性基因的大白菜纯合系材料，泳道9对应的样品为其中一株同时携带抗性基因的大白菜纯合系材料。
将每代自交后种子，穴盘基质育苗，苗龄20天，移栽至新野病原圃，收获时进行综合性状评价；同时，结合分子标记检测数据，从株选后代中筛选出3株同时携带抗性基因的大白菜纯合系材料。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 河南省农业科学院园艺研究所
<120> 一种大白菜的育种方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gattaccact atgtactgaa ct 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctttcaaaaa cgattgaaat ttcat 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtaacttggt acagaacagc atag 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acttgtctaa tgaatgatga tgg 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gattcaatgc atttctctcg at 22
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgtattatat ctctttctcc atccc 25
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatgcatttt cgctcaacc 19

Claims (8)

1.一种大白菜的育种方法，包括以下步骤：
1)对黄芯春大白菜进行游离小孢子培养，培育得到携带Crr1a纯合抗性基因的小孢子培养DH系，作为第一亲本；
对山地王2号大白菜进行游离小孢子培养，培育得到携带Crr3纯合抗性基因的小孢子培养DH系，作为第二亲本；
对CR-福将大白菜进行游离小孢子培养，培育得到携带CRc纯合抗性基因的小孢子培养DH系，作为第三亲本；
2)以第一亲本为母本，第二亲本为父本进行杂交，得到第一F1代种子；
3)将所述第一F1代种子种植后，进行自交，得到第一F2代种子，将所述第一F2代种子种植后，筛选基因型为RCrr1aRCrr1aRCrr3RCrr3的抗性位点纯合单株，得到第四亲本；
4)以第四亲本为母本，第三亲本为父本进行杂交，得到第二F1代种子；
5)将所述第二F1代种子种植后，进行自交，得到第二F2代种子，将所述第二F2代种子种植后，筛选基因型为RCrr1aCrr1aRCrr3Crr3RCRcCRc的抗性位点纯合单株，得到白菜新品种。
2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤3)中利用PCR扩增对根肿病抗性位点检测和根肿病抗性鉴定，筛选得到基因型为RCrr1aRCrr1aRCrr3RCrr3的抗性位点纯合单株；所述根肿病抗性位点检测包括Crr1a抗性位点检测和Crr3抗性位点检测。
3.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤5)中利用PCR扩增对根肿病抗性位点检测和根肿病抗性鉴定，筛选得到基因型为RCrr1aCrr1aRCrr3Crr3RCRcCRc的抗性位点纯合单株；所述根肿病抗性位点检测包括Crr1a抗性位点检测、Crr3抗性位点检测和CRc抗性位点检测。
4.根据权利要求2或3所述的育种方法，其特征在于，所述Crr1a抗性位点检测包括以下步骤：
以待检测大白菜的基因组DNA为模板，利用第一引物组进行第一PCR扩增，得到第一扩增产物；对第一扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR片段大小为950bp时，判断为抗性位点；当PCR片段大小为580bp时，判断为感病位点；
所述第一引物组包括Crr1a-F和Crr1a-R；所述Crr1a-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述Crr1a-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述第一PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：12.6μL ddH2O，2μL10×PCR Buffer，1.6μL dNTPs，Crr1a-F和Crr1a-R各0.8μL，0.2μLAceTaq酶，2μL模板；
所述第一PCR扩增的程序为：94℃、5min；94℃、1min，55℃、2min，72℃、4min，35个循环；72℃、5min。
5.根据权利要求2或3所述的育种方法，其特征在于，所述Crr3抗性位点检测包括以下步骤：
以待检测大白菜的基因组DNA为模板，利用第二引物组进行第二PCR扩增，得到第二扩增产物；对第二扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR片段大小为1500bp时，判断为抗性位点；当PCR片段大小为950bp时，判断为感病位点；
所述第二引物组包括Crr3(OPC11-2F)-F和Crr3(OPC11-2R)-R；所述Crr3(OPC11-2F)-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述Crr3(OPC11-2R)-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述第二PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：12.6μL ddH2O，2μL10×PCR Buffer，1.6μL dNTPs，Crr3(OPC11-2F)-F和Crr3(OPC11-2R)-R各0.8μL，0.2μLAceTaq酶，2μL模板；
所述第二PCR扩增的程序为：94℃、5min；94℃、1min，55℃、2min，72℃、3min，35个循环；72℃、5min。
6.根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于，所述CRc抗性位点检测包括以下步骤：
以待检测大白菜的基因组DNA为模板，利用第三引物组进行第三PCR扩增，得到第三扩增产物；对第三扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR片段大小为800bp时，判断为抗性位点；
以待检测大白菜的基因组DNA为模板，利用第四引物组进行第四PCR扩增，得到第四扩增产物；对第四扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR片段大小为800bp时，判断为感病位点；
所述第三引物组包括CRc B50-C9-FW和CRc B50-RV；所述CRc B50-C9-FW的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述CRc B50-RV的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
所述第四引物组包括CRc B50-6R-FW和CRc B50-RV；所述CRc B50-6R-FW的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
所述第三PCR扩增的反应体系和第四PCR扩增的反应体系分别以20μL计，包括：12.6μLddH2O，2μL 10×PCR Buffer，1.6μL dNTPs，Crr1a-F和Crr1a-R各0.8μL，0.2μLAceTaq酶，2μL模板；
所述第三PCR扩增的反应体系和第四PCR扩增的程序分别为：94℃、5min；94℃、1min，55℃、1.5min，72℃、2min，35个循环；72℃、7min。
7.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤2)得到第一F1代种子、步骤3)得到第一F2代种子、步骤4)得到第二F1代种子和步骤5)得到第二F2代种子后，分别包括对种子依次进行催芽和低温处理。
8.根据权利要求7所述的育种方法，其特征在于，所述低温处理包括以下步骤：将催芽后的种子置于4～8℃的条件下25～30d。
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