CN106508669B - 一种抗根肿病大白菜的育种方法 - Google Patents

一种抗根肿病大白菜的育种方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗根肿病大白菜的育种方法，包括以下步骤：1)将拟转育亲本A与转育源亲本B杂交得到F1代种子；2)将F1代种子的幼胚催芽和春化后进行播种培养；3)将F1代植株与拟转育亲本A回交，得到BC1代种子；4)对所述BC1代种子的幼胚进行催芽和春化后播种培养；5)利用分子标记对BC1代植株进行筛选得到BC1代抗病单株；6)将BC1代抗病单株与拟转育亲本A回交，得到BC2代种子；7)以BC2代种子的幼胚为处理对象，重复所述步骤4)～步骤6)中的催芽、春化、播种、筛选和回交4次得到BC6代种子；8)BC6代植株自交得到BC6代自交后代，利用分子标记筛选得到根肿病抗性纯合的转育单株。

Description

一种抗根肿病大白菜的育种方法
技术领域
本发明涉及植物育种技术领域，尤其涉及一种抗根肿病大白菜的育种方法。
背景技术
十字花科根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassica Woronin)侵染引起的一种世界性病害，芸薹根肿菌的寄主范围很广，包括白菜、甘蓝、萝卜、花椰菜、油菜等100多种栽培的和野生的十字花科植物。大白菜是根肿病危害最严重的十字花科蔬菜之一，近年来，我国沿海地区、云贵川、东北部分地区以及西部地区等全国大部分地区都有根肿病发生，发生面积急剧增加并逐年加重，根肿病已经成为大白菜主产区的主要病害。
由于根肿病菌休眠孢子抗逆性强，在土壤中可存活10年以上，化学防治极为困难。抗病品种的选育和应用是解决根肿病危害的根本途径。我国主栽优良大白菜品种普遍不抗根肿病，在根肿病发病区优良品种存在着不能继续生产应用的问题。对当前生产上主栽优良品种的抗根肿病性状改良是生产上迫切的需求，但是抗根肿病性状转育和回交改良是一个漫长的过程，要经过一次杂交转育、5-6代回交选择、2-3代的自交纯化，现有技术每年最多可以实现2代转育，目标材料转育完成需9-10个世代，需时为5年以上；并且现有技术通过根肿病菌接种鉴定的方法筛选抗病单株，存在着病菌污染扩散的风险。因此如何实现优良大白菜育种材料的抗根肿病性状快速安全转育，对改良优良品种具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速安全抗根肿病大白菜的育种方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种抗根肿病大白菜的育种方法，包括以下步骤：
1)将根肿病抗性基因为rr的拟转育亲本A与根肿病抗性基因为RR的转育源亲本B杂交得到F1代种子，所述F1代种子的根肿病抗性基因为Rr；
2)将所述F1代种子的幼胚催芽和春化后进行播种培养，获得F1代植株；
3)将所述F1代植株与拟转育亲本A回交，得到BC1代种子；
4)对所述BC1代种子的幼胚进行催芽和春化后播种培养，获得BC1代植株；
5)利用抗根肿病分子标记KBrH129J18R对所述BC1代植株进行抗性鉴定，筛选得到根肿病抗性基因为Rr的BC1代抗病单株；
6)将所述BC1代抗病单株与拟转育亲本A回交，得到BC2代种子；
7)以所述BC2代种子的幼胚为处理对象，重复所述步骤4)中的催芽、春化和播种，所述步骤5)中的鉴定和筛选以及所述步骤6)中的回交4次得到BC6代种子；
8)播种所述BC6代种子获得BC6代植株，将所述BC6代植株自交得到BC6代自交后代，利用抗根肿病分子标记KBrH129J18R对所述BC6代自交后代进行抗性鉴定，筛选获得根肿病抗性纯合的转育单株。
优选的，所述种子为授粉后20～25天的种子。
优选的，所述步骤2)、步骤4)和步骤7)中幼胚催芽的温度独立地为24～26℃。
优选的，所述幼胚催芽的时间独立地为5～7天。
优选的，所述幼胚催芽至胚根长为5～10mm、根毛长为1～3mm时进行春化。
优选的，所述春化的温度为4～6℃，所述春化的时间为3～4周。
优选的，所述幼胚催芽和春化后进行播种培养的环境温度为23～25℃，湿度为65～70％。
优选的，所述幼胚催芽和春化后进行播种培养的时间为40～50天，培养过程全天光照。
优选的，所述抗性鉴定使用的植株DNA为播种后2～3周的植株DNA。
优选的，所述拟转育亲本A在回交前与幼胚同时进行催芽、春化和播种。
本发明的有益效果：本发明提供的育种方法通过对未成熟种子的幼胚培养，从幼胚到下一代幼胚，需要90～100天，每年可转育3代以上，目标亲本2年即可转育成功，大大地缩短了育种周期；另外本发明采用分子标记方法筛选抗病单株，可快速筛选抗病基因型，避免人工接种鉴定造成的病菌传播。
附图说明
图1为剥取的幼胚；
图2为催芽后的幼胚；
图3为春化中的幼胚；
图4为人工气候箱中培养的植株；
图5为开花的植株；
图6为授粉后的植株。
具体实施方式
本发明提供了一种抗根肿病大白菜的育种方法，包括以下步骤：1)将根肿病抗性基因为rr的拟转育亲本A与根肿病抗性基因为RR的转育源亲本B杂交得到F1代种子，所述F1代种子的根肿病抗性基因为Rr；2)将F1代种子的幼胚催芽和春化后进行播种培养，获得F1代植株；3)将所述F1代植株与拟转育亲本A回交，得到BC1代种子；4)对所述BC1代种子的幼胚进行催芽和春化后播种培养，获得BC1代植株；5)利用抗根肿病分子标记KBrH129J18R对所述BC1代植株进行抗性鉴定，从中筛选出根肿病抗性基因为Rr的BC1代抗病单株；6)将所述BC1代抗病单株与拟转育亲本A回交，得到BC2代种子；7)以所述BC2代种子的幼胚为处理对象，重复所述步骤4)～步骤6)中的催芽、春化、播种、筛选和回交，得到BC3代种子，以此类推，重复4次得到BC6代种子；8)播种所述BC6代种子获得BC6代植株，将所述BC6代植株自交得到BC6代自交后代，利用抗根肿病分子标记KBrH129J18R对所述BC6代自交后代进行抗性鉴定，筛选获得根肿病抗性纯合的转育单株。
本发明中，所述转育源亲本B是抗根肿病DH(Double Haploid)系，是指通过单倍体培养获得的染色体自然加倍双单倍体，抗根肿病基因是纯合的，为RR。在本发明中，所述拟转育亲本A是常规的不抗根肿病的大白菜植株，由于根肿病抗性基因为显性基因，不抗根肿病的拟转育亲本A的基因型必然是rr。
本发明首先将根肿病抗性基因为rr的拟转育亲本A与根肿病抗性基因为RR的转育源亲本B杂交得到F1代种子，根据拟转育亲本A与转育源亲本B的基因型，可以确定杂交得到的F1代种子的基因型为Rr。由于F1代种子的根肿病抗性基因为Rr，表现抗病，因此F1代不需要经过抗病性鉴定，可以省去一次分子标记鉴定或接种鉴定筛选的工作。
本发明在杂交授粉完成后，优选的在20～25天摘取种荚，得到F1代种子，更优选的在杂交授粉完成后21～24天摘取种荚；本发明在摘取种荚后，剥出F1代种子的幼胚，本发明采用F1代种子的幼胚，而不是成熟的胚，所述剥取后的幼胚的形态如附图1所示，更容易发芽，可以大大的缩短世代培养的时间，加快育种进程。
本发明在得到F1代种子的幼胚后，对所述幼胚进行催芽。在本发明中，所述幼胚催芽的环境温度优选的为24～26℃，更优选的为25℃；所述幼胚催芽的时间优选的为5～7天，更优选的为6天。在本发明中，所述的催芽优选的在铺有湿润滤纸的培养皿中进行，催芽过程的幼胚如图2所示，可以看到2片子叶。
所述催芽后，本发明将萌发的幼胚进行春化。本发明优选在幼胚催芽至胚根长为5～10mm、根毛长为1～3mm进行春化，更优选的至胚根长6～8mm、根毛长2mm。在本发明中，所述的春化优选的在低温箱中进行，所述春化的温度优选的为4～6℃，更优选的为5℃，所述春化的时间优选的为3～4周，更优选的为3.5周，春化中的幼胚的形态如图3所示，可以看出春化中的幼胚2片子叶已经展开。在本发明中，如果F1代种子是转育冬性强的材料(即耐抽薹育种材料)春化时间优选的延长至35～40天。
本发明在F1代种子的幼胚春化后，将得到的F1代种子的幼胚播种培养，得到F1代植株。在本发明中，所述播种培养的环境温度优选的为23～25℃，更优选的为24℃；所述播种培养的湿度优选的为65～70％，更优选的为66～68％；所述播种培养的时间优选的为40～50天，更优选的为42～48天。本发明中的F1代植株在培养过程全天光照；本发明在实验室试验中播种用的容器优选的为72孔穴盘中，实验室试验中培养优选的在人工气候箱中进行。
本发明在得到F1代植株后，将所述F1代植株与拟转育亲本A进行回交，得到BC1代种子。本发明为了保证F1代植株与拟转育亲本A在相同的生长期回交，在对F1代种子的幼胚进行催化、春化和播种培养的同时，对回交亲本，即拟转育亲本A在相同的条件下进行催芽、春化和播种。本发明中所述回交的具体操作优选的包括：取F1代植株单株开花前1～3天的花蕾，用拟转育亲本A当天开花的鲜花粉授粉；优选的将所述花蕾剥开，露出柱头，所述剥开花蕾使用的工具优选的为尖头镊子。
本发明在获得BC1代种子后，对获得的BC1代种子的幼胚进行催芽和春化后播种培养，获得BC1代植株。本发明独立地选择上述技术方案所述对F1代种子的幼胚催芽、春化和播种培养的条件，在此不再赘述。
本发明在获得BC1代植株后，利用抗根肿病分子标记KBrH129J18R对所述BC1代植株进行抗性鉴定，筛选得到根肿病抗性基因为Rr的BC1代抗病单株。本发明优选的在所述的BC1代植株培养2～3周后，提取BC1代单株的全基因组DNA，所述全基因组DNA的提取方法采用本领域常规的植物组织DNA的提取方法即可，对此本发明没有特殊限定。本发明在获得BC1代单株的全基因组DNA后，利用抗根肿病分子标记KBrH129J18R对所述BC1代植株的全基因组DNA进行PCR扩增；本发明中所述的抗根肿病分子标记KBrH129J18R的具体序列参见参考文献《大白菜抗根肿病基因位点CRa和CRb的分子标记鉴定》华北农学报，2015，30(2)：87-92。本发明所述的KBrH129J18R为共显性分子标记，扩增产物目标片段为254bp的抗病带和194bp的感病带，根据各单株电泳条带，筛选具有245bp条带的单株。由于F1代和各回交世代均为抗病性杂合世代，因此具有抗、感两个条带的单株即为抗病单株。
本发明在获得基因型为Rr的BC1代抗病单株后，对获得的BC1代抗病单株和拟转育亲本A同时进行培养，并进行回交授粉，此处所述的培养方法、回交授粉的操作独立地选择与上述技术方案F1代的培养方法及回交授粉操作相同的范围，回交授粉后获得BC2代种子。
本发明在获得BC2代种子后，以BC2代种子的幼胚为处理对象，重复所述步骤4)～步骤6)中的催芽、春化、播种、筛选和回交，得到BC3代种子，以此类推，重复4次得到BC6代种子；所述的BC6代种子，从理论来说已经有99.72％接近拟转育亲本A。
本发明获得BC6代种子后，播种所述BC6代种子获得BC6代植株，将所述BC6代植株自交得到BC6代自交后代，利用抗根肿病分子标记KBrH129J18R对所述BC6代自交后代进行抗性鉴定，筛选获得根肿病抗性纯合的，即根肿病抗性基因为RR的大白菜植株。
本发明的方法从上一代的幼胚到下一代幼胚，需要90～100天，每年可转育3代以上，根肿病抗性基因为RR的植株2年即可培育成功。
下面结合实施例对本发明提供的抗根肿病大白菜的育种方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
2014年4月中旬，转育目标亲本Y1(根肿病抗性基因型rr)和转育源CRA-2(DH系，根肿病抗性基因型RR)杂交得到F1代种子。
5月上旬摘取F1的种荚，剥取幼胚于铺有湿润滤纸的培养皿中(见图1)，24℃培养箱中催芽，发芽后的幼胚(见图2)于4℃冷藏培养箱中(SANYO MEDICALCOOL)弱光培养春化(见图3)，6月播种，于人工气候箱中培养(见图4)，培养温度24℃，湿度69％，24小时光照，7月回交授粉获得BC1代种子，8月BC1代种子剥胚、25℃催芽6天。
BC1代催芽后的幼胚经过5℃春化3周，9月播种，10月进行KBrH129J18R分子标记鉴定，从中筛选出根肿病抗性基因为Rr的BC1代抗病单株，11月BC1代抗病单株与目标亲本Y1回交，获得BC2代种子，12月对BC2代种子剥胚、26℃催芽7天。
BC2代催芽后的幼胚经过4℃春化4周，2015年1月播种(见图5)，2月进行KBrH129J18R分子标记筛选，从中筛选出根肿病抗性基因为Rr的BC2代抗病单株，3月BC2代抗病单株与目标亲本Y1回交(见图6)，获得BC3代种子，4月对BC3代种子剥胚、25℃催芽6天。
BC3代催芽后的幼胚5月4℃春化4周，6月播种，7月进行KBrH129J18R分子标记筛选，从中筛选出根肿病抗性基因为Rr的BC3代抗病单株，8月BC3代抗病单株与目标亲本Y1回交，获得BC4代种子，9月对BC4代种子剥胚、26℃催芽7天。
BC4代幼胚经过4℃春化3周，9月底播种，10月中下旬进行KBrH129J18R分子标记筛选，从中筛选出根肿病抗性基因为Rr的BC4代抗病单株，11月中旬BC4代抗病单株与目标亲本Y1回交，获得BC5代种子，12月中旬对BC5代种子剥胚、25℃催芽6天。
BC5代幼胚经过4℃春化3周，2016年1月中旬播种，2月中旬进行KBrH129J18R分子标记筛选，从中筛选出根肿病抗性基因为Rr的BC5代抗病单株，3月上旬BC5代抗病单株与目标亲本Y1回交，获得BC6代种子，4月初对BC6代种子进行剥胚，25℃催芽6天。
BC6代幼胚经4℃春化3.5周，5月上旬播种，6月初进行KBrH129J18R分子标记筛选抗病株，6月下旬筛选到的抗病株自交授粉，得到BC6代自交后代，7月底至8月初收获自交后代种子，利用抗根肿病分子标记KBrH129J18R对所述BC6代自交后代进行抗性鉴定经抗根肿病分子标记鉴定，筛选出纯合抗病基因型(RR)单株，经秋季田间性状鉴定，获得CRY1，根肿病抗性基因为RR的大白菜植株。
上述方案的全程培养时间是为95天。
实施例2
2014年4月中旬，转育目标亲本Y1(根肿病抗性基因型rr)和转育源CRA-2(DH系，根肿病抗性基因型RR)杂交得到F1代种子。
5月上旬摘取F1的种荚，剥取幼胚于铺有湿润滤纸的培养皿中24℃培养箱中催芽，发芽后的幼胚于4-5℃冷藏培养箱中(SANYO MEDICALCOOL)弱光培养春化，6月播种，于人工气候箱中培养，培养温度24℃，湿度66％，24小时光照，7月回交授粉获得BC1代种子，8月BC1代种子剥胚、25℃催芽6天。
BC1代催芽后的幼胚经过5℃春化3周，9月播种，10月进行KBrH129J18R分子标记鉴定，从中筛选出根肿病抗性基因为Rr的BC1代抗病单株，11月BC1代抗病单株与目标亲本Y1回交，获得BC2代种子，12月对BC2代种子剥胚、25℃催芽7天。
BC2代催芽后的幼胚经过4℃春化4周，2015年1月播种，2月进行KBrH129J18R分子标记筛选，从中筛选出根肿病抗性基因为Rr的BC2代抗病单株，3月BC2代抗病单株与目标亲本Y1回交，获得BC3代种子，4月对BC3代种子剥胚、25℃催芽7天。
BC3代催芽后的幼胚5月4℃春化4周，6月播种，7月进行KBrH129J18R分子标记筛选，从中筛选出根肿病抗性基因为Rr的BC3代抗病单株，8月BC3代抗病单株与目标亲本Y1回交，获得BC4代种子，9月对BC4代种子剥胚、26℃催芽7天。
BC4代幼胚经过4℃春化3周，9月底播种，10月中下旬进行KBrH129J18R分子标记筛选，从中筛选出根肿病抗性基因为Rr的BC4代抗病单株，11月中旬BC4代抗病单株与目标亲本Y1回交，获得BC5代种子，12月中旬对BC5代种子剥胚、25℃催芽6天。
BC5代幼胚经过4℃春化3周，2016年1月中旬播种，2月中旬进行KBrH129J18R分子标记筛选，从中筛选出根肿病抗性基因为Rr的BC5代抗病单株，3月上旬BC5代抗病单株与目标亲本Y1回交，获得BC6代种子，4月初对BC6代种子进行剥胚，25℃催芽6天。
BC6代幼胚经4℃春化3.5周，5月上旬播种，6月初进行KBrH129J18R分子标记筛选抗病株，6月下旬筛选到的抗病株自交授粉，得到BC6代自交后代，7月底至8月初收获自交后代种子，利用抗根肿病分子标记KBrH129J18R对所述BC6代自交后代进行抗性鉴定经抗根肿病分子标记鉴定，筛选出纯合抗病基因型(RR)单株，经秋季田间性状鉴定，获得CRY1，根肿病抗性基因为RR的大白菜植株。
上述方案的全程培养时间是为90天。
实施例3
2014年4月中旬，转育目标亲本Y1(根肿病抗性基因型rr)和转育源CRA-2(DH系，根肿病抗性基因型RR)杂交得到F1代种子。
5月上旬摘取F1的种荚，剥取幼胚于铺有湿润滤纸的培养皿中24℃培养箱中催芽，发芽后的幼胚于5℃冷藏培养箱中(SANYO MEDICALCOOL)弱光培养春化，6月播种，于人工气候箱中培养，培养温度24℃，湿度68％，24小时光照，7月回交授粉获得BC1代种子，8月BC1代种子剥胚、25℃催芽6天。
BC1代催芽后的幼胚经过5℃春化3周，9月播种，10月进行KBrH129J18R分子标记鉴定，从中筛选出根肿病抗性基因为Rr的BC1代抗病单株，11月BC1代抗病单株与目标亲本Y1回交，获得BC2代种子，12月对BC2代种子剥胚、26℃催芽6天。
BC2代催芽后的幼胚经过4℃春化3.5周，2015年1月播种，2月进行KBrH129J18R分子标记筛选，从中筛选出根肿病抗性基因为Rr的BC2代抗病单株，3月BC2代抗病单株与目标亲本Y1回交，获得BC3代种子，4月对BC3代种子剥胚、25℃催芽5天。
BC3代催芽后的幼胚5月4℃春化4周，6月播种，7月进行KBrH129J18R分子标记筛选，从中筛选出根肿病抗性基因为Rr的BC3代抗病单株，8月BC3代抗病单株与目标亲本Y1回交，获得BC4代种子，9月对BC4代种子剥胚、26℃催芽6天。
BC4代幼胚经过4℃春化3周，9月底播种，10月中下旬进行KBrH129J18R分子标记筛选，从中筛选出根肿病抗性基因为Rr的BC4代抗病单株，11月中旬BC4代抗病单株与目标亲本Y1回交，获得BC5代种子，12月中旬对BC5代种子剥胚、25℃催芽6天。
BC5代幼胚经过4℃春化3周，2016年1月中旬播种，2月中旬进行KBrH129J18R分子标记筛选，从中筛选出根肿病抗性基因为Rr的BC5代抗病单株，3月上旬BC5代抗病单株与目标亲本Y1回交，获得BC6代种子，4月初对BC6代种子进行剥胚，25℃催芽6天。
BC6代幼胚经4℃春化3.5周，5月上旬播种，6月初进行KBrH129J18R分子标记筛选抗病株，6月下旬筛选到的抗病株自交授粉，得到BC6代自交后代，7月底至8月初收获自交后代种子，利用抗根肿病分子标记KBrH129J18R对所述BC6代自交后代进行抗性鉴定经抗根肿病分子标记鉴定，筛选出纯合抗病基因型(RR)单株，经秋季田间性状鉴定，获得CRY1，根肿病抗性基因为RR的大白菜植株。
上述方案的全程培养时间是为97天。
由以上实施例可知，本发明通过对未成熟的幼胚培养，从幼胚到下一代幼胚，需要90～100天，每年可转育3代以上，根肿病抗性植株2年即可转育成功，大大地缩短了育种周期；另外本发明采用分子标记方法筛选抗病单株，可快速筛选抗病基因型，避免人工接种鉴定造成的病菌传播。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种抗根肿病大白菜的育种方法，包括以下步骤：
1)将根肿病抗性基因为rr的拟转育亲本A与根肿病抗性基因为RR的转育源亲本B杂交得到F1代种子，所述F1代种子的根肿病抗性基因为Rr；
2)将所述F1代种子的幼胚催芽和春化后进行播种培养，获得F1代植株；
3)将所述F1代植株与拟转育亲本A回交，得到BC1代种子；
4)对所述BC1代种子的幼胚进行催芽和春化后播种培养，获得BC1代植株；
5)利用抗根肿病分子标记KBrH129J18R对所述BC1代植株进行抗性鉴定，筛选得到根肿病抗性基因为Rr的BC1代抗病单株；
6)将所述BC1代抗病单株与拟转育亲本A回交，得到BC2代种子；
7)以所述BC2代种子的幼胚为处理对象，重复所述步骤4)中的催芽、春化和播种，所述步骤5)中的鉴定和筛选以及所述步骤6)中的回交4次得到BC6代种子；
8)播种所述BC6代种子获得BC6代植株，将所述BC6代植株自交得到BC6代自交后代，利用抗根肿病分子标记KBrH129J18R对所述BC6代自交后代进行抗性鉴定，筛选获得根肿病抗性纯合的转育单株；
所述F1种子为授粉后20～25天的未成熟种子；
所述步骤2)、步骤4)和步骤7)中幼胚催芽的温度独立地为24～26℃；
所述幼胚催芽的时间独立地为5～7天；
所述幼胚催芽至胚根长为5～10mm、根毛长为1～3mm时进行春化；
所述春化的温度为4～6℃，所述春化的时间为3～4周。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述幼胚催芽和春化后进行播种培养的环境温度为23～25℃，湿度为65～70％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述幼胚催芽和春化后进行播种培养的时间为40～50天，培养过程全天光照。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗性鉴定使用的植株DNA为播种后2～3周的植株DNA。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述拟转育亲本A在回交前与幼胚同时进行催芽、春化和播种。
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