CN111296278A - 一种选育抗根肿病大白菜的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种选育抗根肿病大白菜的方法，属于大白菜育种技术领域，所述方法将携带抗根肿病基因的四种亲本14CR403‑3(CRb)、Y991‑1(Crr3)、YT80‑1(CRc)和Y960‑2(Crr1a)两两杂交后、自交，将自交后获得的纯合材料进一步杂交获得携带有四种抗根肿病基因的大白菜，筛选的过程中利用分子标记技术选育纯合材料，所述方法能够显著提高目标性状选择的准确性和抗病育种工作的效率。

Description

一种选育抗根肿病大白菜的方法
技术领域
本发明属于大白菜育种技术领域，尤其涉及一种选育抗根肿病大白菜的方法。
背景技术
大白菜(Brassica rapa subsp.pekinensis)是十字花科芸薹属中的常见蔬菜，种植和分布面积广，是我国菜篮子中的重要蔬菜。大白菜为两性花，异花授粉作物，杂种优势十分明显。近年来，由于芸薹根肿菌的侵染，大白菜根肿病频发，且在世界范围内的危害面积日益扩大，导致大白菜的品质和产量受到了极大影响，根肿病严重时甚至导致绝收，该病现已成为大白菜育种过程中亟须解决的问题。由于根肿菌在土壤中的存活时间长，携带休眠孢子的土壤很容易导致病害的持续发生，而且利用农业、化学和生物等防治手段不能从根本上解决根肿病的防治问题，所以，培育抗根肿病的大白菜新品种是防治该病的最佳方法。
根肿病生理小种的性质会发生变化情况，这是每个根肿病研究者都不容小觑的一个问题，也是目前根肿病防治中最难克服的问题之一。多年种植单一的抗病品种，最后会使得抗病品种抗性丧失，这主要是由于根肿菌大多混生，繁殖力超强，在繁殖过程会迅速积累一些变异，随着某一抗病品种的长期种植，土壤中优势生理小种种群数量降低，而混生的其他生理小种或变异的生理小种则逐渐成为新的优势种群，由于抗病基因与不同生理小种存在对应关系，从而造成抗病品种抗病性丧失，给抗病育种带来了极大挑战。这也提醒我们需要掌握其变化规律，根据其规律合理的开发和利用抗病品种，减少根肿病的危害。
传统育种方法周期长、选择准确性差、极易受到外界环境的影响，造成病菌的传播。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种选育抗根肿病大白菜的方法，所述方法将携带抗根肿病基因的四种亲本两两杂交后、自交，将自交后获得的纯合材料进一步杂交获得携带有四种抗根肿病基因的大白菜，筛选的过程中利用分子标记技术选育纯合材料，所述方法能够显著提高目标性状选择的准确性和抗病育种工作的效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种选育抗根肿病大白菜的方法，包括以下步骤：
1)以14CR403-3(CRb)为母本，以Y991-1(Crr3)为父本进行杂交获得基因型为RCrr3-RCRb-的F1真杂种；将所述基因型为RCrr3-RCRb-的F1真杂种自交，利用分子标记筛选获得基因型为RCrr3RCrr3RCRbRCRb的F2种子；
2)以YT80-1(CRc)为母本，以Y960-2(Crr1a)为父本进行杂交获得基因型为RCrr1a-RCRc-的F1真杂种；将所述基因型为RCrr1a-RCRc-的F1真杂种自交，利用分子标记筛选获得基因型为RCrr1aCrr1aRCRcCRc的F2种子；
3)以步骤1)中获得的基因型为RCrr3RCrr3RCRbRCRb的F2种子为母本，以步骤2)获得的基因型为RCrr1aCrr1aRCRcCRc的F2种子为父本，进行杂交获得基因型为RCrr1a-RCrr3-RCRb-RCRc-的杂合F1代种子；
4)采用游离小孢子培养方法对所述基因型为RCrr1a-RCrr3-RCRb-RCRc-的杂合F1代种子进行培养，利用分子标记筛选纯合单株获得基因型为RCrr1aRCrr1aRCrr3RCrr3RCRbRCRbRCRcRCRc的纯合抗根肿病大白菜；
步骤1)和步骤2)之间无时间顺序限定。
优选的，步骤1)中所述分子筛选标记包括RCrr3基因的分子标记；扩增所述RCrr3基因的分子标记的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
优选的，步骤1)中所述分子筛选标记包括RCRb基因的分子标记；扩增所述RCRb基因的分子标记的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
优选的，步骤2)中所述分子筛选标记包括RCrr1a基因的分子标记；扩增所述RCrr3基因的分子标记的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。
优选的，步骤2)中所述分子筛选标记包括RCRb基因的分子标记；扩增所述RCRc基因的分子标记的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。
优选的，步骤1)、步骤2)和步骤3)中的杂交为人工授粉杂交。
优选的，步骤4)中所述游离小孢子培养方法包括以下步骤：
S1)将所述基因型为RCrr1a-RCrr3-RCRb-RCRc-的杂合F1代种子进行低温春化处理后进行播种，培养获得大白菜植株；
S2)从所述大白菜植株的花蕾中分离获得小孢子；
S3)将所述小孢子在32～35℃暗培养2～3d后，25℃继续暗培养8～12d获得胚状体；
S4)将所述胚状体光照培养、分化、生根获得大白菜植株。
优选的，所述低温春化处理为将催芽后的种子置于4～8℃，处理25～30d。
优选的，步骤S4)中所述光照培养的光照强度为8000～10000lx；所述光照培养的光照时间为10～14h/d。
优选的，所述光照培养的时间为2～3d。
本发明的有益效果：本发明提供的选育抗根肿病大白菜的方法，通过将携带不同抗根肿病基因的四种亲本两两杂交后、进行自交，将自交后获得的纯合材料进一步杂交获得携带有四种抗根肿病基因的大白菜，筛选的过程中利用分子标记技术选育纯合材料，所述方法能够显著提高目标性状选择的准确性和抗病育种工作的效率。利用本发明所述的方法能够获得聚合四种抗根肿病基因的纯合材料。
附图说明
图1为聚合含有Crr1a、Crr3、CRb和CRc四个抗性基因纯合材料技术路线；
图2为筛选获得的聚合Crr1a、Crr3、CRb和CRc四个抗性基因的纯合材料的电泳图。
具体实施方式
本发明提供了一种选育抗根肿病大白菜的方法，包括以下步骤：
1)以14CR403-3(CRb)为母本，以Y991-1(Crr3)为父本进行杂交获得基因型为RCrr3-RCRb-的F1真杂种；将所述基因型为RCrr3-RCRb-的F1真杂种自交，利用分子标记筛选获得基因型为RCrr3RCrr3RCRbRCRb的F2种子；
2)以YT80-1(CRc)为母本，以Y960-2(Crr1a)为父本进行杂交获得基因型为RCrr1a-RCRc-的F1真杂种；将所述基因型为RCrr1a-RCRc-的F1真杂种自交，利用分子标记筛选获得基因型为RCrr1aCrr1aRCRcCRc的F2种子；
3)以步骤1)中获得的基因型为RCrr3RCrr3RCRbRCRb的F2种子为母本，以步骤2)获得的基因型为RCrr1aCrr1aRCRcCRc的F2种子为父本，进行杂交获得基因型为RCrr1a-RCrr3-RCRb-RCRc-的杂合F1代种子；
4)采用游离小孢子培养方法对所述基因型为RCrr1a-RCrr3-RCRb-RCRc-的杂合F1代种子进行培养，利用分子标记筛选纯合单株获得基因型为RCrr1aRCrr1aRCrr3RCrr3RCRbRCRbRCRcRCRc的纯合抗根肿病大白菜；
步骤1)和步骤2)之间无时间顺序限定。
在本发明中，以14CR403-3(CRb)为母本，以Y991-1(Crr3)为父本进行杂交获得基因型为RCrr3-RCRb-的F1真杂种。在本发明中，所述14CR403-3(CRb)优选的来自韩国大白菜商品种耐斯高的小孢子培养DH系(双单倍体，Double Haploid)，携带CRb纯合抗性基因，综合性状优良。在本发明中，所述Y991-1(Crr3)来自韩国商品种春鸣的小孢子培养DH系(DoubleHaploid)，携带Crr3纯合抗性基因，综合性状优良。在本发明中，所述杂交优选为人工授粉杂交；本发明对所述杂交的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规的杂交操作即可。本发明在获得所述基因型为RCrr3-RCRb-的F1真杂种后，将所述基因型为RCrr3-RCRb-的F1真杂种进行自交。本发明对所述自交的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规的自交操作即可。在本发明中，在所述自交获得的F2植株中利用分子标记筛选获得基因型为RCrr3RCrr3RCRbRCRb的F2种子。在本发明中，所述分子标记包括RCrr3基因的分子标记和RCRb基因的分子标记；扩增所述RCrr3基因的分子标记的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；具体如下：Crr3(OPC11-2F)-F：GTAACTTGGTACAGAACAGCATAG(SEQ ID No.1)；Crr3(OPC11-2R)-R：ACTTGTCTAATGAATGATGATGG(SEQ ID No.2)。在本发明中，利用所述引物对扩增所述F2植株的基因组DNA，获得扩增产物；当所述扩增产物的大小为1500bp时，所述F2植株为抗性植株，当所述扩增产物的大小为950bp时，所述F2植株为感病植株。在本发明中，扩增所述RCRb基因的分子标记的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；具体如下：CRb(B0902)-F：AGCCTTGCGTAAAAGCAACTAC(SEQ ID No.3)；CRb(B0902)-R:GTTTGGAATCCGACAAATACATCCAT(SEQ ID No.4)。在本发明中，利用所述引物对扩增所述F2植株的基因组DNA，获得扩增产物；当所述扩增产物的大小为170bp时，所述F2植株为抗性植株，当所述扩增产物的大小为240bp时，所述F2植株为感病植株。在本发明中，筛选同时携带RCrr3和RCRb抗性基因的F2植株，收集种子获得基因型为RCrr3RCrr3RCRbRCRb的F2种子。
在本发明中，以YT80-1(CRc)为母本，以Y960-2(Crr1a)为父本进行杂交获得基因型为RCrr1a-RCRc-的F1真杂种。在本发明中，所述YT80-1(CRc)来自河南地方品种的小孢子培养DH系(Double Haploid)，携带CRc纯合抗性基因，综合性状优良；所述Y960-2(Crr1a)：来自北京中联韩种业公司的新观春品种的小孢子培养DH系(Double Haploid)，携带Crr1a纯合抗性基因，综合性状优良。在本发明中，所述杂交优选为人工授粉杂交；本发明对所述杂交的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规的杂交操作即可。在本发明中，将所述基因型为RCrr1a-RCRc-的F1真杂种自交，利用分子标记筛选获得基因型为RCrr1aCrr1aRCRcCRc的F2种子。本发明对所述自交的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规的自交操作即可。在本发明中，所述分子标记包括RCrr1a基因的分子标记和RCRc基因的分子标记；扩增所述RCrr1a基因的分子标记的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；具体如下：Crr1a-F：GATTACCACTATGTACTGAACT(SEQ ID No.5)；Crr1a-R：CTTTCAAAAACGATTGAAATTTCAT(SEQ IDNo.6)在本发明中，利用所述引物对扩增所述F2植株的基因组DNA，获得扩增产物；当所述扩增产物的大小为950bp时，所述F2植株为抗性植株，当所述扩增产物的大小为580bp时，所述F2植株为感病植株。在本发明中，扩增所述RCRc基因的分子标记的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；具体如下：CRc B50-C9-FW：GATTCAATGCATTTCTCTCGAT(SEQ ID No.7)；CRc B50-RV:CGTATTATATCTCTTTCTCCATCCC(SEQ ID No.8)；在本发明中，利用所述引物对扩增所述F2植株的基因组DNA，获得扩增产物；当所述扩增产物的大小为800bp时，所述F2植株为抗性植株；在本发明中，当以CRc B50-6R-FW：AATGCATTTTCGCTCAACC(SEQ ID No.9)和CRc B50-RV:CGTATTATATCTCTTTCTCCATCCC(SEQ ID No.8)为引物，扩增所述F2植株的基因组DNA，扩增产物的大小为800bp时，所述F2植株为感病植株。在本发明中，筛选同时携带RCrr1a和RCRc抗性基因的F2植株，收集种子获得基因型为基因型为RCrr1aCrr1aRCRcCRc的F2种子。
在本发明中，以步基因型为RCrr3RCrr3RCRbRCRb的F2种子为母本，以基因型为RCrr1aCrr1aRCRcCRc的F2种子为父本，进行杂交获得基因型为RCrr1a-RCrr3-RCRb-RCRc-的杂合F1代种子。在本发明中，所述杂交优选为人工授粉杂交；本发明对所述杂交的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规的杂交操作即可。
在本发明中，采用游离小孢子培养方法对所述基因型为RCrr1a-RCrr3-RCRb-RCRc-的杂合F1代种子进行培养，利用分子标记筛选纯合单株获得基因型为RCrr1aRCrr1aRCrr3RCrr3RCRbRCR bRCRcRCRc的纯合抗根肿病大白菜。在本发明中，所述游离小孢子培养方法包括以下步骤：S1)将所述基因型为RCrr1a-RCrr3-RCRb-RCRc-的杂合F1代种子进行低温春化处理后进行播种，培养获得大白菜植株；S2)从所述大白菜植株的花蕾中分离获得小孢子；S3)将所述小孢子在32～35℃暗培养2～3d后，25℃继续暗培养8～12d获得胚状体；S4)将所述胚状体光照培养、分化、生根获得大白菜植株。
在本发明中，将所述基因型为RCrr1a-RCrr3-RCRb-RCRc-的杂合F1代种子进行低温春化处理后进行播种，培养获得大白菜植株。在本发明中，所述低温春化处理优选为将催芽后的种子置于4～8℃，处理25～30d。本发明对所述催芽的方法没有特殊限定，采用本领域常规的催芽方法即可，具体参见实施例记载。在本发明中，所述低温春化处理能够加快育种进程。在本发明中，所述培养优选在日光温室中进行，白天温度优选为25℃，时间优选为16h，夜晚温度优选为18℃，时间优选为8h，所述培养的光照强度优选为8000～12000lx，
在本发明中，从所述大白菜植株的花蕾中分离获得小孢子。在本发明中，所述花蕾优选为主苔及一级侧枝上健康、正常饱满花蕾；本发明对所述花蕾进行消毒后，收集所述花蕾中的小孢子，在本发明中，优选的将小孢子游离于洗涤培养基中进行洗涤后离心，调整小孢子的浓度为1～2×105个/mL置于培养基中进行培养。
在本发明中，将所述小孢子在32～35℃暗培养2～3d后，25℃继续暗培养8～12d获得胚状体；然后将所述胚状体光照培养、分化、生根获得大白菜植株。在本发明中，所述光照培养的光照强度优选为8000～12000lx；所述光照培养的光照时间优选为10～14h/d，更优选为12h/d。在本发明中，所述光照培养的时间优选为2～3d。在本发明中，所述分化的培养培养基优选为MS+3％蔗糖+8g/L的琼脂糖，所述分化的培养基的pH值优选为5.8。在本发明中，所述生根的培养基优选为MS+0.2mg/L的NAA+3％蔗糖+8g/L的琼脂糖；所述生根的培养基的pH值优选为6.0。
在本发明中，所述分子标记筛选优选的筛选携带包括RCrr1a、RCrr3、RCRb和RCRc四个基因的纯合材料，具体的筛选方法参见上述记载，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
抗根肿病大白菜聚合亲本
14CR403-3(CRb)：来自韩国大白菜商品种耐斯高的小孢子培养DH系(双单倍体，Double Haploid)，携带CRb纯合抗性基因，综合性状优良。
Y991-1(Crr3)：来自韩国商品种春鸣的小孢子培养DH系(Double Haploid)，携带Crr3纯合抗性基因，综合性状优良。
YT80-1(CRc)：来自河南地方品种的小孢子培养DH系(Double Haploid)，携带CRc纯合抗性基因，综合性状优良。
Y960-2(Crr1a：来自北京中联韩种业公司的新观春品种的小孢子培养DH系(Double Haploid)，携带Crr1a纯合抗性基因，综合性状优良。
杂交育种流程：
杂交获得F1代：以14CR403-3(CRb)亲本为母本，Y991-1(Crr3)为父本配置杂交组合，通过人工授粉获得F1杂交种子，获得同时携带2个抗性基因的F1真杂种(基因型RCrr3-RCRb-)；同时，以YT80-1(CRc)为母本，Y960-2(Crr1a)为父本配置杂交组合，通过人工授粉获得F1杂交种子，获得F1真杂种(基因型RCrr1a-RCRc-)。
自交获得F2种子：将2份基因型分别为RCrr3-RCRb-及RCrr1a-RCRc-的F1种子种植，各自自交获得F2种子，利用分子标记结合根肿病抗性鉴定来检测抗性位点纯合单株，基因型分别为RCrr3RCrr3RCRbRCRb及RCrr1aCrr1aRCRcCRc。
第2次杂交：以基因型为RCrr3RCrr3RCRbRCRb的材料为母本，基因型为RCrr1aCrr1aRCRcCRc的材料为父本，杂交获得杂合F1代，基因型为RCrr1a-RCrr3-RCRb-RCRc-。
上述杂交育种流程种利用PCR进行根肿病抗性位点检测的具体方法
根据已发表的与大白菜根肿病抗性基因紧密连锁的分子标记合成引物Crr1(Suwabe K.,Tsukazaki H.,Iketani H.,et al.(2006)Simple sequence repeat-basedcomparative genomics between Brassica rapa and Arabidopsis thaliana:thegenetic origin ofclubroot resistance.Genetics,173:309-319)、Crr3(Saito M.,KuboN.,Matsumoto S.,et al.(2006)Fine mapping ofthe clubroot resistance gene,Crr3,in Brassica rapa.Theor.Appl.Genet.,114:81-91)、CRb(Hatakeyama K.,Niwa T.,KatoT.,et al.(2017)The tandem repeated organization of NB-LRR genes in theclubroot-resistant CRb locus in Brassica rapa L.Molecular genetics andgenomics,MGG 292,397-405)、CRc(Sakamoto K.,Saito A.,Hayashida N.,et al.(2008)Mapping of isolate-specific QTLs for clubroot resistance in Chinese cabbage(Brassica rapa L.ssp.pekinensis).Theor.Appl.Genet.,117:759-767)。
PCR反应总体积为20μL，含有12.6μL ddH2O，2μL的10×PCR Buffer(MgCl2)，1.6μLdNTPs(10mM)，上下游引物各0.8μL(10μM)，0.2μL AceTaq酶(5.0U/μL)，2μL DNA模板(40ng/μL)，试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司公司。
Crr1a抗性位点检测
检测引物：Crr1a-F：GATTACCACTATGTACTGAACT；Crr1a-R：CTTTCAAAAACGATTGAAATTTCAT。
PCR扩增程序：94℃变性5min；35个循环，每循环94℃变性1min，55℃退火2min，72℃延伸4min；72℃延伸5min；4℃保存。利用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物。
抗性位点PCR片段大小为950bp，感病位点PCR片段大小为580bp。
Crr3抗性位点检测
检测引物：Crr3(OPC11-2F)-F：GTAACTTGGTACAGAACAGCATAG；Crr3(OPC11-2R)-R：ACTTGTCTAATGAATGATGATGG
PCR扩增程序：94℃变性5min；35个循环，每循环94℃变性1min，55℃退火2min，72℃延伸3min；72℃延伸5min；4℃保存。利用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物。
抗性位点PCR片段大小为1500bp，感病位点PCR片段大小为950bp。
CRb抗性位点检测
检测引物：CRb(B0902)-F：AGCCTTGCGTAAAAGCAACTAC；CRb(B0902)-R:GTTTGGAATCCGACAAATACATCCAT
PCR扩增程序：94℃变性2min；35个循环，每循环94℃变性30sec，55℃退火30sec，68℃延伸30sec；68℃延伸5min；4℃保存。利用3.0％琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物。
抗性位点PCR片段大小为170bp，感病位点PCR片段大小为240bp。
CRc抗性位点检测
检测引物：CRc B50-C9-FW:GATTCAATGCATTTCTCTCGAT；CRc B50-6R-FW:AATGCATTTTCGCTCAACC；CRc B50-RV:CGTATTATATCTCTTTCTCCATCCC
PCR扩增程序包括：94℃变性5min；35个循环，每循环94℃变性1min，55℃退火1.5min，72℃延伸2min；72℃延伸7min；4℃保存。利用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物。
抗性位点(引物组合CRc B50-C9-FW和CRc B50-RV)和感病位点(引物组合；CRcB50-6R-FW和CRc B50-RV)PCR扩增产物片段大小均为800bp。
获得基因型为RCrr1a-RCrr3-RCRb-RCRc-的杂合F1代种子后，按照游离小孢子培养程序进行培养，获得DH系单株，进行分子标记结合根肿病抗性鉴定来检测抗性位点纯合单株，选定目的株系。
为加快回交育种进程，利用种子春化对目的株系材料进行低温处理，具体如下：催芽阶段的处理：选用纯、净度好的种子，用45℃水浸种2h，倒水时搅动4～5min，把种子捞出摊在纸巾晾一晾，把多余的水沥出去，湿度达到90％以上为宜；然后放到发芽的器皿中，下面垫上湿润的滤纸，放到25℃恒温的条件下催芽。这样经20～40h，种子全部萌动，用肉眼看到有60％～70％的种子长出胚根，催芽即可结束。低温阶段的处理：将催完芽的种子装入底部铺上滤纸的培养皿上，然后放到预先调好，温度稳定在4～8℃冰箱内，把种子摊平。处理时间25～30d。在这个时期三天检查一次种子湿度，补充水分，处理25～30d后通过春化阶段即可播种，日光温室(温度白天25℃，16h)，夜晚18℃，8h)，光照强度8000～12000lx中种植，当白菜现蕾开花时，进行每年两代人工授粉回交。
小孢子培养
取材与挑蕾：取大白菜主苔及一级侧枝上健康、正常饱满花蕾(时间一般为早上8：00-9：00)，其长为2～3mm。
消毒：先用洗涤灵(立白集团，广州)将花蕾冲洗干净，然后将洗净的花蕾置于消过毒的样品夹中，再用75％的酒精进行表面消毒30s，接着倒出酒精，用10％次氯酸钠(上海沪试试剂，上海)消毒15min，最后用灭菌水冲洗3次，每次3min，备用。
把消毒的花蕾置于无菌的研钵中，加入适量B5培养基(PhytoTechnologyLaboratories，美国)，用研钵棒轻捣花蕾挤出孢子将小孢子游离于洗涤培养基中，用400目孔径的钢丝网过滤到10ml离心管中，待离心。
将收集好的滤液3500rpm离心，每次3min，共离心3次，弃上清，加入NLN-13培养基(PhytoTechnology Laboratories，美国)；
用血球计数板检测小孢子密度，将浓度调至每mL 1×105～2×105个游离小孢子，分装于已灭菌的培养皿中，每皿2mL，用Parafilm封口膜(Bemis Company，美国)封口；同时，每皿加入2～3滴活性炭(1％)(用于吸附有毒物质)；减少褐变，防止玻璃化；创造黑暗环境，增加培养基的通透性，利于根的生长；活性炭购自智科生物科技有限公司，济南。
将分装好的小孢子放入32～35℃的恒温培养箱中，暗培养2～3天，然后转入25℃条件下继续暗培养；
10天后，将有胚状体产生的培养皿移至组培室光照培养，光照时间12h/d，光照强度8000～10000lx；2-3d后，胚状体变绿，接种至MS分化培养基上(MS+3％蔗糖+8g/L琼脂糖，pH值5.8)。
将正常生长的小孢子植株接种至继代培养基上(MS+0.2mg/L的NAA+3％蔗糖+8g/L的琼脂糖，pH值6.0)进行培养。
待根生长至2～3cm即可移栽。
实施例2
筛选获得的目的株系的抗性鉴定
供试菌源
大白菜根肿菌取自河南新野(4号生理小种)，洗净于-20℃冰箱保存备用。
接种液的制备
将预存于-20℃冰箱内的大白菜根肿块搅碎，四层纱布过滤，收集滤液，常温下，离心5000rpm离心10min，弃上清，用蒸馏水悬浮沉淀，共重复3次，最后弃上清，取一滴休眠孢子提取液于血球计数板(上海精密仪器仪表有限公司，上海)上，盖上盖玻片，于600倍显微镜下镜检。用蒸馏水将悬浮液孢子浓度分别调至2×108个/mL。4℃保存备用。
接种
以蛭石和草炭1:1配制的营养土，用pH值为6.0的酸性水浇透。将目的株系的种子栽于营养土中。接种后，前两周要在苗盘下放酸性水浸泡，靠土壤吸水力保持水分供应，2周后，撤掉底盘，喷淋浇水。定苗后4周鉴定。
试验材料的抗病性鉴定采用田间人工接种鉴定，利用灌根接种法对实验材料进行抗性鉴定，接菌处理30天后，开始对每株材料根部发病程度进行分级调查，并认真记载发病情况。大白菜根肿病的发病级别主要是将发病植株的发病部位和肿根的大小结合一起来进行确定的。
表1大白菜根肿病发病级别鉴定标准
Figure BDA0002417605830000121
病株率和病情指数的计算公式如下：
Figure BDA0002417605830000122
植株的抗病性差异主要依据病情指数来进行划分，主要分类标准：高抗≤30.0；30.0<抗病≤40.0；40.0<低抗/低感≤50.0；50.0<感病≤80.0；高感>80.0。
经鉴定本发明筛选的目的株系的病情指数为0，抗病性为高抗。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 河南省农业科学院园艺研究所
<120> 一种选育抗根肿病大白菜的方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gtaacttggt acagaacagc atag 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
acttgtctaa tgaatgatga tgg 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
agccttgcgt aaaagcaact ac 22
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gtttggaatc cgacaaatac atccat 26
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gattaccact atgtactgaa ct 22
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ctttcaaaaa cgattgaaat ttcat 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 8
cgtattatat ctctttctcc atccc 25
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
aatgcatttt cgctcaacc 19

Claims (10)

1.一种选育抗根肿病大白菜的方法，包括以下步骤：
1)以14CR403-3(CRb)为母本，以Y991-1(Crr3)为父本进行杂交获得基因型为RCrr3-RCRb-的F1真杂种；将所述基因型为RCrr3-RCRb-的F1真杂种自交，利用分子标记筛选获得基因型为RCrr3RCrr3RCRbRCRb的F2种子；
2)以YT80-1(CRc)为母本，以Y960-2(Crr1a)为父本进行杂交获得基因型为RCrr1a-RCRc-的F1真杂种；将所述基因型为RCrr1a-RCRc-的F1真杂种自交，利用分子标记筛选获得基因型为RCrr1aCrr1aRCRcCRc的F2种子；
3)以步骤1)中获得的基因型为RCrr3RCrr3RCRbRCRb的F2种子为母本，以步骤2)获得的基因型为RCrr1aCrr1aRCRcCRc的F2种子为父本，进行杂交获得基因型为RCrr1a-RCrr3-RCRb-RCRc-的杂合F1代种子；
4)采用游离小孢子培养方法对所述基因型为RCrr1a-RCrr3-RCRb-RCRc-的杂合F1代种子进行培养，利用分子标记筛选纯合单株获得基因型为RCrr1aRCrr1aRCrr3RCrr3RCRbRCRbRCRcRCRc的纯合抗根肿病大白菜；
步骤1)和步骤2)之间无时间顺序限定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述分子筛选标记包括RCrr3基因的分子标记；扩增所述RCrr3基因的分子标记的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述分子筛选标记包括RCRb基因的分子标记；扩增所述RCRb基因的分子标记的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQID No.4所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述分子筛选标记包括RCrr1a基因的分子标记；扩增所述RCrr3基因的分子标记的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQID No.6所示。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述分子筛选标记包括RCRb基因的分子标记；扩增所述RCRc基因的分子标记的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQID No.8所示。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)、步骤2)和步骤3)中的杂交为人工授粉杂交。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述游离小孢子培养方法包括以下步骤：
S1)将所述基因型为RCrr1a-RCrr3-RCRb-RCRc-的杂合F1代种子进行低温春化处理后进行播种，培养获得大白菜植株；
S2)从所述大白菜植株的花蕾中分离获得小孢子；
S3)将所述小孢子在32～35℃暗培养2～3d后，25℃继续暗培养8～12d获得胚状体；
S4)将所述胚状体光照培养、分化、生根获得大白菜植株。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述低温春化处理为将催芽后的种子置于4～8℃，处理25～30d。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S4)中所述光照培养的光照强度为8000～10000lx；所述光照培养的光照时间为10～14h/d。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述光照培养的时间为2～3d。
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