CN107926423B - 一种猕猴桃抗溃疡病双向脱毒大苗生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猕猴桃抗溃疡病双向脱毒大苗生产方法：首先将抗溃疡病猕猴桃砧木茎尖脱毒及组培，生产达到一定标准的专用砧木苗；通过脱毒及组培技术，建立接穗品种的无溃疡病采穗圃，通过隔离种植及周期性检测保证采穗圃内接穗品种不携带猕猴桃溃疡病病原；砧木及接穗经检测均无溃疡病感染的情况下进行嫁接，培育成抗溃疡病的双向脱毒成苗。针对目前红肉猕猴桃及黄肉猕猴桃多数易感溃疡病的严重问题，本发明旨在从根本上解决猕猴桃苗木带病交叉感染的问题，满足新建红肉及黄肉猕猴桃果园或更新老果园过程中对抗溃疡病苗木的需求，是解决目前猕猴桃生产中主栽品种的溃疡病爆发及毁园问题的最佳方案，可作为商业用途在生产上的大规模使用。

Description

一种猕猴桃抗溃疡病双向脱毒大苗生产方法

技术领域

本发明属于猕猴桃栽培技术领域，具体涉及一种猕猴桃抗溃疡病双向脱毒大苗生产方法，应用到猕猴桃抗溃疡病苗木生产中。

背景技术

猕猴桃作为一种独特的功能性水果，近10年以来在中国的栽培面积和消费量突飞猛进，其重要性仍在上升，超越了其它传统小宗水果。中国也是猕猴桃的主要分布中心和多样性中心。溃疡病是由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringaepv.actinidiae，简写Psa)引起的恶性传染性细菌病害，近几年先后在意大利、新西兰爆发，在我国造成的危害也呈现迅速增加的趋势，具有发生范围广、传播迅速、致病性强和防治难度大等特点，极易在短期内造成大面积树体死亡。在当前我国园艺类作物种苗繁育和引种现状下，各主产区、新种植区交叉感染极其严重，2016年已经感染约3000公顷，造成近4.5亿元人民币损失。我国目前的主栽品种结构正在朝着高品质升级调整，一批优质品种的商业种植面积增长迅速，传统老品种面积降低，经济效益随之提高明显。但是，正在形成的新型品种结构中，多数主栽品种易感溃疡病，例如“红阳”、“Hort16A”、“华优”、“翠香”等都属于易感品种，感染果园逐年增多，呈蔓延趋势。从防治的效果看，铜制剂和链霉素等抗生素是目前猕猴桃溃疡病最常用的化学药剂，但多项研究证实，这两种试剂虽然可以杀死Psa病原菌，但对于已进入猕猴桃组织器官的溃疡病病原菌毫无办法，且容易使猕猴桃产生药害，产生抗药性。因此，当前的猕猴桃产业品种结构调整，一方面提高了行业的经济效益，但同样增大了整个产业的溃疡病系统性风险。借鉴其它农作物或者果树作物的重大病害防治及其基础研究经验，可以预料，通过品种选育综合现有品种高品质特点及抗溃疡病性状的新品种尚需较长时间，于是如何解决当前溃疡病蔓延问题成为最大的难点。

分析我国猕猴桃产业的种苗供应体系及商业化市场，不难看出，由于国内大量使用传统嫁接苗，其生产过程的主要特点是：使用野外收集的混杂野生猕猴桃种子育苗，嫁接所用品种接穗来源混乱，导致来自于疫区感病果园的接穗进入新建园区，而苗木的引种流通实际上是完全放开的状态，导致带病苗木到处交叉感染，直到开始挂果才表现出溃疡病症状，很多果园多年经济投入却不得不毁园，投资者损失惨重。基于以上背景，本发明通过筛选抗病砧木，综合多项技术，形成科学、有效的种苗生产技术体系，在解决当前猕猴桃产业的溃疡病风险方面具有广泛的适用性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猕猴桃抗溃疡病双向脱毒大苗生产方法，解决猕猴桃苗木传统生产技术中“疫区接穗交叉感染导致苗木携带溃疡病风险，砧木、接穗同时不抗病导致感染后毁园”等问题。通过本方法生产的双向脱毒嫁接苗不携带溃疡病，同时由于使用了抗溃疡病砧木，采取大苗高位嫁接，使树体对溃疡病抗性明显增强，且能提高商品果的标准化程度，最大程度降低溃疡病风险。

本发明的另一个目的在于提供猕猴桃抗溃疡病双向脱毒大苗生产方法在已感染溃疡病果园改造中的应用。我国已有250万亩猕猴桃种植面积，15年以上老果园有10-20万亩，这些老果园品种老化，经济效益低，一部分种植户已经开始更换黄肉或红肉品种，希望通过提高品种的市场价值提高经济收入。而目前的黄肉或红肉品种多数不抗溃疡病，而连根挖出重新建园成本太大，因此，本发明提供一种保留强大根系，通过中间抗性砧木与二次嫁接脱毒品种接穗的方式，也最大程度上降低重建成本，降低溃疡病风险。

为实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种猕猴桃抗溃疡病双向脱毒大苗生产方法，包括以下步骤：

(1)猕猴桃抗溃疡病砧木苗生产：取筛选出的抗溃疡病猕猴桃砧木的新梢顶端茎尖进行愈伤组织诱导培养，将组培苗培育成大苗，形成脱毒的抗溃疡病的砧木大苗；

(2)猕猴桃品种脱毒苗生产：将接穗品种的新梢顶端茎尖进行愈伤组织诱导培养生成组培苗，经检测不携带溃疡病病原菌的组培苗在设置于采穗园中的隔离网室中定植，并定期抽样检测接穗品种以确保不携带溃疡病病原菌，培育成脱毒的接穗母树；

(3)抗溃疡病大苗嫁接及成苗生产：在脱毒的砧木大苗及接穗品种苗达到嫁接标准后，砧木及接穗经检测均无溃疡病感染的情况下进行嫁接，培育成抗溃疡病的双向脱毒成苗。

进一步地，砧木苗嫁接标准为：在距离地面根茎部位1.6米处，主干直径大于或等于0.8厘米，接穗的嫁接位置为距离砧木根茎部位1.6米以上，1.8米以下，采用劈接或腹接。

进一步地，上述抗溃疡病猕猴桃砧木由下述方法筛选而得：

(1)枝条筛选：在半木质化当年营养枝的枝条下部打孔至皮层，接种Psa-V菌液后置于培养箱内培养，第20天调查各枝条的感病情况，根据枝条的感病症状确定不同的感染率：

感染率0：无褐化及腐烂症状

感染率10％：皮层组织仅出现褐色、变软、隆起或龟裂

感染率33％：皮孔向外溢出乳白色液体，并出现褐色、变软

感染率66％：菌液与汁液结合变红褐色，韧皮部变黑褐色

感染率100％：韧皮部腐烂，木质部变为黑褐色

平均感染率＝∑(相同感染率的病枝数×感染率)/(调查的枝条总数)

根据枝条感病情况划分为不同的发病等级：

0级：无症状

1级：1/3部分发病或萎蔫，主干病斑不超过茎围的1/3

2级：1/3-1/2发病或萎蔫，主干病斑不超过茎围的1/3-1/2

3级：2/3-4/5发病或萎蔫，主干病斑不超过茎围的1/2-3/4

4级：全株死亡

病情指数＝∑(病枝数×病级)/(调查的总枝数×最高级别)

选取枝条平均感病率低于或等于10％，且病情指数≦5的材料用于下一步的幼苗筛选；

(2)幼苗筛选：幼苗长到5-7片叶，真叶长度达到20cm以上时开始用于筛选，在最大3个叶片的主叶脉针刺接种Psa-V菌液后置于培养箱内培养，第20天统计平均感染率，根据幼苗以下症状确定不同的感染率：

感染率0：无症状

感染率10％：叶片仅出现白色病斑

感染率33％：叶片黄化且出现褐色病斑

感染率66％：叶片枯死，茎部出现腐烂

感染率100％：叶片枯死脱落、茎腐烂、幼苗濒临死亡

平均感染率＝∑(相同感染率的苗数×感染率)/(调查苗总数)

选取平均感染率低于或等于10％的材料作为抗溃疡病猕猴桃砧木。

进一步地，上述猕猴桃接穗品种为中华猕猴桃红肉品种或黄肉品种，红肉猕猴桃包括但不限于当前栽培品种：‘红阳’、‘红华’、‘东红’、‘红昇’、‘楚红’、‘晚红’、‘脐红’及‘金红50’，黄肉猕猴桃品种包括但不限于当前栽培品种：‘华优’、‘金艳’、‘Hort16A’(国内称‘金果’)、‘金桃’、‘金硕’、‘武植3号’等。

进一步地，上述猕猴桃抗溃疡病砧木为金魁，还可以是筛选出来的新材料，比如Kr-1、Hr-1、Wild-4等。

进一步地，抗溃疡病砧木苗由组培苗培育成大苗的方法如下：将组培苗依次移栽至育苗穴盘、营养钵、大营养钵进行培育，苗高度达到20厘米时，使用水肥一体结合滴灌，N:P:K＝15-18:15-18:15-18复合肥工作浓度0.2-0.4％，每周施肥一次，施用量为20-50升/株/次，每个月使用干基40％的腐殖酸肥一次，工作浓度为0.05％，施用量为200-400升/株/次；幼苗高度超过30厘米时，用棉线从基部牵引，使幼苗直立单头生长；苗高超过1米后，复合肥工作浓度加至每周每次0.5％，干基40％的腐殖酸肥每15天滴灌一次；苗高达到1-1.5米时，根据生长强度掐尖1-2次，之后达到1.8-2米时再次掐尖，促进主干增粗。

进一步地，采穗圃选址标准为：年平均温度在14-16度之间，冬季最低温不低于零下5度，在方圆20公里所处位置较高、光照充足、排水良好的避风地点，距离已有猕猴桃果园距离达到15-20公里以上。

猕猴桃抗溃疡病双向脱毒大苗生产方法在已感染溃疡病果园改造中的应用，其方法是：

(1)根茎部溃疡病检测：已经感染溃疡病的果园，在切除病株地上部并连续消毒3个月后，取根茎部以下组织，进行溃疡病分子检测(具体参照实施例所述方法)，只有当阳性率为0时，开始使用抗病砧木作为中间砧嫁接；

(2)中间砧嫁接及标准砧木大苗培育：从原砧木基部甚至根茎部嫁接筛选的抗病砧木作为中间砧，培育到“高度≥1.6m+直径≥0.8cm”的标准，作为嫁接备选苗，进行溃疡病分子检测，只有当阳性率为0时，表示未检测到猕猴桃溃疡病Psa-V，才能继续嫁接脱毒品种的接穗；

(3)抗病砧木嫁接：接穗嫁接位置为距离砧木根茎部位1.6米以上，1.8米以下，采用劈接或腹接。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

当前我国猕猴桃产业主栽品种中的高品质红肉猕猴桃、黄肉猕猴桃市场需求旺盛，经济效益高，但溃疡病发展迅速，一些主产区损失严重，限制了产业发展。而目前国内还没有抗溃疡病的高品质红肉、黄肉猕猴桃品种，在此情况下，只有通过技术途径解决溃疡病问题。本项发明利用抗病砧木材料，通过脱毒技术、病害快速检测技术以及高效水肥系统等综合技术，培育出高抗溃疡病的砧木大苗，创建猕猴桃主栽品种的脱毒采穗圃，解决接穗、砧木等带病传播的问题根源，也利用砧木的抗病性在最大程度上预防和控制猕猴桃溃疡病在生产过程中的感染和传播，解决现阶段溃疡病对我国猕猴桃产业带来的巨大损失和投资风险，保证猕猴桃产业健康可持续发展。在技术上实现了：杜绝猕猴桃种苗携带溃疡病，大幅度提高建园后树体的抗病性，为品质优良经济价值高但对溃疡病抗性弱的新品种产业化提供了有效的解决途径；降低果园再感染溃疡病的风险；能够使感染溃疡病的果园得以迅速恢复重建；通过砧木的遗传一致性提高猕猴桃品质和产量的标准化水平；通过大苗的专业化生产提高果园的早期经济效益，缩短投资回报周期。

通过以上技术体系生产的猕猴桃苗木大，出土时苗高已经达到182厘米，根幅达到48厘米，主根长达到87厘米，侧根数85个，定植后发根数平均达到681个，健壮，根系活力强，而传统方式生产的苗仅有15-30厘米高，根系小活力低。此外，定植后，传统苗木极易感染溃疡病，随着季节推移感染传播迅速，而本技术方式生产的苗木到目前尚未发现感染，表现出极强的抗溃疡病效果。本发明通过组织培养及脱毒技术结合，解决了接穗和砧木携带病原菌的问题，并选用抗溃疡病砧木材料，且使用高位嫁接及大苗培育方案，大大提高树体的田间持续抗病性。在溃疡病爆发园区，采用该方法连续3年未发现再次感染，而传统苗木在重新嫁接第二年就大面积再次感染，可见本发明在生产应用中具有预防、控制溃疡病的明显效果。

具体实施方式

本发明通过猕猴桃抗溃疡病双向脱毒苗生产过程及使用效果实例说明实施方式。

1.猕猴桃抗溃疡病砧木的筛选和鉴定

抗溃疡病种质筛选：本实施例选用了20种猕猴桃材料进行抗溃疡病砧木的筛选，材料来源说明如下：①野生美味猕猴桃资源，Wild-1—Wild-6，Kr-1，Hr-1，采集于秦岭；②猕猴桃品种：‘金魁’、‘翠香’、‘徐香’、‘翠玉’、‘G3’；③用以上抗/耐病品种作为母本，与长势旺盛的美味猕猴桃雄株杂交，从人工杂交后代筛选抗病材料，Hybrid-1─Hybrid-7。

将以上抗病备选种质使用以下“离体枝条鉴定法”进行初步筛选。

离体枝条抗性筛选：每个鉴定材料在同一时间取样，选长度范围在80-150cm且相对一致(长度差异小于10cm)的半木质化当年营养枝(6-9月份)作为接种材料。从上述营养枝第5-12节开始剪取20-30cm，枝条下口直径0.8-1.2cm，每个材料重复15-20份枝条，表面使用75％酒精消毒，在枝条中下部相同部位打孔(1个)，深达皮层但不能伤害皮层，直径0.5cm，用浓度为1×10⁸cfu/mL的Psa-V(从苍溪感病果园分离鉴定)菌液100μL接种。接种后，枝条间隔10cm放于20度±2恒温、湿度为70-90％的培养箱内，枝条基部切面新鲜，保持湿润供水状态，每2天调查一次感染率及发病程度，持续24天。以感染率及病情指数为指标选出高抗材料。

感染率调查：第20天调查平均感染率，平均感染率低于或等于10％为抗病。根据枝条的感病症状确定不同的感染率：无褐化及腐烂症状(感染率0)，皮层组织仅出现褐色、变软、隆起或龟裂(感染率10％)，皮孔向外溢出乳白色液体，并出现褐色、变软等并发症(感染率33％)，菌液与汁液结合变红褐色，韧皮部变黑褐色(感染率66％)，韧皮部腐烂，木质部变为黑褐色(感染率100％)，平均感染率＝∑(相同感染率的病枝数×感染率)/(调查的枝条总数)。感染率越高，说明抗病性越差。

病情指数＝∑(病枝数×病级)/(调查的总枝数×最高级别)。病情指数≦5为高抗，5<病情指数≦15为抗病，15<病情指数≦35为耐病，35<病情指数≦55为感病，病情指数≥55为高感病。病级标准如下：

枝条平均感染率低于或等于10％，且病情指数≦5时，作为可能的抗病砧木备选材料进入幼苗筛选阶段。

幼苗抗病性筛选：幼苗长到5-7片叶，第五片真叶长度达到20cm以上时开始用于筛选，每份待筛选材料重复20株，在最大3个叶片的主叶脉进行针刺接种，每个叶片接种1×10⁸cfu/mL的Psa-V菌液100μL，放于25度、湿度为70-90％的培养箱内，第20天调查平均感染率，平均感染率低于或等于10％为抗病。

根据幼苗以下症状确定不同的感染率：无症状(感染率0)，叶片仅出现白色病斑(感染率10％，高抗)，叶片黄化且出现褐色病斑(感染率33％，耐)、叶片枯死，茎部出现腐烂(感染率66％，感病)，叶片枯死脱落、茎腐烂、幼苗濒临死亡(感染率100％，高感)。通过枝条感病率和病情指数调查达到高抗溃疡病标准的材料，再经过幼苗抗病性筛选，平均感染率低于或等于10％的材料，才能继续进行嫁接亲和性鉴定。

嫁接亲和性鉴定：将抗溃疡病砧木种质组培苗培养到距离根茎部10-15厘米处直径达到0.8厘米时，嫁接经检测未染病的主栽品种‘红阳’、‘红昇’、‘金艳’、‘Hort16A’接穗，以这些品种的传统嫁接苗(注：这些嫁接苗所用砧木来源于生产苗木单位购买的不同山脉野生中华猕猴桃变种或美味猕猴桃变种果实的混合种子播种所得实生苗，或野生葛枣猕猴桃混合单株的枝条扦插苗，见技术背景)为对照。嫁接亲和性筛选标准：嫁接后成活率高，成活后树体长势旺盛，整齐度高，果实品质好。

最终筛选出具有高抗溃疡病且与主栽品种亲和性良好的材料作为生产用砧木，筛选结果见表1，通过该系统鉴定筛选出新种质‘Kr-1’、‘Hr-1’、Wild-4及金魁4份高抗溃疡病砧木资源。

2.猕猴桃抗溃疡病砧木苗的生产

砧木组培苗的生产：对筛选出来的猕猴桃抗溃疡病砧木种质，取新梢顶端<5mm茎尖，用无菌水清洗后，用75％酒精及0.1％升汞消毒，使用MS为基础培养基诱导愈伤组织，含0.5-3mg/L的6-BA和0-2.5mg/L的NAA或(0-2mg/LZT)，暗培养5-7天后，光照培养25-35天；继代培养基以MS培养基为基础，含0.5-3mg/L的6-BA和0.05-1.5mg/L的NAA；生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，含0.1-2mg/L的IBA。其余培养条件：25±2℃，光照强度为2000-3000Lux，光照时间为12～14h/D。

炼苗：当组培苗达到株高2-3厘米，根系发达，出现4片幼叶以上时开始移栽，但移栽最佳季节为春季3-4月份，秋季9-11月份。在遮阴、保湿条件下，保持白天温度25度，夜间18-22度，组培苗逐渐锻炼适应后，用草炭土6份(体积，下同)+河沙2份+蛭石2份，通过高温消毒后，再拌入杀菌剂作为移栽基质。先移栽进入育苗穴盘，逐渐增加光照到4000Lux，生长30天后，移栽进入15-18×13-15厘米营养钵，生长50-60天，苗高约20厘米，移栽进入25-30×35-45厘米大营养钵。进入营养钵后，幼苗生长条件：空气湿度60-80％，土壤含水70-85％，光照3500-4000Lux。将抗病砧木(包括‘Kr-1’及‘Hr-1’等)的组培苗从移栽进入大营养钵(30×40厘米)开始，苗高度达到20厘米时，使用水肥一体结合滴灌，N:P:K＝15-18:15-25:15-25复合肥工作浓度0.2-0.4％(m/v)，4-8月内每周施肥一次，每次每株施用量为200-400升；每个月使用干基40％的腐殖酸肥一次，工作浓度为0.05％(m/v)，施用量为200-400升/株/次。

大苗培育：经水肥一体化系统周期性施用N:P:K＝15-18:15-18:15-18复合肥及腐殖酸液体肥，第二个生长季从夏季开始苗木逐渐达到大苗标准。砧木苗培育在相对独立环境(大棚或温室)中，使用遮阳网及微喷技术，温度控制在白天20-30度，夜间18-25度。管理过程及工具均实行无菌操作，幼苗高度超过30厘米时，开始用棉线从基部牵引，使幼苗直立单头生长。苗高超过1米后，复合肥工作浓度加至每周每次0.5％(施用量保持不变)，干基40％的腐殖酸肥每15天滴灌一次(工作浓度及施用量保持不变)。苗高达到1-1.5米时，根据生长强度掐尖1-2次，之后达到1.8-2米时再次掐尖，促进主干增粗；第二个生长季中期或末期(8-12月份)大部分砧木苗能够达到距离根茎部1.6米处，树干粗度达到0.8厘米以上，形成脱毒的砧木大苗。

3.猕猴桃易感溃疡病品种脱毒苗生产及采穗圃建设

猕猴桃品种苗脱毒及无毒化生产：本技术可用于中华猕猴桃红肉品种或黄肉品种种苗生产，红肉猕猴桃包括但不限于当前栽培品种：‘红阳’、‘红华’、‘东红’、‘红昇’、‘楚红’、‘晚红’、‘脐红’及‘金红50’，黄肉猕猴桃品种包括但不限于当前栽培品种：‘华优’、‘金艳’、‘Hort16A’(国内称‘金果’)、‘金桃’、‘金硕’、‘武植3号’等。取猕猴桃品种新梢顶端<5mm茎尖，用无菌水清洗后，用75％酒精及0.1％升汞消毒，使用MS为基础培养基诱导愈伤组织，含0.5-2mg/L的6-BA和0.1-3.5mg/L的NAA，暗培养5-7天后，光照培养25-35天；继代培养基以MS培养基为基础，含0.05-2.5mg/L的6-BA和0.3mg/L的NAA；生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，含0.05-2mg/L的IBA。其余培养条件：25±2℃，光照强度为2000-3000Lux，光照时间为12～14h/D。品种接穗无毒苗生产规模需要根据成品苗年生产量先计算采穗量，再确定采穗圃种植需要的苗木数量。例如，需要‘红阳’成品苗5万株，则采穗圃需要种植苗木数量250-300株，采集6-7万个接穗芽。

炼苗：当组培苗达到株高2-3厘米，根系发达，出现4片幼叶以上时开始移栽，但移栽最佳季节为春季3-4月份，秋季9-11月份。在遮阴、保湿条件下，保持白天温度25度，夜间18-22度，组培苗逐渐锻炼适应后，用草炭土6份+河沙2份+蛭石2份，通过高温消毒后，再拌入杀菌剂作为移栽基质。先移栽进入育苗穴盘，逐渐增加光照到4000Lux，生长30天后，移栽进入15-18×13-15厘米营养钵，生长50-60天，苗高约20厘米，移栽进入25-30×35-45厘米大营养钵。经水肥一体化系统周期性施用N:P:K＝15-18:15-18:15-18复合肥及腐殖酸液体肥。

采穗圃建设：将无毒化采穗圃建设与脱毒苗生产基地统一规划在同一区域。建设本发明所述的双向脱毒苗生产基地所需的品种采穗圃之前，根据以下标准选址：年平均温度在14-16度之间，冬季最低温不低于零下5度，在位置较高、光照充足、排水良好的避风地点，距离已有猕猴桃果园距离达到15-20公里以上。采穗圃面积根据年生产苗木数量计算。建立隔离网室，通过专门配置改土和消毒等措施，在网室内保存种植经过脱毒的上述猕猴桃主栽品种组培苗。品种接穗培育成苗后，进入网室前，对所有苗进行溃疡病分子检测，检测不携带溃疡病病原菌后，再定植。此后每年在1月、4月、7月及10月，抽样15％检测溃疡病，阳性率为0表明无溃疡病感染。在定植采穗圃每年少量挂果，适度修剪，管理过程、工具均实行无菌化操作。采集接穗前，再按照同样的方法进行抽样检测，确保接穗不携带溃疡病病原。

溃疡病快速分子检测方法：从增殖苗上分别取适量叶片、根、茎，离心管中进行匀浆，取10μL的匀浆液涂布在固体KB-CFC培养基上，28度过夜培养。若无菌在此平板上生长，表示样本内无丁香假单胞杆菌属(Ps)细菌。若有菌落产生，则需要进一步鉴定是否为Psa菌株，即在培养皿内放一张滤纸，滤纸上加浓度为1％的二甲基对苯二胺盐酸盐，使其湿润。用灭菌牙签挑取生长24小时的菌苔涂在滤纸上，若菌苔在10秒内变成蓝色，为阳性反应(P)；在60s以后变色或一直不变色为阴性反应(N)，Psa细菌为阴性。挑选具有每个样本疑似Psa的氧化酶阴性菌株，分别以F1/R2引物对、F3/R4引物对进行菌落PCR，PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶检测，观察是否有目的片段条带，其中F1/R2引物对，目的条带大小280bp，F3/R4引物对，目的条带大小175bp。如果F1/R2引物对扩出280bp产物，或/和F3/R4引物对扩出175bp产物，表明材料已经感染溃疡病。

Psa F1：5’-TTTTGCTTTGCACACCCGATTT-3’

Psa R2：5’-CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3’

Psa F3：5’-ACCTGGTGAAGTTGGTCAGAGC-3’

Psa R4：5’-CGCACCCTTCAATCAGGATG-3’

PCR反应体系及反应条件：反应体系为25μL，其中不含Mg²⁺的10×buffer 1.5μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，25mmol/L MgCl₂ 1.5μL，10μmol/L上游引物1.25μL，10μmol/L下游引物1.25μL，5U/μL Taq酶0.062μL，DNA模板2μL，无菌去离子水16.938μL；PCR扩增反应程序为95℃2min；94℃15s，58℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。

4.抗病大苗嫁接及成苗生产

(1)砧木苗嫁接标准：由于苗木生长多数情况下不完全一致，因此，从练苗移栽后第二年7月份开始，按照“高度≥1.6m+直径≥0.8cm”的标准选出砧木苗，作为嫁接备选苗，抽样15-25％进行溃疡病分子检测，如阳性率为0表示未检测到猕猴桃溃疡病Psa-V，将作为嫁接砧木。

(2)接穗检测：根据品种的需求，从采穗圃采集无毒化接穗，立即进行5-10％抽样检测，只有在阳性率为0时表明未检测到猕猴桃溃疡病Psa-V时，可以嫁接接穗。

(3)高位嫁接：在无菌操作模式(工具、苗木培育设施及操作人员消毒)下，在砧木培育区迅速完成嫁接，嫁接位置为距离砧木根茎部位1.6米以上，1.8米以下，采用劈接或腹接。

(4)成苗时期：如果在7-9月份的生长季嫁接，则接穗生长少量后，第三年春季即可作为成苗带土定植到商业果园；如果冬季嫁接，接穗发芽生长3-5个月后，带基质定植。

5.红肉/黄肉猕猴桃主栽品种的抗病大苗生产及使用效果实例

使用上述方法，生产当前国内红肉、黄肉猕猴桃主栽品种的抗病大苗，下面分别列出‘红阳’、‘红昇’及‘金艳’3个品种的抗病大苗生产关键环节及建园效果：

实例1——‘红阳’抗溃疡病种苗生产及应用

‘Kr-1’砧木苗生产：通过实生选育获得抗病砧木‘Kr-1’，经上述方法(参见上述猕猴桃抗溃疡病砧木的筛选和鉴定)鉴定为高抗溃疡病材料，且与‘红阳’具有良好亲合性；然后通过组培脱毒生产组培苗，具体方法如下：

取‘Kr-1’新梢顶端<5mm茎尖，用无菌水清洗后，用75％酒精及0.1％升汞消毒，使用MS为基础培养基诱导愈伤组织，含2mg/L的6-BA和0.2mg/L的NAA，暗培养5-7天后，光照培养25-35天；继代培养基以MS培养基为基础，含2mg/L的6-BA和0.3mg/L的NAA；生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，含0.6mg/L的IBA。其余培养条件：25±2℃，光照强度为2000-3000Lux，光照时间为12～14h/D。

‘Kr-1’组培苗经过炼苗和精细培育(参见上述猕猴桃抗溃疡病砧木苗的生产)获得‘Kr-1’大苗，苗高1.65m处，直径达到0.9cm，经检测无溃疡病感染，生长势强，达到嫁接标准。

‘红阳’无毒苗生产：2008年从‘红阳’原育种地四川省苍溪县文昌取‘红阳’茎尖材料，经脱毒、诱导愈伤、继代培养及生根等，生产‘红阳’无毒组培苗，具体方法如下：

取新梢顶端<5mm茎尖，用无菌水清洗后，用75％酒精及0.1％升汞消毒，使用MS为基础培养基诱导愈伤组织，含1mg/L的6-BA和0.3mg/L的NAA，暗培养5-7天后，光照培养25-35天；继代培养基以MS培养基为基础，含1mg/L的6-BA和0.3mg/L的NAA；生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，含0.5mg/L的IBA。其余培养条件：25±2℃，光照强度为2000-3000Lux，光照时间为12～14h/D。

经溃疡病分子检测不携带病原菌，炼苗，按照上述方法(参见上述猕猴桃易感溃疡病品种脱毒苗生产及采穗圃建设)培育苗木，苗高1.9米，基部粗度1.1cm，每株苗可取5-8个嫁接芽，本次直接使用苗圃接穗嫁接。另外部分苗用于在湖北武汉、四川苍溪分别建设‘红阳’无毒采穗圃。

双向嫁接及‘红阳’抗溃疡病种苗生产(表2)：经过溃疡病检测后的‘红阳’接穗嫁接到‘Kr-1’砧木苗，技术方案参见“抗病大苗嫁接及成品苗生产”，2015年1月嫁接，2015年6月份生产出标准化‘红阳’抗病成品苗1200株，600株定植到湖北省巴东县沿渡河镇堆子村村，面积10.5亩，600株定植到湖北襄阳南漳县观音堂村，面积10亩。

‘红阳’抗溃疡病种苗使用效果(表3)：

巴东县堆子村：‘红阳’果园2016年开始挂果，单株平均挂果2.4公斤，2017年单株平均挂果15.3公斤，果实平均大小83.2克。全园树体健壮，无溃疡病症状，经过2016年12月、2017年5月抽样检测，未发现溃疡病感染。

南漳县观音堂村：‘红阳’果园2016年开始挂果，单株平均挂果6.4公斤，2017年单株平均挂果26.8公斤，果实平均大小80.5克。全园树体健壮，无溃疡病症状，经过2016年12月、2017年5月抽样检测，未发现溃疡病感染。

对比：在湖北省巴东县沿渡河镇另一果园从湖北省建始县引入的传统‘红阳’嫁接苗，2016年年底发现少量溃疡病感染，2017年春季已经大面积感染，无法生产。

实例2——‘红昇’抗溃疡病种苗生产及应用

‘Kr-1’砧木苗生产：‘红昇’品种苗木生产中使用与‘红阳’相同的抗病砧木‘Kr-1’，‘Kr-1’育种来源及大苗生产过程与“实例1——‘红阳’抗溃疡病大苗生产及应用”完全相同。

‘红昇’无毒苗生产：‘红昇’原始材料2010年取自原始育种地四川省苍溪县三川育种基地，使用‘红昇’的茎尖材料，经脱毒、诱导愈伤、继代培养及生根等，生产‘红昇’无毒组培苗，具体方法如下：

取新梢顶端<5mm茎尖，用无菌水清洗后，用75％酒精及0.1％升汞消毒，使用MS为基础培养基诱导愈伤组织，含1.5mg/L的6-BA和0.5mg/L的ZT，暗培养5-7天后，光照培养25-35天；继代培养基以MS培养基为基础，含0.6mg/L的6-BA和0.5mg/L的NAA；生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，含1mg/L的IBA。其余培养条件：25±2℃，光照强度为2000-3000Lux，光照时间为12～14h/D。

经溃疡病分子检测不携带病原菌，炼苗，按照上述方法(参见猕猴桃易感溃疡病品种脱毒苗生产及采穗圃建设)培育苗木，建设‘红昇’无毒采穗圃。

双向嫁接及‘红昇’抗溃疡病种苗生产：经过严格检测后的‘红昇’接穗嫁接到‘Kr-1’砧木苗，技术方案参见“抗病大苗嫁接及成品苗生产”，2016年1月嫁接，2016年5月份生产出标准化‘红昇’抗病成品苗1000株，定植到四川苍溪，面积18亩。

‘红昇’抗溃疡病种苗使用效果：该果园2017年开始挂果，单株平均挂果1.6公斤，果实平均大小79克。全园树体健壮，无溃疡病症状，经过2017年5月抽样检测，未发现溃疡病感染。

实例3——‘金艳’抗溃疡病种苗生产及老果园更新应用

‘Hr-1’砧木苗生产：通过实生选育获得抗病砧木‘Hr-1’，经上述方法(参见猕猴桃抗溃疡病砧木的筛选和鉴定)鉴定为高抗溃疡病材料，且与‘金艳’具有良好亲合性；然后通过组培脱毒生产组培苗，具体方法如下：

取新梢顶端<5mm茎尖，用无菌水清洗后，用75％酒精及0.1％升汞消毒，使用MS为基础培养基诱导愈伤组织，含1.5mg/L的6-BA和0.5mg/L的KT，暗培养5-7天后，光照培养20-30天；继代培养基以MS培养基为基础，含1mg/L的6-BA和0.5mg/L的NAA；生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，含1mg/L的IBA。其余培养条件：25±2℃，光照强度为2000-3000Lux，光照时间为12～14h/D。‘Hr-1’组培苗经过炼苗和精细培育(参见猕猴桃抗溃疡病砧木苗的生产)获得‘Hr-1’大苗，达到嫁接用接穗标准。

‘金艳’无毒苗生产：2010年取‘金艳’(中国科学院武汉植物园)茎尖材料，经脱毒、诱导愈伤、继代培养及生根等，生产‘金艳’无毒组培苗，具体方法如下：

取新梢顶端<5mm茎尖，用无菌水清洗后，用75％酒精及0.1％升汞消毒，使用MS为基础培养基诱导愈伤组织，含3.5mg/L的6-BA和0.2mg/L的NAA，暗培养5-7天后，光照培养15-28天；继代培养基以MS培养基为基础，含1.5mg/L的6-BA和0.5mg/L的NAA；生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，含0.6mg/L的IBA。其余培养条件：25±2℃，光照强度为2000-3000Lux，光照时间为12～14h/D。经溃疡病分子检测不携带病原菌，炼苗，按照上述方法(参见猕猴桃易感溃疡病品种脱毒苗生产及采穗圃建设)培育苗木，建设‘金艳’无毒采穗圃。

感染溃疡病的‘金艳’果园更新：重庆某果园中，由于早期‘红阳’果园感染后，与之邻近的‘金艳’在2013-2014感染溃疡病，逐渐扩散。2013年11-12月，在感染果园原大树根茎部以下约10厘米处锯平口，采取严格消毒措施3次，对老果园土壤全面灭菌消毒。2014年1-2月采集切口附近愈伤及活组织进行室内鉴定，对于未检测到溃疡病的大树根茎部切口，在切口下2-3厘米迅速嫁接‘Hr-1’砧木作为中间砧。2014年生长季使用杀菌剂连续在树体、田间杀菌6次。2014年10月15日，中间砧生长至距离地面1.6m处，茎粗达到1.1cm，经检测‘Hr-1’砧木各部位叶、枝条无感染，2015年1月份，在距离基部1.6米处嫁接脱毒品种接穗‘金艳’500株。重建效果见表4，2016年开始恢复挂果，单株产量3.5公斤，果实平均大小92克，2017年春、秋季全面检测后树体均无溃疡病感染，说明已经完全控制溃疡病。

对比：同期，在该园区邻近感染溃疡病的部分‘金艳’果园，将发现溃疡病症状的树切除主干后，在基部重新嫁接表现正常的树体上的‘金艳’接穗，从基部嫁接25株，发现2016年冬季重新嫁接的部分幼树又开始发病，2017年春季已经再次感染18株，实验室检测发现重新嫁接的幼树已经全部再次感染。

实例4——‘红阳’溃疡病果园的恢复重建

使用“实例1——‘红阳’抗溃疡病种苗生产及应用”中的抗病砧木‘Kr-1’，‘Kr-1’脱毒组培苗经过炼苗和精细培育(参见上述猕猴桃抗溃疡病砧木苗的生产)获得‘Kr-1’大苗，达到嫁接用接穗标准。使用“实例1——‘红阳’抗溃疡病种苗生产及应用”中‘红阳’无毒采穗圃中的接穗嫁接。

已经感染溃疡病的四川苍溪某‘红阳’果园，2012年春季已有45％发病，出现春季流脓，春、夏季叶片出现不规则枯死病斑，并且还在扩散。2012年9月在原砧木苗根茎部以下约10厘米处锯平口，采取严格消毒3次。2012年12月-2013年2月，采集切口附近、皮层及木质部进行室内鉴定，对于未检测到溃疡病的大树根茎部切口，在切口下5厘米处迅速嫁接‘Kr-1’砧木作为中间砧。2013年生长季使用杀菌剂连续在树体、田间杀菌6次，并加强水肥供应。2013年11月3日，大部分中间砧生长至距离地面1.6m处，茎粗达到0.95cm，再次检测‘Kr-1’中间砧木苗，未检测到溃疡病。2014年1月在1.6米处嫁接脱毒品种接穗‘红阳’，重建效果见表5，2015年初挂果，平均单株产量0.8公斤，果实平均大小73克，2016年单株平均产量8.5公斤，2015年、2016年、2017年经溃疡病检测后，树体均无溃疡病感染，说明已经完全控制溃疡病。

对比：同期，在该园区邻近感染溃疡病的部分‘红阳’果园，将发现溃疡病症状的树切除主干。选择园区没有任何病症的健康‘红阳’采集接穗，2013年2月从基部嫁接共58株，2014年春季发现有其中的13株主干又开始出现红色锈脓，2014年冬季至2015年春季，重新嫁接的58株中有43株又开始发病，实验室检测发现重新嫁接的幼树已经全部感染。

Claims (6)

1.一种猕猴桃抗溃疡病双向脱毒大苗生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)猕猴桃抗溃疡病砧木苗生产：取筛选出的抗溃疡病猕猴桃砧木的新梢顶端茎尖进行愈伤组织诱导培养，将组培苗培育成大苗，形成脱毒的抗溃疡病的砧木大苗；

所述的抗溃疡病猕猴桃砧木由下述方法筛选而得：

a.枝条筛选：在半木质化当年营养枝的枝条下部打孔至皮层，接种Psa-V菌液后置于培养箱内培养，第20天调查各枝条的感病情况，根据枝条的感病症状确定不同的感染率：

感染率0：无褐化及腐烂症状

感染率10％：皮层组织仅出现褐色、变软、隆起或龟裂

感染率33％：皮孔向外溢出乳白色液体，并出现褐色、变软

感染率66％：菌液与汁液结合变红褐色，韧皮部变黑褐色

感染率100％：韧皮部腐烂，木质部变为黑褐色

平均感染率＝∑(相同感染率的病枝数×感染率)/(调查的枝条总数)

根据枝条感病情况划分为不同的发病等级：

0级：无症状

1级：1/3部分发病或萎蔫，主干病斑不超过茎围的1/3

2级：1/3-1/2发病或萎蔫，主干病斑不超过茎围的1/3-1/2

3级：2/3-4/5发病或萎蔫，主干病斑不超过茎围的1/2-3/4

4级：全株死亡

病情指数＝∑(病枝数×病级)/(调查的总枝数×最高级别)

选取枝条平均感病率低于或等于10％，且病情指数≦5的材料用于下一步的幼苗筛选；

b.幼苗筛选：幼苗长到5-7片叶，真叶长度达到20cm以上时开始用于筛选，在最大3个叶片的主叶脉针刺接种Psa-V菌液后置于培养箱内培养，第20天统计平均感染率，根据幼苗以下症状确定不同的感染率：

感染率0：无症状，

感染率10％：叶片仅出现白色病斑

感染率33％：叶片黄化且出现褐色病斑

感染率66％：叶片枯死，茎部出现腐烂

感染率100％：叶片枯死脱落、茎腐烂、幼苗濒临死亡

平均感染率＝∑(相同感染率的苗数×感染率)/(调查苗总数)

选取平均感染率低于或等于10％的材料作为抗溃疡病猕猴桃砧木；

(2)猕猴桃品种脱毒苗生产：将接穗品种的新梢顶端茎尖进行愈伤组织诱导培养生成组培苗，经检测不携带溃疡病病原菌的组培苗在设置于采穗园中的隔离网室中定植，并定期抽样检测接穗品种以确保不携带溃疡病病原菌，培育成脱毒的接穗母树；

(3)抗溃疡病大苗嫁接及成苗生产：在脱毒的砧木大苗及接穗品种苗达到嫁接标准后，砧木及接穗经检测均无溃疡病感染的情况下进行嫁接，培育成抗溃疡病的双向脱毒成苗。

2.根据权利要求1所述的猕猴桃抗溃疡病双向脱毒大苗生产方法，其特征在于，砧木苗嫁接标准为：在距离地面根茎部位1.6米处，主干直径大于或等于0.8厘米，接穗的嫁接位置为距离砧木根茎部位1.6米以上，1.8米以下，采用劈接或腹接。

3.根据权利要求1所述的猕猴桃抗溃疡病双向脱毒大苗生产方法，其特征在于，所述的猕猴桃接穗品种为中华猕猴桃红肉品种或黄肉品种。

4.根据权利要求1所述的猕猴桃抗溃疡病双向脱毒大苗生产方法，其特征在于，抗溃疡病砧木苗由组培苗培育成大苗的方法如下：将组培苗依次移栽至育苗穴盘、营养钵、大营养钵进行培育，苗高度达到20厘米时，使用水肥一体结合滴灌，N:P:K＝15-18:15-18:15-18复合肥工作浓度0.2-0.4％，每周施肥一次，施用量为20-50升/株/次，每个月使用干基40％的腐殖酸肥一次，工作浓度为0.05％，施用量为200-400升/株/次；幼苗高度超过30厘米时，用棉线从基部牵引，使幼苗直立单头生长；苗高超过1米后，复合肥工作浓度加至每周每次0.5％，干基40％的腐殖酸肥每15天滴灌一次；苗高达到1-1.5米时，根据生长强度掐尖1-2次，之后达到1.8-2米时再次掐尖，促进主干增粗。

5.根据权利要求1所述的猕猴桃抗溃疡病双向脱毒大苗生产方法，其特征在于，采穗圃选址标准为：年平均温度在14-16度之间，冬季最低温不低于零下5度，在方圆20公里所处位置较高、光照充足、排水良好的避风地点，距离已有猕猴桃果园距离达到15-20公里以上。

6.权利要求1所述的猕猴桃抗溃疡病双向脱毒大苗生产方法在已感染溃疡病果园改造中的应用。