CN112385424A - 一种黄瓜嫁接方法及其在根结线虫防治中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄瓜嫁接方法及其在根结线虫防治中的应用。本发明要求保护一种黄瓜嫁接方法，包括如下步骤：以具有根结线虫抗性的角瓜(Cucumis metuliferus)作为砧木，以黄瓜(Cucumis sativus)作为接穗进行嫁接。本发明实现了黄瓜的共砧嫁接，不仅丰富了黄瓜砧木的选择余地，具有明显的增产作用，对根结线虫的防治效果显著优于南瓜嫁接与杀线虫药剂，同时改善了嫁接黄瓜的风味与品质。此外，使用本发明防治根结线虫，减少了杀线虫药剂的使用，降低了生产成本，减少了农药残留，提升了黄瓜种植收益与产品质量，保障了黄瓜产业的可持续发展。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种黄瓜嫁接方法及其在根结线虫防治中的应用。
背景技术
根结线虫(Meloidogyne spp.)是危害黄瓜(Cucumis sativus L.,2n＝14)生产的重要病原，对全球黄瓜产量造成重大损失，一般年份减产10％～15％，严重时达30％～40％，甚至绝收，已成为影响黄瓜生产的严重障碍。线虫侵入根系造成的伤口还可引起黄瓜枯萎(Fusarium oxysporum)、根腐(Pythium aphanidermatum)等土传病原的复合侵染，进而导致连作障碍的发生。南方根结线虫(M.incognita)、爪哇(M.javanica)、花生(M.arenaria)和北方(M.hapla)根结线虫均可对黄瓜造成危害，许多研究报道南方根结线虫是危害黄瓜生产的优势种群。
黄瓜生产上防治根结线虫的技术措施主要包括轮作倒茬、高温闷棚和化学防治等。轮作倒茬对控制根结线虫具有一定的效果，但由于根结线虫寄主范围较广，可供轮作的作物较少。高温闷棚在杀死土壤中根结线虫的同时，也减少了土壤中其它有益微生物的数量，影响了土壤中有机质的分解。使用杀线虫剂是目前控制黄瓜根结线虫病害的主要手段，但是化学药剂残留较多，污染环境且难以防治。其它控制根结线虫的技术措施，如植物源农药的开发与生物防治等研究起步较晚，在黄瓜生产中的应用报道较少。实践证明，选育和利用抗线虫品种是防治根结线虫最经济有效和无污染的方法，目前国内外尚无抗南方根结线虫的黄瓜品种应用于生产，对根结线虫缺乏有效的防控措施。
黄瓜栽培种内根结线虫抗源匮乏，黄瓜属一些野生资源，如C.metuliferusE.Meyer ex Naudin，C.anguria L.，C.f icifolius A.Rich，C.heptadactylus Naud.，C.longipes Hook以及C.hystrix Chakr.等对南方根结线虫具有抗性。角瓜(C.metuliferus,2n＝24)为原产非洲的黄瓜属野生物种，角瓜的南方根结线虫抗性得到了葫芦科遗传育种学家的广泛关注，大量抗性鉴定研究发现，角瓜种内存在对南方根结线虫抗性的遗传分化。国内外学者在黄瓜属内开展了广泛的种间杂交，但由于角瓜与黄瓜种间存在严重的生殖隔离障碍，从而制约了角瓜在黄瓜品种遗传改良中的利用。
嫁接栽培是黄瓜生产上防控土传病害的重要举措。利用南瓜作砧木进行黄瓜嫁接栽培，对防治黄瓜枯萎病发挥了重要作用。研究人员对葫芦科作物进行了大量的抗线虫鉴定，发现对南方根结线虫具有抗性的南瓜种质资源极少，且南瓜对根结线虫的抗性水平较低。因此，从角瓜中筛选鉴定抗根结线虫的种质材料作砧木，进行黄瓜嫁接栽培，是一条防治根结线虫切实可行的有效措施，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明针对根结线虫严重危害黄瓜生产的突出问题，以及现有防控技术的不足，提供一种黄瓜嫁接方法及其在根结线虫防治中的应用，涉及砧木的筛选、嫁接方法的筛选等。
第一方面，本发明要求保护一种黄瓜嫁接方法。
本发明所要求保护的黄瓜嫁接方法，可包括如下步骤：以具有根结线虫抗性的角瓜(Cucumis metuliferus)作为砧木，以黄瓜(Cucumis sativus)作为接穗进行共砧嫁接。
进一步地，所述根结线虫可为南方根结线虫。
进一步地，作为砧木的所述角瓜(Cucumis metuliferus)可为角瓜(Cucumismetuliferus)品系PI 482443或角瓜(Cucumis metuliferus)品系PI 482452。
进一步地，进行所述嫁接的方式可为插接或劈接。
进一步地，作为接穗的所述黄瓜(Cucumis sativus)可为密刺型黄瓜或白黄瓜或水果型黄瓜。
更进一步地，所述密刺型黄瓜可为‘津绿3号’，所述白黄瓜可为‘白叶三’，所述水果型黄瓜可为‘玉米迷你’。
第二方面，本发明要求保护前文所述方法或通过前文所述方法得到的嫁接苗在防治黄瓜根结线虫和/或促进黄瓜增产中的应用。
第三方面，本发明要求保护角瓜(Cucumis metuliferus)品系PI 482443或角瓜(Cucumis metuliferus)品系PI 482452作为嫁接砧木在获得具有根结线虫抗性和/或能够促进增产的黄瓜嫁接苗中的应用。
第四方面，本发明要求保护角瓜(Cucumis metuliferus)品系PI 482443或角瓜(Cucumis metuliferus)品系PI 482452作为砧木，密刺型黄瓜‘津绿3号’或白黄瓜‘白叶三’或水果型黄瓜‘玉米迷你’作为接穗，在获得具有根结线虫抗性和/或能够促进增产的黄瓜嫁接苗中的应用。
在本发明中，所述防治黄瓜根结线虫和所述具有根结线虫抗性具体可体现为：提高对所述根结线虫的防治效果(％)和/或降低病级指数(RKI)。
其中，RKI＝∑(s×n)/N(s：各根结级别的代表值，n：各根结级别的株数，N：调查总株数)，据此计算各处理组合防治效果，防治效果(％)＝(RKI对照-RKI处理)/RKI对照×100％。
在上述第二到四方面中，所述根结线虫具体可为南方根结线虫。
本发明利用根结线虫2龄幼虫接种法，通过盆栽接种与田间病圃相结合的抗线虫鉴定技术，从黄瓜属种质资源中筛选到2份抗南方根结线虫的种质材料角瓜(Cucumismetuliferus)品系PI 482443和PI 482452，并通过嫁接亲和力测定与共生亲和力测试，确定了两种适宜的嫁接方法，实现了黄瓜的共砧嫁接。本发明不仅丰富了黄瓜砧木的选择余地，具有明显的增产作用，对根结线虫的防治效果显著优于南瓜嫁接与杀线虫药剂，同时改善了嫁接黄瓜的风味与品质。此外，使用本发明防治根结线虫，减少了杀线虫药剂的使用，降低了生产成本，减少了农药残留，提升了黄瓜种植收益与产品质量，保障了黄瓜产业的可持续发展。
具体而言，本发明具有如下几方面的优势：
(1)本发明利用根结线虫2龄幼虫接种法，通过盆栽接种与田间病圃相结合的抗线虫鉴定技术，从黄瓜属种质资源中筛选到抗南方根结线虫的种质材料，不仅为黄瓜抗线虫基因的定位、克隆以及黄瓜线虫抗性的遗传改良提供了有用的遗传材料，同时该接种方法与抗线虫鉴定技术也为其它作物抗线虫材料的选育提供了借鉴。
(2)本发明通过嫁接方法的筛选，确定了插接和劈接两种适宜的嫁接方法，并通过嫁接亲和力测定与共生亲和力测试，保障了砧木与接穗高度的亲和性与匹配度，有利于推动黄瓜的嫁接生产，从而为黄瓜的高产高效优质栽培奠定了基础。
(3)本发明筛选到的角瓜品系PI 482443和PI 482452，在盆栽接种与田间病圃抗线虫鉴定中表现出高抗南方根结线虫，在田间防效试验中，二者较对照具有明显的增产作用，对根结线虫的防治效果分别达82.76％、85.19％，显著优于南瓜嫁接与杀线虫药剂的防治效果，体现了本发明在防治根结线虫上的高效性。
(4)本发明以筛选到的角瓜品系PI 482443和PI 482452作砧木，栽培黄瓜为接穗，实现了黄瓜的共砧嫁接，本发明不仅丰富了黄瓜嫁接生产上砧木品种的选择余地，同时改善了嫁接黄瓜的风味与品质，克服了南瓜与葫芦砧对黄瓜风味品质的负面影响。
(5)本发明利用角瓜嫁接黄瓜防治根结线虫危害，减少了黄瓜生产中杀线虫药剂以及其它化学农药的使用，不仅降低了生产成本，提高了种植收益，同时减少了产品中的农药残留，对作物、人与环境安全无害，符合绿色农产品的市场需求，保障了黄瓜产业的可持续发展。
附图说明
图1为根结线虫病原鉴定与扩繁。A为供检根结线虫雌虫会阴花纹形态；B为供检根结线虫苹果酸脱氢酶(MDH)、酯酶(EST)同工酶电泳图谱；C为番茄根系上扩繁获得的根结线虫卵块。
图2为根结线虫接种液的制备。
图3为盆栽接种根结线虫植株根部症状。
图4为砧木及其与接穗适宜的嫁接方法。
图5为抗根结线虫黄瓜砧木的田间防治效果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
角瓜(Cucumis metuliferus)品系PI 482443和PI 482452：记载于“YiqunWeng.Genetic Diversity among Cucumis metuliferus Populations Revealed byCucumber Microsatellites.HortScience 45(2):214-219.2010”一文，公众可自申请日起20年内从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。
密刺型黄瓜‘津绿3号’：购于兰州种子市场。
白黄瓜‘白叶三’：购于兰州种子市场。
水果型黄瓜‘玉米迷你’：购于兰州种子市场。
实施例1、抗根结线虫黄瓜种质资源的筛选鉴定
1、种质资源搜集
从国内外搜集黄瓜属种质资源110份，包括华北型黄瓜材料4份，华南型黄瓜材料2份，水果黄瓜材料2份，白黄瓜材料2份，黄瓜野生资源50份，种间杂交渐渗系材料46份，半野生资源4份。部分具有代表性的材料见表1。
2、线虫病原鉴定与接种液制备
(1)线虫病原鉴定与扩繁
从田间采集感染根结线虫的黄瓜根系，从黄瓜根结上挑取色泽淡黄、大而饱满的优质单卵块，接种到预先培养在消毒土壤的感病番茄根部，在温室中培养。采用雌虫会阴花纹形态和苹果酸脱氢酶(MDH)、酯酶(EST)同工酶表型进行根结线虫种类鉴定。经线虫病原鉴定后，接种在感病番茄上于温室中进行繁殖(图1)。经鉴定根结线虫具体为南方根结线虫。
(2)接种液制备
将温室中培养的发病番茄根系冲洗干净，剪成1-2mm的小段，置于振荡罐中，然后按1:100的比例加入1％的NaOCl溶液，放入振荡器充分振荡2min，随后依次通过60、200和500目的网筛冲洗，最后用去离子水冲洗至线虫孵化杯中，置26℃恒温箱中孵化，逐天收集孵化的2龄幼虫，利用细胞计数皿在显微镜下统计线虫数并确定其浓度(图2)，备用。
3、盆栽接种抗线虫鉴定
(1)无菌化育苗
所有材料均采用穴盘育苗，种子经55-60℃温汤浸种消毒，28℃恒温催芽，待种子露白后播种于穴盘，内装经高温(120℃)灭菌的基质(泥炭土∶蛭石＝1∶1，体积比)，待幼苗长至2叶1心时从育苗穴盘移入装有灭菌基质的盆钵中继续培养。
(2)根结线虫接种
待幼苗长至3～4片真叶时开始接种，接种采用2龄幼虫接种法，在黄瓜根系周围用玻璃棒打2个孔，将收集孵化的2龄幼虫用移液器注入孔中，接种量为2000个幼虫·株-1，接种后进行正常的肥水管理。
(3)抗线虫鉴定
接种8周后轻轻洗去根系的基质，调查记载每株根系的根结数和卵块数。根结数和卵块数的调查统计在10倍相差物镜下进行，根结数和卵块数按0～5级指标评价：无根结或卵块为0级，1～2个根结或卵块为1级，3～10个为2级，11～30个为3级，31～100个为4级，大于100个为5级。根结指数(GI)和卵块指数(EI)的计算公式为G(E)I＝Σ(si·ni)/N(si:根结数或卵块数级别，ni：相应级别的株数，i：根结数或卵块数分级的各个级别，N：调查总株数)，病情指数(DI)计算公式为：
最后依据病情指数将各材料对根结线虫的抗病类型分为7级：免疫(IM)，0＜DI≤1；高抗(HR)，1＜DI≤2；抗(R)，2＜DI≤3；中抗(MR)，3＜DI≤4；中感(MS)，4＜DI≤5；感(S)，5＜DI≤6；高感(HS)，DI＞6。通过盆栽接种抗线虫鉴定，从110份供试黄瓜材料中，筛选出来源于角瓜(Cucumis metuliferus)的2个品系PI 482443和PI 482452，对南方根结线虫表现高抗，且抗性稳定(图3和表1)。
表1、部分供试黄瓜的盆栽接种抗根结线虫鉴定结果
4、田间病圃抗线虫鉴定
(1)田间病圃选择
首先选择根结线虫发病严重的黄瓜地块，在黄瓜发病时采集病根与根际土样，进行根结线虫分离与种群鉴定。根结线虫分离采用淘洗-过筛法，分别称取100g土样用水流冲洗，将悬浮液依次通过60、200和500目样本筛，收集500目筛网上的残物，淋洗、过滤后收集于小烧杯内，在体视解剖镜下统计线虫数量。根结线虫种群鉴定采用雌虫会阴花纹形态和苹果酸脱氢酶(MDH)、酯酶(EST)同工酶表型进行鉴定。经测定，抽检土样100g干土中平均根结线虫数量达95.3条，属根结线虫重度病圃，且根结线虫在田间分布较为均匀，经鉴定该种群为南方根结线虫，符合田间病圃选择标准，适宜作为抗线虫鉴定的田间病圃。
(2)无菌化育苗
供试材料津春4号、津绿3号、白叶三、玉米迷你购于兰州种子市场，角瓜(Cucumismetuliferus)品系PI 482443和PI 482452引自美国。所有材料均采用穴盘育苗，种子经55-60℃温汤浸种消毒，28℃恒温催芽，待种子露白后播种于穴盘，内装经高温(120℃)灭菌的市售基质，待幼苗长至3叶1心时进行田间移栽，每品种在田间定植78株，随机排列，3次重复，每小区定植26株，缓苗后进行正常的田间管理。
(3)抗线虫鉴定
适于采收时用铁锹挖出完整根系，轻轻抖落根系上的泥土，统计根结线虫发病率，计算病级指数(RKI)。单株根结级别划分标准：0级为所有的根上都没有根结，1级为0％＜有根结的根系百分数＜10％，2级为10％≤有根结的根系百分数＜25％，3级为25％≤有根结的根系百分数＜50％，4级为50％≤有根结的根系百分数＜75％，5级为75％≤有根结的根系百分数≤100％。RKI＝∑(s×n)/N(s：各根结级别的代表值，n：各根结级别的株数，N：调查总株数)。群体抗性类型评价标准：免疫(IM)，RKI＝0；高抗(HR)，0＜RKI≤1；抗病(R)，1＜RKI≤2；中抗(MR)，2＜RKI≤3；感病(S)，3＜RKI≤4；高感(HS)，4＜RKI≤5。通过田间病圃抗线虫鉴定，来源于角瓜(Cucumis metuliferus)的2个品系PI 482443和PI 482452在田间长势较好，表现高抗南方根结线虫(表2)。
表2、黄瓜田间病圃抗根结线虫鉴定结果
实施例2、抗根结线虫种质的嫁接适应性测试
1、育苗
砧木2份，分别为筛选出的角瓜(Cucumis metuliferus)品系PI 482443和PI482452，接穗3份，包括密刺型黄瓜‘津绿3号’，白黄瓜‘白叶三’，水果型黄瓜‘玉米迷你’。砧木采用营养钵育苗，接穗直接撒播在苗床上，砧木较接穗提前20d播种，出苗后进行正常的肥水管理，培育壮苗。
2、嫁接方法的筛选
通过适宜嫁接方法的筛选，确定采用插接和劈接两种方法进行嫁接。
插接：先将砧木的真叶和生长点挖掉，用竹签从一侧子叶的主叶脉基部向另一侧子叶方向朝下斜插5～7mm深；再选适当的接穗，在子叶下8～10mm处下刀斜切至胚轴的2/3处，切口长约5mm左右，再从对面下刀，将接穗削成楔形，拔出竹签，插入接穗，夹好嫁接夹，栽入10×10cm的营养钵中，摆入扣了拱棚的苗床中。
劈接：用刀片挑出砧木的真叶及生长点，顺两子叶的连接线的一半处向下直切8mm，接穗削法同插接，将削好的接穗插入砧木的切口中，用嫁接夹固定，栽入营养钵中，放入扣了拱棚的苗床中(图4)。
嫁接后拱棚内白天温度控制在25-28℃，夜间保持在20℃左右，保温保湿遮荫，4天后逐步通风透光，待嫁接苗成活后，进行正常的肥水管理。
3、嫁接亲和力测定
嫁接亲和力，是指嫁接后砧木与接穗愈合的程度。嫁接亲和力可用嫁接后的成活百分率表示，嫁接后砧木很快就与接穗愈合，成活率高，则表明该砧木与接穗的嫁接亲和力高。嫁接后2周待嫁接苗成活后，统计嫁接苗成活率，进行亲和力测定。试验结果如表3所示，3个不同生态型黄瓜品种与2个角瓜(Cucumis metuliferus)品系PI 482443和PI 482452嫁接后，嫁接成活率均在76％以上，除PI 482452与‘白叶三’通过插接的成活率稍低外，其余不同砧木、不同接穗以及不同嫁接方法间嫁接成活率差异均未达显著水平，嫁接苗平均成活率达86.5％以上，说明本发明筛选出的2个角瓜(Cucumis metuliferus)品系PI 482443和PI 482452与黄瓜的嫁接亲和力较高。
表3、黄瓜嫁接成活率测定结果
4、共生亲和力测试
嫁接苗成活后进行田间移栽，此后进行正常的生产管理。试验结果显示，嫁接苗在田间缓苗快，生长迅速，长势较好，节间短，雌花多，易坐瓜，瓜条顺直，与自根黄瓜相比，嫁接黄瓜地上部病害减少，说明角瓜(Cucumis metuliferus)品系PI 482443和PI 482452与黄瓜的共生亲和力较好，适宜作黄瓜的嫁接砧木。
实施例3、抗根结线虫黄瓜砧木的应用
1、试验地选择
田间试验安排在甘肃省武威市凉州区发放镇安置村日光温室，该地块为黄瓜连茬地，连续种植黄瓜5年，根结线虫发生严重，土壤中南方根结线虫平均密度为71.3条/100g干土。
2、试验处理
试验共设6个处理组合，其中编号1、2、3为嫁接栽培，砧木分别为黑籽南瓜、角瓜(Cucumis metuliferus)品系PI 482443和PI 482452，接穗均为津绿3号，整个生长季不施用杀线虫药剂，编号4、5、6均为津绿3号自根栽培，4号不施杀线虫药剂，5号在定植穴内放入植物线虫散，6号从缓苗后每次随水冲施阿维菌素(表4)。田间按顺序排列，三次重复，每小区每个处理组合定植28株，每个处理组合共种植84株，田间栽培管理措施同常规生产田。
3、田间防治效果
试验结束后调查各处理组合根结线虫发病情况，统计病情级别及各级别发病株数，计算病级指数(RKI)，RKI＝∑(s×n)/N(s：各根结级别的代表值，n：各根结级别的株数，N：调查总株数；单株根结级别划分标准见实施例1)，据此计算各处理组合防治效果，防治效果(％)＝(RKI对照-RKI处理)/RKI对照×100％。
试验结果显示，对照津绿3号自根苗与黑籽南瓜嫁接栽培的病级指数相当，分别为4.93、4.94，施用植物线虫散与阿维菌素病级指数均低于对照，对根结线虫的防治效果分别为18.46％、28.19％，方差分析二者差异达显著水平，说明阿维菌素防效优于植物线虫散，PI 482443和PI 482452嫁接栽培的病级指数仅为0.85、0.73，对根结线虫的防治效果分别达到82.76％、85.19％，方差分析二者差异不显著，但显著高于其它各处理组合。比较6个处理组合的小区产量不难发现，角瓜品系PI 482443和PI 482452与黄瓜嫁接具有明显的增产作用，较对照增产分别达37.98％、40.04％，显著高于其它各处理组合，黑籽南瓜与黄瓜嫁接导致减产，说明黑籽南瓜高感南方根结线虫，施用植物线虫散和阿维菌素较对照分别增产12.51％、23.68％，说明二者对根结线虫也具有较好的防治效果(图5和表4)。
表4、不同处理组合田间防治根结线虫试验结果
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种黄瓜嫁接方法，包括如下步骤：以具有根结线虫抗性的角瓜(Cucumismetuliferus)作为砧木，以黄瓜(Cucumis sativus)作为接穗进行嫁接。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述根结线虫为南方根结线虫。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：作为砧木的所述角瓜(Cucumismetuliferus)为角瓜(Cucumis metuliferus)品系PI 482443或角瓜(Cucumismetuliferus)品系PI 482452。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：进行所述嫁接的方式为插接或劈接。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：作为接穗的所述黄瓜(Cucumissativus)为密刺型黄瓜或白黄瓜或水果型黄瓜。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述密刺型黄瓜为‘津绿3号’，所述白黄瓜为‘白叶三’，所述水果型黄瓜为‘玉米迷你’。
7.权利要求1-6中任一所述方法或通过权利要求1-6中任一所述方法得到的嫁接苗在防治黄瓜根结线虫和/或促进黄瓜增产中的应用。
8.角瓜(Cucumis metuliferus)品系PI 482443或角瓜(Cucumis metuliferus)品系PI482452作为嫁接砧木在获得具有根结线虫抗性和/或能够促进增产的黄瓜嫁接苗中的应用。
9.角瓜(Cucumis metuliferus)品系PI 482443或角瓜(Cucumis metuliferus)品系PI482452作为砧木，密刺型黄瓜‘津绿3号’或白黄瓜‘白叶三’或水果型黄瓜‘玉米迷你’作为接穗，在获得具有根结线虫抗性和/或能够促进增产的黄瓜嫁接苗中的应用。
10.根据权利要求7-9中任一所述的应用，其特征在于：所述根结线虫为南方根结线虫。
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