CN110791505B

CN110791505B - 猕猴桃溃疡病抗性基因AcLac35及其应用

Info

Publication number: CN110791505B
Application number: CN201911134730.XA
Authority: CN
Inventors: 刘普; 李亚巍; 赵志伟; 梁宽
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2019-11-19
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2039-11-19
Also published as: CN110791505A

Abstract

本发明提供猕猴桃溃疡病抗性基因AcLac35及其应用。基因AcLac35及其编码蛋白的序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。将基因AcLac35转入到易感猕猴桃品种中，得到具有溃疡病抗性的猕猴桃。同时该基因的利用有效解决了传统育种方法中童期长、雌雄异株、倍性差异等问题，利用基因转化技术将AcLac35转入猕猴桃中，大大缩短了育种周期，还能避免传统育种中存在的效率低，靶标基因与其他控制不良性状基因连锁等带来的问题。通过转化获得的抗病植株及其后代，可通过组培扩繁、嫁接等方式将AcLac35基因稳定遗传给后代。基因AcLac35具有显著抗溃疡病的特点，利用该基因育成的抗病新品种可大面积推广种植。

Description

猕猴桃溃疡病抗性基因AcLac35及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物遗传育种领域，具体地说，涉及猕猴桃溃疡病抗性基因AcLac35及其应用。

背景技术

猕猴桃属于猕猴桃科猕猴桃属，其经济价值高，果实营养丰富，特别是膳食纤维和维生素C含量较高。猕猴桃细菌性溃疡病(Bacterial canker of kiwifruit)是猕猴桃产业发展的第一大病害，给全球猕猴桃产业造成严重的经济损失。

猕猴桃溃疡病是由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringaepv.actinidiae，Psa)引起的猕猴桃毁灭性病害，主要危害猕猴桃的主蔓、枝干、叶片和花蕾。病菌在猕猴桃苗期呈潜伏状态不易被发现，常在猕猴桃开始挂果(一般为定植后第三年)或丰产后，树势减弱情况下发病。国内外在猕猴桃溃疡病菌的遗传多样性及致病机制、猕猴桃抗病机制和综合防治等方面均取得了新的研究进展(Scortichini et al.2012)。按照毒素和致病力不同，溃疡病菌分为5种类型(biovar 1-5)，其中biovar 3(Psa-V)致病力最强，危害也最为严重，我国致病菌主要为Psa-V(Fujikawa and Sawada2016；Liu etal.2016)。

在病菌诱导下，植物会发生细胞壁木质素沉积和胼胝质积累等。同时，细菌会分泌酶和毒素等来克服、抑制或干扰植物细胞壁介导的抗病性以建立侵染关系。木质素结构更为复杂且难以被细菌和真菌等所降解(Brown and Chang 2014)。木质素可驱除基质中的水分，并与基质中的多聚糖相互交联，通过共价键连接形成一个疏水网络，这种共价结合主要是通过阿魏酸或其他的酚类残基结合到木聚糖上。木质素也可结合或包裹在纤维素上，从而加固整个细胞壁。木质素的加固和疏水作用，可降低细胞壁对来自病菌水解酶攻击的敏感性(Xu et al.2011)。在拟南芥中病菌侵染会促进植物胼胝质(β-1,3葡聚糖)在细胞壁积累，然而胼胝质却提高了拟南芥对丁香假单胞菌(P.syringae)的敏感性，木质素积累则能有效抑制该病程发生(

-Delgado et al.2003；De Benedictis et al.2018)。

通过对抗病种质资源进行筛选及分析发现，对p-香豆酸等木质素前体的酚类物质与猕猴桃溃疡病抗性负协同，检测发现木质素含量与溃疡病抗性正协同，结果显示酚类物质向木质素合成受阻可能是抗病性差异的内在原因。基于转录组和蛋白组对猕猴桃在病菌诱导的木质素合成途径进行了富集后发现大量AcLac(laccase-like，Lac)基因的差异表达，而AcLac基因在木质素合成中的具体功能目前尚未完全证实。鉴于此围绕AcLac基因在木质素合成途径中的功能及其与猕猴桃抗溃疡病的关系来开展工作，以期待揭示猕猴桃对溃疡病抗性的分子机制，以此来为栽培生产、开发分子标记和培育抗病育种提供理论依据。

以链霉素、四环素和春雷霉素等抗生素类、硫酸铜等铜制剂类和噻霉酮是目前猕猴桃溃疡病最有效的防治药剂，但抗药性及病菌可侵入猕猴桃枝干木质部等问题造成一旦侵染，药剂很难防控(Colombi et al.2017)。

发明内容

本发明旨在解决现有防治手段防治效率低、抗药性等问题，提供猕猴桃溃疡病抗性基因AcLac35及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供猕猴桃溃疡病抗性基因AcLac35，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

猕猴桃溃疡病抗性基因AcLac35的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。原位杂交显示该基因主要表达于根、茎和叶等易受溃疡病危害的部位。

第二方面，本发明提供含有所述基因AcLac35的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。

第三方面，本发明提供所述基因AcLac35或含有该基因的生物材料的以下任一应用：

1)用于提高植物对溃疡病的抗性；

2)用于促进植物木质素的合成；

3)用于提高植物对丁香假单胞菌及其变种以及它们所致植物病害(特别是溃疡病)的抗性；

4)用于制备转基因植物；

5)用于植物育种。

优选地，丁香假单胞菌的变种为丁香假单胞菌的猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringae pv.actinidiae，Psa)。

本发明中，所述植物包括但不限于猕猴桃、烟草。

第四方面，本发明提供一种提高植物溃疡病抗性的方法，所述方法包括：

1)使植物包含所述基因AcLac35；或

2)使植物过表达所述基因AcLac35。

所述方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

前述的方法，过表达基因AcLac35的方法选自以下1)～4)，或任选的组合：

1)通过向植物中导入具有所述基因AcLac35的质粒；

2)通过增加植物染色体上所述基因AcLac35的拷贝数；

3)通过将强启动子与所述基因AcLac35可操作地连接；

4)通过导入增强子。

第五方面，本发明提供用于检测所述基因AcLac35的特异性引物，包括正向引物AcLac35-F1和反向引物AcLac35-R2，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和4所示。

第六方面，本发明提供含有上述引物的检测试剂或试剂盒。

在本发明的一个具体实施方式中，将猕猴桃抗性基因AcLac35转入到易感猕猴桃品种中，得到具有溃疡病抗性的猕猴桃。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

将本发明的猕猴桃抗病基因AcLac35转入到易感猕猴桃品种中，可以产生抗溃疡病猕猴桃新品种；同时，该基因的利用有效解决了传统育种方法中童期长、雌雄异株、倍性差异等问题，本发明提供的抗溃疡病基因AcLac35可以用转化技术将其转移到猕猴桃中，通过基因转化，大大缩短了育种周期，同时可以避免传统育种中存在的效率低，靶标基因与其他控制不良性状基因连锁等带来的问题。本发明通过转化获得的抗病植株及其后代，可通过组培扩繁、嫁接等方式将AcLac35基因稳定遗传给后代。基因AcLac35具有显著抗溃疡病的特点，利用该基因育成的抗病新品种可大面积推广种植。

附图说明

图1为本发明实施例1中猕猴桃总木质含量测定结果；其中，HY-N：红阳(感病猕猴桃品种)正常叶片；HY-D-L：红阳感病叶片；HY-D-S：红阳重病叶片；JK-N：金魁(抗病猕猴桃品种)正常叶片；JK-D：金魁感病叶片。

图2为本发明实施例1中猕猴桃基因AcLac35原位杂交特异性表达结果；其中，JK-CK：对照组；JK-CL：处理组。

图3为本发明实施例1中AcLac35基因克隆产物的电泳图；其中，M：DNA分子量标准，1和2：扩增产物。

图4为本发明实施例2中pCAMBIA1300(p1300)载体双酶切检测结果；其中，M：DNA分子量标准，1～5：酶切产物。

图5为本发明实施例2中AcLac35基因的亚细胞定位分析结果。

图6为本发明实施例2中AcLac35转基因烟草植株的总木质含量测定结果。其中，35S-GFP表示空载对照，35S-AcLac35-GFP表示携带AcLac35基因的转基因植株。

图7为本发明实施例2中过表达AcLac35基因的猕猴桃植株接种溃疡病菌后的植株发病情况。其中，CK、Psa、AcLac35、Psa+AcLac35分别表示空载对照、空载对照接种Psa病菌处理、AcLac35转基因植株、AcLac35转基因植株接种Psa病菌处理。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中涉及的p1300载体、猕猴桃品种‘金魁’，以及各种试剂均为市售，猕猴桃溃疡病菌JF8菌株由中国典型培养物保藏中心提供(CCTCC AB2018305)，参见猕猴桃溃疡病菌质粒的分离与功能分析，王月等，华中农业大学学报，2018。

实施例1溃疡病抗性候选基因的筛选及基因AcLac35的获得

1、溃疡病抗性候选基因的筛选及分析

通过抗病品种‘金魁’猕猴桃转录组分析，共25个AcLac基因表达量发生不同程度的变化，其中发现6个差异表达比较显著的基因AcLac2、AcLac8、AcLac14、AcLac20、AcLac35和AcLac38，而这些基因在处理之后几乎都是上调表达。而在感病品种‘红阳’猕猴桃中，共发现29个漆酶基因表达发生变化，其中只有AcLac16,AcLac18,AcLac24在漆酶家族中上调表达，其他基因在不同程度上被下调。通过两个品种转录组猕猴桃漆酶基因的之间的差异表达的差值，推测AcLac35基因可能与猕猴桃遭遇溃疡病入侵时参与木质素合成中起到非常重要的地位。

通过选择6个具有代表性的漆酶基因AcLac2，AcLac14，AcLac17，AcLac20，AcLac33，AcLac35，对其转录组数据验证。通过分析发现，转录组数据与荧光定量数据基因差异表达趋势一致，其中AcLac35基因在品种之间的表达量差异明显。在感病品种中，AcLac35的表达随着病症的严重程度逐渐下调，在抗病品种则上调表达，最终将基因AcLac35作为研究重点。

猕猴桃总木质含量测定结果见图1。总木质素含量测定参考巯基乙酸的方法，见Dyckmans J,Flessa H,Brinkmann K,et al.Carbon and nitrogen dynamics in aciddetergent fibre lignins of beech(Fagus sylvatica L.)during the growth phase[J].Plant Cell&Environment,2010,25(4):469-478。所述方法包括：

(1)样品的洗涤：将样品1克从-80℃冰箱中取出置于5ml洗液(100mM的K₂HPO₄/KH₂PO₄，0.5％Triton X-100，0.5％PVP，pH 7.8)中，室温下振荡洗涤30min，6000rpm离心20min(水平转子)，用洗液重悬浮沉淀，重复清洗2次，再用100％甲醇清洗4次，每次清洗的时间均为30min，80℃烘箱中烘干过夜。

(2)木质素的测定：称取2mg粉末于2ml离心管中；加入1.5ml的2M HCl和0.3ml的巯基乙酸，95℃水浴4h后置于冰上冷却；样品12000rpm，4℃离心10min。弃上清，收集沉淀；沉淀用蒸馏水离心清洗3次，重悬浮于1ml的0.5M NaOH溶液中，室温下轻微振荡反应18h；12000rpm离心10min，上清液置于新的试管中；沉淀中加再次加入0.5ml的0.5M NaOH溶液，12000rpm离心10min；将上述两步收集的上清合并，加入0.3ml浓盐酸，于4℃静置4h，以沉淀巯基乙酸结合的木质素；4℃条件下12000rpm离心10min，沉淀溶于2ml的0.5M NaOH溶液中。测定280nm处的吸光值。空白对照为相同体积0.5M NaOH溶液的吸光值。单位为mg/ml，每个样品重复3次。使用木质素标准品制作标准曲线。

基因AcLac35原位杂交特异性表达结果见图2。所述方法包括：

采用针刺注射猕猴桃溃疡病菌JF8(CCTCC AB2018305)的方法对抗病品种‘金魁’组培苗进行处理，注射方法参见He R.,Liu.P.,Jia B.g,et.al.,Genetic diversity ofPseudomonas syringae pv.actinidiae strains from different geographic regionsin China.Phytopathology.109,((3)):p.347-357(2018)。注射24h后分别对根、茎、叶取样，置于FAA固定液中(4％甲醛，10％乙酸，50％无水乙醇)。在JK-AcLac35的cDNA序列中选择特异性片段合成探针(5′-cy3-TGGCTTGGGTTGTGAAGGGCTTGACATA-3′)。通过包埋、切片、杂交、DAPI复染核以及镜检操作对其不同部位进行观察。参见Baker R F,Leach K A,Boyer NR,et al.Sucrose Transporter ZmSut1Expression and Localization Uncover NewInsights into Sucrose Phloem Loading[J].Plant Physiology,2016,172(3):1876-1898.

2、基因AcLac35的全长cDNA序列的获得

使用RNA试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，货号：DP441)提取‘金魁’猕猴桃叶片的RNA；使用反转录试剂盒(北京全式金生物公司，货号：AT311)获得cNDA。根据基因组结合转录组数据获取猕猴桃漆酶AcLac35基因CDS完整序列，用Primer 5.0软件设计全长引物。cDNA为模板，进行PCR扩增，优化后的反应体系如下：

PCR扩增程序根据所使用的高保真I-5酶(北京擎科新业生物技术有限公司，货号：TP001)以及试验过程中优化后的为准：98℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸1min，35次循环；72℃延伸10min，4℃保存。

扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图3。

3、基因AcLac35的序列分析

利用获得的基因AcLac35的cDNA与AcLac35基因的基因组DNA序列比较分析表明，AcLac35的基因组序列含有5个内含子。基因AcLac35编码一个由562个氨基酸组成的蛋白。得到AcLac35基因cDNA，长度一致全长，编码个氨基酸。SMART在线分析软件对其结构域分析，发现AcLac35基因具有三个铜离子氧化酶结构域。基因AcLac35的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例2抗溃疡病基因AcLac35的遗传转化

根据p1300载体的功能，将目的基因插入到35S启动子之后，载体自带EGFP标记基因，同时满足亚细胞定位和基因超表达的功能，试验操作方便。根据p1300载体可供选择的酶切位点(Xba I和BamH I)利用诺唯赞公司(Vazyme Biotech Co.,Ltd)提供的软件(CEDesign V1.04)设计出同源臂引物(表1)。

表1重组载体构建引物序列

注：下划线标注的部分为对应的酶切位点。

使用同源加酶切位点的引物对重新PCR扩增目的基因片段，片段纯化并测其浓度。扩增体系如下：

同时，对p1300空载大肠杆菌进行活化后摇菌提取质粒，检测浓度对其进行双酶切操作：

在水浴锅中37℃酶切1h，酶切结束后置于65℃、5min使酶失活。1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测(图4)，纯化回收目的片段(生工生物有限公司(上海)，货号：B515103)。

根据诺唯赞公司提供的软件(CE Design V1.04)计算其片段和载体片段的加入量。连接体系如下：

注：Exnase、5×CE II Buffer购自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：C112。

将混合物置于PCR仪中37℃连接30min，反应结束后转化到大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1(北京全式金生物公司，货号：CD501-01)，并进行重组子筛选和测序验证。对经测序验证正确的阳性重组子菌液中吸取0.5ul在5ml LB/Kan⁺液体培养基中37℃、200rpm过夜震荡培养，使用质粒回收试剂盒(生工生物有限公司(上海)，货号：B518191)提取大肠杆菌中的p1300-35S-HY-AcLac35-GFP、p1300-35S-JK-AcLac35-GFP质粒。将重组质粒p1300-35S-HY-AcLac35-GFP、p1300-35S-JK-AcLac35-GFP转化到GV3101(上海唯地生物技术有限公司，货号：AC1001)农杆菌中。

培养至48h左右，挑取单菌落置于YEB液体培养基(含Kan⁺和Rif⁺)中28℃、200rpm摇摇菌检测，摇菌至OD₆₀₀＝0.6-0.8；对菌液进行检测，引物见表2，p1300空载片段大小540bp扩增检测程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸3min，35次循环；72℃延伸10min。检测体系如下：

注：Premix Taq^TM购自宝日医生物技术(北京)有限公司，货号：RR901。

表2重组质粒检测引物

农杆菌介导的遗传转化：

(1)预培养：将猕猴桃组培苗的叶柄切成1cm的小段，叶片切成0.5cm×1cm的小叶盘，叶脉向下平铺到MS+3mg/L ZT(玉米素)+1mg/L NAA(萘乙酸)的培养基上预培养3-5d。

(2)侵染：将预培养的叶盘与叶柄放到农杆菌转化液里侵染20min；将侵染后的材料放到无菌滤纸上吸取多余的菌液。

(3)暗培养：之后将材料接种到MS+50μM AS(乙酰丁香酮)的培养基上28℃暗培养2d。

(4)筛选：将材料用无菌水冲洗3次，吸干水分后接种到MS+3mg/L ZT+1mg/LNAA+400mg/L Cef+150mg/L Kan的培养基上培养；筛选过程中，尽量不要更换培养基，以避免污染。

(5)继代培养：一个月后，将长出的幼苗切出，继续在MS+3mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)+1mg/L NAA+400mg/L Cef+100mg/L Kan的培养基上继代培养。愈伤则继续培养。

(6)诱导生根：将长至3-4cm的猕猴桃幼苗切出，放置在1/2MS+0.7mg/L IBA(吲哚丁酸)+50mg/L Kan的培养基上进行生根培养。

AcLac35基因的亚细胞定位分析结果见图5。转基因烟草植株的总木质含量测定结果见图6。过表达AcLac35基因的猕猴桃植株接种溃疡病菌后的植株发病情况见图7。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献:

[1].Scortichini M,Marcelletti S,Ferrante P,Petriccione M,FirraoG.Pseudomonas syringae pv.actinidiae:are-emerging,multi-faceted,pandemicpathogen.Molecular Plant Pathology 2012,13(7):631–640.

[2].Fujikawa T,Sawada H.Genome analysis of the kiwifruit cankerpathogen Pseudomonas syringae pv.actinidiae biovar 5.Scientific Reports 2016,6:21399.

[3].Liu P,Xue S,He R,Hu J,Wang X,Jia B,Gallipoli L,Mazzaglia A,Balestra GM,Zhu L.Pseudomonas syringae pv.actinidiae isolated from non-kiwifruit plant species in China.European Journal of Plant Pathology 2016,145:743–754.

[4].Brown ME,Chang MC.Exploring bacterial lignin degradation.CurrentOpinion in Chemical Biology 2014,19(1):1–7.

[5].Xu L,Zhu L,Tu L,Liu L,Yuan D,Jin L,Long L,Zhang X.Ligninmetabolism has a central role in the resistance of cotton to the wilt fungusVerticillium dahliae as revealed by RNA-Seq-dependent transcriptionalanalysis and histochemistry.Journal of Experimental Botany 2011,62(15):5607–5621.

[6].

-Delgado A1,Penfield S,Smith C,Catley M,Bevan M.Reducedcellulose synthesis invokes lignification and defense responses inArabidopsis thaliana.The Plant Journal 2003,34(3):351–362.

[7].De Benedictis M,Brunetti C,Brauer EK,Andreucci A,Popescu SC,Commisso M,Guzzo F,Sofo A,Ruffini Castiglione M,Vatamaniuk OK,Sanitàdi ToppiL.The Arabidopsis thaliana knockout mutant for phytochelatin synthase1(cad1-3)is defective in callose deposition,bacterial pathogen defense and auxincontent.Frontiers in Plant Science 2018,9:19.

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 猕猴桃溃疡病抗性基因AcLac35及其应用

<130> KHP191114887.0

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1689

<212> DNA

<213> 猕猴桃(Actinidia chinensis Planch)

<400> 1

atggcgccgg gatatagatt cctgccagga tgcctctttt ccatcacttt cttcatcatc 60

tttctctctt tctctgcttc cgcagcattg aagaaatatg acttcaatat acaagtgaag 120

aatgtaagca gattgtgcaa tgcaaaatca atagtgacag tcaatgggat gttccctggg 180

cctacagttt acattagaga aggagatcaa gtccttgtaa atgtctccaa ccatgcacaa 240

tacaatattt ctattcattg gcatggcttg aaacaatttc ggaatggctg ggcagatgga 300

ccggcatata taacacaatg tccgatccag actggccgga gctacgttta caatttcact 360

gtcacaggtc aaagaggaac attgtggtgg cacgcacata tcctgtggct tagagcaact 420

gtttatggcg cccttgttat catgcccaag gaaggaactc catttccatt ccctcagcct 480

taccaggaaa ctaacataat tctaggagaa tggtggaatc aagatgttga aacaattgtt 540

aaccaagcta ataagttggg cttaccacca caaacctctg acgctcatac aatcaatggg 600

aaaccaggac cactttttcc atgctctgag aaatatacct ttgccatgga agttcagttt 660

ggtaaaacat acctcttgag gatcatcaac tctgcactta atgacgagct cttcttcgcg 720

atagctggtc accccatgac tgttgtggag atcgatgcag tttatgtcaa gcccttcaca 780

acccaagcca ttctgatcgc gcctggccaa acaacaaatg ttctcgttaa agctgaccag 840

tcaccaaatc ggtacttcat ggctgcccgg cctttcatgg atgcaccact cgctgtggac 900

aacaagacgg tcacagctat tttacaatac aaaggcattc caaacacagt tctcccgact 960

ttcccccaat taccggctcc caacgacacc aagtttgcat tgaactataa tagcagactc 1020

aaaagtctca acactccaca attcccagca aaagttcctc ttaagagtga ccgccatctc 1080

ttttacacca tcggtttagg aatcaacccc tgtccaactt gccaaaatgg aacacaagta 1140

gtagcttcat tgaacaacat aacctttgtg atgcctaagg tggggctttt acaggctcat 1200

tatttcaaca tcgcgggagt tttcagaact aatttcccgg acaaccctcc tgctccattt 1260

aattacacgg gtgcaccgct tacagctaat cttgggacta ccgtggggac taggctaagt 1320

acgctgcctt tcaatactac ggttgagttg gtcttacaag acactaatct tctctcggtc 1380

gaatctcacc cctttcatct tcatgggttc aacttctttg tcgttgggag tggggttgga 1440

aacttcaatc ccaaaaaaga cccagctaac ttcaacttgg ttgatcctcc tgagagaaat 1500

acagtcggtg ttcctactgg aggttggacg gctatcagat tcagagctga taatccaggt 1560

gtctggttca tgcactgtca tctagaactt catacaatgt ggggcctaaa gatggccttt 1620

gtggttgaga atgggaagtc agcagaagaa tctgttctac cgcctcctca agaccttccg 1680

ccctgctaa 1689

<210> 2

<211> 562

<212> PRT

<213> 猕猴桃(Actinidia chinensis Planch)

<400> 2

Met Ala Pro Gly Tyr Arg Phe Leu Pro Gly Cys Leu Phe Ser Ile Thr

1 5 10 15

Phe Phe Ile Ile Phe Leu Ser Phe Ser Ala Ser Ala Ala Leu Lys Lys

20 25 30

Tyr Asp Phe Asn Ile Gln Val Lys Asn Val Ser Arg Leu Cys Asn Ala

35 40 45

Lys Ser Ile Val Thr Val Asn Gly Met Phe Pro Gly Pro Thr Val Tyr

50 55 60

Ile Arg Glu Gly Asp Gln Val Leu Val Asn Val Ser Asn His Ala Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ile Ser Ile His Trp His Gly Leu Lys Gln Phe Arg Asn Gly

85 90 95

Trp Ala Asp Gly Pro Ala Tyr Ile Thr Gln Cys Pro Ile Gln Thr Gly

100 105 110

Arg Ser Tyr Val Tyr Asn Phe Thr Val Thr Gly Gln Arg Gly Thr Leu

115 120 125

Trp Trp His Ala His Ile Leu Trp Leu Arg Ala Thr Val Tyr Gly Ala

130 135 140

Leu Val Ile Met Pro Lys Glu Gly Thr Pro Phe Pro Phe Pro Gln Pro

145 150 155 160

Tyr Gln Glu Thr Asn Ile Ile Leu Gly Glu Trp Trp Asn Gln Asp Val

165 170 175

Glu Thr Ile Val Asn Gln Ala Asn Lys Leu Gly Leu Pro Pro Gln Thr

180 185 190

Ser Asp Ala His Thr Ile Asn Gly Lys Pro Gly Pro Leu Phe Pro Cys

195 200 205

Ser Glu Lys Tyr Thr Phe Ala Met Glu Val Gln Phe Gly Lys Thr Tyr

210 215 220

Leu Leu Arg Ile Ile Asn Ser Ala Leu Asn Asp Glu Leu Phe Phe Ala

225 230 235 240

Ile Ala Gly His Pro Met Thr Val Val Glu Ile Asp Ala Val Tyr Val

245 250 255

Lys Pro Phe Thr Thr Gln Ala Ile Leu Ile Ala Pro Gly Gln Thr Thr

260 265 270

Asn Val Leu Val Lys Ala Asp Gln Ser Pro Asn Arg Tyr Phe Met Ala

275 280 285

Ala Arg Pro Phe Met Asp Ala Pro Leu Ala Val Asp Asn Lys Thr Val

290 295 300

Thr Ala Ile Leu Gln Tyr Lys Gly Ile Pro Asn Thr Val Leu Pro Thr

305 310 315 320

Phe Pro Gln Leu Pro Ala Pro Asn Asp Thr Lys Phe Ala Leu Asn Tyr

325 330 335

Asn Ser Arg Leu Lys Ser Leu Asn Thr Pro Gln Phe Pro Ala Lys Val

340 345 350

Pro Leu Lys Ser Asp Arg His Leu Phe Tyr Thr Ile Gly Leu Gly Ile

355 360 365

Asn Pro Cys Pro Thr Cys Gln Asn Gly Thr Gln Val Val Ala Ser Leu

370 375 380

Asn Asn Ile Thr Phe Val Met Pro Lys Val Gly Leu Leu Gln Ala His

385 390 395 400

Tyr Phe Asn Ile Ala Gly Val Phe Arg Thr Asn Phe Pro Asp Asn Pro

405 410 415

Pro Ala Pro Phe Asn Tyr Thr Gly Ala Pro Leu Thr Ala Asn Leu Gly

420 425 430

Thr Thr Val Gly Thr Arg Leu Ser Thr Leu Pro Phe Asn Thr Thr Val

435 440 445

Glu Leu Val Leu Gln Asp Thr Asn Leu Leu Ser Val Glu Ser His Pro

450 455 460

Phe His Leu His Gly Phe Asn Phe Phe Val Val Gly Ser Gly Val Gly

465 470 475 480

Asn Phe Asn Pro Lys Lys Asp Pro Ala Asn Phe Asn Leu Val Asp Pro

485 490 495

Pro Glu Arg Asn Thr Val Gly Val Pro Thr Gly Gly Trp Thr Ala Ile

500 505 510

Arg Phe Arg Ala Asp Asn Pro Gly Val Trp Phe Met His Cys His Leu

515 520 525

Glu Leu His Thr Met Trp Gly Leu Lys Met Ala Phe Val Val Glu Asn

530 535 540

Gly Lys Ser Ala Glu Glu Ser Val Leu Pro Pro Pro Gln Asp Leu Pro

545 550 555 560

Pro Cys

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcgccgg gatatagatt cctgc 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttagcagggc ggaaggtctt gaggag 26

Claims

1.猕猴桃溃疡病抗性基因AcLac35，其特征在于，其所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.含有权利要求1所述基因AcLac35的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。

3.权利要求1所述基因AcLac35或权利要求2所述生物材料的以下任一应用：

1）用于提高植物对溃疡病的抗性；

2）用于促进植物木质素的合成；

3）用于提高植物对丁香假单胞菌及其变种以及它们所致植物病害的抗性；

4）用于制备转基因植物；

5）用于植物育种；

所述植物为猕猴桃；

丁香假单胞菌的变种为丁香假单胞菌的猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)。

4.提高植物溃疡病抗性的方法，其特征在于，所述方法包括：

1）使植物包含权利要求1所述基因AcLac35；或

2）使植物过表达权利要求1所述基因AcLac35；

其中，所述植物为猕猴桃。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，过表达基因AcLac35的方法选自以下1）~4），或任选的组合：

1）通过向植物中导入具有所述基因AcLac35的质粒；

2）通过增加植物染色体上所述基因AcLac35的拷贝数；

3）通过将强启动子与所述基因AcLac35可操作地连接；

4）通过导入增强子。

7.用于检测权利要求1所述基因AcLac35的特异性引物，其特征在于，包括正向引物AcLac35-F1和反向引物AcLac35-R2，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和4所示。

8.含有权利要求7所述引物的检测试剂或试剂盒。