DE112010003389T5 - Nematodenresistente transgene Pflanzen - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung stellt Nematoden-resistente transgene Pflanzen und Saatgut bereit, die Polynukleotide exprimieren, welche AP2/EREBP-Transkriptionsfaktoren, Harpin-induzierte Proteine, TINY-like Transkriptionsfaktoren, Annexine, Laccasen, Isoflavon-7-O-Methyltransferasen, Anthocyanidin-3-glucosid-Rhamnosyltransferasen, hsr201-like- oder AUX/IAA-Proteine codieren. Die Erfindung stellt ebenfalls Verfahren der Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegen parasitäre Pflanzennematoden und Expressionsvektoren zur Verwendung in solchen Verfahren bereit.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft die Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität durch Verwendung von nematodenresistenten transgenen Pflanzen und Samen, und Verfahren zur Herstellung derartiger Pflanzen und Samen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Nematoden sind mikroskopische Fadenwürmer, die sich von den Wurzeln, Blättern und Stängeln von mehr als 2000 Reihenkulturpflanzen, Gemüsen, Obstarten und Zierpflanzen ernähren, was einen geschätzten Nutzpflanzenverlust von 100 Milliarden US-Dollar weltweit verursacht. Eine Vielzahl an parasitischen Nematodenspezies infiziert Nutzpflanzen, wobei Wurzelgallennematoden (RKN bzw. Root-Knot-Nematoden), Zysten- und läsionsbildende Nematoden eingeschlossen sind. Wurzelgallennematoden, welche durch die Hervorrufung von Wurzelgallenbildung an den Fraßstellen gekennzeichnet sind, besitzen ein relativ breites Wirtsspektrum und kommen deshalb parasitisch auf einer großen Zahl an Nutzpflanzenspezies vor. Die Zysten- und läsionsbildenden Nematodenspezies besitzen ein beschränkteres Wirtsspektrum, aber verursachen dennoch erhebliche Verluste bei anfälligen Nutzpflanzen.
  • Parasitische Nematoden sind überall in den Vereinigten Staaten vorhanden, wobei die größten Konzentrationen in den warmen, humiden Regionen des Südens und Westens sowie in sandigen Böden auftreten. Die Sojabohnenzystennematode (Heterodera glycines), der bedeutendste Schädling von Sojabohnenpflanzen, wurde zuerst im Jahre 1954 in den Vereinigten Staaten in North Carolina entdeckt. Manche Gebiete sind so stark von der Sojabohnenzystennematode (SCN) befallen, dass die Sojabohnenproduktion ohne Bekämpfungsmaßnahmen nicht länger wirtschaftlich möglich ist. Obwohl Sojabohne die hauptsächliche wirtschaftliche Nutzpflanze ist, die von SCN angegriffen wird, parasitiert SCN auf insgesamt etwa fünfzig Wirten, einschließlich Feld-Nutzpflanzen, Gemüsen, Zierpflanzen und Unkräutern.
  • Anzeichen von Nematodenschaden beinhalten das Verkümmern und Gelbwerden der Blätter sowie das Verwelken der Pflanzen während Hitzeperioden. Nematodenbefall kann jedoch signifikante Ertragsverluste ohne jedwede offensichtliche oberirdische Erkrankungssymptome verursachen. Die primären Ursachen der Ertragsminderung beruhen auf unterirdischer Wurzelbeschädigung. Von SCN befallene Wurzeln sind zwergwüchsig oder verkümmert. Ein Nematodenbefall kann auch die Anzahl an stickstofffixierenden Knöllchen auf den Wurzeln verringern und kann die Wurzeln anfälliger für Angriffe seitens anderer im Erdboden vorkommender Pflanzennematoden machen.
  • Der Nematoden-Lebenszyklus weist drei Hauptstufen auf: Ei, Jungtier und Adultstadium. Der Lebenszyklus variiert unter den Spezies der Nematoden. Der Lebenszyklus von SCN ist ähnlich zu den Lebenszyklen anderer pflanzenparasitischer Nematoden. Der SCN-Lebenszyklus kann üblicherweise bei Optimalbedingungen in 24 bis 30 Tagen abgeschlossen sein, wohingegen andere Spezies ein Jahr oder mehr brauchen können, um den Lebenszyklus zu vollenden. Wenn im Frühling die Temperatur und die Feuchtigkeitsspiegel günstig werden, schlüpfen die wurmförmigen Jungtiere aus Eiern im Erdboden. Nur Nematoden im juvenilen Entwicklungsstadium sind in der Lage, Sojabohnenwurzeln zu infizieren.
  • Nach Eindringen in die Sojabohnenwurzeln bewegen sich die SCN-Jungtiere durch die Wurzel bis sie auf Gefäßgewebe stoßen, und an diesem Zeitpunkt beenden sie die Wanderung und beginnen zu fressen. Mit einem Stilett injiziert die Nematode Sekrete, welche bestimmte Wurzelzellen modifizieren und sie zu spezialisierten Fraßstellen umwandeln. Die Wurzelzellen werden morphologisch zu großen mehrkernigen Synzytien (oder im Fall von RKN zu Riesenzellen) umgewandelt, welche als eine Nährstoffquelle für die Nematoden verwendet werden. Somit stehlen die aktiv fressenden Nematoden der Pflanze essentielle Nährstoffe, was zu einem Ertragsverlust führt. Während weibliche Nematoden fressen, schwellen sie an und werden schließlich so groß, dass ihre Körper durch das Wurzelgewebe brechen und auf der Oberfläche der Wurzel freigelegt werden.
  • Nach einer Periode des Fressens wandern männliche SCN, welche nicht so geschwollen sind wie die adulten Weibchen, aus der Wurzel in den Erdboden und befruchten die vergrößerten adulten Weibchen. Danach sterben die Männchen, während die Weibchen an das Wurzelsystem angelagert bleiben und werter fressen. Die Eier in den geschwollenen Weibchen beginnen sich zu entwickeln, anfänglich in einer Masse oder einem Eisack außerhalb des Körpers, und anschließend später innerhalb der Körperhöhle der Nematode. Schließlich ist die gesamte Körperhöhle des adulten Weibchens mit Eiern gefüllt, und die Nematode stirbt. Es ist der mit Eiern gefüllte Körper des toten Weibchens, der als die Zyste bezeichnet wird. Die Zysten lösen sich schließlich ab und werden frei im Erdboden vorgefunden. Die Wände der Zyste werden sehr zäh, was einen hervorragenden Schutz für die ungefähr 200 bis 400 darin enthaltenen Eier bereitstellt. SCN-Eier überleben innerhalb der Zyste, bis geeignete Bedingungen für das Schlüpfen auftreten. Obwohl viele der Eier innerhalb des ersten Jahres zum Schlüpfen kommen können, werden viele ebenfalls innerhalb der schützenden Zysten mehrere Jahre lang überleben.
  • Eine Nematode kann sich aus eigener Kraft nur einige wenige Zpll pro Jahr durch das Erdreich bewegen. Allerdings kann sich der Nematodenbefall auf zahlreichen Wegen über erhebliche Distanzen ausbreiten. Alles, was das befallene Erdreich bewegen kann, ist zur Verbreitung des Befalls in der Lage, einschließlich Landwirtschaftsmaschinen, Fahrzeugen und Werkzeugen, Wind, Wasser, Tieren und Landarbeitern. Häufig kontaminieren samengroße Teilchen des Erdreichs das geerntete Saatgut. Folglich kann der Nematodenbefall ausgebreitet werden, wenn kontaminierte Samen von befallenen Feldern in nicht-befallenen Feldern eingepflanzt werden. Es gibt sogar Beweise, dass bestimmte Nematodenspezies von Vögeln verbreitet werden können. Nur einige dieser Ursachen können verhindert werden.
  • Zu herkömmlichen Praktiken zum Umgang mit Nematodenbefall zählen: Aufrechthalten geeigneter Spiegel der Boden-Nährstoffe und des Boden-pH-Werts auf von Nematoden befallenem Land; Bekämpfen von anderen Pflanzenerkrankungen sowie Insekten- und Unkraut-Schädlingen; Anwenden von Sanierungspraktiken, wie Pflügen, Bepflanzen und Kultivieren von nematodenbefallenen Feldern ausschließlich nach der Bearbeitung von nicht-befallenen Feldern; gründliche Reinigung von Gerätschaften mit Hochdruck-Wasser oder -Dampf nach Arbeiten auf befallenen Feldern; Nicht-Gebrauch von auf befallenem Land herangezogenem Saatgut für das Bepflanzen von nicht-befallenen Feldern, es sei denn, das Saatgut ist geeignet gereinigt worden; Fruchtwechsel bei befallenen Feldern und Abwechseln von Wirtsnutzpflanzen mit Nicht-Wirtsnutzpflanzen; Anwendung von Nematiziden; und Anpflanzen resistenter Pflanzenvarietäten.
  • Es sind Verfahren zur genetischen Transformation von Pflanzen vorgeschlagen worden, um eine erhöhte Resistenz gegen pflanzenparasitische Nematoden herbeizuführen. Die U.S.-Patente Nrn. 5 589 622 und 5 824 876 richten sich zum Beispiel auf die Identifizierung von Pflanzengenen, die spezifisch in oder nahe der Fraßstelle der Pflanze nach der Anlagerung durch die Nematode exprimiert werden. Eine Reihe von Vorgehensweisen beinhaltet die Transformation von Pflanzen mit doppelsträngiger RNA, die zum Inhibieren essentieller Nematodengene in der Lage ist. Bei anderen landwirtschaftlichen Biotechnologie-Vorgehensweisen wird vorgeschlagen, Gene überzuexprimieren, welche Proteine codieren, die für Nematoden toxisch sind.
  • Bislang wurde keine genetisch modifizierte Pflanze, die ein Transgen umfasst, das zur Herbeiführung von Nematodenresistenz in der Lage ist, in irgendeiner Nation dereglementiert. Folglich besteht fortgesetzt ein Bedarf daran, sichere und wirksame Zusammensetzungen und Verfahren zur Bekämpfung pflanzenparasitischer Nematoden unter Anwendung landwirtschaftlicher Biotechnologie zu identifizieren.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben herausgefunden, dass eine transgene Überexpression von gewissen Pflanzen-Polynukleotiden Pflanzen resistent gegenüber parasitären Nematoden machen kann. Insbesondere eine Überexpression eines Pflanzen-Polynukleotids, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht: a) einem AP2/EREBP-Transkriptionsfaktor-Polynukleotid, ähnlich zu SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 3, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 17 oder SEQ ID NR: 19; b) einem Harpin-induzierten Polynukleotid, ähnlich zu SEQ ID NR: 21, SEQ ID NR: 23, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 27, SEQ ID NR: 29, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 37; c) einem TINY-like-Polynukleotid, ähnlich zu SEQ ID NR: 39, SEQ ID NR: 41, SEQ ID NR: 43, SEQ ID NR: 45 oder SEQ ID NR: 47; d) einem Annexin-Polynukleotid, ähnlich zu SEQ ID NR: 49, SEQ ID NR: 51, SEQ ID NR: 53, SEQ ID NR: 55, SEQ ID NR: 57, SEQ ID NR: 59, SEQ ID NR: 61, SEQ ID NR: 63, SEQ ID NR: 65, SEQ ID NR: 67, SEQ ID NR: 69, SEQ ID NR: 71, SEQ ID NR: 73, SEQ ID NR: 75 oder SEQ ID NR: 77; e) einem Laccase-Polynukleotid, ähnlich zu SEQ ID NR: 79, SEQ ID NR: 81, SEQ ID NR: 83, SEQ ID NR: 85, SEQ ID NR: 87, SEQ ID NR: 89, SEQ ID NR: 91, SEQ ID NR: 93, SEQ ID NR: 95, SEQ ID NR: 97, SEQ ID NR: 99, SEQ ID NR: 101 oder SEQ ID NR: 103; f) einem Benzoyltransferase-Polynukleotid, ähnlich zu SEQ ID NR: 105 oder SEQ ID NR: 107; g) einem Rhamnosyltransferase-Polynukleotid, ähnlich zu SEQ ID NR: 109, SEQ ID NR: 111, SEQ ID NR: 113 oder SEQ ID NR: 115; h) einem Isoflavon-7-O-Methyltransferase-Polynukleotid, ähnlich zu SEQ ID NR: 117, SEQ ID NR: 119, SEQ ID NR: 121, SEQ ID NR: 123 oder SEQ ID NR: 125; und i) einem AUX/IAA-Polynukleotid, ähnlich zu SEQ ID NR: 127, SEQ ID NR: 129, SEQ ID NR: 131 oder SEQ ID NR: 133. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen und Saatgut und Verfahren bereit, um einen Nematodenbefall von wertvollen landwirtschaftlichen Nutzpflanzen zu überwinden oder zumindest abzuschwächen.
  • In einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, umfassend ein isoliertes Polynukleotid, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht: a) einem Polynukleotid, das einen AP2/EREBP-Transkriptionsfaktor codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 18 oder SEQ ID NR: 20; b) einem Polynukleotid, das ein Harpin-induziertes Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR: 24, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 28, SEQ ID NR: 30, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 36 oder SEQ ID NR: 38; c) einem Polynukleotid, das einen TINY-like Transkriptionsfaktor codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 40, SEQ ID NR: 42, SEQ ID NR: 44, SEQ ID NR: 46 oder SEQ ID NR: 48; d) einem Polynukleotid, das ein Annexin-Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 50, SEQ ID NR: 52, SEQ ID NR: 54, SEQ ID NR: 56, SEQ ID NR: 58, SEQ ID NR: 60, SEQ ID NR: 62, SEQ ID NR: 64, SEQ ID NR: 66, SEQ ID NR: 68, SEQ ID NR: 70, SEQ ID NR: 72, SEQ ID NR: 74, SEQ ID NR: 76 oder SEQ ID NR: 78; e) einem Polynukleotid, das eine Laccase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 80, SEQ ID NR: 82, SEQ ID NR: 84, SEQ ID NR: 86, SEQ ID NR: 88, SEQ ID NR: 90, SEQ ID NR: 92, SEQ ID NR: 94, SEQ ID NR: 96, SEQ ID NR: 98, SEQ ID NR: 100, SEQ ID NR: 102 oder SEQ ID NR: 104; f) einem Polynukleotid, das eine Benzoyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 106 oder SEQ ID NR: 108; g) einem Polynukleotid, das eine Rhamnosyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 110, SEQ ID NR: 112, SEQ ID NR: 114 oder SEQ ID NR: 116; h) einem Polynukleotid, das eine Isoflavon-7-O-Methyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 118, SEQ ID NR: 120, SEQ ID NR: 122, SEQ ID NR: 124 oder SEQ ID NR: 126; und i) einem Polynukleotid, das ein AUX/IAA-Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 128, SEQ ID NR: 130, SEQ ID NR: 132 oder SEQ ID NR: 134.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung stellt ein Saatgut bereit, das durch die oben beschriebene transgene Pflanze hergestellt wird. Das Saatgut ist sortenecht bezüglich eines Transgens, umfassend mindestens ein Polynukleotid, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht: a) einem Polynukleotid, das einen AP2/EREBP Transkriptionsfaktor codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 18 oder SEQ ID NR: 20; b) einem Polynukleotid, das ein Harpin-induziertes Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR: 24, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 28, SEQ ID NR: 30, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 36 oder SEQ ID NR: 38; c) einem Polynukleotid, das einen TINY-like Transkriptionsfaktor codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 40, SEQ ID NR: 42, SEQ ID NR: 44, SEQ ID NR: 46 oder SEQ ID NR: 48; d) einem Polynukleotid, das ein Annexin-Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 50, SEQ ID NR: 52, SEQ ID NR: 54, SEQ ID NR: 56, SEQ ID NR: 58, SEQ ID NR: 60, SEQ ID NR: 62, SEQ ID NR: 64, SEQ ID NR: 66, SEQ ID NR: 68, SEQ ID NR: 70, SEQ ID NR: 72, SEQ ID NR: 74, SEQ ID NR: 76 oder SEQ ID NR: 78; e) einem Polynukleotid, das eine Laccase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 80, SEQ ID NR: 82, SEQ ID NR: 84, SEQ ID NR: 86, SEQ ID NR: 88, SEQ ID NR: 90, SEQ ID NR: 92, SEQ ID NR: 94, SEQ ID NR: 96, SEQ ID NR: 98, SEQ ID NR: 100, SEQ ID NR: 102 oder SEQ ID NR: 104; f) einem Polynukleotid, das eine Benzoyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 106 oder SEQ ID NR: 108; g) einem Polynukleotid, das eine Rhamnosyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 110, SEQ ID NR: 112, SEQ ID NR: 114 oder SEQ ID NR: 116; h) einem Polynukleotid, das eine Isoflavon-7-O-Methyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 118, SEQ ID NR: 120, SEQ ID NR: 122, SEQ ID NR: 124 oder SEQ ID NR: 126; und i) einem Polynukleotid, das ein AUX/IAA-Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 128, SEQ ID NR: 130, SEQ ID NR: 132 oder SEQ ID NR: 134, und die Expression des Transgens vermittelt der Pflanze, die aus dem transgenen Saatgut wachsen gelassen wird, eine erhöhte Nematodenresistenz.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung einen Expressionsvektor bereit, der einen Promotor umfasst, welcher in funktionsfähiger Weise an ein Polynukleotid verknüpft ist, welches mindestens ein Polynukleotid codiert, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht: a) einem Polynukleotid, das einen AP2/EREBP-Transkriptionsfaktor codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 18 oder SEQ ID NR: 20; b) einem Polynukleotid, das ein Harpin-induziertes Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR: 24, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 28, SEQ ID NR: 30, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 36 oder SEQ ID NR: 38; c) einem Polynukleotid, das einen TINY-like Transkriptionsfaktor codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 40, SEQ ID NR: 42, SEQ ID NR: 44, SEQ ID NR: 46 oder SEQ ID NR: 48; d) einem Polynukleotid, das ein Annexin-Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 50, SEQ ID NR: 52, SEQ ID NR: 54, SEQ ID NR: 56, SEQ ID NR: 58, SEQ ID NR: 60, SEQ ID NR: 62, SEQ ID NR: 64, SEQ ID NR: 66, SEQ ID NR: 68, SEQ ID NR: 70, SEQ ID NR: 72, SEQ ID NR: 74, SEQ ID NR: 76 oder SEQ ID NR: 78; e) einem Polynukleotid, das eine Laccase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 80, SEQ ID NR: 82, SEQ ID NR: 84, SEQ ID NR: 86, SEQ ID NR: 88, SEQ ID NR: 90, SEQ ID NR: 92, SEQ ID NR: 94, SEQ ID NR: 96, SEQ ID NR: 98, SEQ ID NR: 100, SEQ ID NR: 102 oder SEQ ID NR: 104; f) einem Polynukleotid, das eine Benzoyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 106 oder SEQ ID NR: 108; g) einem Polynukleotid, das eine Rhamnosyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 110, SEQ ID NR: 112, SEQ ID NR: 114 oder SEQ ID NR: 116; h) einem Polynukleotid, das eine Isoflavon-7-O-Methyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 118, SEQ ID NR: 120, SEQ ID NR: 122, SEQ ID NR: 124 oder SEQ ID NR: 126; und i) einem Polynukleotid, das ein AUX/IAA-Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 128, SEQ ID NR: 130, SEQ ID NR: 132 oder SEQ ID NR: 134. Vorzugsweise ist der Promotor ein konstitutiver Promotor. Stärker bevorzugt ist der Promotor in der Lage, die Expression spezifisch in Pflanzenwurzeln zu steuern. Am meisten bevorzugt ist der Promotor in der Lage, die Expression in einer Synzytienstelle einer Pflanze, die mit Nematoden infiziert ist, spezifisch zu steuern.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren der Herstellung einer Nematoden-resistenten transgenen Pflanze bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Transformieren einer Pflanzenzelle vom Wild-Typ mit einem Expressionsvektor, der einen Promotor umfasst, welcher in funktionsfähiger Weise an ein Polynukleotid gebunden ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht: a) einem Polynukleotid, das ein AP2/EREBP-Transkriptionsfaktor codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 18 oder SEQ ID NR: 20; b) einem Polynukleotid, das ein Harpin-induziertes Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR: 24, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 28, SEQ ID NR: 30, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 36 oder SEQ ID NR: 38; c) einem Polynukleotid, das einen TINY-like Transkriptionsfaktor codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 40, SEQ ID NR: 42, SEQ ID NR: 44, SEQ ID NR: 46 oder SEQ ID NR: 48; d) einem Polynukleotid, das ein Annexin-Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 50, SEQ ID NR: 52, SEQ ID NR: 54, SEQ ID NR: 56, SEQ ID NR: 58, SEQ ID NR: 60, SEQ ID NR: 62, SEQ ID NR: 64, SEQ ID NR: 66, SEQ ID NR: 68, SEQ ID NR: 70, SEQ ID NR: 72, SEQ ID NR: 74, SEQ ID NR: 76 oder SEQ ID NR: 78; e) einem Polynukleotid, das eine Laccase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 80, SEQ ID NR: 82, SEQ ID NR: 84, SEQ ID NR: 86, SEQ ID NR: 88, SEQ ID NR: 90, SEQ ID NR: 92, SEQ ID NR: 94, SEQ ID NR: 96, SEQ ID NR: 98, SEQ ID NR: 100, SEQ ID NR: 102 oder SEQ ID NR: 104; f) einem Polynukleotid, das eine Benzoyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 106 oder SEQ ID NR: 108; g) einem Polynukleotid, das eine Rhamnosyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 110, SEQ ID NR: 112, SEQ ID NR: 114 oder SEQ ID NR: 116; h) einem Polynukleotid, das eine Isoflavon-7-O-Methyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 118, SEQ ID NR: 120, SEQ ID NR: 122, SEQ ID NR: 124 oder SEQ ID NR: 126; und i) einem Polynukleotid, das ein AUX/IAA-Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 128, SEQ ID NR: 130, SEQ ID NR: 132 oder SEQ ID NR: 134; b) Regenerieren von transgenen Pflanzen aus der transformierten Pflanzenzelle; und c) Selektieren von transgenen Pflanzen auf erhöhte Nematodenresistenz im Vergleich zu einer Kontrollpflanze der gleichen Spezies.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren der Erhöhung des Ertrags einer Nutzpflanze bereit, wobei das Verfahren die Schritte des Transformierens einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, der einen Promotor umfasst, der in funktionsfähiger Weise an ein Polynukleotid gebunden ist, codierend einen AP2/EREBP-Transkriptionsfaktor, ähnlich zu SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 18 oder SEQ ID NR: 20; des Regenerierens von transgenen Pflanzen aus der transformierten Pflanzenzelle und des Selektierens von transgenen Pflanzen auf gesteigertes Wurzelwachstum im Vergleich zu einer Kontrollpflanze der gleichen Spezies umfasst.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die Tabelle von SEQ ID NRn, welche entsprechenden Polynukleotiden und Promotoren zugeordnet sind.
  • 2 zeigt ein Aminosäurealignment von exemplarischen AP2/EREBP-Transkriptionsfaktoren, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Das Alignment wird in der Vector NTI-Software-Suite (Lückenöffnungs-Strafwert = 10, Lückenerweiterungs-Strafwert = 0,05, Lückentrennungs-Strafwert = 8) ausgeführt.
  • 3 zeigt ein Aminosäurealignment von exemplarischen Harpin-induzierten Proteinen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Das Alignment wird in der Vector NTI-Software-Suite (Lückenöffnungs-Strafwert = 10, Lückenerweiterungs-Strafwert = 0,05, Lückentrennungs-Strafwert = 8) ausgeführt.
  • 4 zeigt ein Aminosäurealignment von exemplarischen TINY-like Transkriptionsfaktoren, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Das Alignment wird in der Vector NTI-Software-Suite (Lückenöffnungs-Strafwert = 10, Lückenerweiterungs-Strafwert = 0,05, Lückentrennungs-Strafwert = 8) ausgeführt.
  • 5a–5b zeigt ein Aminosäurealignment von exemplarischen Annexin-Proteinen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Das Alignment wird in der Vector NTI-Software-Suite (Lückenöffnungs-Strafwert = 10, Lückenerweiterungs-Strafwert = 0,05, Lückentrennungs-Strafwert = 8) ausgeführt.
  • 6a–6c zeigt ein Aminosäurealignment von exemplarischen Laccase-Proteinen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Das Alignment wird in der Vector NTI-Software-Suite (Lückenöffnungs-Strafwert = 10, Lückenerweiterungs-Strafwert = 0,05, Lückentrennungs-Strafwert = 8) ausgeführt.
  • 7 zeigt ein Aminosäurealignment von exemplarischen Benzoyltransferasen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Das Alignment wird in der Vector NTI-Software-Suite (Lückenöffnungs-Strafwert = 10, Lückenerweiterungs-Strafwert = 0,05, Lückentrennungs-Strafwert = 8) ausgeführt.
  • 8 zeigt ein Aminosäurealignment von exemplarischen Anthocyanidin-3-glucosid-Rhamnosyltransferasen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind Das Alignment wird in der Vector NTI-Software-Suite (Lückenöffnungs-Strafwert = 10, Lückenerweiterungs-Strafwert = 0,05, Lückentrennungs-Strafwert = 8) ausgeführt.
  • 9 zeigt ein Aminosäurealignment von exemplarischen Isoflavon-7-O-Methyltransferasen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Das Alignment wird in der Vector NTI-Software-Suite (Lückenöffnungs-Strafwert = 10, Lückenerweiterungs-Strafwert = 0,05, Lückentrennungs-Strafwert = 8) ausgeführt.
  • Die 10 zeigt ein Aminosäurealignment von exemplarischen AUX/IAA-Proteinen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Das Alignment wird in der Vector NTI-Software-Suite (Lückenöffnungs-Strafwert = 10, Lückenerweiterungs-Strafwert = 0,05, Lückentrennungs-Strafwert = 8) ausgeführt.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung kann durch Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung und die hierin eingeschlossenen Beispiele leichter verstanden werden. Überall in dieser Patentanmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen Bezug genommen. Die Offenbarungen von allen diesen Veröffentlichungen, und diejenigen Bezugsstellen, die innerhalb dieser Veröffentlichungen zitiert werden, sind in ihrer jeweiligen Gesamtheit hiermit durch den Bezug darauf in diese Patentanmeldung einbezogen, um den Stand der Technik vollständiger zu beschreiben, der von dieser Erfindung betroffen wird. Die hierin verwendete Terminologie dient lediglich dem Zwecke der Beschreibung von spezifischen Ausführungsformen und ist nicht als einschränkend beabsichtigt. Wie hierin verwendet, kann ”ein” oder ”eine” abhängig vom Zusammenhang, in dem es verwendet wird, eines oder mehrere bedeuten. So kann die Bezugnahme auf ”eine Zelle” zum Beispiel bedeuten, dass mindestens eine Zelle verwendet werden kann. Wie hierin verwendet, bedeutet das Wort ”oder” ein beliebiges Mitglied einer bestimmten Liste und schließt auch jedwede Kombination von Mitgliedern dieser Liste ein.
  • Wie hierin definiert, ist eine ”transgene Pflanze” eine Pflanze, welche mit Hilfe rekombinanter DNA-Technologie so verändert worden ist, dass sie eine isolierte Nukleinsäure enthält, welche ansonsten nicht in der Pflanze vorhanden wäre. Wie hierin verwendet, schließt der Begriff ”Pflanze” eine gesamte Pflanze, Pflanzenzellen und Pflanzenteile ein. Pflanzenteile schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Stängel, Wurzeln, Samenanlagen, Staubblätter, Blätter, Embryonen, meristematische Regionen, Callusgewebe, Gametophyten, Sporophyten, Pollen, Mikrosporen und dergleichen ein.
  • Wie hierin definiert, sind der Begriff ”Nukleinsäure” und ”Polynukleotid” austauschbar und beziehen sich auf RNA oder DNA, welche linear oder verzweigt, einzel- oder doppelsträngig, oder ein Hybrid davon ist. Der Begriff umfasst ebenfalls RNA/DNA-Hybride.
  • Ein ”isoliertes” Nukleinsäuremolekül ist ein solches, das von anderen Nukleinsäuremolekülen, welche in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorhanden sind (d. h. Sequenzen, die andere Polypeptide codieren), im Wesentlichen getrennt ist. Zum Beispiel wird eine klonierte Nukleinsäure als isoliert angesehen. Eine Nukleinsäure wird ebenfalls als isoliert angesehen, wenn sie durch menschlichen Eingriff verändert oder an einem Locus oder einem Ort platziert worden ist, bei dem es sich nicht um ihre natürliche Stelle handelt, oder wenn sie durch Transformation in eine Zelle eingebracht worden ist. Darüber hinaus kann ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül, frei von manchem des sonstigen zellulären Materials, mit dem es von Natur aus assoziiert ist, oder von Kulturmedium, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder von chemischen Vorläufern oder sonstigen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird, vorliegen. Obgleich es gegebenenfalls sowohl am 3'- als auch am 5'-Ende der codierenden Region eines Gens lokalisierte untranslatierte Sequenz beinhalten kann, kann man bevorzugen, die Sequenzen, welche von Natur aus die codierene Region in ihrem natürlich vorkommenden Replikon flankieren, zu entfernen.
  • Der Begriff ”Gen” wird im breiten Sinne verwendet, um auf ein beliebiges Segment von Nukleinsäure, das mit einer biologischen Funktion in Zusammenhang steht, Bezug zu nehmen. So schließen Gene Introns und Exons, wie etwa in einer genomischen Sequenz, oder nur die codierenen Sequenzen, wie in cDNAs, und/oder die für ihre Expression erforderlichen regulatorischen Sequenzen ein. Zum Beispiel bezieht sich Gen auf ein Nukleinsäurefragment, welches mRNA oder funktionelle RNA exprimiert, oder ein spezifisches Protein codiert, und welches regulatorische Sequenzen einschließt.
  • Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden hierin austauschbar verwendet, um auf ein Polymer von aufeinanderfolgenden Aminosäureresten Bezug zu nehmen.
  • Die Begriffe ”funktionsfähig verbunden” und ”in operativer Verknüpfung mit” sind austauschbar und bezeichen, wie hierin verwendet, die Assoziation von isolierten Polynukleotiden auf einem einzelnen Nukleinsäurefragment, so dass die Funktion eines isolierten Polynukleotids durch das andere isolierte Polynukleotid beeinflusst wird. Zum Beispiel sagt man, dass eine regulatorische DNA mit einer DNA, die eine RNA exprimiert oder ein Polypeptid codiert, ”funktionsfähig verbunden” ist, wenn die zwei DNAs so gelegen sind, dass die regulatorische DNA die Expression der codierenden DNA beeinflusst.
  • Der Begriff ”Promotor”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche, wenn sie an eine Nukleotidsequenz von Interesse ligiert ist, zur Steuerung der Transkription der Nukleotidsequenz von Interesse zu mRNA in der Lage ist. Ein Promotor ist typischerweise, obwohl nicht notwendigerweise, 5' (z. B. stromaufwärts) von einem Nukleotid von Interesse (z. B. proximal zur Transkriptionsstartstelle eines Strukturgens), dessen Transkription zu mRNA er steuert, lokalisiert und sieht eine Stelle für die spezifische Bindung durch RNA-Polymerase und andere Transkriptionsfaktoren für die Initiation der Transkription vor.
  • Der Begriff ”transkriptionsregulatorisches Element”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Polynukleotid, das zum Regulieren der Transkription eines funktionsfähig verbundenen Polynukleotids in der Lage ist. Er schließt, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Promotoren, Enhancer, Introns, 5'-UTRs und 3'-UTRs ein.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff ”Vektor” auf ein Nukleinsäuremolekül, das zum Transportieren einer anderen Nukleinsäure, an die es verknüpft worden ist, in der Lage ist. Ein Typ von Vektor ist ein ”Plasmid”, was eine kreisförmige doppelsträngige DNA-Schleife bezeichnet, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. In der vorliegenden Beschreibung können ”Plasmid” und ”Vektor” austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form eines Vektors ist. Ein Vektor kann ein binärer Vektor oder eine T-DNA sein, welche die linke Border und die rechte Border umfasst, und kann ein Gen von Interesse dazwischen umfassen. Der Begriff ”Expressionsvektor” ist austauschbar mit dem Begriff ”Transgen”, wie hierin verwendet, und bedeutet einen Vektor, der zum Lenken der Expression eines bestimmten Nukleotids in einer passenden Wirtszelle in der Lage ist. Die Expression des Nukleotids kann eine Überexpression sein. Ein Expressionsvektor umfasst ein regulatorisches Nukleinsäureelement, das funktionsfähig an eine Nukleinsäure von Interesse verknüpft ist, die – wahlfrei – funktionsfähig an ein Terminationssignal und/oder anderes regulatorisches Element verknüpft ist.
  • Der Begriff ”Homologe”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Gen, das mit einem zweiten Gen durch Abstammung von einer gemeinsamen anzestralen DNA-Sequenz verwandt ist. Der Begriff ”Homologe” kann auf die Verwandtschaft bzw. Beziehung zwischen Genen, die durch das Ereignis der Speziation getrennt wurden (z. B. Orthologe), oder auf die Beziehung zwischen Genen, die durch das Ereignis der genetischen Duplikation getrennt wurden (z. B. Paraloge), zutreffen.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff ”Orthologe” auf Gene aus unterschiedlichen Spezies, die sich durch Speziation aber aus einem gemeinsamen anzestralen Gen evolviert haben. Orthologe behalten im Lauf der Evolution dieselbe Funktion bei. Orthologe codieren Proteine mit den gleichen oder ähnlichen Funktionen. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff ”Paraloge” auf Gene, welche durch Duplikation innerhalb eines Genoms verwandt sind. Paraloge weisen in der Regel unterschiedliche Funktionen oder neue Funktionen auf, aber diese Funktionen können verwandt sein.
  • Der Begriff ”konservierte Region” oder ”konservierte Domäne”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Region in heterologen Polynukleotid- oder Polypeptidsequenzen, in der ein relativ hoher Grad an Sequenzidentität zwischen den verschiedenen Sequenzen besteht. Die ”konservierte Region” kann zum Beispiel aus dem Mehrfach-Sequenzalignment mit Hilfe des Clustal W-Algorithmus identifiziert werden.
  • Der Begriff ”Zelle” oder ”Pflanzenzelle”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine einzelne Zelle und schließt ebenfalls eine Population von Zellen ein. Die Population kann eine reine Population sein, welche einen einzigen Zelltyp umfasst. Ebenso kann die Population mehr als einen Zelltyp umfassen. Eine Pflanzenzelle innerhalb der Bedeutung der Erfindung kann isoliert (z. B. in Suspensionskultur) oder in einem Pflanzengewebe, Pflanzenorgan oder einer Pflanze bei einem beliebigen Entwicklungsstadium enthalten sein.
  • Der Begriff ”sortenecht”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Pflanzenvarietät bezüglich einer bestimmten Eigenschaft, wenn sie zu dem Ausmaß genetisch homozygot hinsichtlich dieser Eigenschaft ist, dass, wenn die sortenechte Varietät selbst-bestäubt wird, eine signifikante Menge an unabhängiger Segregation der Eigenschaft unter den Nachkommen nicht beobachtet wird.
  • Der Begriff ”Nullsegregant”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Nachkommen (oder aus den Nachkommen abgeleitete Linien) einer transgenen Pflanze, welcher das Transgen aufgrund Mendel'scher Segregation nicht enthält.
  • Der Begriff ”Wildtyp”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Pflanzenzelle, einen Samen, eine Pflanzenkomponente, ein Pflanzengewebe, ein Pflanzenorgan, oder eine ganze Pflanze, welche(r/s) nicht genetisch modifiziert oder in einem experimentellen Sinn behandelt worden ist.
  • Der Begriff ”Kontrollpflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Pflanzenzelle, ein Explantat, einen Samen, eine Pflanzenkomponente, ein Pflanzengewebe, ein Pflanzenorgan oder eine ganze Pflanze, die zum Vergleich gegenüber einer transgenen oder genetisch modifizierten Pflanze zum Zweck der Identifizierung eines gesteigerten Phänotyps oder eines wünschenswerten Merkmals in der transgenen oder genetisch modifizierten Pflanze verwendet wird. Eine ”Kontrollpflanze” kann in manchen Fällen eine transgene Pflanzenlinie sein, welche ein(en) Leer-Vektor oder Markergen umfasst, aber nicht das rekombinante Polynukleotid von Interesse enthält, das in der transgenen oder genetisch modifizierten Pflanze, die ausgewertet wird, vorhanden ist. Eine Kontrollpflanze kann eine Pflanze von der gleichen Linie oder Varietät wie die transgene oder genetisch modifizierte Pflanze, die getestet wird, sein, oder bei ihr kann es sich um eine andere Linie oder Varietät handeln, wie etwa um eine Pflanze, die bekanntermaßen einen spezifischen Phänotyp, ein Charakteristikum oder einen bekannten Genotyp aufweist. Eine geeignete Kontrollpflanze schließt eine genetisch unveränderte oder nicht-transgene Pflanze der hierin zur Erzeugung einer transgenen Pflanze verwendeten parentalen Linie ein.
  • Der Begriff ”Synzytien-Stelle”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Fraßstelle, welche in Pflanzenwurzeln nach Nematodenbefall gebildet wird. Die Stelle wird als eine Quelle von Nährstoffen für die Nematoden verwendet. Ein Synzytium ist die Fraßstelle für Zysten-Nematoden, und Riesenzellen sind die Fraßstellen von Wurzelgallen-Nematoden.
  • Nutzpflanzen und entsprechende parasitische Nematoden sind in "Index of Plant Diseases in the United States" (U. S. Dept. of Agriculture, Handbuch Nr. 165, 1960); "Distribution of Plant-Parasitic Nematode Species in North America" (Society of Nematologists, 1985); sowie "Fungi on Plants and Plant Products in the United States" (American Phytopathological Society, 1989) aufgelistet. Zum Beispiel schließen pflanzenparasitische Nematoden, welche von der vorliegenden Erfindung angezielt werden, ohne Einschränkung darauf, Zysten-Nematoden und Wurzelgallen-Nematoden ein. Spezifische pflanzenparasitische Nematoden, auf welche durch die vorliegende Erfindung abgezielt wird, schließen, ohne Einschränkung darauf, Heterodera glycines, Heterodera schachtii, Heterodera avenae, Heterodera oryzae, Heterodera cajani, Heterodera trifolii, Globodera pallida, G. rostochiensis oder Globodera tabacum, Meloidogyne incognita, M. arenaria, M. hapla, M. javanica, M. naasi, M. exigua, Ditylenchus dipsaci, Ditylenchus angustus, Radopholus similis, Radopholus citrophilus, Helicotylenchus multicinctus, Pratylenchus coffeae, Pratylenchus brachyurus, Pratylenchus vulnus, Paratylenchus curvitatus, Paratylenchus zeae, Rotylenchulus reniformis, Paratrichodorus anemones, Paratrichodorus minor, Paratrichodorus christiei, Anguina tritici, Bidera avenae, Subanguina radicicola, Hoplolaimus seinhorsti, Hoplolaimus Columbus, Hoplolaimus galeatus, Tylenchulus semipenetrans, Hemicycliophora arenaria, Rhadinaphelenchus cocophilus, Belonolaimus longicaudatus, Trichodorus primitivus, Nacobbus aberrans, Aphelenchoides besseyi, Hemicriconemoides kanayaensis, Tylenchorhynchus claytoni, Xiphinema americanum, Cacopaurus pestis, Heterodera zeae, Heterodera filipjevi und dergleichen ein.
  • In einer Ausführungsform sieht die Erfindung eine transgene Pflanze vor, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein isoliertes Polynukleotid umfasst, das einen AP2/EREBP-Domäne-enthaltenden Transkriptionsfaktor codiert, der ähnlich zu den Transkriptionsfaktoren ist, die in SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 18 oder SEQ ID NR: 20 dargestellt sind. Wie in den Beispielen 1 und 2 nachstehend beschrieben, zeigten transgene Soja-Wurzel-Linien, welche die AP2/EREBP-Polynukleotide mit den SEQ ID NRn: 1, 3, bzw. 7 exprimierten, eine erhöhte Resistenz gegenüber Nematodeninfektion im Vergleich zu Kontroll-Linien. Ein Aminosäurealignment von einigen exemplarischen AP2/EREBP-Domäne enthaltenden Transkriptionsfaktoren, welche zur Verwendung in der vorliegenden Ausführungsform geeignet sind, ist in 2 gezeigt. Ein beliebiges Polynukleotid, das ein Protein codiert, das eine AP2/EREBP-Domäne umfasst, die ähnlich zu den AP2/EREBP-Domänen von SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 18 oder SEQ ID NR: 20 ist, kann wie hierin beschrieben verwendet werden, um eine nematodenresistente transgene Pflanze herzustellen. Zum Beispiel können Polynukleotide, die beliebige der AP2/EREBP-Domäne enthaltenden Proteine codieren, die in 2 dargestellt sind, in eine für Nematoden anfällige Pflanze transformiert werden, um eine nematodenresistente transgene Pflanze herzustellen.
  • Wie im nachstehenden Beispiel 3 dargelegt, zeigten transgene Soja-Wurzel-Linien, welche die von SEQ ID NRn: 1 und 7 codierten AP2/EREBP-Proteine exprimierten, auch erhöhtes Wurzelgewicht im Vergleich zu Kontroll-Linien. Die Wurzelarchitektur ist bei mehreren Nutzpflanzen mit dem Ertrag in Verbindung gebracht worden. Zum Beispiel haben retrospektive Analysen der physiologischen Grundlage der genetischen Ertragsverbesserung in Mais gezeigt, dass neuere Maishybride eine höhere Anbaudichte besser tolerieren als kommerzielle Hybride aus früheren Jahrzehnten und dass diese Änderung einen Großteil des genetischen Zuwachses hinsichtlich des Ertrags erklärt, der durch Pflanzenzucht über die vergangenen letzten Jahrzehnte hinweg erzielt worden war. Die Fähigkeit von Pflanzen, die mit höherer Anbaudichte einhergehende Zwischen-Pflanzen-Konkurrenz zu tolerieren, ist eine Form von Stresstoleranz. Von dieser Stresstoleranz und der daraus folgenden Ertragsverbesserung wurde gezeigt, das Ergebnis des effizienteren Einfangens und Nutzens von Ressourcen aus der Umgebung zu sein, wodurch Pflanzen-Wachstum und -Entwicklung unterstützt werden. Unterschiede in der ”Canopy”- bzw. Laubkronen-Architektur und Langlebigkeit von Blättern ermöglichen, dass mehr Licht (Energie) während des Lebenszyklus der Pflanze. aufgefangen wird, was zu größerer Photosynthese führt, und dies ermöglicht seinerseits, dass mehr Kohlenhydrate produziert und als Biomasse oder im Samen gespeichert werden können. Darüber hinaus ermöglicht ein effizienteres Wurzelsystem eine größere Aufnahme von Nährstoffen und Wasser unter den kompetitiveren Bedingungen, die mit höherer Anbaudichte einhergehen. Kürzliche Computer-Simulations-Studien, welche durch Feldexperimente bestätigt wurden, zeigen, dass eine Änderung in der Wurzelsystemarchitektur, welche den Wassereinfang erhöht, einen größeren und direkteren Effekt auf die Biomasseakkumulation und den Mais-Ertrag aufweist als Änderungen in der Laubkronenarchitektur.
  • Die Beziehung zwischen der Pflanzengröße und der Aufnahme von Wasser durch Wurzeln wird auf Basis der Biophysik des Pflanzenwachstums vorausgesagt. Pflanzen wachsen durch die Expansion von Zellen. Diese wird osmotisch durch Unterschiede im Wasserpotential zwischen dem Innenraum und dem Außenraum der Zelle vorangetrieben und wird durch die Zellwand-Elastizität oder -Dehnfähigkeit begrenzt bzw. gehemmt. Der Wasserpotentialgradient wird durch einen Gradienten von osmotisch-aktiven gelösten Stoffen erzeugt, einschließlich Kalium und anderen Nährstoffen, die aus dem Erdreich erhalten werden. Deshalb kann die Zellexpansion durch entweder mechanische oder hydraulische Beschränkungen, oder beides, begrenzt sein. Die hydraulischen Beschränkungen wegen einer Verknappung der Menge an Wasser oder osmotisch-aktiver Nährstoffe kann entweder durch einen Mangel von deren Verfügbarkeit im Erdreich (z. B. Dürre) oder durch einen Mangel von Wurzelpenetration in die Regionen des Erdbodens, welche Wasser und Nährstoffe enthalten, verursacht sein.
  • Wurzeln sind auch wichtig, um die Pflanze bei der Reife in einer aufrechten Position zu halten, wodurch das Ernten zugelassen wird. Wegen Stängelbruch oder wegen Ausbrechen der Pflanze aus dem Erdboden kann ein Umlegen bzw. Umfallen auftreten. Bei Mais würde eine Verbesserung hinsichtlich der Kronenwurzelzahlen oder hinsichtlich des Ausmaßes der Wurzelverzweigung die Stand-Begründung und Standfestigkeit verbessern, insbesondere wenn er bei hohen Anbaudichten wachsen gelassen wird. Deshalb wird bei Mais vorausgesehen, dass verbesserte Wurzeleigenschaften, einschließlich Architektur, Verzweigung und Bodenpenetration, eine erhöhte Erfassung von Wasser und Nährstoffen zum Unterstützen der Zellexpansion, eine erhöhte Nährstoffaufnahme zum Unterstützen des Metabolismus, einschließlich der Proteinsynthese, und ein verringertes Umfallen bereitstellen, was zu einem erhöhten erntefähigen Ertrag führt. Um die Nährstoff- und Wasseraufnahme zu erleichtern, haben Pflanzen auch die Bildung von mikroskopischen Fortsätzen aus epidermalen Zellen der Wurzeloberflächen evolviert, welche als Wurzelhaare bekannt sind. Wurzelhaare vergrößern die Oberfläche der Wurzel um so viel wie 77% bei Nutzpflanzen, wodurch die Aufnahme von Wasser und Nährstoffen unterstützt und die Wechselwirkung mit der abiotischen und biotischen Rhizosphäre beeinflusst wird. Von Wurzelhaaren wurde gezeigt, dass sie eine wesentliche Rolle bei der Beeinflussung von Erträgen spielen, speziell bei Mais. Variationen in Wurzelhaaranzahl, -größe und -gestalt können zu beträchtlichen Auswirkungen auf das Vermögen der Pflanze führen, Wasser und Nährstoffe optimal aufzunehmen. Bei einer drastisch verminderten Wurzelhaar-Entwicklung können Erträge beim Mais Verluste von bis zu ungefähr 40% zeigen, was auf die Rolle hinweist, die ein erhöhtes Wurzelhaarwachstum zum insgesamten Kornertrag beisteuert.
  • Folglich können Polynukleotide, welche AP2/EREBP-Proteine codieren, die den AP2/EREBP-Domäne enthaltenden Transkriptionsfaktoren von 2 ähnlich sind, auch verwendet werden, um den Ertrag von Nutzpflanzen zu verbessern. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff ”erhöhter Ertrag” jedwede Verbesserung im Ertrag von einem beliebigen gemessenen pflanzlichen Produkt, wie Getreide, Früchte oder Fasern. Gemäß der Erfindung können Änderungen in diversen phänotypischen Eigenschaften den Ertrag verbessern. Zum Beispiel, und ohne Einschränkung, sind Parameter, wie Blütenorgan-Entwicklung, Wurzelinitiation, Wurzelbiomasse, Samenzahl, Samengewicht, Ernteindex, Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, Verringerung der Anforderung an den Nährstoff-, z. B. Stickstoff- oder Phosphor-Eintrag, Blattbildung, Phototropismus, Apikaldominanz und Fruchtentwicklung, geeignete Messungen eines verbesserten Ertrags. Jedwede Erhöhung hinsichtlich des Ertrags ist ein verbesserter Ertrag in Übereinstimmung mit der Erfindung. Zum Beispiel kann die Verbesserung des Ertrags eine Erhöhung von 0,1%, 0,5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder mehr in einem beliebigen gemessenen Parameter umfassen. Zum Beispiel ist eine Erhöhung im Scheffel/Morgen- bzw. ”bu/acre”-Ertrag von Sojabohnen oder Mais, abgeleitet aus einer Nutzpflanze, umfassend Pflanzen, welche transgen bezüglich der hierin beschriebenen AP2/EREBP-Domäne enthaltenden Transkriptionsfaktoren sind, im Vergleich zu dem ”bu/acre”-Ertrag von unter den gleichen Bedingungen angebauten, unbehandelten Sojabohnen oder Mais, ein verbesserter Ertrag in Übereinstimmung mit der Erfindung.
  • In einer anderen Ausführungsform sieht die Erfindung eine transgene Pflanze vor, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein isoliertes Polynukleotid umfasst, das ein Harpin-induziertes Protein codiert, das ähnlich zu den Polypeptiden ist, die in SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR: 24, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 28, SEQ ID NR: 30, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 36 oder SEQ ID NR: 38 dargestellt sind. Wie in den Beispielen 1 und 2 nachstehend beschrieben, zeigten transgene Soja-Wurzel-Linien, welche das Harpin-induzierte Polynukleotid mit der SEQ ID NR: 21 exprimierten, erhöhte Resistenz gegenüber Nematodeninfektion im Vergleich zu Kontroll-Linien. Ein Aminosäurealignment von einigen exemplarischen Harpin-induzierten Polypeptiden, welche zur Verwendung in dieser Ausführungsform geeignet sind, ist in 3 dargestellt. Ein beliebiges Polynukleotid, das ein Protein codiert, das ähnlich zu den Harpin-induzierten Proteinen ist, die in SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR: 24, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 28, SEQ ID NR: 30, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 36 und SEQ ID NR: 38 dargestellt sind, kann wie hierin beschrieben verwendet werden, um eine nematodenresistente transgene Pflanze herzustellen. Zum Beispiel können Polynukleotide, die beliebige der Harpin-induzierten Proteine codieren, die in 3 dargestellt sind, in eine für Nematoden anfällige Pflanze transformiert werden, um eine nematoden-resistente transgene Pflanze herzustellen.
  • In einer anderen Ausführungsform sieht die Erfindung eine transgene Pflanze vor, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein isoliertes Polynukleotid umfasst, das einen TINY-like-Transkriptionsfaktor codiert, der ähnlich zu den Polypeptiden ist, die in SEQ ID NR: 40, SEQ ID NR: 42, SEQ ID NR: 44, SEQ ID NR: 46 und SEQ ID NR: 48 dargestellt sind. Wie in den Beispielen 1 und 2 nachstehend beschrieben, zeigten transgene Soja-Wurzel-Linien, welche das M. trunculata-TINY-like Transkriptionsfaktor-Polynukleotid mit der SEQ ID NR: 39 exprimierten, eine erhöhte Resistenz gegen Nematodeninfektion im Vergleich zu Kontroll-Linien. Ein Aminosäurealignment von exemplarischen TINY-like Transkriptionsfaktoren, welche zur Verwendung in dieser Ausführungsform geeignet sind, ist in 4 dargestellt. Ein beliebiges Polynukleotid, das ein Protein codiert, das ähnlich zu den TINY-like-Transkriptionsfaktorproteinen von SEQ ID NR: 40, SEQ ID NR: 42, SEQ ID NR: 44, SEQ ID NR: 46 oder SEQ ID NR: 48 ist, kann wie hierin beschrieben verwendet werden, um eine nematodenresistente transgene Pflanze herzustellen. Zum Beispiel können Polynukleotide, die beliebige der TINY-like Transkriptionsfaktorproteine codieren, die in 4 dargestellt sind, in eine Wildtyp-Pflanze transformiert werden, um eine nematodenresistente transgene Pflanze herzustellen.
  • In einer anderen Ausführungsform sieht die Erfindung eine transgene Pflanze vor, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein isoliertes Polynukleotid umfasst, das ein Annexin codiert, das ähnlich zu den Annexinen ist, die in SEQ ID NR: 50: SEQ ID NR: 52, SEQ ID NR: 54, SEQ ID NR: 56, SEQ ID NR: 58, SEQ ID NR: 60, SEQ ID NR: 62, SEQ ID NR: 64, SEQ ID NR: 66, SEQ ID NR: 68, SEQ ID NR: 70, SEQ ID NR: 72, SEQ ID NR: 74, SEQ ID NR: 76 und SEQ ID NR: 78 dargestellt sind. Wie in den Beispielen 1 und 2 nachstehend beschrieben, zeigten transgene Soja-Wurzel-Linien, welche das G. max-Annexin-Polynukleotid mit der SEQ ID NR: 49 exprimieren, eine erhöhte Resistenz gegenüber Nematodeninfektion im Vergleich zu Kontroll-Linien. Ein Aminosäurealignment von einigen exemplarischen Annexinen, welche zur Verwendung in dieser Ausführungsform geeignet sind, ist in 5 dargestellt. Ein beliebiges Polynukleotid, das ein Annexin codiert, das ähnlich zu dem Protein von SEQ ID NR: 50: SEQ ID NR: 52, SEQ ID NR: 54, SEQ ID NR: 56, SEQ ID NR: 58, SEQ ID NR: 60, SEQ ID NR: 62, SEQ ID NR: 64, SEQ ID NR: 66, SEQ ID NR: 68, SEQ ID NR: 70, SEQ ID NR: 72, SEQ ID NR: 74, SEQ ID NR: 76 oder SEQ ID NR: 78 ist, kann wie hierin beschrieben verwendet werden, um eine nematodenresistente transgene Pflanze herzustellen. Zum Beispiel können Polynukleotide, die beliebige der Annexin-Proteine codieren, die in 5 dargestellt sind, in eine für Nematoden anfällige Pflanze transformiert werden, um eine nematodenresistente transgene Pflanze herzustellen.
  • In einer anderen Ausführungsform sieht die Erfindung eine transgene Pflanze vor, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein isoliertes Polynukleotid umfasst, das eine Laccase codiert, die ähnlich zu den Laccasen ist, die in SEQ ID NR: 80, SEQ ID NR: 82, SEQ ID NR: 84, SEQ ID NR: 86, SEQ ID NR: 88, SEQ ID NR: 90, SEQ ID NR: 92, SEQ ID NR: 94, SEQ ID NR: 96, SEQ ID NR: 98 SEQ ID NR: 100, SEQ ID NR: 102 und SEQ ID NR: 104 dargestellt sind. Wie in den Beispielen 1 und 2 nachstehend beschrieben, zeigten transgene Soja-Wurzel-Linien, welche das G. max-Laccase-Polynukleotid mit der SEQ ID NR: 79 exprimieren, eine erhöhte Resistenz gegenüber Nematodeninfektion im Vergleich zu Kontroll-Linien. Ein Alignment von einigen exemplarischen Laccasen, welche zur Verwendung in dieser Ausführungsform geeignet sind, ist in 6 dargestellt. Ein beliebiges Polynukleotid, das eine Laccase codiert, die ähnlich zu dem Protein von SEQ ID NR: 80 ist, kann wie hierin beschrieben verwendet werden, um eine nematodenresistente transgene Pflanze herzustellen. Zum Beispiel können Polynukleotide, die beliebige der Laccase-Proteine codieren, die in 6 dargestellt sind, in eine für Nematoden anfällige Pflanze transformiert werden, um eine nematodenresistente transgene Pflanze herzustellen.
  • In einer anderen Ausführungsform sieht die Erfindung eine transgene Pflanze vor, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein isoliertes Polynukleotid umfasst, das eine Benzoyl-CoA:Benzylalkohol/Phenylethanol-Benzoyltransferase codiert, die ähnlich zu den Polypeptiden ist, die in SEQ ID NR: 106 und SEQ ID NR: 108 aufgeführt sind. Wie in den Beispielen 1 und 2 nachstehend beschrieben, zeigten transgene Soja-Wurzel-Linien, welche das G. max-Benzoyl-CoA:Benzylalkohol/Phenylethanol-Benzoyltransferase-Polynukleotid mit der SEQ ID NR: 105 exprimieren, eine erhöhte Resistenz gegenüber Nematodeninfektion im Vergleich zu Kontroll-Linien. Ein Alignment von exemplarischen Benzoyltransferasen, welche zur Verwendung in dieser Ausführungsform geeignet sind, ist in 7 dargestellt. Ein beliebiges Polynukleotid, das eine Benzoyltransferase codiert, die ähnlich zu den Proteinen von SEQ ID NR: 106 oder SEQ ID NR: 108 ist, kann wie hierin beschrieben verwendet werden, um eine nematodenresistente transgene Pflanze herzustellen. Zum Beispiel können Palynukleotide, die beliebige der Benzoyltransferase-Proteine codieren, die in 7 dargestellt sind, in eine für Nematoden anfällige Pflanze transformiert werden, um eine nematodenresistente transgene Pflanze herzustellen.
  • In einer anderen Ausführungsform sieht die Erfindung eine transgene Pflanze vor, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein isoliertes Polynukleotid umfasst, das eine Anthocyanidin-3-Glucosid-Rhamnosyltransferase codiert, die ähnlich zu den Rhamnosyltransferasen ist, welche in SEQ ID NR: 110, SEQ ID NR: 112, SEQ ID NR: 114 und SEQ ID NR: 116 dargestellt sind. Wie in den Beispielen 1 und 2 nachstehend beschrieben, zeigten transgene Soja-Wurzel-Linien, welche das G. max-Anthocyanidin-3-glucosid-Rhamnosyltransferase-Polynukleotid mit der SEQ ID NR: 109 exprimierten, eine erhöhte Resistenz gegen Nematodeninfektion im Vergleich zu Kontroll-Linien. Ein Alignment von einigen exemplarischen Rhamnosyltransferasen, welche zur Verwendung in dieser Ausführungsform geeignet sind, ist in 8 dargestellt. Ein beliebiges Polynukleotid, das eine Rhamnosyltransferase codiert, die ähnlich zu denjenigen von SEQ ID NR: 110, SEQ ID NR: 112, SEQ ID NR: 114 oder SEQ ID NR: 116 ist, kann wie hierin beschrieben verwendet werden, um eine nematodenresistente transgene Pflanze herzustellen. Zum Beispiel können Polynukleotide, die beliebige der Laccase-Proteine codieren, die in 8 dargestellt sind, in eine für Nematoden anfällige Pflanze transformiert werden, um eine nematodenresistente transgene Pflanze herzustellen.
  • In einer anderen Ausführungsform sieht die Erfindung eine transgene Pflanze vor, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein isoliertes Polynukleotid umfasst, das eine Isoflavon-7-O-Methyltransferase codiert, die ähnlich zu den Methyltransferasen ist, die in SEQ ID NR: 118, SEQ ID NR: 120, SEQ ID NR: 122, SEQ ID NR: 124 und SEQ ID NR: 126 dargestellt sind. Wie in den Beispielen 1 und 2 nachstehend beschrieben, zeigten transgene Soja-Wurzel-Linien, welche das G. max-Isoflavon-7-O-Methyltransferase-Polynukleotid mit der SEQ ID NR: 117 exprimierten, eine erhöhte Resistenz gegenüber Nematodeninfektion im Vergleich zu Kontroll-Linien. Ein Alignment von exemplarischen Isoflavon-7-O-Methyltransferasen, welche zur Verwendung in dieser Ausführungsform geeignet sind, ist in der 9 dargestellt. Jedwedes Polynukleotid, das eine Methyltransferase codiert, die ähnlich zu den Proteinen von SEQ ID NR: 118, SEQ ID NR: 120, SEQ ID NR: 122, SEQ ID NR: 124 und SEQ ID NR: 126 ist, kann wie hierin beschrieben verwendet werden, um eine nematodenresistente transgene Pflanze herzustellen. Zum Beispiel können Polynukleotide, die beliebige der Isoflavon-7-O-Methyltransferase-Proteine codieren, die in 9 dargestellt sind, in eine für Nematoden anfällige Pflanze transformiert werden, um eine nematodenresistente transgene Pflanze herzustellen.
  • In einer anderen Ausführungsform sieht die Erfindung eine transgene Pflanze vor, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein isoliertes Polynukleotid umfasst, das ein AUX/IAA-Polypeptid codiert, das zu den AUX/IAA-Proteinen ähnlich ist, die in SEQ ID NR: 128, SEQ ID NR: 130, SEQ ID NR: 132 und SEQ ID NR: 134 dargestellt sind. Wie in den Beispielen 1 und 2 nachstehend beschrieben, zeigten transgene Soja-Wurzel-Linien, welche das G. max-AUX/IAA-Polynukleotid mit der SEQ ID NR: 127 exprimieren, erhöhte Resistenz gegenüber Nematodeninfektion im Vergleich zu Kontroll-Linien. Ein Alignment von exemplarischen AUX/IAA-Proteinen, welche zur Verwendung in dieser Ausführungsform geeignet sind, ist in 10 dargestellt. Ein beliebiges Polynukleotid, das ein AUX/IAA-Protein codiert, das ähnlich zu den AUX/IAA-Proteinen von SEQ ID NR: 128, SEQ ID NR: 130, SEQ ID NR: 132 und SEQ ID NR: 134 ist, kann wie hierin beschrieben verwendet werden, um eine nematodenresistente transgene Pflanze herzustellen. Zum Beispiel können Polynukleotide, die beliebige der AUX/IAA-Proteine codieren, die in 10 dargestellt sind, in eine für Nematoden anfällige Pflanze transformiert werden, um eine nematodenresistente transgene Pflanze herzustellen.
  • Die transgene Pflanze der Erfindung kann als eine monokotyle Pflanze oder eine dikotyle Pflanze charakterisiert werden. Zum Beispiel, und ohne Einschränkung, kann es sich bei transgenen Pflanzen der Erfindung um Mais, Weizen, Reis, Gerste, Hafer, Roggen, Sorghum, Banane, Raygras, Erbse, Alfalfa, Sojabohne, Karotte, Sellerie, Tomate, Kartoffel, Baumwolle, Tabak, Pfeffer bzw. Paprika, Ölsamenraps, Zuckerrübe, Kohl, Blumenkohl, Broccoli, Kopfsalat, A. thaliana, Rose oder jegliche Pflanzenspezies handeln, welche einer Transformation zuführbar ist. Die transgene Pflanze der Erfindung kann männlich-steril oder männlich-fruchtbar sein und kann ferner andere Transgene als diejenigen einschließen, welche die hierin beschriebenen isolierten Polynukleotide umfassen.
  • Die transgenen Pflanzen der Erfindung können mit gleichartigen transgenen Pflanzen oder mit transgenen Pflanzen, denen die oben beschriebenen Polynukleotide fehlen, oder mit nicht-transgenen Pflanzen mit Hilfe bekannter Verfahren der Pflanzenzüchtung gekreuzt werden, um Samen herzustellen. Die vorliegende Erfindung stellt auch Saatgut und Teile aus den oben beschriebenen transgenen Pflanzen, und Nachfahren-Pflanzen aus solchen Pflanzen, einschließlich Hybriden und Inzucht-Sorten, bereit. Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Pflanzenzüchtung bereit, z. B. um eine gekreuzte fruchtbare transgene Pflanze herzustellen. Das Verfahren umfasst das Kreuzen einer fruchtbaren transgenen Pflanze, die einen betreffenden Expressionsvektor der Erfindung umfasst, mit sich selbst oder mit einer zweiten Pflanze, z. B. einer solchen ohne den betreffenden Expressionsvektor, um den Samen einer gekreuzten fruchtbaren transgenen Pflanze, umfassend den betreffenden Expressionsvektor, herzustellen. Das Saatgut wird dann eingepflanzt, um eine gekreuzte fruchtbare transgene Pflanze zu erhalten. Die gekreuzte fruchtbare transgene Pflanze kann den betreffenden Expressionsvektor über einen weiblichen Elternteil oder über einen männlichen Elternteil ererbt haben. Die zweite Pflanze kann eine Inzucht-Pflanze sein. Die gekreuzte fruchtbare transgene Pflanze kann eine Hybride sein. Ebenfalls innerhalb der vorlegenden Erfindung eingeschlossen, sind Samen von beliebigen dieser gekreuzten fruchtbaren transgenen Pflanzen. Die Samen dieser Erfindung können aus fruchtbaren transgenen Pflanzen geerntet werden und verwendet werden, um Nachkommen-Generationen von transformierten Pflanzen dieser Erfindung anzubauen, einschließlich Hybridpflanzen-Linien, welche die oben beschriebenen nematodenresistenzverleihenden Polynukleotide umfassen.
  • In Übereinstimmung mit der Erfindung können nematodenresistente transgene Pflanzen durch Stacking bzw. ”Stapeln” eines beliebigen der hierin beschriebenen Nematodenresistenz-Polynukleotide mit mindestens einem anderen hierin offenbarten Polynukleotid hergestellt werden. Die transgene Pflanze der vorliegenden Erfindung kann eine oder mehrere Transgene umfassen und/oder mit einer anderen transgenen Pflanze, die eine oder mehrere Transgene umfasst, gekreuzt werden, wodurch ein ”Stack” bzw. ”Stapel” von Transgenen (ebenfalls bezeichnet als ein ”Gen-Stack”) in der Pflanze und/oder ihren Nachkommen erzeugt wird. Diese gestockten Kombinationen können durch jedwedes Verfahren, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Kreuzung von Pflanzen durch herkömmliche Verfahren, oder durch genetische Transformation erzeugt werden. Wenn die Merkmale durch genetische Transformation gestockt werden, können die merkmalsvermittelnden Polynukleotide sequentiell oder gleichzeitig in beliebiger Reihenfolge kombiniert werden. Wenn zum Beispiel zwei Polynukleotide eingeführt werden sollen, können die zwei Sequenzen in separaten Transformationskassetten oder auf der gleichen Transformationskassette enthalten sein. Die Expression der Sequenzen kann vom selben oder unterschiedlichen Promotoren angetrieben werden.
  • Zum Beispiel können Polynukleotide, die beliebige zwei oder mehr der AP2/EREBP-Transkriptionsfaktoren von SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 18 oder SEQ ID NR: 20 codieren, gestackt werden, um eine verstärkte Nematodenresistenz oder einen gesteigerten Ertrag vorzusehen. Als ein weiteres Beispiel können Polynukleotide, die beliebige zwei oder mehr der Harpin-induzierten Proteine von SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR: 24, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 28, SEQ ID NR: 30, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 36 oder SEQ ID NR: 38 codieren, gestackt werden, um eine verstärkte Nematodenresistenz vorzusehen. Alternativ dazu können Polynukleotide, die beliebige zwei oder mehr der TINY-like-Transkriptionsfaktoren von SEQ ID NR: 40, SEQ ID NR: 42, SEQ ID NR: 44, SEQ ID NR: 46 und SEQ ID NR: 48 codieren, gestackt werden, um eine verstärkte Nematodenresistenz vorzusehen. In einer anderen Stacking-Ausführungsform können Polynukleotide, die beliebige zwei oder mehr der Annexine codieren, die in SEQ ID NR: 50: SEQ ID NR: 52, SEQ ID NR: 54, SEQ ID NR: 56, SEQ ID NR: 58, SEQ ID NR: 60, SEQ ID NR: 62, SEQ ID NR: 64, SEQ ID NR: 66, SEQ ID NR: 68, SEQ ID NR: 70, SEQ ID NR: 72, SEQ ID NR: 74, SEQ ID NR: 76 und SEQ ID NR: 78 dargestellt sind, gestackt werden, um eine verstärkte Nematodenresistenz vorzusehen. Außerdem können Polynukleotide, die beliebige zwei oder mehr der Laccasen von SEQ ID NR: 80, SEQ ID NR: 82, SEQ ID NR: 84, SEQ ID NR: 86, SEQ ID NR: 88, SEQ ID NR: 90, SEQ ID NR: 92, SEQ ID NR: 94, SEQ ID NR: 96, SEQ ID NR: 98 SEQ ID NR: 100, SEQ ID NR: 102 und SEQ ID NR: 104 codieren, gestackt werden, um eine verstärkte Nematodenresistenz vorzusehen. In einer anderen Ausführungsform können Polynukleotide, die beliebige zwei oder mehr der Benzoyl-CoA:Benzylelkohol/Phenylethanol-Benzoyltransferasen von SEQ ID NR: 106 und SEQ ID NR: 108 codieren, gestackt werden, um eine verstärkte Nematodenresistenz vorzusehen. In einer anderen Ausführungsform können Polynukleotide, die beliebige zwei oder mehr der Anthocyanidin-3-glucosid-Rhamnosyltransferasen von SEQ ID NR: 110, SEQ ID NR: 112, SEQ ID NR: 114 und SEQ ID NR: 116 codieren, gestackt werden, um eine verstärkte Nematodenresistenz vorzusehen. Polynukleotide, die beliebige zwei oder mehr der Isoflavon-7-O-Methyl-Transferasen von SEQ ID NR: 118, SEQ ID NR: 120, SEQ ID NR: 122, SEQ ID NR: 124 und SEQ ID NR: 126 codieren, können gestackt werden, um eine verstärkte Nematodenresistenz vorzusehen. In einer anderen Ausführungsform können Polynukleotide, die beliebige zwei oder mehr der AUX/IAA-Proteine von SEQ ID NR: 128, SEQ ID NR: 130, SEQ ID NR: 132 und SEQ ID NR: 134 codieren, gestackt werden, um eine verstärkte Nematodenresistenz vorzusehen. [0065] Alternativ dazu kann ein Polynukleotid, das einen hierin offenbarten AP2/EREBP-Transkriptionsfaktor codiert, gestackt werden mit einem Polynukleotid, das ein hierin offenbartes Harpin-induziertes Protein codiert, einem Polynukleotid, des einen hierin offenbarten TINY-like Transkriptionsfaktor codiert, einem Polynukleotid, das ein hierin offenbartes Annexin codiert, einem Polynukleotid, das eine hierin offenbarte Laccase codiert, einem Polynukleotid, das eine hierin offenbarte Benzoyl-CoA:Benzylalkohol/Phenylethenol-Benzoyltransferase codiert, einem Polynukleotid, das eine hierin offenbarte Anthocyanidin-3-glucosid-Rhamnosyltransferase codiert, einem Polynukleotid, das eine hierin offenbarte Isoflavon-7-O-Methyltransferase codiert, oder einem Polynukleotid, das ein hierin offenbartes AUX/IAA-Protein codiert. Jedwede Kombination der hierin offenbarten Polynukleotide kann kombiniert werden, um eine nematodenresistente Pflanze herzustellen. Darüber hinaus kann jedwedes der hierin offenbarten Polynukleotide mit einem beliebigen Polynukleotid kombiniert werden, von dem bekannt ist, dass es die Resistenz gegenüber pflanzenparasitischen Nematoden steigert.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft einen Expressionsvektor, der einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit einem oder mehreren Polynukleotiden der Erfindung umfasst, wobei die Expression des Polynukleotids eine erhöhte Nematodensresistenz an eine transgene Pflanze vermittelt. In einer Ausführungsform ist das die Transkription regulierende Element ein Promotor, der zum Lenken einer konstitutiven Expression eines funktionsfähig gebundenen Polynukleotids in der Lage ist. Ein ”konstitutiver Promotor” bezieht sich auf einen Promotor, der zum Exprimieren des offenen Leserahmens oder des regulatorischen Elements, welches diesen steuert, in allen oder fast alten der Pflanzengewebe während aller oder fast aller Entwicklungsstadien der Pflanze in der Lage ist. Konstitutive Promotoren schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, den 35S-CaMV-Promotor aus Pflanzenviren (Franck et al., Cell 21: 285–294, 1980), den Nos-Promotor (An G. at al., The Plant Cell 3: 225–233, 1990), den Ubiquitin-Promotor (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12: 619–632, 1992 und 18: 581–8, 1991), den MAS-Promotor (Velten et al., EMBO J. 3: 2723–30, 1984), den Mais-H3-Histon-Promotor (Lepetit et al., Mol Gen. Genet 231: 276–85, 1992), den ALS-Promotor ( WO96/30530 ), den 19S-CaMV-Promotor ( US 5 352 605 ), den ”Super”-Promotor ( US 5 955 646 ), den Braunwurz-Mosaikvirus-Promotor ( US 6 051 753 ), den Reis-Aktin-Promotor ( US 5 641 876 ), und den Promotor der kleinen Rubisco-Untereinheit ( US 4 962 028 ) ein.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das die Transkription regulierende Element ein regulierter Promotor. Ein ”regulierter Promotor” bedeutet einen Promotor, der Genexpression nicht konstitutiv, sondern in einer zeitlichen und/oder räumlichen Weise steuert, und schließt sowohl gewebespezifische als auch induzierbare Promotoren ein. Verschiedene Promotoren können die Expression von einem Polynukleotid oder regulatorischen Element in verschiedenen Geweben oder Zelltypen oder bei unterschiedlichen Stadien der Entwicklung oder in Antwort auf verschiedene Umweltbedingungen steuern.
  • Ein ”gewebespezifischer Promotor” oder ”gewebebevorzugter Promotor” bezieht sich auf einen regulierten Promotor, der nicht in allen Pflanzenzellen, sondern nur in einem oder mehr Zelltypen in spezifischen Organen (wie Blättern oder Samen), spezifischen Geweben (wie Embryo oder Kotyledon) oder spezifischen Zelltypen (wie Blattparenchym oder Samen-Speicherzellen) exprimiert wird. Diese schließen auch Promotoren ein, welche zeitlich reguliert sind, wie etwa in der frühen oder späten Embryogenese, während der Fruchtreifung in sich entwickelnden Samen oder Früchten, im voll differenzierten Blatt oder am Beginn der Abfolge bzw. Seneszenz. Zu geeigneten Promotoren zählen der Promotor des Napin-Gens aus Raps ( US 5 608 152 ), der USP-Promotor aus Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet. 225(3): 459–67, 1991), der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis ( WO 98145461 ), der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris ( US 5 504 200 ), der Bce4-Promotor aus Brassica ( WO 91/13980 ) oder der Legumin-B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al., Plant Journal, 2 (2), 233–9, (1992)), sowie Promotoren, welche die samenspezifische Expression in monokotylen Pflanzen, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. herbeiführen. Geeignete Promotoren, welche erwähnt werden sollten, sind der Ipt2- oder Ipt1-Gen-Promotor aus Gerste ( WO 95/15389 und WO 95/23230 ) oder diejenigen, welche in WO 99/16890 beschrieben sind (Promotoren aus dem Gerste-Hordein-Gen, dem Reis-Glutein-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen, dem Prolamin-Gen von Reis, dem Gliadin-Gen von Weizen, dem Glutelin-Gen von Weizen, dem Zein-Gen von Mais, dem Glutein-Gen von Hafer, dem Kosirin-Gen von Sorghum und dem Secalin-Gen von Roggen). Promotoren, die für eine präferentielle Expression in pflanzlichen Wurzelgeweben geeignet sind, schließen zum Beispiel den Promotor, der aus dem Mais-Nicotianamin-Synthase-Gen abgeleitet ist ( US 20030131377 ), und den Reis-RCC3-Promotor ( US 11/075,113 ) ein. Ein geeigneter Promotor zur präferentiellen Expression in grünen Pflanzengeweben schließt die Promotoren aus Genen, wie Mais-Aldolase-Gen FDA ( US 20040216189 ), Aldolase und Pyruvat-Orthophosphat-Dikinase (PPDK) (Taniguchi et. al., Plant Cell Physiol. 41(1): 42–48, 2000) ein.
  • ”Induzierbare Promotoren” beziehen sich auf diejenigen regulierten Promotoren, welche in einem oder mehreren Zelltypen durch einen externen Stimulus, zum Beispiel eine Chemikalie, Licht, Hormon, Stress oder eine Nematode, wie Nematoden, angeschaltet werden können. Chemisch induzierbare Promotoren sind besonders geeignet, wenn Genexpression erwünschtermaßen in einer zeitspezifischen Weise auftreten soll. Beispiele derartiger Promotoren sind ein salicylsäureinduzierbarer Promotor ( WO 95/19443 ), ein tetracyclininduzierbarer Promotor (Gatz et al., Plant J. 2: 397–404, 1992), der licht-induzierbare Promotor aus der kleinen Untereinheit von Ribulose-1,5-bis-phosphat-Carboxylase (ssRUBISCO), und ein ethanolinduzierbarer Promotor ( WO 93/21334 ). Des Weiteren sind geeignete Promotoren, welche auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, diejenigen, wie etwa der nematodeninduzierbare PRP1-Genpromotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22: 361–366, 1993), der hitzeinduzierbare hsp80-Promotor der Tomate ( US 5187267 ), der kälteinduzierbare Alpha-Amylase-Promotor der Kartoffel ( WO 96/12814 ), der dürreinduzierbare Promotor von Mais (Busk et. al., Plant J. 11: 1285–1295, 1997), der durch Kälte, Dürre und Hochsalz induzierbare Promotor aus Kartoffel (Kirch, Plant Mol. Biol. 33: 897–909, 1997) oder der RD29A-Promotor aus Arabidopsis (Yamaguchi-Shinozalei et. al., Mol. Gen. Genet. 236: 331–340, 1993), zahlreiche kälteinduzierbare Promotoren, wie cor15a-Promotor aus Arabidopsis (Genbank-Eintrag Nr. U01377), blt101 und blt4.8 aus Gerste (Genbank-Einträge Nrn. AJ310994 und U63993), wcs120 aus Weizen (Genbank-Eintrag Nr. AF031235), mlip15 aus Mais (Genbank-Eintrag Nr. D26563), bn115 aus Brassica (Genbank-Eintrag Nr. U01377), und der durch Verwundung induzierbare pinII-Promotor ( Europäisches Patent Nr. 375091 ).
  • Von besonderer Nützlichkeit in der vorliegenden Erfindung sind Synzytienortsbevorzugende oder Nematoden-Fraßstellen-induzierte Promotoren, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Promotoren wie der in PCT/EP2008/051328 offenbarte Mtn3-like-Promotor, der in PCT/EP2007/051378 offenbarte Mtn21-like-Promotor, der in PCT/EP2007/064356 offenbarte Peroxidase-like-Promoter, der in PCT/EP2007/063761 offenbarte Trehalose-6-Phosphat-Phosphatase-like-Promotor und der in PCT/EP2008/051329 offenbarte At5g12170-like-Promotor. Alle der vorangehend genannten Patentanmeldungen sind hierin durch den Bezug darauf einbezogen.
  • Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer nematodenresistenten transgenen Pflanze, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Transformieren einer Wildtyp-Pflanze mit einem Expressionsvektor, umfassend ein Polynukleotid, codierend ein; und c) Selektieren transgener Pflanzen hinsichtlich erhöhter Nematodenresistenz.
  • Eine Vielzahl von Verfahren zur Einbringung von Polynukleotiden in das Genom von Pflanzen und für die Regenerierung von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen ist bekannt, zum Beispiel in Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und Wu R, Academic Press, 15–38; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer; Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, S. 128–143; Potrykus (1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42: 205–225; Halford NG, Shewry PR (2000) Br. Med. Bull. 56(1): 62–73.
  • Transformationsverfahren können direkte und indirekte Verfahren der Transformation einschließen. Geeignete direkte Verfahren schließen Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, Liposom-vermittelte Transformation ( US 4 536 475 ), Biolistik-Verfahren unter Einsatz der Genkanone (Fromm ME et al., Bio/Technology. 8(9): 833–9, 1990; Gordon-Kamm et al. Plant Cell 2: 603, 1990), Elektroporation, Inkubation von trockenen Embryonen in DNA-haltiger Lösung und Mikroinjektion ein. Im Falle dieser direkten Transformationsverfahren müssen die verwendeten Plasmide keinen besonderen Anforderungen genügen. Einfache Plasmide, wie diejenigen der pUC-Serie, pBR322, M13mp-Serie, pACYC184 und dergleichen können zur Anwendung kommen. Wenn intakte Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden sollen, ist vorzugsweise ein zusätzliches selektierbares Markergen auf dem Plasmid befindlich. Die Techniken zur direkten Transformation sind für dikotyle und monokotyle Pflanzen gleichermaßen geeignet.
  • Die Transformation kann ebenfalls durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium (zum Beispiel EP 0 116 718 ), virale Infektion mittels viraler Vektoren ( EP 0 067 553 ; US 4 407 956 ; WO 95/34668 ; WO 93/03161 ) oder mittels Pollen ( EP 0 270 356 ; WO 85/01856 ; US 4 684 611 ) durchgeführt werden. Auf Agrobacterium basierende Transformationstechniken (speziell für dikotyle Pflanzen) sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Der Agrobacterium-Stamm (z. B. Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes) umfasst ein Plasmid (Ti- oder Ri-Plasmid) und ein T-DNA-Element, das anschließend an die Infektion mit Agrobacterium in die Pflanze übertragen wird. Die T-DNA (transferierte DNA) wird in das Genom der Pflanzenzelle integriert. Die T-DNA kann auf dem Ri- oder Ti-Plasmid lokalisiert sein oder ist getrennt davon in einem sogenannten binären Vektor enthalten. Verfahren für die agrobacteriumvermittelte Transformation sind, zum Beispiel, in Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229, beschrieben. Die agrobacteriumvemittelte Transformation eignet sich am besten für dikotyle Pflanzen, aber ist auch für monokotyle Pflanzen adaptiert worden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist zum Beispiel in White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38; Jenes B et al. Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 128–143; Potrykus (1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Molec. Biol. 42: 205–225, beschrieben.
  • Die hierin beschriebenen Polynukleotide können direkt in das Plastidengenom transformiert werden. Die Plastidenexpression, bei der Gene durch homologe Rekombination in die mehreren tausend Kopien des zirkulären Plastidengenoms, die in jeder Pflanzenzelle vorhanden sind, inseriert werden, zieht einen Nutzen aus dem Vorteil der enormen Kopienzahl gegenüber nukleär exprimierten Genen, wodurch hohe Expressionsspiegel erlaubt werden. In einer Ausführungsform werden die Nukleotide in einen Plastiden-Targetingvektor inseriert und in das Plastidengenom eines gewünschten pflanzlichen Wirts transformiert. Pflanzen, die homoplasmisch hinsichtlich Plastidengenomen sind, welche die Nukleotidsequenzen enthalten, werden erhalten und sind präferentiell zu einer hohen Expression der Nukleotide in der Lage.
  • Die Plastidentransformations-Technologie ist zum Beispiel umfangreich in den U.S.-Pat. NRn. 5 451 513 , 5 545 817 , 5 545 818 und 5 877 462 , in der WO 95/16783 und WO 97/32977 , und in McBride et al. (1994) PNAS 91, 7301–7305, beschrieben.
  • Die transgenen Pflanzen der Erfindung können in einem Verfahren zur Bekämpfung des Befalls einer Nutzpflanze durch eine Pflanzennematode zur Anwendung kommen, welches den Schritt des Wachsenlassens der Nutzpflanze aus Samen, welche einen Expressionsvektor umfassen, umfassend einen Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit einem Polynukleotid, das mindestens ein Annexin-, AUX/IAA-, Isoflavon-7-OMT-, Anthocyanidin-3-Glucosid-Rhamnosyltransferase-like-, hsr201-like-, Laccase-, AP2-like-, HI1- oder TINY-like-Polypeptid codiert, umfasst, wobei der Expressionsvektor stabil in die Genome der Samen integriert ist.
  • Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, welche keinesfalls zur Auferlegung von Einschränkungen auf den Umfang derselben interpretiert werden sollen. Durch Bezugnahme ist die am 25. Aug. 2009 eingereichte provisorische U.S.-Patentanmeldung Nr. 61/236624 einbezogen.
  • Beispiel 1: Vektorkonstruktion
  • Unter Anwendung der verfügbaren cDNA-Sequenz für die Sojabohne-Ziel-Polynukleotide wurde PCR angewandt, um DNA-Fragmente zu isolieren, die verwendet wurden, um die binären Vektoren zu konstruieren, welche in Tabelle 1 beschrieben und in Beispiel 2 erörtert sind. Die PCR-Produkte wurden in TOPO pCR2.1-Vektoren (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert, und Inserts wurden durch Sequenzieren bestätigt. Offene Leserahmen, die durch die Polynukleotide GmAnnAt4-like (SEQ ID NR: 49), GmAux28 (SEQ ID NR: 127), Gmisoflavone7OMT-9 (SEQ ID NR: 117), GmAnUGT_47218626 (SEQ ID NR: 109), Gmhsr201-like (SEQ ID NR: 105), MtTINY-like (SEQ ID NR: 39), GmLaccase1 (SEQ ID NR: 79) und GmHI1 (SEQ ID NR: 21) beschrieben sind, wurden unter Anwendung dieses Verfahrens isoliert. Alternativ dazu wurde verfügbare genomische Sequenz aus Sojabohne verwendet, um Primer für die Amplifikation von Gensequenzen aus genomischer Sojabohne-DNA zu entwerfen, um die in Tabelle 1 beschriebenen und in Beispiel 2 und Beispiel 3 erörterten binären Vektoren zu konstruieren. DNA-Sequenzen für die Sojabohne-Zielgene wurden mittels PCR amplifiziert, in TOPO pCR2.1-Vektoren (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert, und Inserts wurden durch Sequenzieren bestätigt. Genfragmente für die Ziel-Polynukleotide GmAP2-like 1 (SEQ ID NR: 1), GmAP2-like 2 (SEQ ID NR: 3) und GmAP2-like 3 (SEQ ID NR: 7) wurden durch PCR-Amplifizieren der Polynukleotidsequenzen aus genomischer Sojabohne-DNA isoliert.
  • Die klonierten Polynukleotide GmAnnAt4-like (SEQ ID NR: 49), GmAux28 (SEQ ID NR: 127), GmAnUGT_47218626 (SEQ ID NR: 109), Gmhsr201-like (SEQ ID NR: 105) und GmLaccase1 (SEQ ID NR: 79) wurden sequenziert und individuell in einen Pflanzen-Expressionsvektor subkloniert, der einen TPP-Promotor aus Arabidopsis thaliana enthielt, welcher in 1 als p-AtTPP-Promotor (SEQ ID NR: 135) bezeichnet wird. Das klonierte GmIsoflavone7OMT-9 (SEQ ID NR: 117) wurde sequenziert und individuell in einen Pflanzen-Expressionsvektor subkloniert, der einen Ubiquitin-Promotor aus Petersilie enthielt ( WO 031102198 ; p-PcUbi4-2-Promotor (SEQ ID NR: 137) in 1). Die klonierten Polynukleotide GmLaccase1 (SEQ ID NR: 79), MtTINY-like (SEQ ID NR: 39) wurden sequenziert und individuell in einen Pflanzen-Expressionsvektor subkloniert, der einen MtN3-like-Promotor aus Sojabohne enthielt, bezeichnet als p-MtN3-like (SEQ ID NR: 136), ebenfalls aufgeführt als p-GmN3L in 1. Die klonierten Polynukleotide GmHI1 (SEQ ID NR: 21), GmAP2-like1 (SEQ ID NR: 1), GmAP2-like2 (SEQ ID NR: 3) und GmAP2-like3 (SEQ ID NR: 7) wurden sequenziert und individuell in einen Pflanzen-Expressionsvektor subkloniert, der den SUPER-Promotor ( US 5 955 646 ) enthielt (SEQ ID NR: 138 in 1). Der Selektionsmarker für die Transformation war die mutierte Form des Acetohydroxysäure-Synthase(AHAS)-Selektionsgens (ebenfalls bezeichnet als AHAS2) aus Arabidopsis thaliana (Sathasivan et al., Plant Phys. 97: 1044–50, 1991), das Resistenz gegen das Herbizid ARSENAL (Imazapyr, BASF Corporation, Mount Olive, NJ) verleiht. Die Expression von AHAS2 wurde von einem Ubiquitin-Promotor aus Petersilie ( WO 03/102198 ) (SEQ ID NR: 137) angetrieben. Die Tabelle 1 beschreibt die Konstrukte, welche GmAnnAt4-like-, GmAux28-, GmIsoflavone7OMT-9-, GmAnUGT_47218626-, Gmhsr201-like-, GmLaccasel-, GmAP2-like1-, GmAP2-like2-, GmAP2-like3-, MtTINY-like- und GmHI1-Polynukleotide enthielten. Tabelle 1
    Vektorname Promotorname Polynukleotidname SEQ ID NR:
    RTP2833 Super GmAP2-like1 1
    RTP2834 Super GmAP2-like2 3
    RTP2839 Super GmAP2-like3 7
    RTP2766 Super GmHI1 21
    RBM056 MtN3-like MtTINY-like 39
    RTP2424 AtTPP GmAnnAt4-like 49
    RTP1960 MtN3-like GmLaccase1 79
    RTP1961 AtTPP GmLaccase1 79
    RTP1433 AtTPP Gmhsr201-like 105
    MSB126 AtTPP GmAnUGT_47218626 109
    MS6131 Ubi GmIsoflavone 7OMT-9 117
    RTP1808 AtTPP GmAux28 127
  • Beispiel 2: Nematoden-Bioassay
  • Ein Bioassay zur Auswertung der Nematodenresistenz, die durch die hierin beschriebenen Polynukleotide vermittelt wird, wurde mit Hilfe eines bewurzelten Pflanzen-Testsystems durchgeführt, das in der, in gemeinschaftlichem Besitz befindlichen, gleichzeitig hängigen USSN 12/001,234 offenbart ist. Transgene Wurzeln wurden nach Transformation mit den in Beispiel 1 beschriebenen binären Vektoren erzeugt. Mehrere transgene Wurzellinien wurden subkultiviert und mit oberflächendekontaminierten Rasse-3-SCN-Jungtieren des zweiten Stadiums (J2) bei einem Verhältnis von etwa 500 J2/Vertiefung inokuliert. Vier Wochen nach der Nematoden-Inokulation wurde die Zystenzahl in jeder Vertiefung gezählt. Für jedes Transformationskonstrukt wurde die Anzahl an Zysten pro Linie berechnet, um die durchschnittliche Zystenzahl und den Standardfehler für das Konstrukt zu bestimmen. Die Zystenzahl-Werte für jedes Transformationkonstrukt wurden mit den Zystenzahl-Werten einer parallel getesteten Leer-Vektorkontrolle verglichen, um zu ermitteln, ob das getestete Konstrukt zu einer Verringerung in der Zystenzahl führt. Bewurzelte Explantatkulturen, die mit den Vektoren RTP2424, RTP1808, MSB131, MSB126, RTP1433, RTP1960, RTP1961, RTP2833, RTP2834, RTP2839, RBM056 und RTP2766 transformiert waren, zeigten einen allgemeinen Trend zu verringerten Zysten-Anzahlen und Weibchen-Index im Vergleich zur bekannten anfälligen Varietät Williams82.
  • Wurzelfläche-Messungen wurden bestimmt, um die Menge an Wurzelmaterial für jede subkultivierte Linie auszuwerten, welche aus 4 Wochen Wachstum nach der Nematoden-Inokulation resultierte. Die Wurzelflächenwerte für jedes Konstrukt werden mit den Wurzelflächenwerten einer parallel getesteten Leervektor-Kontrolle verglichen, um zu ermitteln, ob das getestete Konstrukt zu einer Veränderung bei der Wurzelfläche führt. Bewurzelte Explantat-Kulturen, die mit den Vektoren RTP2833, RTP2834, und RTP2839 transformiert waren, zeigten einen allgemeinen Trend zu erhöhter Wurzelfläche im Vergleich zu einer Leervektor-Kontrolle.
  • Beispiel 3: Wurzelbiomasse-Assay
  • Das bewurzelte Pflanzen-Testsystem, das in der, in gemeinschaftlichem Besitz befindlichen, gleichzeitig hängigen USSN 12/001,234 offenbart ist, wurde ebenfalls angewandt, um das Wurzelwachstum von nicht-infizierten transgenen Wurzeln, welche RTP2833, RTP2834 und RTP2839 umfassten, abzuschätzen. Mehrere transgene Wurzellinien und angeschlossenes Kotyledon werden zur Beobachtung auf Agarplatten subkultiviert. Zum Zeitpunkt der Sub-Kultivierung wird die Wurzelspitze auf der Rückseite der Platte als ein Referenzpunkt gekennzeichnet. Die subkultivierte Wurzel samt Kotyledon werden in einer Lichtkammer, mit der Kotyledonseite nach oben, während 6 Tagen inkubiert. Für jedes Transformationskonstrukt zeichnet man Wurzelgewicht, Wurzellänge und die Zahl der Seitenwurzeln auf. Die Wurzelparameter-Messwerte für jedes Transformationskonstrukt werden mit den Wurzelparameter-Messwerten einer parallel getesteten Leervektor-Kontrolle verglichen, um zu ermitteln, ob das getestete Konstrukt zu einer Veränderung bei Wurzelgewicht, Wurzellänge, Wurzelfläche und Seitenwurzel-Zahl führt. Bewurzelte Explantat-Kulturen, die mit den Vektoren RTP2833 und RTP2839 transformiert waren, zeigten einen allgemeinen Trend zu erhöhtem Wurzelgewicht im Verhältnis zur Leervektor-Kontrolle.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Claims (5)

  1. Transgene Pflanze, transformiert mit einem Expressionsvektor, umfassend isoliertes Polynukleotid, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus Folgendem besteht: a) einem Polynukleotid, das einen AP2/EREBP-Transkriptionsfaktor codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 18 oder SEQ ID NR: 20; b) einem Polynukleotid, das ein harpininduziertes Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR: 24, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 28, SEQ ID NR: 30, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 36 oder SEQ ID NR: 38; c) einem Polynukleotid, das einen TINY-like Transkriptionsfaktor codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 40, SEQ ID NR: 42, SEQ ID NR: 44, SEQ ID NR: 46 oder SEQ ID NR: 48; d) einem Polynukleotid, das ein Annexin-Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 50, SEQ ID NR: 52, SEQ ID NR: 54, SEQ ID NR: 56, SEQ ID NR: 58, SEQ ID NR: 60, SEQ ID NR: 62, SEQ ID NR: 64, SEQ ID NR: 66, SEQ ID NR: 68, SEQ ID NR: 70, SEQ ID NR: 72, SEQ ID NR: 74, SEQ ID NR: 76 oder SEQ ID NR: 78; e) einem Polynukleotid, das Laccase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 80, SEQ ID NR: 82, SEQ ID NR: 84, SEQ ID NR: 86, SEQ ID NR: 88, SEQ ID NR: 90, SEQ ID NR: 92, SEQ ID NR: 94, SEQ ID NR: 96, SEQ ID NR: 98, SEQ ID NR: 100, SEQ ID NR: 102 oder SEQ ID NR: 104; f) einem Polynukleotid, das Benzoyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 106 oder SEQ ID NR: 108; g) einem Polynukleotid, das Rhamnosyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 110, SEQ ID NR: 112, SEQ ID NR: 114 oder SEQ ID NR: 116; h) einem Polynukleotid, das eine Isoflavon-7-O-Methyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 118, SEQ ID NR: 120, SEQ ID NR: 122, SEQ ID NR: 124 oder SEQ ID NR: 126; und i) einem Polynukleotid, das ein AUX/IAA-Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 128, SEQ ID NR: 130, SEQ ID NR: 132 oder SEQ ID NR: 134.
  2. Saatgut, welches sortenecht bzgl. eines Transgens ist, umfassend mindestens ein Polynukleotid, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus Folgendem besteht: a) einem Polynukleotid, das einen AP2/EREBP-Transkriptionsfaktor codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 18 oder SEQ ID NR: 20; b) einem Polynukleotid, das ein harpininduziertes Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR: 24, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 28, SEQ ID NR: 30, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 36 oder SEQ ID NR: 38; c) einem Polynukleotid, das einen TINY-like Transkriptionsfaktor codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 40, SEQ ID NR: 42, SEQ ID NR: 44, SEQ ID NR: 46 oder SEQ ID NR: 48; d) einem Polynukleotid, das ein Annexin-Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 50, SEQ ID NR: 52, SEQ ID NR: 54, SEQ ID NR: 56, SEQ ID NR: 58, SEQ ID NR: 60, SEQ ID NR: 62, SEQ ID NR: 64, SEQ ID NR: 66, SEQ ID NR: 68, SEQ ID NR: 70, SEQ ID NR: 72, SEQ ID NR: 74, SEQ ID NR: 76 oder SEQ ID NR: 78; e) einem Polynukleotid, das Laccase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 80, SEQ ID NR: 82, SEQ ID NR: 84, SEQ ID NR: 86, SEQ ID NR: 88, SEQ ID NR: 90, SEQ ID NR: 92, SEQ ID NR: 94, SEQ ID NR: 96, SEQ ID NR: 98, SEQ ID NR: 100, SEQ ID NR: 102 oder SEQ ID NR: 104; f) einem Polynukleotid, das Benzoyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 106 oder SEQ ID NR: 108; g) einem Polynukleotid, das Rhamnosyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 110, SEQ ID NR: 112, SEQ ID NR: 114 oder SEQ ID NR: 116; h) einem Polynukleotid, das eine Isoflavon-7-O-Methyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 118, SEQ ID NR: 120, SEQ ID NR: 122, SEQ ID NR: 124 oder SEQ ID NR: 126; und i) einem Polynukleotid, das ein AUX/IAA-Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 128, SEQ ID NR: 130, SEQ ID NR: 132 oder SEQ ID NR: 134, wobei die Expression des Transgens erhöhte Nematodenresistenz an die Pflanze vermittelt, die aus dem transgenen Saatgut wachsen gelassen wird.
  3. Expressionsvektor, der einen Promotor umfasst, der in funktionsfähiger Weise an ein Polynukleotid gebunden ist, codierend mindestens ein Polynukleotid, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus Folgendem besteht: a) einem Polynukleotid, das einen AP2/EREBP-Transkriptionsfaktor codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 18 oder SEQ ID NR: 20; b) einem Polynukleotid, das ein harpininduziertes Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR: 24, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 28, SEQ ID NR: 30, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 36 oder SEQ ID NR: 38; c) einem Polynukleotid, das einen TINY-like Transkriptionsfaktor codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 40, SEQ ID NR: 42, SEQ ID NR: 44, SEQ ID NR: 46 oder SEQ ID NR: 48; d) einem Polynukleotid, das ein Annexin-Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 50, SEQ ID NR: 52, SEQ ID NR: 54, SEQ ID NR: 56, SEQ ID NR: 58, SEQ ID NR: 60, SEQ ID NR: 62, SEQ ID NR: 64, SEQ ID NR: 66, SEQ ID NR: 68, SEQ ID NR: 70, SEQ ID NR: 72, SEQ ID NR: 74, SEQ ID NR: 76 oder SEQ ID NR: 78; e) einem Polynukleotid, das eine Laccase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 80, SEQ ID NR: 82, SEQ ID NR: 84, SEQ ID NR: 86, SEQ ID NR: 88, SEQ ID NR: 90, SEQ ID NR: 92, SEQ ID NR: 94, SEQ ID NR: 96, SEQ 10 NR: 98, SEQ ID NR: 100, SEQ ID NR: 102 oder SEQ ID NR: 104; f) einem Polynukleotid, das eine Benzoyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 106 oder SEQ ID NR: 108; g) einem Polynukleotid, das eine Rhamnosyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 110, SEQ ID NR: 112, SEQ ID NR: 114 oder SEQ ID NR: 116; h) einem Polynukleotid, das eine Isoflavon-7-O-Methyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 118, SEQ ID NR: 120, SEQ ID NR: 122, SEQ ID NR: 124 oder SEQ ID NR: 126; und i) einem Polynukleotid, das ein AUX/IAA-Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 128, SEQ ID NR: 130, SEQ ID NR: 132 oder SEQ ID NR: 134.
  4. Verfahren der Herstellung einer nematodenresistenten transgenen Pflanze, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Transformieren einer Pflanzenzelle vom Wild-Typ mit einem Expressionsvektor, der einen Promotor umfasst, der in funktionsfähiger Weise an ein Polynukleotid gebunden ist, codierend mindestens ein Polynukleotid, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus Folgendem besteht: a) einem Polynukleotid, das einen AP2/EREBP-Transkriptionsfaktor codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 18 oder SEQ ID NR: 20; b) einem Polynukleotid, das ein harpininduziertes Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR: 24, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 28, SEQ ID NR: 30, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 36 oder SEQ ID NR: 38; c) einem Polynukleotid, das einen TINY-like Transkriptionsfaktor codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 40, SEQ ID NR: 42, SEQ ID NR: 44, SEQ ID NR: 46 oder SEQ ID NR: 48; d) einem Polynukleotid, das ein Annexin-Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 50, SEQ ID NR: 52, SEQ ID NR: 54, SEQ ID NR: 56, SEQ ID NR: 58, SEQ ID NR: 60, SEQ ID NR: 62, SEQ ID NR: 64, SEQ ID NR: 66, SEQ ID NR: 68, SEQ ID NR: 70, SEQ ID NR: 72, SEQ ID NR: 74, SEQ ID NR: 76 oder SEQ ID NR: 78; e) einem Polynukleotid, das eine Laccase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 80, SEQ ID NR: 82, SEQ ID NR: 84, SEQ ID NR: 86, SEQ ID NR: 88, SEQ ID NR: 90, SEQ ID NR: 92, SEQ ID NR: 94, SEQ ID NR: 96, SEQ ID NR: 98, SEQ ID NR: 100, SEQ ID NR: 102 oder SEQ ID NR: 104; f) einem Polynukleotid, das eine Benzoyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 106 oder SEQ ID NR: 108; g) einem Polynukleotid, das eine Rhamnosyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 110, SEQ ID NR: 112, SEQ ID NR: 114 oder SEQ ID NR: 116; h) einem Polynukleotid, das eine Isoflavon-7-O-Methyltransferase codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 118, SEQ ID NR: 120, SEQ ID NR: 122, SEQ ID NR: 124 oder SEQ ID NR: 126; und i) einem Polynukleotid, das ein AUX/IAA-Protein codiert, ähnlich zu SEQ ID NR: 128, SEQ ID NR: 130, SEQ ID NR: 132 oder SEQ ID NR: 134; b) Regenerieren von transgenen Pflanzen aus der transformierten Pflanzenzelle; und c) Selektieren von transgenen Pflanzen auf erhöhte Nematodenresistenz im Vergleich zu einer Kontrollpflanze der gleichen Spezies.
  5. Verfahren der Erhöhung des Ertrags einer Nutzpflanze, wobei das Verfahren die Schritte des Transformierens einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, der einen Promotor umfasst, der in funktionsfähiger Weise an ein Polynukleotid gebunden ist, codierend AP2/EREBP-Transkriptionsfaktor, ähnlich zu SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 18 oder SEQ ID NR: 20; Regenerieren von transgenen Pflanzen aus der transformierten Pflanzenzelle und Selektieren von transgenen Pflanzen auf gesteigertes Wurzelwachstum im Vergleich zu einer Kontrollpflanze der gleichen Spezies.
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