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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Pflanzenmolekularbiologie
und insbesondere ein symmetrisches stromaufwärts gelegenes Element und die
kombinierte Anordnung eines solchen Elements mit einem Promotor
innerhalb einer Promotorregion, derart, dass die Genexpression verstärkt wird.
Die Erfindung gestattet die verstärkte Expression von gewünschten
Strukturgenen sowohl in monokotyledonen als auch dikotyledonen Pflanzen.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
Genexpression umfasst eine Anzahl von Schritten, ausgehend von dem
DNA-Templat und schließlich
bis zum finalen Protein oder Proteinprodukt. Kontrolle und Regulation
der Genexpression können durch
zahlreiche Mechanismen erfolgen. Vom Start der Transkription eines
Gens wird in der Regel angenommen, dass er die vorherrschende Kontrolle
bei der Genexpression ist. Die Transkriptionskontrollen (oder Promotoren)
werden in der Regel zu relativ kurzen Sequenzen relegiert, die in
die 5'-flankierende
oder die stromaufwärts
gelegene Region des transkribierten Gens eingebettet sind. Es existieren
DNA-Sequenzen, die die Genexpression als Reaktion auf umweltbedingte
Stimulantien, Nahrungsverfügbarkeit
oder widrige Umstände, einschließlich Wärmeschock,
Anaerobiose oder die Gegenwart von Schwermetallen, beeinflussen.
Ferner existieren auch DNA-Sequenzen, die die Genexpression während der
Entwicklung oder gewebe- oder organspeziftsch steuern.
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Promotoren
enthalten die Signale für
die RNA-Polymerase, um die Transkription zu starten, so dass die
Proteinsynthese ablaufen kann. DNA-bindende nukleäre Proteine
wechselwirken spezifisch mit diesen Promotor-DNA-Erkennungssequenzen,
um die Bildung des Transkriptionskomplexes zu beschleunigen und um
gegebenenfalls den Genexpressionsprozess zu starten.
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Eines
der häufigsten
Sequenzmotive, das in den Promotoren von Genen vorkommt, die durch das
eukariotische RNA-Polymerase II(polII)-System transkribiert werden,
ist das "TATA"-Element, das vom Start der Transkription
stromabwärts
lokalisiert ist. Eukariotische Promotoren sind komplex und bestehen
aus Komponenten, die eine TATA-Box-Konsensussequenz bei etwa 35
Basenpaaren 5'-relativ
zu der Transkriptions-Startstelle oder Kappungsstelle, die als +1
definiert ist, einschließen.
Das TATA-Motiv ist die Stelle, an der das TATA-Bindungsprotein (TBP) als Teil eines
Komplexes von mehreren Polypeptiden (TFIID-Komplex) bindet und produktiv (direkt
oder indirekt) mit Faktoren wechselwirkt, die an andere Sequenzelemente
des Promotors gebunden sind. Dieser TFIID-Komplex rekrutiert wiederum
den RNA-Polymerase-II-Komplex so, dass er für den Start der Transkription
in der Regel 25–30
Basenpaare stromabwärts
von dem TATA-Element angeordnet ist und die Elongation beschleunigt
und somit RNA-Moleküle
produziert. Die Sequenzen um den Transkriptionsstart (genannt INR)
von einigen polII-Genen stellen anscheinend eine alternative Bindungsstelle
für Faktoren bereit,
die ebenfalls Elemente des TFIID-Komplexes rekrutieren und somit
die Transkription "aktivieren". Diese INR-Sequenzen
sind besonders in Promotoren relevant, denen die funktionellen TATA-Elemente
fehlen, die die Kern-Promotor-Bindungsstellen für eine mögliche Transkription bereitstellen.
Es wurde vorgeschlagen, dass Promotoren, die sowohl ein funktionelles
TATA- als auch INR-Motiv enthalten, in der Transkriptionsaktivität besonders
effizient sind (Zenzie-Gregory et al., 1992. J. Biol. Chem. 267:
2823–2830).
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In
den meisten Fällen
sind Sequenzelemente, die anders sind als das TATA-Motiv, für eine exakte Transkription
erforderlich. Solche Elemente liegen oft stromaufwärts von
dem TATA-Motiv,
und eine Unterserie kann Homologie zu der Konsensussequenz CCAAT
aufweisen.
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Es
wurde gefunden, dass weitere DNA-Sequenzen das Expressionsgesamtniveau
der nahen Gene erhöhen.
Eines der häufigeren
Elemente, die beschrieben worden sind, befindet sich weit stromaufwärts von der
Startstelle und weist anscheinend positions- und orientierungsunabhängige Merkmale
auf. Diese weit stromaufwärts
gelegenen Elemente wurden als Enhancer bezeichnet.
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Eines
der auf Grund ihrer Spezifitäten
weniger häufigen
Elemente sind Sequenzen, die mit spezifischen DNA-Bindungsfaktoren
wechselwirken. Diese Sequenzmotive sind als stromaufwärts gelegene
Elemente kollektiv bekannt, die in der Regel positions- und orientierungsabhängig sind.
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Viele
stromaufwärts
gelegene Elemente wurden in einer Anzahl von Pflanzenpromotoren
zunächst
auf der Grundlage von Funktions- und dann von Sequenzhomologien
identifiziert. Diese stromaufwärts
gelegenen Promotor-Elemente sind in der Art der Kontrolle weit reichend:
von umweltbedingten Reaktionen, wie Temperatur, Feuchtigkeit, Verletzungen
etc., Entwicklungsrichtungen (Keimung, Samenreifung, Blüte, etc.)
bis zu Rauminformationen (gewebespezifisch). Diese Elemente zeigen
anscheinend auch insofern eine Modularität als sie mit anderen Elementen
ausgetauscht werden können,
während
ihre charakteristische Kontrolle über die Genexpression aufrechterhalten
wird.
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Die
Promotoren sind in der Regel 5' oder
stromaufwärts
relativ zum Start der codierenden Region des entsprechenden Gens
und der gesamten Region angeordnet, die sämtliche Hilfselemente enthält, die
die Regulation beeinflussen, oder die absoluten Niveaus der Transkription
können
aus weniger als 100 Basenpaaren oder aus soviel wie 1 Kilobasenpaar
bestehen.
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Eine
Anzahl von Promotoren, die in Pflanzenzellen aktiv sind, wurde bereits
in der Literatur beschrieben. Diese umfassen Nopalinsynthase(NOS)-
und Octopinsynthase(OCS)-Promotoren (die von den Tumor-auslösenden Plasmiden
von Acrobacterium tumefaciens getragen werden). Die Blumenkohlmosaikvirus(CaMV)-Promotoren
19S und 35S, der lichtinduzierbare Promotor aus der kleinen Untereinheit
der Ribulosebisphosphatcarboxylase (ssRUBISCO), ein sehr reichlich
vorhandenes pflanzliches Polypeptid, und der Saccharosesynthasepromotor
sind ebenfalls eingeschlossen. Promotoren zur Verwendung in Pflanzen
sind auch in EP-A-0 459 643; WO-A-95 14098; und EP-A-0 342 926 offenbart.
Alle diese Promotoren wurden zur Erzeugung verschiedener Typen von
DNA-Konstrukten verwendet, die in Pflanzen exprimiert werden (siehe beispielsweise
die PCT-Veröffentlichung
WO84/02913, Rogers et al.).
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Zwei
Promotoren, die bei Pflanzenzellentransformationen bereits breit
eingesetzt wurden, sind diejenigen der Gene, die die Alkoholdehydrogenase,
AdhI und AdhII, codieren. Beide Gene werden nach dem Einsetzen der
Anaerobiose ausgelöst.
Mais-AdhI ebenso wie AdhII wurde kloniert und sequenziert. Die Bildung eines
chimären
AdhI-Gens Adh-CAT, das die AdhI-Promotor-Links
zu den Chloramphenicolacetyltransferase(CAT)-codierenden Sequenzen
und zum Nopalinsynthase(NOS)-3'-Signal
einschließt,
bewirkte bei geringen Sauerstoffkonzen trationen eine CAT-Expression
auf einem etwa 4-fach höheren
Niveau als unter Kontrollbedingungen. Die Sequenzelemente, die für eine anaerobe
Induktion des chimären
Adh-CAT notwendig sind, wurden ebenfalls identifiziert. Die Existenz
des anaeroben regulatorischen Elements (ARE) zwischen den Positionen –140 und –99 des
Mais-AdhI-Promotors bestand aus mindestens 2 Sequenzelementen, den
Positionen –133
bis –124
und den Positionen –113
bis 99, von denen festgestellt wurde, dass sie beide für eine Sauerstoffmangel-Expression
der Adh-CAT-Genaktivität
notwendig und hinreichend sind. Allerdings reagiert der Adh-Promotor auf die
Anaerobiose und ist kein konstitutiver Promotor, was seine Wirksamkeit
drastisch einschränkt.
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Ein
weiterer allgemein verwendeter Promotor ist der 35S-Promotor des
Blumenkohlmosaikvirus. Der (CaMV)-35S-Promotor ist ein dikotyledoner
viraler Promotor, allerdings steuert er die Expression von Genen, die
in die Protoplasten sowohl von Dikotyledonen als auch Monokotyledonen
eingeschleust wurden. Der 35S-Promotor ist ein sehr starker Promotor,
und dies spricht für
seine weit verbreitete Verwendung für eine Expression auf hohem
Niveau von Charakterzügen
in transgenen Pflanzen. Allerdings hat der CaMV-35S-Promotor auch
in mehreren landwirtschaftlich bedeutenden Gras-Pflanzen, wie Weizen,
eine relativ schwache Aktivität
gezeigt. Obgleich diese Promotoren in Dikotyledonen alle eine hohe
Expression ergeben, ergeben sich in Monokotyledonen keine hohen
Expressionsniveaus. Es besteht Bedarf an synthetischen Promotoren
und anderen Elementen, die die Expression in transformierten Monokotyledonen-Protoplastenzellen
auslösen.
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Eine
Hauptaufgabe der Erfindung besteht darin, synthetische Regulatorelemente
bereitzustellen, die die Expression von eingeschleusten Genen in
Pflanzenzellen und Pflanzengeweben verstärken.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, synthetische stromaufwärts gelegene
Enhancer-Elemente bereit
zu stellen, die die Aktivität
eines beliebigen Promotors weiterhin stimulieren können.
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Noch
eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Pflanzen, Pflanzenzellen
und Pflanzengewebe bereit zu stellen, die das erfindungsgemäße stromaufwärts gelegene
Element enthalten.
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Wieder
eine andere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung
von Vehikeln zur Transformation von Pflanzenzellen, einschließlich von
Virus- oder Plasmidvektoren und Expressionskassetten, die die erfindungsgemäßen stromaufwärts gelegenen
Elemente einschließen.
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Wieder
eine andere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Bakterienzellen,
die solche Vektoren zur Aufrechterhaltung, Replikation und Pflanzentransformation
umfassen.
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Weitere
Aufgaben der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung der
Erfindung hervor.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Nach
einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein synthetisches
stromaufwärts
gelegenes Element mit einer Sequenz von SEQ ID Nr. 2 bereit.
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Nach
einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung eine Expressionskassette
bereit, umfassend
einen Promotor
ein Strukturgen, das
mit der Promotorsequenz zweckorientiert verknüpft ist;
ein Polyadenylierungssignal;
und
ein synthetisches stromaufwärts gelegenes Element umfassend
die SEQ ID Nr. 2, das mit dem Promotor zweckorientiert verknüpft ist,
so dass die Expression verstärkt
wird.
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Der
Promotor kann ein synthetischer Promotor sein, der ein TATA-Motiv;
eine Transkriptions-Startstelle und eine Region zwischen dem TATA-Motiv
und der Transkriptions-Startstelle,
die zu mindestens 64% GC-reich ist, einschließt. Der Promotor kann die SEQ
ID Nr. 1 oder die SEQ ID Nr. 10 sein.
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Nach
einem dritten Aspekt stellt die Erfindung einen Nucleinsäurevektor
bereit, der die Expressionskassette des zweiten Aspekts umfasst.
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Nach
einem vierten Aspekt stellt die Erfindung einen Nucleinsäurevektor
bereit, umfassend
- (i) einen mit einem Strukturgen
zweckorientiert verknüpften
Promotor, wobei der Promotor eine synthetische DNA-Pflanzen-Promotorsequenz
ist, die folgendes umfasst:
ein TATA-Motiv;
eine Transkriptions-Startstelle;
und
eine Region zwischen dem TATA-Motiv und der Startstelle,
die zu mindestens 64% GC-reich ist; und
- (ii) ein stromaufwärts
gelegenes Element, das mit dem Promotor zweckorientiert verknüpft ist,
der die Sequenz SEQ ID Nr. 2 umfasst.
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In
dem Vektor des vierten Aspektes kann die Promotorsequenz die SEQ
ID Nr. 10 oder die SEQ ID Nr. 1 sein. Der erfindungsgemäße Vektor
kann ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor sein. Bei
einer Ausführungsform
umfasst der Vektor weiterhin ein Markergen zur Selektion von transformierten
Zellen, wie ein Antibiotikum-resistentes Gen. Der Vektor kann außerdem ein
Polyadenylierungssignal umfassen.
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Die
Erfindung stellt auch eine mit dem Nucleinsäurevektor des vierten Aspekts
transformierte prokariotische oder eukariotische Wirtszelle und
eine transgene Pflanze, die eine pflanzliche Zelle oder einen Ahnen davon
umfasst, der mit dem Vektor des vierten Aspekts transformiert worden
ist, sowie einen transformierten Samen einer solchen transgenen
Pflanze bereit.
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Die
Erfindung stellt ein stromaufwärts
gelegenes Element bereit, das die Fachwelt befähigt, zuverlässige hohe
Niveaus der Expression von in Zielzellen eingeschleusten Strukturgenen
zu erhalten. Das Element kann in Kombination mit einem synthetischen
Kernpromotor verwendet werden, der eine TATA-Box und einen Transkriptionsstart
umfasst. Weiterhin ist die Region "TATA bis Start" zu 64% oder mehr GC-reich. Eine Ausführungsform
des Kernpromotors ist in SEQ ID Nr. 1 gezeigt. Das stromaufwärts gelegene
Element kann in Kombination mit verschiedenen pflanzlichen Kernpromotorsequenzen
verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden der Kernpromotor
und das stromaufwärts
gelegene Element zusammen verwendet, um eine 10-fach höhere Expression
eines in monokotyledone transgene Pflanzen eingeschleusten Markergens
zu erhalten, als sie mit dem Mais-Ubiquitin-1-Promotor erhalten
wird.
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Der
Kernpromotor umfasst ein TATA-Motiv und eine GC-reiche "TATA-bis-Transkrip tionsstart"-Region (GC-Gehalt
64% oder höher
als er traditionsgemäß für tierische
Promotoren charakteristisch ist). Die Sequenz ist 5' von einem Strukturgen
angeordnet und beschleunigt die konstitutive Expression, die in
transgenen Pflanzenzellen nicht gewebespezifisch ist.
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Die
Erfindung umfasst auch eine Expressionskassette, die das stromaufwärts gelegene
Element, den synthetischen Kernpromotor, ein Strukturgen, dessen
Expression in Pflanzenzellen gewünscht
ist, und ein Polyadenylierungs- oder Stopsignal umfasst. Die Expressionskassette
kann in Plasmid- oder Virus-Vektoren zur Transformation von pflanzlichen
Protoplastenzellen eingeschlossen sein.
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Die
Erfindung umfasst auch transformierte Bakterienzellen zur Aufrechterhaltung
und Replikation des Vektors sowie transformierte monokotyledone
oder dikotyledone Zellen und schließlich transgene Pflanzen.
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Die
Erfindung umfasst auch eine Expressionskassette, die das erfindungsgemäße synthetische
stromaufwärts
gelegene Element 5' zu
einem induzierbaren pflanzlichen Promotor umfasst, der 5' zu einem Strukturgen
liegt. Diese Expressionskassette kann in Vektoren und Plasmiden,
wie zuvor beschrieben, ausgeführt sein.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
wird das synthetische stromaufwärts
gelegene Element in Kombination mit der synthetischen Kernpromotorsequenz
verwendet, um eine nicht gewebespezifische konstitutive Expression
des Genprodukts zu erreichen, das eine 10-fache Verstärkung des
Mais-Ubi-1-Promotors ist.
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BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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1 ist
eine Beschreibung einer typischen Nucleotidbasenanordnung eines
Kernpromotors, der die Consensus-Sequenzen der TATA- und INR-Motive
enthält,
die in pflanzlichen Promotoren vorhanden sind. A bezeichnet +1 der
transcribierten Region.
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2 ist
eine Beschreibung der vollständigen
Syn-II-Kernpromotorsequenz mit einem Beispiel eines pflanzlichen
Promotors. Beide sind am Hauptstart der Transkription (fett gedruckt)
ausgerichtet. Das TATA-Motiv ist unterstrichen. Der CaMV-35S-Promotor
ist gezeigt, wobei bei den Sequenzen der prozentuale GC-Gehalt in
Klammern gezeigt ist.
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3 ist
die DNA-Sequenz des stromaufwärts
gelegenen Elements Rsyn7. Die TGACG-Motive sind fett gedruckt.
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4 ist
eine Plasmidkarte einer Ausführungsform
der Erfindung, die den Syn-II-Kernpromotor
und Rsyn7-Elemente umfasst, die ein GUS-enthaltendes Konstrukt steuern.
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5 beschreibt
mehrere Schemata von erfindungsgemäßen synthetischen Promotoren,
die in transienten und stabilen Transformanten getestet wurden.
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6 ist
eine Beschreibung der Schnelltestdaten unter Verwendung der Plasmide,
die die erfindungsgemäße Promotorsequenzen
umfassen.
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7(A). Rsyn7::GUS (6086)-Aktivität in T0-Maispflanzen.
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7(B) zeigt ein Schema von VT-Stadium-Maispflanzen
unter Angabe der Stellen der Gewebeproben.
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8 beschreibt
die GUS-Aktivität
in Wurzelsegmenten einer Segregationspopulation von transgenen Mais-T1-Sämlingen,
die das Rsyn7::GUS(6086)- oder das UBI::GUS(3953)-Konstrukt enthalten.
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9 beschreibt die GUS-Expression von 3
synthetischen Promotoren in transgenen T0-Maispflanzen, einschließlich der
erfindungsgemäßen Promotorsequenzen
als Vergleich.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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In
der Beschreibung, die folgt, wird eine Anzahl von Begriffen ausgiebig
verwendet. Die folgenden Definitionen sind bereitgestellt, um Zweideutigkeiten
in Absicht oder Umfang ihrer Verwendung in der Spezifikation und
in den Ansprüchen
auszuschließen
und um das Verständnis
der Erfindung zu erleichtern.
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Ein
Strukturgen ist eine in Messenger-RNA (mRNA) transcribierte DNA-Sequenz,
die sodann in eine Sequenz von Aminosäuren translatiert wird, die
für ein
spezifisches Polypeptid charakteristisch ist.
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Ein
Promotor ist eine DNA-Sequenz, die die Transkription eines Strukturgens
steuert. Typischerweise liegt ein Promotor in der 5'-Region eines Gens,
proximal zu der Transkriptions-Startstelle
eines Strukturgens.
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Ein
Kern- oder Minimalpromotor enthält
die wesentlichen Nucleotidsequenzen für ein ordnungsgemäßes Funktionieren, einschließlich TATA-Box und Transkriptionsstart.
Durch diese Definition kann ein Kernpromotor in Abwesenheit von
spezifischen Sequenzen, die die Aktivität verstärken oder gewebespezifische
Aktivität übertragen
können,
eine nachweisbare Aktivität
aufweisen oder nicht. Beispielsweise besteht der Mais-Kernpromotor
aus etwa 37 Nucleotiden 5' von
der Transkriptions-Startstelle des SGB6-Gens, während der Blumenkohlmosaikvirus(CaMV)-35S-Kernpromotor
aus etwa 33 Nucleotiden 5' von
der Transkriptions-Startstelle
des 35S-Genoms besteht.
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ADH
bezieht sich allgemein auf ein Pflanzen-exprimierbares Alkoholdehydrogenase-Gen
und insbesondere auf das Alkoholdehydrogenase-Gen aus Mais.
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ADH
1-Promotor bezieht sich auf das DNA-Fragment, das die Region zwischen
den Nucleotidpositionen von etwa –1094 bis etwa –106 des
Alkoholdehydrogenase-Gens 1 aus Mais umspannt, oder auf ein homologes,
funktionell äquivalentes
Fragment. Die Sequenz ist nummeriert, wobei der Start der Transkriptionsstelle
nach der von Ellis et al. (1987), supra, veröffentlichten Korrektur als
+1 bezeichnet ist.
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"TATA bis Start" soll die Sequenz
zwischen TATA-Motiv und Start der Transkription bedeuten.
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Eine
synthetische DNA ist eine künstlich
erzeugte DNA-Sequenz, die nicht natürlich produziert wird und in
einen Organismus oder einen Vorfahren dieses Organismus zur Kontrolle
oder zur Expression eingeschleust werden muss.
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OCS-Element
bezieht sich auf das TGACG-Motiv, das aus dem Octopinsynthase-Gen,
den Histon-Genen, den Enzym-Genen für die Agropin-Biosynthese,
dem Mannopinsynthase-Gen, dem CaMV-35S-Gen, dem Histon-H3-Gen und
aus dem Nopalinsynthase-Gen identifiziert worden ist. Wie hier verwendet,
umfasst der Begriff jede Sequenz, die in der Lage ist, den ASF-1-Faktor
zu binden, wie in der US-Patentschrift Nr. 4,990,607 identifiziert.
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Ein
Enhancer ist ein DNA-Regulatorelement, das die Effizienz der Transkription
erhöhen
kann, ohne Rücksicht
auf den Abstand oder die Orientierung des Enhancers relativ zu der
Startstelle der Transkription.
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Der
Begriff Expression bezieht sich auf die Biosynthese eines Genprodukts.
Im Falle eines Strukturgens umfasst die Expression die Transkription
des Strukturgens in mRNA und sodann die Translation der mRNA in
eine oder mehrere Polypeptide.
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Ein
Klonierungsvektor ist ein DNA-Molekül, wie ein Plasmid, Cosmid
oder ein bakterieller Phage, der sich in einer Wirtszelle autonom
zu replizieren vermag. Klonierungsvektoren enthalten typischerweise
eine oder eine geringe Anzahl von Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen,
an denen Fremd-DNA-Sequenzen in terminierbarer Weise ohne Verlust
der essentiellen biologischen Funktion des Vektors inseriert werden können, sowie
ein Markergen, das zur Verwendung bei der Identifizierung und Selektion
von Zellen geeignet ist, die mit dem Klonierungsvektor transformiert
wurden. Markergene umfassen typischerweise Gene, die Tetracyclin-Resistenz,
Hygromycin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz bereitstellen.
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Ein
Expressionsvektor ist ein DNA-Molekül, das ein Gen umfasst, das
in einer Wirtszelle exprimiert wird. Typischerweise liegt die Genexpression
unter der Kontrolle von bestimmten Regulatorelementen, einschließlich von
Promotoren, gewebespezifischen Regulatorelementen und Enhancern.
Man sagt, ein solches Gen ist mit den Regulatorelementen "zweckorientiert verknüpft".
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Ein
rekombinanter Wirt kann jede beliebige prokariotische oder eukariotische
Zelle sein, die entweder einen Klonierungsvektor oder einen Expressionsvektor
enthält.
Dieser Begriff umfasst auch diejenigen prokariotischen oder eukariotischen
Zellen, die gentechnisch hergestellt wurden, um die klonierten Gene
im Chromosom oder Genom der Wirtszelle zu enthalten.
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Eine
transgene Pflanze ist eine Pflanze mit einer oder mehreren pflanzlichen
Zellen, die einen Expressionsvektor enthalten.
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Selbstverständlich können kleinere
Sequenzvariationen in der Sequenz oder den Fragmenten, die in dieser
Anmeldung verwendet werden oder offenbart sind, vorhanden sein.
Diese Variationen können
durch Standardtechniken bestimmt werden, um die Fachwelt zur Manipulation
und Ausnutzung der funktionellen Einheiten der Promotorelemente
zu befähigen,
die zur Steuerung des Starts der Transkription in dem Strukturgen notwendig
sind, worauf ein Pflanzen-exprimierbares Transkriptionsterminations(und
vielleicht ein Polyadenylierungs)-Signal folgen.
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Pflanzengewebe
umfasst differenzierte und undifferenzierte Gewebe von Pflanzen,
einschließlich
von, jedoch nicht beschränkt
auf, Wurzeln, Stämmen,
Sprossen, Blättern,
Pollen, Samen, Tumorgewebe und diversen Formen von Zellen und Kultur,
wie Einzelzellen, Protoplasten, Embryonen und Callusgewebe. Das
Pflanzengewebe kann Gewebe in der Pflanze oder in einem Organ, eine
Gewebe- oder Zellkultur sein.
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Der
Promotor, der in SEQ ID Nr. 1 und/oder SEQ ID Nr. 10 festgestellt
wird, kann zum Erhalt hoher Expressionsniveaus von Strukturgenen
eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße stromaufwärts gelegene Element
(SEQ ID NR. 2) kann in Kombination mit anderen Promotoren oder den
Promotoren der SEQ ID Nr. 1 und/oder SEQ ID Nr. 10 verwendet werden,
um die Transkriptionsniveaus in gentechnisch veränderten Pflanzen zu potenzieren.
Die Produktion eines gentechnisch veränderten Pflanzengewebes, das
ein Strukturgen unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen stromaufwärts gelegenen
Elements exprimiert, kombiniert die Lehren der vorliegenden Offenbarung
mit einer Vielzahl von Techniken und Arbeiten, die aus der Technik
bekannt sind. In den meisten Fällen
existieren für
jedes Stadium des Gesamtprozesses alternative Wege. Die Wahl der Wege
hängt von
den Variablen ab, wie dem Plasmidvektorsystem, das für die Klonierung
und den Einbau der rekombinanten DNA-Moleküle gewählt wird, der zu modifizierenden
Pflanzenspezies, dem bestimmten Strukturgen, den Promotorelementen
und den stromaufwärts
gelegenen Elementen, die verwendet werden. Fachleute sind in der
Lage, zum Erzielen von Funktionsfähigkeit entsprechende Alternativen
zu wählen
und einzusetzen. Die Kulturbedingungen zur Expression der gewünschten
Strukturgene und der kultivierten Zellen sind aus der Technik bekannt.
Wie ebenfalls aus der Technik bekannt, sind eine Reihe von sowohl
monokotyledonen als auch dikotyledonen Pflanzenspezies so transformierbar
und regenerierbar, dass die gesamten Pflanzen, die die gewünschten
Gene enthalten und exprimieren, unter der regulatorischen Kontrolle
der Promotormoleküle
und der erfindungsgemäßen stromaufwärts gelegenen
Elemente erhalten werden können.
Wie es der Fachwelt bekannt ist, kann die Expression in transformierten
Pflanzen gewebespezifisch und/oder spezifisch auf bestimmte Entwicklungsstadien
sein. Die verkürzte
Promotor- und Strukturgen-Selektion sind weitere Parameter, die
optimiert werden können,
um die gewünschte
pflanzliche Expression, wie sie der Fachwelt bekannt ist und hier
gelehrt wird, zu erreichen.
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Die
Wahl eines geeigneten Expressionsvektors hängt von dem Verfahren zur Einschleusung
des Expressionsvektors in Wirtszellen ab. Typischerweise enthält ein Expressionsvektor
(1) prokariotische DNA-Elemente, die einen bakteriellen Replikationsursprung
und einen Antibiotikum-Resistenzmarker codieren, um Wachstum und
Selektion des Expressionsvektors in einem bakteriellen Wirt bereitzustellen;
(2) DNA-Elemente, die den Start der Transkription kontrollieren,
wie einen Promotor; und (3) DNA-Elemente, die die Verarbeitung von
Transcripten kontrollieren, wie eine Transkriptionsterminations/Polyadenylierungssequenz;
und (4) ein Reportergen, das mit den DNA-Elementen zur Kontrolle
der Transkriptionsstart zweckorientiert verknüpft ist. Geeignete Reporter-Gene
umfassen β-Glucuronidase, β-Galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase,
Luciferase, grün
fluoreszierendes Protein (GFP) und dergleichen. Vorzugsweise ist
das Reporter-Gen entweder β-Glucuronidase
(GUS), GFP oder Luciferase. Die allgemeinen Beschreibungen von pflanzlichen
Expressionsvektoren und Reporter-Genen können bei Gruber et al., "Vectors for Plant
Transformation, in Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology", in Glich et al.,
(Hrsg. S. 89–119,
CRC Press, 1993) gefunden werden. Zudem sind GUS-Expressionsvektoren
und GUS-Genkassetten
von der Fa. Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, California
erhältlich,
während
Luciferase-Expressionsvektoren und Luciferase-Genkassetten von der
Fa. Promega Corp. (Madison, Wisconsin) erhältlich sind.
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Expressionsvektoren,
die genomische oder synthetische Fragmente enthalten, können in
Protoplasten oder in intakte Gewebe oder isolierte Zellen eingeschleust
werden. Vorzugsweise werden Expressionsvektoren in intaktes Gewebe
eingeschleust. Allgemeine Verfahren der Kultivierung von Pflanzengeweben
sind beispielsweise von Maki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA
into Plants" in
Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology, Glich et al., (Hrsg.
S. 67–88
CRC Press, 1993); und von Phillips et al., "Cell-Tissue Culture and In-Vitro Manipulation" in Corn & Corn Improvement,
3. Ausgabe Sprague et al., (Hrsg. S. 345–387) American Society of Agronomy
Inc. et al., 1988 bereitgestellt.
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Die
Verfahren zur Einschleusung von Expressionsvektoren in pflanzliches
Gewebe umfassen die direkte Infektion oder Co-Kultivierung von Pflanzenzellen
mit Agrobacterium tumefaciens, Horsch et al., Science, 227: 1229
(1985). Beschreibungen von Agrobacterium-Vektorsystemen und Verfahren zum Agrobacterium-vermittelten
Gentransfer sind von Gruber et al., supra, bereitgestellt.
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Vorzugsweise
werden die Expressionsvektoren unter Verwendung eines direkten Gentransfer-Verfahren, wie die
Mikroprojektil-vermittelte Abgabe, DNA-Injektion, Elektroporation
und dergleichen, in Mais oder andere Pflanzengewebe eingeschleust.
Mehr bevorzugt werden die Expressionsvektoren unter Anwendung der
Mikroprojektil-Mediumabgabe mit einer biolistischen Vorrichtung
in Pflanzengewebe eingeschleust.
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Die
erfindungsgemäßen Vektoren
können
nicht nur zur Expression von Strukturgenen, sondern auch beim Exon-Trap-Klonieren
oder Promotor-Trap-Verfahren zum Nachweis einer differenziellen
Genexpression in den Gewebe-Varietäten verwendet werden, K. Lindsey
et al., 1993 "Tagging
Genomic Sequences That Direct Transgene Expression by Activation
of a Promoter Trap in Plants",
Transgenic Research 2: 33–47.
D. Auch & Reth,
et al., "Exon Trap
Cloning: Using PCR to Rapidly Detect and Clone Exons from Genomic
DNA Fragments",
Nucleic Acids Research, Bd. 18, Nr. 22, S. 6743.
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Der
Promotor, der mit dem stromaufwärts
gelegenen erfindungsgemäßen Element
geeignet ist, beruht zum Teil auf der Entdeckung, dass eine GC-reiche "TATA-bis-Start"-Region in einem
Pflanzenpromotor als ein sehr starker, nicht gewebespezifischer
Kern-Promotor wirkt, der die konstitutive Expression in Pflanzenzellen auslöst.
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Das
TATA-Element der Pflanzenpromotoren von polII-Genen besitzt allgemein
die Sequenz TATA(A/T)A(A/T)A, SEQ ID Nr. 3, wohingegen die Konsensus-Sequenz
des Trans kriptionsstarts aus der Sequenz 5' ...TYYTCAT(A/C)AA...3'. SEQ ID Nr. 3, besteht,
wobei A die Starterbase für
die Transkription bezeichnet. Die typische Pflanzenpromotorsequenz
ist in 1 abgebildet.
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Von
Sequenzen, die in das TATA-Element und den Start der Transkription
eingreifen, wurde gezeigt, dass sie bei der Transkriptionsaktivierungseffizienz
eine wesentliche Rolle spielen. Vom TATA-Bindungsprotein wurde gezeigt,
dass es mit der kleinen Rille der Doppelhelix wechselwirkt, die
an das TATA-Motiv bindet und es in Richtung der Seite der großen Rille
biegt (Kim, et al., 1993, Nature, 365: 512–520). Somit folgt, dass die Sequenzen
stromabwärts
des TATA-Motivs, die diese Feststellung nahe legen, die Effizienz
der stabilen Transkriptionskomplexbildung und schließlich die
Expression beeinflussen. Die Überprüfung der "TATA-bis-Start"-Regionen von Pflanzenpromotoren
zeigen ein wesentlich höheres
Niveau an AT-reichen Sequenzen, die die potentielle kleine Rillenkompression
bewirken (Yaurawaj et al Biological Abstracts Bd. 47, Kap. 8, Ref.
144712, "Consensus
Sequences for Plant Minimal Promoters" Annual Meeting of the American Society
of Plant Physiologists, 29. Juli–2. August 1995, Plant Physiology
108 [Ergänzungsband
2] 1995, 114). Im Allgemeinen zeigen tierische Promotoren eine GC-reiche "TATA-bis-Start"-Sequenz, die eine
große
Rillenkompression bewirkt, was nahe legt, dass der durchschnittliche
pflanzliche und tierische Kernpromotor-Transkriptionskomplex eine
etwas verschiedene "TATA-bis-Start"-Struktur mit der
entsprechenden Sequenzdifferenz erkennt und damit wechselwirkt.
Der Anmelder hat recht überraschend
gefunden, dass ein GC-reicher tierischer Typ von synthetischem Promotor
sehr gut in Pflanzen wirkt.
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Obwohl
nicht der Wunsch besteht, auf eine Theorie festgelegt zu werden,
ist es möglich,
dass das AT-reiche TATA-Motiv, das in einer GC-reichen Sequenz vorhanden
ist, sich dem TATA-bindenden Komplex durch eine scharfe Demarkation
der TATA-Sequenz von GC-reich nach AT-reich prominenter präsentieren könnte. Das "gebundene" TATA-Motiv würde mit
dem TATA-bindenden Komplex stärker
wechselwirken. Dies würde
die beginnende Transkriptionseffizienz durch Verschiebung der Gleichgewichte
des Bindens zu einer stabilisierteren Form verbessern, wohingegen
die "nicht gebundene" Version, d. h. mit
mehr AT-reichen statt TATA-Motiv-flankierenden Sequenzen möglicherweise
verrutschen oder auf und ab wandern könnte und die Effizienz des
Bindens wirksam herabsetzen würde.
Es sind wenige Daten hinsichtlich dieser Region der pflanzlichen
Promotoren verfügbar,
mit Ausnahme von Rohdeletionen und einigen Punktmutationen. Die
offensichtliche Konstruktion eines synthetischen Kernpromotors für die pflanzliche
Expression würde
die AT-reiche "TATA-bis-Start"-Sequenz einschließen. Allerdings wird auf der
Grundlage des "gebundenen" Mechanismus von dem
erfindungsgemäßen Mechanismus
postuliert, dass ein effizienterer Kernpromotor ein in eine GC-reiche Sequenz
eingebettetes TATA-Motiv zeigen würde.
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2 beschreibt
die Syn-II-Kernpromotorsequenz, SEQ ID Nr. 1, wobei die Beispiele
für die
pflanzlichen Kernpromotoren am Hauptstart der Transkription ausgerichtet
sind. Ein weiteres Beispiel eines Pflanzenpromotors, 35S von CaMV
(SEQ ID Nr. 4), ist mit den GC-reichen
Sequenzen in Prozent, die rechts in Klammern gezeigt sind, gezeigt.
Die Syn-II-Kernsequenz
zeigt keine signifikante Sequenzhomologie mit Sequenzen aus öffentlichen
Sequenzdatenbasen.
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Die
synthetische Kernpromotorsequenz Syn II zeigt eine zu 64% GC-reiche "TATA-bis-Start"-Sequenz, die von
der zu 40% GC-reichen Gesamtsequenz verschieden ist, die in den
traditionellen Pflanzenpromotoren (beispielsweise CaMV35S) vorhanden
ist. Der natürlich
vorkommende und isolierte UBI-Kernpromotor, der sehr hohe Aktivitätsniveaus
potenziert, zeigt eine zu 64% GC-reiche "TATA-bis-Start"-Sequenz, die tierischen Promotoren ähnlicher
ist. Solche Beispiele lieferten, im Gegensatz zu dem derzeitigen
Dogma der pflanzlichen Kernpromotoren, den Antrieb für die Konstruktion
einer sehr GC-reichen "TATA-bis-Start"-Sequenz zur effizienten Transkription.
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Somit
umfasst die synthetische pflanzliche Kernpromotorsequenz ein TATA-Motiv
und eine "TATA-bis-Start"-Region, die zu 64%
oder mehr GC-reich ist. Der Promotor kann Restriktionsendonucleotid-Zielstellen
zum leichteren Klonieren umfassen. Die Sequenz kann diejenige der
SEQ ID Nr. 1 sein. Wie es der Fachwelt bekannt ist, können innerhalb
von SEQ ID Nr. 1 mehrere Basentransversionen auftreten, die den
prozentualen GC-Gehalt beibehalten und innerhalb des Umfangs der
Erfindung sein sollen, SEQ ID Nr. 10. Beispielsweise könnte Guanine
durch Cytosine und umgekehrt ersetzt werden, ohne Beeinflussung
der Gesamteffizienz des Promotors, solange der prozentuale GC-Gehalt
beibehalten wird.
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Die
Erfindung umfasst ein synthetisches stromaufwärts gelegenes Element, das
5' zu einem natürlich vorkommenden
oder synthetischen Promotor angeordnet sein kann, zur Verwendung in
Pflanzen, insbesondere bei der Mais-Genexpression.
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Aus
der Aktivität
von zahlreichen Promotoren wurden grundlegende Elemente (Bindungsstellen)
definiert. Diese umfassen beispielsweise AT-reiche Regionen aus
Hitzeschock-Promotoren
und ASF-1-Bindungsstellen(AS-1)-Elementen, die in der Octopinsynthase
(OCS) vorhanden sind, und Blumenkohlmosaikvirus-Promotoren. AS-1
ist eines der besser bekannten stromaufwärts gelegenen Elemente, und
seine Bindungssequenz (OCS-Element) ist in vielen konstitutiven
pflanzlichen Promotoren vorhanden, wie in CaMV35S-, A. tumefaciens-,
NOS- und OCS-Weizenhiston-Promotoren. Das OCS-Element wurde zuerst
als Enhancer-Element
in dem Promotor des OCS-Gens isoliert, wo es als 16-Basenpaar-Palindromsequenz
identifiziert (Ellis et al., 1987 MBOJ 6: 11–16), jedoch auf seine wesentlichen
Merkmale als TGACG-Motiv reduziert wurde. Siehe Katagiri, U.S. Patent
Nr. 4,990,607.
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Das
erfindungsgemäße stromaufwärts gelegene
Element weist eine 71%ige Homologie mit dem Promotor-Enhancer-Element
auf, das in der US-Patentschrift 5,023,179 von Lam et al. offenbart
ist. Die beiden Sequenzen sind in ihren das TGACG-Motiv umgebenden
Flankierungssequenzen recht unterschiedlich, wobei sich gezeigt
hat, dass die Regionen das Niveau der Transkriptionsverstärkung beeinflussen.
Die Transkriptions-verstärkende
Aktivität
des OCS-Elements ist mit dem in vitro Binden eines Transkriptionsfaktors
korreliert. Ähnliche
Elemente wurde auch in den Promotorbereichen von 6 anderen cDNA-Genen,
die an der Opinsynthese beteiligt sind, und in 3 pflanzlichen viralen
Promotoren, einschließlich
des CaMV-35S-Promotors (Bouchez et al. 1989) supra, identifiziert.
Es hat sich gezeigt, dass die Elemente den OCS-Transkriptionsfaktor
in vitro binden und die Transkription in Pflanzenzellen verstärken.
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Bei
Tabak hat sich gezeigt, dass ein DNA-bindender Faktor, TGA1, mit
dem AS-1-Element, entweder allein oder in Verbindung mit anderen
Promotorelementen, spezifisch wechselwirkt. Katagiri et al. 19891,
Nature 340: 727–730.
Es wurde auch gezeigt, dass dieser Faktor in Tabakpflanzen Wurzel-präferiert
exprimiert wird. Kernpromotoren mit einer oder zwei Kopien des stromaufwärts gelegenen
OCS-Elements neigen zur Potenzierung der Genexpression, wohingegen
4 oder mehr Wiederholungssequenzen dieses Elements eine mehr oder
weniger konstitutive, obgleich relativ zu intakten 35S-Promotoren
geringe, Aktivität
erzeugen.
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Somit
umfasst die Erfindung ein synthetisches stromaufwärts gelegenes
Element, das mit einem Kernpromotor, wie hier offenbart, oder anderen
Kernpromotoren verwendet werden kann, um die Genexpression zu verstärken. Das
Element umfasst 3 OCS-artige Motive und neue intervenierende Sequenzen,
die die Genexpression potenzieren.
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3,
SEQ ID Nr. 2, zeigt die vollständige
Sequenz von (Rsyn7), des synthetischen stromaufwärts gelegenen Elements, das
mindestens 3 TGACG-SEQ ID Nr. 5-OSC-artige Motive umfasst, die in
Großbuchstaben
angegeben sind.
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Sequenzen,
die viele Elemente flankieren, wie das TGACG-SEQ ID Nr. 5-Motiv,
haben gezeigt, dass sie tiefgreifende Auswirkungen auf die Bindungsaffinitäten der
DNA-Bindungsfaktoren
besitzen und somit eine ebenso wichtige Rolle wie die zentralen
Motive selbst spielen. (Burrows et al., 1992, Plant Molecular Biology 19:
665–675,
Shindler et al., 1992, Plant Cell 4: 1309–1319, Foster et al., 1994,
FASEBJ 8: 192–200).
Die neuen Sequenzen, die die TGACG-Motive in dem Rsyn7-Promotor
flankieren, wurden bestimmt und liefern eine eindeutige Verstärkung der
Trancriptionsaktivität
mit verschiedenen Promotoren, insbesondere bei Verwendung mit dem
Syn-II-Kernpromotor.
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Das
stromaufwärts
gelegene Rsyn7-Element wurde stromaufwärts vom Syn-II-Kernpromotor
kloniert, der ein GUS-Konstrukt steuert und in transgenen Maispflanzen
potenzierte Niveaus der GUS-Aktivität aufweist, die etwa 10 Mal
besser sind als der Ubiquitin-Promotor, der bisher stärkste Maispromotor.
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Die
folgenden Beispiele sind nur zu Erläuterungszwecken angegeben und
sollen den Umfang oder die Anwendung der vorliegenden Erfindung
keinesfalls einschränken.
Die Fachwelt weiß,
dass viele Permutationen erreicht werden können und in der Tat absichtlich
im Umfang der Erfindung liegen. Sämtliche Literaturzitate in
der Spezifikation sind hiermit ausdrücklich unter Bezugnahme mit
umfasst.
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BEISPIEL 1
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Plasmide
wurden unter Verwendung der multiplen Klonierungsstelle von pBlueScriptIIKS+
von der Fa. Stratagene konstruiert (zur leichteren Klonierung der
verschiedenen Kombination von Elementen). Oligonucleotide, die die
Sequenzen der Elemente enthalten, wurden an den Enden mit Restriktionsendonucleasestellen synthetisiert.
Somit konnten die Elemente nach Bedarf addiert oder entfernt und
ersetzt werden. GUS und Luciferase wurden als Reporter-Gene eingesetzt.
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Für die schnellen
Tests wurde Plasmid-DNA in intakte 3 Tage alte Maissämlinge durch
Teilchenbombardement eingeschleust. 16 h nach der Inkubation bei
25°C im
Dunklen wurde die Expression durch Messen der GUS-Enzymaktivität in Wurzel-
und Sprossenextrakt für
jeden Sämling
getestet, um zu bestimmen, ob sich eine Gewebe-präferierte
Expression zeigte. Die GUS-Aktivität wurde unter Verwendung eines
GUS-Licht-Testkit von der Fa. Tropix (47 Wiggins Avenue, Bedford,
MA 01730) gemessen.
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Konstrukte,
die hohe Expressionsniveaus ergaben, wurden in eine Zelllinie eingeschleust,
um stabile Transformanten zu erzeugen. Die stabilen Transformanten
(T0) wurden durch PCR geprüft,
um die Gegenwart des GUS-Gens durch den MUG(4-Methylumbelliferylglucuronid)-Test zu bestimmen,
um das Aktivitätsniveau des
erzeugten GUS-Proteins zu quantifizieren. Wenn die Pflanzen zur
Umsiedlung in das Gewächshaus
bereit waren, wurden sie mit X-gluc histochemisch getestet, um zu
bestimmen, wo das GUS-Produkt synthetisiert wurde. Pflanzen, die
bevorzugte Expressionsniveaus zeigten, wurden im Gewächshaus
bis zum V6-Stadium wachsen gelassen.
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BEISPIEL 2
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Konstruktion von Plasmiden,
die den Syn-II-Kernpromotor enthalten
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Es
wurden die molekularbiologische Standardtechniken nach Maniantis
et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. durchgeführt. Sämtliche Plasmide,
die bei der Erfindung verwendet werden, können nach den Anweisungen in
der Beschreibung von einem Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren unter
Einsatz von in der Technik leicht verfügbaren Materialien hergestellt
werden.
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Die
Oligonucleotide N306 SEQ ID Nr. 6 TCGACACTGC AGCTCTAGGG ATGGTAGCGC
AGGGTGCGTA GGTACGTATT TATAGCCGCT CGAGTG-3' und N307 SEQ ID Nr. 7 GATCCACTCG AGCGGCTATA AATACGTACC
TACGCACCCT GCGCTACCAT CCCTAGAGCT GCAGTG-3' wurden nach den Anweisungen auf einem
automatischen DNA-Synthesegerät
(wie Applied Biosystems Inc. DNA Synthesizer (Model 380B)) synthetisiert.
Diese automatischen Synthesegeräte
sind im Handel erhältlich.
Sodann wurden die Oligonucleotide mit dem BamHI-Fragment des pBlueScriptIIKS+-Plasmid,
umfassend das β-Glucuronidase-Gen,
das von der Mais ADH1 Intron-1-Intronregion unterbrochen ist, ligiert.
Eine Karte eines Plasmids, die sowohl den Syn-II-Kernpromotor als
auch das stromaufwärts
gelegene Element umfasst, ist wie in 4 offenbart.
Mehrere andere Ausführungsformen
sind bei anderen Plasmiden gezeigt, die in 5 beschrieben
sind. Die Plasmidnummern sind rechts von jedem Promotordiagramm
gezeigt, wobei die entsprechende Legende unterhalb der Diagramme
angebracht ist. Das obere Diagramm zeigt die komplette transplantierte
Transkriptionseinheit, wobei sich die anschließenden Diagramme auf die auffallenden
Unterschiede zwischen den 35S- und Syn-II-Kernpromotoren konzentrieren.
Die Legende zeigt die Anzahl und Natur der verschiedenen Promotor-Subelemente,
die Sequenz, falls relativ kurz, die Quelle des Elements und die
Position relativ zum Start der Transkription.
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Die
Sequenz des Kernpromotors besteht aus 35 Basenpaaren, mit Enzymstellen
stromaufwärts
einer TATA-Box und mit einem Transkriptionsstart 10 bis 15 Basenpaaren
stromabwärts.
Die stromaufwärts
gelegenen Elemente (Gal 4-Bindungsstellen, Rsyn, AT-GBL etc.) wurden
mit der Kernsequenz mit dem ADHI-Intron und verschiedenen Markergenen
(LUC oder GUS) kondensiert und erwiesen sich sowohl in Schnelltests (6)
als auch in Rsyn-stabil transformierten Pflanzen (7)
als funktionell.
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BEISPIEL 3
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Konstruktion des stromaufwärts gelegenen
Elements Rsyn7, das mit dem Syn-II-Kernpromotor kondensiert ist, was die
Plasmide P5903 und P6086 ergibt
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Oligonucleotide
zur Konstruktion der Rsyn7-Promotor-Subelemente N1965: (SEQ ID Nr.
8) GATCCTATGA CGTATGGTAT GACGTGTGTT CAAGATGATG ACTTCAAACC TACCTATGAC
GTATGGTATG ACGTGTGTCG ACTGATGACT TA und N1966: (SEQ ID Nr. 9) GATCTAAGTC
ATCAGTCGAC ACACGTCATA CCATACGTCA TAGGTAGGTT TGAAGTCATC ATCTTGAACA
CACGTCATAC CATACGTCA TAG wurden wie bereits beschrieben synthetisiert
und in die pBlueScriptIIKS+-Plasmid-BamHI-Stelle kloniert. Die Oligonucleotide
wurden anneliert und in ein P3398-Plasmid stromaufwärts von
der Syn-II-Kernsequenz kloniert und ergaben auf Grund spontaner
Deletionen mehrere Ver sionen der ursprünglichen Rsyn7-Sequenz. Die Rsyn7-2-Version
umfasste eine Einzelbasendeletion, was ein 3-fach reiteratives TGACG-Motiv
stromaufwärts des
Syn-II-Kernpromotors (Rsyn7::LUC, P5903) ergab. Die LUC-Kodierungssequenz
wurde durch die GUS-Kodierungssequenz
ersetzt, um das Rsyn7-GUS-Konstrukt P6086 zu erzeugen. P6086 wurde
später
in transgenen Mais eingebaut und ergab in 4 der 6 aktiven Ereignisse,
die geprüft
wurden, hohe Niveaus der konstitutiven Aktivität (7).
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Die
Nachkommenschaft von T0-Pflanzen aus mehreren Transformationsereignissen
wurde überprüft, wobei
die GUS-Aktivität
von 1 bis 400 ppm (Mikrogramm GUS-Enzym/GFW in Wurzelgewebe von
7 Tage alten Keimlingen) reichte, 8. Diese
T0- und T1-Pflanzen erzeugten im Allgemeinen eine 4- bis 10-fach
höhere GUS-Aktivität als Pflanzen
mit dem Ubiquitin::GUS-Reporter-Gen.
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Somit
kann aus dem Vorgenannten gesehen werden, dass die Erfindung mindestens
alle ihrer Aufgaben erfüllt.
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BEISPIEL 4
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Transformation und Expression
mit dem Syn-II-Kernpromotor- und/oder dem stromaufwärts gelegenen Rsyn7-Element
-
Unter
Verwendung von Bombardement-Schnelltests wurde die Syn-II-Kernpromotorsequenz
mit der 35S-Kernsequenz, entweder allein oder in Verbindung mit
zahlreichen Aktivierungselementen, verglichen. 6 ist
eine Beschreibung der Schnelltestdaten unter Verwendung der Plasmide,
die die erfindungsgemäßen Promotorsequenzen
umfassen, und zeigt eine transiente GUS- oder LUC-Aktivität in 3 Tage
alten Maiswurzeln oder BMS-Callus, bombardiert mit dem chimären Promotor::GUS-
oder -LUC-Konstrukten. Die ca. 33 CaMV-35S-Syn-II-Kernpromotorversionen
der synthetischen Promotor::GUS (oder LUC)-Konstrukte wurde in 3
Tage alte Maiswurzeln (oder in kultivierte BMS-Kalli, wie im Folgenden
beschrieben) bombardiert und 20 h nach dem Bombardement auf die
Enzymaktivität
getestet. Die gezeigten Daten sind die rohen Enzymeinheiten einer
Kompilierung von mindestens 3 Experimenten und wurden auf Grund
der von Natur aus vorhandenen Variabilität der Schnelltests in keiner
Weise normalisiert. Die Kontrollplasmide 1654 und 3537 sind die LUC-Konstrukte,
die in Mais-BMS-Calli getestet wurden. Es besteht ein etwa 4- bis
20-facher Unterschied in der tran sienten Aktivität zwischen den 35S- und Syn-II-Kern-Versionen.
Die Y-Achse ist in der Log-Skala.
Beide Kernpromotoren steuerten ein GUS-enthaltendes Konstrukt (4 und 5)
und erzeugten ein basales Aktivitätsniveau (6).
Wenn allerdings Aktivatorelemente stromaufwärts des TATA-Motivs angeordnet
waren, stellte der Syn-II-Kern in der Regel höhere Aktivitätsniveaus
(2 bis 4-fach besser) in Maiszellen bereit als wenn die Aktivatorelemente
stromaufwärts
des 35S-Kerns angeordnet waren (6).
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Es
hat sich gezeigt, dass die Syn-II-Kernsequenz die Aktivität in stabil
transformierten Pflanzen potenziert. Mit bestimmten Aktivatorsequenzen
stromaufwärts
des TATA-Elements erreichten die Aktivitätsniveaus in stabil transformierten
Maispflanzen außerdem
Niveaus, die 10-fach größer waren
als die Mais-Ubiquitin-Konstrukte, die extrem hohe Aktivitätsniveaus
erzeugen.
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Die 7 und 8 zeigen
die GUS-Aktivitätsniveaus
aus isolierten Geweben der VT-Stadium-T0-Pflanzen
bzw. Wurzelgewebe aus T1-Sämlingen.
Die Daten zeigen, dass diese Maissequenz an der Potenzierung sehr
hoher Aktivitätsniveaus
als funktioneller Partner für
die aktiven chimären
Promotoren teilhaben kann. 7 zeigt
die Rsyn7::GUS (6086)-Aktivität in T0-Maispflanzen.
VT-Stadium-Pflanzen mit Ähren, 3
bis 8 Tage nach der Bestäubung,
wurden zerkleinert und auf die GUS-Aktivität getestet. 7A beschreibt die
GUS-Expression in
den bezeichneten Geweben. 7B beschreibt
ein Schema von Maispflanzen, wobei die Stellen der Messung angegeben
sind. Es wurden Pflanzen aus T0-Ereignissen getestet, die einen
Bereich an Aktivitäten
mit dem Rsyn7-Promotor zeigen. Wiederum ist die Log-Skala angegeben.
Auf der rechten Seite des Graphen ist zu Vergleichszwecken der Aktivitätsbereich
für UBI::GUS-Pflanzen
angegeben. Diese Daten zeigen, dass der Rsyn7-Promotor die Aktivität auf das
10-Fache über
die Niveaus des Ubiquitin-Promotors potenzieren kann und doch eine
geringe Gewebepräferenz
aufweist, was den Rsyn7 als starken konstitutiven Promotor geeignet
macht.
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8 beschreibt
die GUS-Aktivität
in Wurzelsegmenten einer segregierenden Population von transgenen
Mais-T1-Sämlingen,
die das Rsyn7::GUS (6086)- oder das UBI::GUS (3953)-Konstrukt enthalten. 1-cm-Wurzelsegmente
aus 6–7
Tage alten transgenen Maissämlingen
wurden zerschnitten, gewogen und unter Verwendung eines GUS-Licht-Kit
getestet. Die Aktivität
ist in ppm Frischgewicht angegeben. Die Wurzelaktivität von mehreren
T1-Pflanzen, in denen der Rsyn7::GUS-Promotor zugegen ist, zeigt
eine höhere
Aktivität
als viele der Aktivitätsniveaus,
die durch den UBI-Promotor erzeugt wurden. Dies steht mit den Daten
aus der transgenen T0-Pflanze im Einklang. Die Aktivitätsniveaus
in Rsyn7::GUS-enthaltenden jungen Blättern sind viel höher als
die Aktivitätsniveaus
von jungen UBI::GUS-enthaltenden Blättern (Daten nicht gezeigt).
Es wurde gezeigt, dass die Syn-II-Kernsequenz mit einer Vielzahl
von stromaufwärts
gelegenen Elementen, einschließlich
von Gal 4-Bindungsstellen, Rsyn7-Elementen, GBL-Elementen etc.,
gut funktioniert.
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9 zeigt die GUS-Expression von 3 synthetischen
Promotoren in transgenen T0-Maispflanzen.
Die zerschnittenen Gewebe (7B) aus
transgenen VT-Stadium-T0-Pflanzen,
die Rsyn7(Rsyn)-, Atsyn- oder Syn-II-Kern(syn-Kern)-Promotor::GUS-Konstrukte
enthalten, wurden quantitativ auf die GUS-Aktivität getestet.
Jeder Kreis stellt einen Mittelwert der Gewebeaktivität von transgenen
Maispflanzen aus einem einzigen Transformationsereignis dar. Das
TGACG-Motiv entspricht der Rsyn7-Sequenz, und das "AT-com"-Motiv bezieht sich
auf das AT-artige Konsensus-Compositelement Atcom von W. Gurley,
et al., 1993. In: Control of Plant Gene Expression. Hrsg. Desh Pal
Verma. CRC press, Boca Raton, FL., S. 103–123. Syn-Kern bezieht sich
auf die Syn-II-Kern-Promotorsequenz, die das TATA-Element und den Start
der Transkription enthält.
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