DE69936980T2

DE69936980T2 - Synthetische promotoren

Info

Publication number: DE69936980T2
Application number: DE69936980T
Authority: DE
Inventors: Benjamin A. Des Moines BOWEN; Wesley B. Urbandale BRUCE; Guihua Urbandale LU; Lynne E. Polk SIMS; Laura A. Akeny TAGLIANI
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1998-02-24
Filing date: 1999-02-23
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2019-02-24
Also published as: ATE371742T1; US6072050A; DE69936980D1; EP1056875B1; EP1862552A3; AU2781599A; AU751402B2; WO1999043838A1; ES2292234T3; CA2314598A1; CA2314598C; NZ506182A; EP1056875A1; US6555673B1; EP1862552A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Pflanzenmolekularbiologie und insbesondere die verstärkte Expression von gewünschten Strukturgenen sowohl in monocotyledonen als auch in dicotyledonen Pflanzen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Genexpression umfasst eine Anzahl von Stufen, ausgehend von der DNA-Matrize bis schließlich zum endgültigen Protein oder Proteinprodukt. Die Kontrolle und Regulation der Genexpression kann durch eine Anzahl von Mechanismen erfolgen. Die Initiation der Transkription eines Gens wird allgemein als die vorherrschende Kontrolle der Genexpression angesehen. Die Transkriptionskontrollen (oder Promotoren) werden allgemein auf relative kurze Sequenzen degradiert bzw. zurückgedrängt („relegated"), die in die 5'-flankierende oder stromaufwärtige Region des transkribierten Gens eingebettet sind. Es gibt DNA-Sequenzen, die die Genexpression in Reaktion auf Umweltreize, Nährstoffverfügbarkeit oder nachteilige Bedingungen, einschließlich Hitzeschock, Anaerobiose oder das Vorhandensein von Schwermetallen, beeinflussen. Es gibt auch DNA-Sequenzen, die die Genexpression während der Entwicklung oder in einem Gewebe oder auf eine organspezifische Weise kontrollieren.
Promotoren enthalten die Signale für die RNA-Polymerase zum Beginnen der Transkription, so dass die Proteinsynthese fortschreiten kann. Die DNA-Bindung, nukleäre Proteine, Wechselwirken auf spezifische Weise mit diesem zugehörigen („cognate") Promotor-DNA-Sequenzen, um die Bildung des Transkripti onskomplexes zu fördern und schließlich den Genexpressionsvorgang zu initiieren.
Eines der verbreitetsten Sequenzmotive, die in den Promotoren von Genen, die durch das eukaryotische RNA-Polymerase II (polII) -System transkribiert werden, vorhanden ist, ist das „TATA"-Element, welches sich stromaufwärts des Transkriptionsbeginns befindet. Eukaryotische Promotoren sind komplex und bestehen aus Komponenten, die eine TATA-Box-Konsensussequenz bei etwa 35 Basenpaaren in 5', relativ zu der Transkriptionsstartstelle oder CAP-Stelle, die als +1 definiert ist, einschließen. Das TATA-Motiv ist die Stelle, an der das TATA-Bindeprotein (TBP) als Teil eines Komplexes aus mehreren Polypeptiden (TFIID-Komplex) bindet und in produktiver Weise (direkt oder indirekt) mit Faktoren wechselwirkt, die an andere Sequenzelemente des Promotors gebunden sind. Dieser TFIID-Komplex wiederum rekrutiert den RNA-Polymerase II-Komplex, der zum Beginn der Transkription allgemein 25 bis 30 Basenpaare stromabwärts des TATA-Elements zu positionieren ist und die Elongation fördert, wodurch RNA-Moleküle produziert werden. Die Sequenzen um den Beginn der Transkription (mit INR bezeichnet) von manchen polII-Genen scheinen eine Ausweichbindungsstelle für Faktoren, die ebenfalls Mitglieder des TFIID-Komplexes rekrutieren und somit die Transkription „aktivieren", darzustellen. Diese INR-Sequenzen sind besonders bedeutsam in Promotoren, denen funktionelle TATA-Elemente, die Kernpromotorbindungsstellen für eine letztendliche Transkription bereitstellen, fehlen. Es ist vorgeschlagen worden, dass Promotoren, die sowohl ein funktionelles TATA- als auch ein funktionelles INR-Motiv enthalten, hinsichtlich der Transkriptionsaktivität am wirksamsten sind (Zenzie-Gregory et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:2823–2830).
In den meisten Fällen sind (weitere) Sequenzelemente außer dem TATA-Motiv für eine akkurate Transkription erforderlich.
Derartige Elemente sind oft stromaufwärts des TATA-Motivs lokalisiert und eine Teilmenge kann eine Homologie zur Konsensussequenz CCAAT aufweisen.
Es ist festgestellt worden, dass andere DNA-Sequenzen den insgesamten Level der Expression der nahegelegenen Gene erhöhen. Eines der verbreiteteren Elemente, die beschrieben worden sind, befindet sich weit stromaufwärts von der Initiationsstelle und scheint positions- und orientierungsunabhängige Merkmale aufzuweisen. Diese weit stromaufwärtigen Elemente sind als Enhancer bezeichnet worden.
Eines aufgrund von deren Spezifitäten weniger verbreiteten Elemente sind Sequenzen, die mit spezifischen DNA-bindenden Faktoren Wechselwirken. Diese Sequenzmotive sind kollektiv als stromaufwärtige Elemente bekannt, die üblicherweise positions- und orientierungsabhängig sind.
In einer Zahl von Pflanzenpromotoren sind viele stromaufwärtige Elemente, anfänglich basierend auf der Funktion und danach auf Sequenzhomologien, identifiziert worden. Diese Promotor-stromaufwärtigen Elemente („promoter upstream elements”) variieren stark im Typ der Kontrolle: von Umweltreaktionen, wie Temperatur, Feuchtigkeit, Verwundung usw., Entwicklungsreizen („developmental cues") (Keimung, Samenreifung, Blühen usw.) bis zur räumlichen Information (Gewebespezifität). Diese Elemente scheinen auch darin, dass sie durch andere Elemente ersetzt werden können, wobei ihre charakteristische Kontrolle über die Genexpression erhalten bleibt, Modularität aufzuweisen.
Promotoren sind üblicherweise 5' oder stromaufwärts relativ zum Beginn der codierenden Region des korrespondierenden Gens positioniert und die gesamte Region, die alle Hilfselemente, die die Regulation oder die absoluten Level der Transkription beeinflussen, enthält, kann aus weniger als 100 Basenpaaren oder soviel wie 1 Kilobasenpaar bestehen.
Eine Zahl von Promotoren, die in Pflanzenzellen aktiv sind, ist in der Literatur beschrieben worden. Diese umfassen die Nopalinsynthase (NOS) und Octopinsynthase (OCS) -Promotoren (die auf tumorinduzierenden Plasmiden von Agrobacterium tumefaciens transportiert werden). Die Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) 19S- und 35S-Promotoren, der lichtinduzierbare Promotor aus der kleinen Untereinheit von Ribulosebisphosphatcarboxylase (ssRUBICSO, ein extrem überreich vorhandenes Pflanzenpolypeptid) und der Saccharosesynthasepromotor sind ebenfalls umfasst. Alle diese Promotoren sind dazu verwendet worden, verschiedene Typen von DNA-Konstrukte zu schaffen, die in Pflanzen exprimiert wurden (siehe zum Beispiel die PCT-Veröffentlichung WO 84/02913 Rogers, et al.).
Zwei Promotoren, die in Pflanzenzelltransformationen weithin verwendet wurden, sind jene der Gene, die für die Alkoholdehydrogenase, AdhI und AdhII, codieren. Beide Gene werden nach dem Beginn einer Anaerobiose induziert. Mais-AdhI ist, ebenso wie AdhII, cloniert und sequenziert worden. Die Bildung eines chimären AdhI-Gens, Adh-Cat, umfassend den AdhI-Promotor, wobei die für die Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) codierenden Sequenzen und das Nopalinsynthase (NOS) -3'-Signal verknüpft sind, bewirkte eine CAT-Expression bei näherungsweise 4-mal höheren Leveln bei niedrigen Sauestoffkonzentrationen als unter Kontrollbedingungen. Die für die anaerobe Induktion der ADH-CAT-Chimäre notwendigen Sequenzelemente sind ebenfalls identifiziert worden. Die Existenz eines anaeroben Regulatorelements (ARE) zwischen den Positionen –140 und –99 des Mais-AdhI-Promotors, zusammengesetzt aus wenigstens zwei Sequenzelementen mit den Positionen –133 bis –124 und den Positionen –113 bis 99, wobei festgestellt wurde, dass beide notwendig sind und für die Expression der ADH-CAT- Genaktivität unter sauerstoffarmen Bedingungen hinreichend sind, wurde festgestellt. Der Adh-Promotor reagiert jedoch auf Anaerobiose und ist kein konstitutiver Promotor, was seine Wirksamkeit dramatisch einschränkt.
Ein weiterer häufig verwendeter Promotor ist der 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus. Der (CaMV) 35S-Promotor ist ein Dicotylen-Viruspromotor, steuert jedoch die Expression von Genen, die in Protoplasten von sowohl Dicotylen als auch Monocotylen eingeführt wurden. Der 35S-Promotor ist ein sehr starker Promotor und dies begründet seine ausgedehnte Verwendung für die Expression von Merkmalen auf hohem Level in transgenen Pflanzen. Der CaMV35S-Promotor hat jedoch auch eine relativ niedrige Aktivität in mehreren agrikulturell bedeutenden grasartigen bzw. zu den Süßgräsern gehörenden Pflanzen („graminaceous plants") wie Weizen gezeigt. Während alle diese Promotoren eine hohe Expression in Dicotylen ergeben, ergeben einige hohe Expressionslevel in Monocotylen. Es besteht ein Bedarf an synthetischen Promotoren und anderen Elementen, die eine Expression in transformierten monocotylen Protoplastenzellen induzieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es werden Verfahren und Zusammensetzungen für die Expression von heterologen Sequenzen in Wirtszellen bereitgestellt. Die Zusammensetzungen finden eine besondere Verwendung beim Kontrollieren der Expression von Sequenzen in Pflanzen. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen Promotorsequenzen. Insbesondere werden ein neues synthetisches Kernpromotormolekül und Regulatorelemente, die zum Kontrollieren der Expression in Zielzellen nützlich sind, bereitgestellt. Der Kernpromotor umfasst eine TATA-Box und einen Transkriptionsbeginn. Weiterhin ist die „TATA bis Beginn"- bzw. „TATA bis Start"-Region 64% oder mehr GC-reich. Die Regulatorelemente umfassen ein neues stromaufwärtiges Element und stromaufwärtige aktivierende Regionen. Die stromaufwärtige aktivierende Region ist von dem synthetischen stromaufwärtigen Element verschieden. Die Elemente können zusammen oder mit anderen Promotorelementen verwendet werden, um die Expression von Sequenzen von Interesse zu kontrollieren.
Es ist ein primäres Ziel der Erfindung, synthetische Regulatorelemente bereitzustellen, die die Expression von eingeführten Genen in Pflanzenzellen und Pflanzengeweben verstärken.
Es ist ein Ziel der Erfindung, ein rekombinantes Promotormolekül bereitzustellen, das zuverlässig hohe Level der Expression von eingeführten Genen in Zielzellen bereitstellt. Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, heterologe stromaufwärtige Enhancer-Elemente bereitzustellen, die die Aktivität eines beliebigen Promotors verstärken können.
Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, Pflanzen, Pflanzenzellen und Pflanzengewebe bereitzustellen, die entweder den rekombinanten Promotor oder ein stromaufwärtiges Element der Erfindung oder beide enthalten.
Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, Vehikel zur Transformation von Pflanzenzellen, einschließlich viraler oder Plasmidvektoren und Expressionskassetten, die den synthetischen Promotor und die stromaufwärtigen Elemente der Erfindung einbauen, bereitzustellen.
Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, Bakterienzellen, umfassend derartige Vektoren zur Erhaltung, und Pflanzentransformation bereitzustellen.
Weitere Ziele der Erfindung werden ausgehend von der folgenden Beschreibung der Erfindung offensichtlich werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine synthetische Pflanzenpromotor-DNA-Sequenz bereitgestellt, wobei die Sequenz umfasst:
ein TATA-Motiv;
eine Transkriptionsstartstelle;
eine Region zwischen dem TATA-Motiv und der Startstelle, die mindestens 64% GC-reich ist;
ein stromaufwärtiges Element; und
eine stromaufwärtige aktivierende Region,
wobei die Promotorsequenz eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

a) einer in SEQ ID NO:12 angegebenen Nucleotidsequenz und
b) einer Nucleotidsequenz, die mindestens 90% Sequenzidentität mit a) aufweist.

Die Erfindung stellt auch eine Expressionskassette bereit, umfassend:
eine synthetische DNA-Promotorsequenz der Erfindung;
ein Strukturgen in funktioneller Verknüpfung mit dem Promotor; und
ein Transkriptionsendstellen-Polyadenylierungssignal.
Die Erfindung stellt auch einen Nucleinsäurevektor bereit, der einen Promotor der Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit einem Strukturgen umfasst.
Die Erfindung stellt auch eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle bereit, die mit einem Nucleinsäurevektor der Erfindung transformiert ist.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Kontrollieren des Levels der Expression einer transgenen Nucleotidsequenz in einer Pflanzenzelle bereit, wobei das Verfahren das Transformieren der Pflanzenzelle mit einer Expressionskassette der Erfindung umfasst.
Die Erfindung stellt auch eine transgene Pflanze bereit, umfassend eine Pflanzenzelle oder einen Vorfahren davon, die/der mit einem Nucleinsäurevektor der Erfindung transformiert worden ist.
Die Erfindung stellt auch eine transformierte Pflanze bereit, die in ihrem Genom eine Expressionskassette der Erfindung enthält.
Die Erfindung stellt auch eine transgene Pflanze bereit, die ein exogenes Oxalatoxidasegen auf hohem Level exprimiert, wobei das Oxalatoxidasegen unter der Transkriptionskontrolle eines rekombinanten Promotors der Erfindung steht.
Die Erfindung stellt auch Samen einer Pflanze der Erfindung bereit, wobei der Samen in seinem Genom einen rekombinanten Promotor der Erfindung enthält.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine Darstellung einer typischen Nucleotidbasenanordnung eines Kernpromotors, der die Konsensussequenzen der TATA- und INR-Motive, die in Pflanzen vorhanden sind, enthält. A bezeichnet +1 der transkribierten Region.
2 ist eine Darstellung der vollständingen Syn II-Kernpromotorsequenz mit einem Beispiel eines Pflanzenpromoters und beide sind am Hauptbeginn der Transkription (fettgedruckter Buchstabe) angeglichen. Das TATA-Motiv ist unter strichen. Der CaMV 35S-Promotor ist mit dem prozentualen GC-Gehalt der Sequenzen, in Klammern angegeben, dargestellt.
3 ist die DNA-Sequenz des stromaufwärtigen Rsyn7-Elements. Die TGACG-Motive sind in Fettdruck angegeben.
4 ist eine Plasmidkarte des Syn II-Kernpromotors und der Rsyn7-Elemente, die ein GUS-enthaltendes Konstrukt steuern.
5 stellt mehrere Schemata von synthetischen Promotoren dar, die in transienten und stabilen Transformanten getestet wurden.
6 ist eine Darstellung von transienten Assaydaten, wobei die Plasmide, die die hierin beschriebenen Kernpromotorsequenzen eingebaut haben, verwendet wurden.
7(A). Rsyn7::GUS (PHP6086)-Aktivität bei T0-Maispflanzen.
7(B) ist ein Schema von Maispflanzen der VT-Stufe, wobei die Stellen der Gewebeproben angegeben sind.
8 stellt die GUS-Aktivität in Wurzelsegmenten einer segregierenden bzw. aufspaltenden Population von transgenen T1-Maissämlingen, enthaltend das Rsyn7::GUS (PHP6086)- oder das UBI:GUS (PHP3953)-Konstrukt, dar.
9 stellt die GUS-Expression von drei synthetischen Promotoren in transgenen T0-Maispflanzen, einschließlich der hierin beschriebenen Kernpromotorsequenzen als Vergleich, dar.
10 zeigt den Vergleich der Aktivitäten des Rsyn7-Promotors, des CaMV 35S-Promotors und des 35SU-Rsyn7-Promotors in der transienten Expression in Sonnenblumen-Keimblättern.
11 zeigt die Wirkung der Ubi-1-stromaufwärtigen aktivierenden Region auf die Stärke des Rsyn7-Promotors in der transienten Expression in Sonnenblumen-Keimblättern.
12 zeigt, dass, im stabil transformierten Sonnenblumenkallus, die GUS-Expression hinter bzw. unter der Kontrolle von 35SU-Rsyn7 20% höher ist als hinter bzw. unter der Kontrolle des 35S CaMV-Promotors.
13 zeigt die Wirkung der Ubi-1-stromaufwärtigen aktivierenden Region auf die Aktivität des Rsyn7-Promotors im Assay mit transgenem Sonnenblumenkallus.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In der folgenden Beschreibung wird eine Zahl von Begriffen ausgiebig verwendet. Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt, um Zweideutigkeiten in der Absicht oder dem Umfang ihrer Verwendung in dieser Beschreibung und den Ansprüchen zu beheben und um das Verständnis der Erfindung zu erleichtern.
Ein Strukturgen ist eine DNA-Sequenz, die in Boten-RNA (mRNA) transkribiert wird, welche dann in eine Sequenz von Aminosäuren translatiert wird, die für ein spezifisches Polypeptid charakteristisch ist.
Ein Promotor ist eine DNA-Sequenz, die die Transkription eines Strukturgens steuert. Typischerweise ist ein Promotor in der 5'-Region eines Gens, proximal zur Transkripti onsstartstelle eines Strukturgens, lokalisiert. Der Promotor der Erfindung umfasst einen Kernpromotor, wie er unten definiert ist. Weiterhin umfasst der Promotor stromaufwärtige Element. Derartige Elemente umfassen UARs und gegebenenfalls andere DNA-Sequenzen, die die Transkription eines Strukturgens beeinflussen, wie ein synthetisches stromaufwärtiges Element.
Ein Kernpromotor oder Minimalpromotor enthält die wesentlichen Nucleotidsequenzen zur Expression der funktionell verknüpften codierenden Sequenz, einschließlich der TATA-Box und des Beginns der Transkription. Mittels dieser Definition kann ein Kernpromotor eine detektierbare Aktivität in Abwesenheit spezifischer Sequenzen, die die Aktivität verstärken oder gewebespezifische Aktivität verleihen können, aufweisen oder nicht. Zum Beispiel besteht der Kernpromotor des Mais-SGB6-Gens aus etwa 37 Nucleotiden 5' der Transkriptionsstartstelle des SGB6-Gens, während der Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) 35S-Kernpromotor aus 33 Nucleotiden 5' der Transkriptionsstartstelle des 35S-Genoms besteht.
ADH bezieht sich allgemein auf ein pflanzenexprimierbares Alkoholdehydrogenasegen und spezifisch auf das Alkoholdehydrogenasegen aus Mais.
ADH 1 DAR bezieht sich auf das DNA-Fragment, das sich über die Region zwischen den Nucleotidpositionen etwa –1094 bis etwa –106 des Alkoholdehydrogenasegens 1 aus Mais erstreckt, oder ein homologes Fragment, das funktionell gleichwertig ist. Die Sequenz ist nummeriert unter Bezeichnung des Beginns der Transkriptionsstelle als +1, gemäß der Korrektur, die von Ellis et al. (1987), supra, veröffentlicht wurde.
„TATA bis Beginn” bzw. „TATA bis Start" soll die Sequenz zwischen dem primären TATA-Motiv und dem Beginn der Transkription bedeuten.
Eine synthetische DNA ist eine künstlich erzeugte DNA-Sequenz, die nicht natürlicherweise produziert wird und in einen Organismus oder einen Vorfahren des Organismus eingeführt werden muss, um zu kontrollieren oder um exprimiert zu werden.
Ein OCS-Element bezieht sich auf das TGACG-Motiv, identifiziert ausgehend von dem Octopinsynthasegen, von Histongenen, Enzymgenen für die Agropinbiosynthese, dem Mannopinsynthasegen, dem CaMV 35S-Gen, Histon-H3-Gen und Nopalinsynthasegen. Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff eine beliebige Sequenz, die zum Bilden des ASE-1-Faktors fähig ist, wie im US-Patent Nr. 4,990,607 von Katagiri identifiziert.
UAR ist typischerweise ein positions- oder orientierungsabhängiges Element, das primär Gewebe, Zelltyp oder regulierte Expression steuert.
Ein Enhancer ist ein DNA-Regulatorelement, das die Effizienz der Transkription erhöhen kann, ungeachtet des Abstands oder der Orientierung des Enhancers relativ zur Startstelle der Transkription.
Der Begriff Expression bezieht sich auf die Biosynthese eines Genprodukts. Im Falle eines Strukturgens umfasst die Expression die Transkription des Strukturgens in mRNA und dann die Translation der mRNA in ein oder mehrere Polypeptide.
Ein Klonierungsvektor ist ein DNA-Molekül, wie ein Plasmid, Kosmid oder eine Bakteriophage, das die Fähigkeit zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle aufweist. Die Klonie rungsvektoren enthalten typischerweise eine oder eine kleine Zahl von Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle(n), an denen fremde DNA-Sequenzen auf eine festlegbare Weise ohne Verlust der wesentlichen biologischen Funktion des Vektors inseriert werden können, sowie ein Markergen, das geeignet ist zur Verwendung in der Identifizierung und Selektion von Zellen, die mit dem Klonierungsvektor transformiert sind. Markergene umfassen typischerweise Gene, die eine Tetracyclinresistenz, Hygromycinresistenz oder Ampicillinresistenz bereitstellen.
Ein Expressionsvektor ist ein DNA-Molekül, das ein Gen, das in einer Wirtszelle exprimiert wird, umfasst. Typischerweise ist die Genexpression unter die Kontrolle von bestimmten Regulatorelementen, einschließlich Promotoren, gewebespezifischen Regulatorelementen und Enhancern, gestellt. Ein derartiges Gen wird als „funktionell verknüpft mit" den Regulatorelementen bezeichnet.
Ein rekombinanter Wirt kann eine beliebige prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein, die entweder einen Klonierungsvektor oder einen Expressionsvektor enthält. Dieser Begriff umfasst auch jene prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, die gentechnisch verändert wurden, so dass sie die klonierten Gene im Chromosom oder Genom der Wirtszelle enthalten.
Eine transgene Pflanze ist eine Pflanze mit einer oder mehreren Pflanzenzelle(n), die einen Expressionsvektor enthält/enthalten.
Es wird verstanden werden, dass es geringfügige Sequenzvariationen innerhalb der Sequenz oder den Fragmenten, die in dieser Anmeldung verwendet oder offenbart werden, geben kann. Mit „geringfügige Variationen" ist gemeint, dass die Sequen zen wenigstens 80%, vorzugsweise 90%, Sequenzidentität aufweisen. Diese Variationen können mittels Standardtechniken bestimmt werden, um es Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet zu erlauben, die funktionellen Einheiten der Promotorelemente, notwendig zum Steuern der Initiation der Transkription im Strukturgen, gefolgt von einem pflanzenexprimierbaren Transkriptions-Terminations (und möglicherweise Polyadenylierungs) -Signal, zu manipulieren und in die Praxis zu bringen.
Pflanzengewebe umfasst differenzierte und undifferenzierte Gewebe oder Pflanzen, einschließlich, aber ohne Beschränkung darauf, Wurzeln, Stängel bzw. Stämme bzw. Halme, Schösslinge, Blätter, Pollen, Samen, Tumorgewebe und verschiedene Formen von Zellen und der Kultur, wie einzelne Zellen, Protoplasten, Embryos und Kallusgewebe. Das Pflanzengewebe kann in Pflanzen oder in Organen, Gewebe- oder Zellkultur sein.
Ein hierin offenbartes Element, der Kernpromoter, ist in SEQ ID NO:1 gezeigt. Der Kernpromotor ist dazu fähig, die Expression einer codierenden Sequenz in einer Zielzelle, insbesondere Pflanzenzellen, zu steuern. Der Kernpromotor findet Verwendung beim Steuern der Expression von Sequenzen, die nur in minimalen Leveln in den Zielzellen benötigt werden. Auch ein neues stromaufwärtiges Element, SEQ ID NO:2, das dabei hilft, die Transkription zu potenzieren, ist offenbart. Der synthetische Kernpromotor kann mit Kombinationen aus Enhancer, stromaufwärtigen Elementen und/oder aktivierenden Sequenzen aus der 5'-flankierenden Region von pflanzenexprimierbaren Strukturgenen verwendet werden. Gleichermaßen kann das stromaufwärtige Element in Kombination mit zahlreichen Pflanzen-Kernpromotorsequenzen verwendet werden. Der Kernpromotor und das stromaufwärtige Element können zusammen verwendet werden, um eine zehnfach höhere Expression eines eingeführten Markergens in monocotylen transgenen Pflanzen zu erhalten, als sie mit dem Mais-Ubiquitin-1-Promotor erhalten wird.
Der Kernpromotor umfasst ein TATA-Motiv und eine GC-reiche „TATA bis Beginn der Transkription"-Region (64% oder mehr GC-Gehalt, der für tierische Promotoren allgemein charakteristisch ist). Die Sequenz wird 5' eines Strukturgens platziert und wird die konstitutive Expression, die in transgenen Pflanzenzellen nicht gewebespezifisch ist, fördern.
Hierin ist auch eine Expressionskassette beschrieben, umfassend das stromaufwärtige Element, den synthetischen Kernpromotor, ein Strukturgen, dessen Expression in Pflanzenzellen erwünscht ist, und ein Polyadenylierungs- oder Stopsignal. Die Expressionskassette kann von Plasmid- oder viralen Vektoren zur Transformation von Pflanzenprotoplastenzellen umfasst sein.
Die Erfindung umfasst auch transformierte Bakterienzellen zur Erhaltung und Replikation des Vektors, sowie transformierte monocotyle oder dicotyle Zellen und schließlich transgene Pflanzen.
Hierin ist auch ein stromaufwärtiges Element offenbart, das in Kombination mit dem synthetischen Promotor oder mit anderen auf dem Fachgebiet bekannten Promotoren verwendet werden kann. Das stromaufwärtige Element umfasst wenigstens 3 OCS-Bindungsmotive (TGACG) mit einer neuen intervenierenden Sequenz. Eine Ausführungsform ist in SEQ ID NO:2 offenbart und wird 5' zu einer Kernpromotorsequenz platziert, um die Transkriptionslevel des resultierenden Genprodukts zu erhöhen. Somit wird eine Expressionskassette beschrieben, umfassend das synthetische stromaufwärtige Element der Erfindung, 5' zu einem pflanzeninduzierbaren Promotor, der 5' zu einem Strukturgen ist. Diese Expressionskassette kann in Vektoren und Plasmiden, wie vorher beschrieben, verkörpert sein.
Das synthetische stromaufwärtige Element kann in Kombination mit der synthetischen Kernpromotorsequenz verwendet werden, um eine nichtgewebespezifische konstitutive Expression des Genprodukts zu erzielen, die eine zehnfache Verstärkung des Mais-Ubi-1-Promotors darstellt.
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Promotorkonstrukt, umfassend den oben beschriebenen synthetischen Kernpromotor und eine stromaufwärtige aktivierende Region. Die stromaufwärtige aktivierende Region ist von dem synthetischen stromaufwärtigen Element verschieden. Vorzugsweise ist die stromaufwärtige aktivierende Region eine stromaufwärtige aktivierende Region (UAR), die eine wesentliche Sequenzähnlichkeit zu der UAR von CaMV 35S aufweist. Promotorkonstrukte der Erfindung umfassen den synthetischen Kernpromotor in Kombination mit einem UAR und einem synthetischen stromaufwärtigen Element.
Das Promotorkonstrukt kann zur Zweckdienlichkeit in einer Expressionskassette enthalten sein. Diese Expressionskassette kann in Transformationsvektoren verkörpert sein.
Die Sequenz der stromaufwärtigen aktivierende Region (UAR) des Mais-Ubi-1-Gens ist ebenfalls offenbart. Diese UAR kann in Kombination mit einem beliebigen Kernpromotor verwendet werden, um die Aktivität des Promotors zu verstärken.
Der Kernpromotor, wie in SEQ ID NO:1 und/oder SEQ ID NO:10 (modifizierter Kernpromotor) ersichtlich, kann verwendet werden, um hohe Level der Expression in den Strukturgenen zu erhalten. Gleichermaßen kann das stromaufwärtige Element von SEQ ID NO:2 in Kombination mit anderen Promotoren oder dem Promotor der Erfindung verwendet werden, um die Level der Transkription in genetisch modifizierten Pflanzen zu potenzieren. Die Produktion eines genetisch modifizierten Pflanzengewebes, das ein Strukturgen unter der Kontrolle der Regu latorelemente der Erfindung exprimiert, kombiniert die Lehren der vorliegenden Offenbarung mit einer Vielzahl von Techniken und Hilfsmitteln, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. In den meisten Fällen existieren für jede Stufe des gesamten Verfahrens Ausweichhilfsmittel („alternate expedients"). Die Auswahl der Hilfsmittel hängt von Variablen, wie dem Plasmidvektorsystem, das zum Klonieren und zur Einführung des rekombinanten DNA-Moleküls gewählt wurde, der zu modifizierenden Pflanzenart, dem speziellen Strukturgen, dem speziellen Promotorelementen und stromaufwärtigen Elementen, die verwendet werden, ab. Fachleute auf dem Gebiet sind dazu in der Lage, zweckdienliche Alternativen auszuwählen und anzuwenden, um Funktionsfähigkeit zu erzielen. Kulturbedingungen zum Exprimieren gewünschter Strukturgene und (für) kultivierte Zellen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Auch ist, wie auf dem Fachgebiet bekannt, eine Zahl von sowohl monocotyledonen als auch dicotyledonen Pflanzenarten transformierbar und regenerierbar, so dass ganze Pflanzen erhalten werden können, die gewünschte Gene unter der Regulationskontrolle der Promotormoleküle der Erfindung enthalten und exprimieren. Wie es Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, kann die Expression in transformierten Pflanzen gewebespezifisch und/oder spezifisch für bestimmte Entwicklungsstufen oder Umwelteinflüsse sein. Die Auswahl eines trunkierten Promotors („truncated promoter selection") und die Strukturgenauswahl sind andere Parameter, die optimiert werden können, um eine gewünschte Pflanzenexpression zu erhalten, was Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist und hierin gelehrt wird.
Die Nucleotidsequenzen der Erfindung können in eine beliebige Pflanze eingeführt werden. Die einzuführenden Gene können zweckdienlicherweise in Expressionskassetten zum Einführen und zur Expression in einer beliebigen Pflanze von Interesse verwendet werden.
Derartige Expressionskassetten werden einen Promotor der Erfindung, verknüpft mit einer Nucleotidsequenz von Interesse, umfassen. Eine derartige Expressionskassette wird mit einer Mehrzahl von Restriktionszellen zur Insertion des Gens von Interesse, das unter der Transkriptionsregulation der Regulationsregionen sein soll, bereitgestellt. Die Expressionskassette kann zusätzlich selektierbare Markergene enthalten.
Die Transkriptionskassette wird in der 5'-3'-Richtung der Transkription eine Transkriptions- und Translationsinitiationsregion, eine DNA-Sequenz von Interesse und eine Transkriptions- und Translationsterminationsregion, funktionelle in Pflanzen, umfassen. Die Terminationsregion kann bezüglich der Transkriptionsinitiationsregion nativ sein, kann bezüglich der DNA-Sequenz von Interesse nativ sein oder kann aus einer beliebigen anderen Quelle stammen. Zweckdienliche Terminationsregionen sind aus dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens erhältlich, wie die Octopinsynthase- und Nopalinsynthaseterminationsregionen. Siehe auch Guerineau et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141–144; Proudfoot (1991) Cell 64:671–674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141–149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261–1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151–158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 1:7891-7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627–9639.
Die hierin beschriebenen Gene werden in Expressionskassetten zur Expression in der Pflanze von Interesse bereitgestellt. Die Kassette wird 5'- und 3'-Regulationssequenzen umfassen, die mit dem Gen von Interesse funktionell verknüpft sind. Die Kassette kann zusätzlich wenigstens ein zusätzliches Gen, mit dem der Organismus co-transformiert werden soll, enthalten. Alternativ kann das zusätzliche Gen/können die zusätzlichen Gene auf einer weiteren Expressionskassette bereitgestellt werden. Wo es zweckdienlich ist, kann das Gen/können die Gene für eine erhöhte Expression in der transformierten Pflanze optimiert sein. Das heißt, die Gene können unter Verwendung pflanzenbevorzugter Codons für eine verbesserte Expression synthetisiert werden. Im Fachgebiet sind Verfahren zum Synthetisieren pflanzenbevorzugter Gene verfügbar. Siehe zum Beispiel die US-Patente Nrn. 5,380,831 , 5,436,391 und Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477–498.
Weitere Sequenzmodifikationen sind dafür bekannt, die Genexpression in einem zellulären Wirt zu verstärken. Diese umfassen die Elimination von Sequenzen, die für störende bzw. falsche Polyadenylierungssignale, Exon-Intron-Spleißstellensignale, Transposon-ähnliche Wiederholungen und andere derartige gut charakterisierte Sequenzen codieren, die für eine Genexpression schädlich sein können. Der GC-Gehalt der Sequenz kann auf Level eingestellt werden, die für einen gegebenen zellulären Wirt durchschnittlich sind, wie unter Bezugnahme auf bekannte Gene, die in der Wirtszelle exprimiert werden, berechnet. Wo möglich wird die Sequenz modifiziert, um vorhergesagte mRNA-Sekundärstrukturen vom Haarnadeltyp zu vermeiden.
Die Auswahl eines zweckdienlichen Expressionsvektors wird vom Verfahren der Einführung des Expressionsvektors in Wirtszellen abhängen. Typischerweise enthält ein Expressionsvektor (1) prokaryotische DNA-Elemente, die für einen bakteriellen Replikationsstartpunkt und ein Antibiotika-Resistenzgen codieren, um die Amplifikation und Selektion des Expressionsvektors in einem bakteriellen Wirt bereitzustellen; (2) DNA-Elemente, die die Initiation der Transkription kontrollieren, wie einen Promotor; (3) DNA-Elemente, die die Prozessierung der Transkripte kontrollieren, wie Introns, eine Transkriptions-Terminations/Polyadenylierungs-Sequenz; und (4) ein Reportergen, das mit den DNA-Elementen zum Kontrollieren der Transkriptionsinitiation funktionell verknüpft ist. Verwend bare Reportergene umfassen β-Glucuronidase, β-Galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase, Luciferase, grünfluoreszierendes Protein (GFP) und dergleichen. Vorzugsweise ist das Reportergen entweder β-Glucuronidase (GUS), GFP oder Luciferase. Allgemeine Beschreibungen von Pflanzenexpressionsvektoren und Reportergenen können in Gruber et al., „Vectors for Plant Transformation" in Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology, Glich et al., (Hrsg., S. 89–119, CRC Press, 1993), gefunden werden. Darüber hinaus sind GUS-Expressionsvektoren und GUS-Genkassetten von Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, Kalifornien, erhältlich, während Luciferaseexpressionsvektoren und Luciferasegenkassetten von Promega Corp. (Madison, Wisconsin) erhältlich sind.
Expressionsvektoren, die genomische oder synthetische Fragmente enthalten, können in Protoplasten oder in intakte Gewebe oder isolierte Zellen eingeführt werden. Vorzugsweise werden die Expressionsvektoren in intaktes Gewebe eingeführt. Allgemeine Verfahren zum Kultivieren von Pflanzengewebe werden zum Beispiel bereit gestellt von Maki et al. „Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology, Glich et al. (Hrsg., S. 67–88, CRC Press, 1993); und von Phillips et al. "Cell-Tissue Culture and In-Vitro Manipulation" in Corn & Corn Improvement, 3. Ausgabe Sprague et al. (Hrsg., S. 345–387) American Society of Agronomy Inc. et al., 1988.
Verfahren zum Einführen von Expressionsvektoren in Pflanzengewebe umfassen die direkte Infektion oder Co-Kultivierung von Pflanzenzellen mit Agrobacterium tumefaciens, Horsch et al., Science, 227:1229 (1985). Beschreibungen von Agrobakterium-Vektorsystemen und Verfahren zum Agrobakteriumvermitteltem Gentransfer werden von Gruber et al., supra, bereitgestellt.
Vorzugsweise werden Expressionsvektoren in Mais oder andere Pflanzengewebe unter Verwendung eines direkten Gentransferverfahrens, wie Mikroprojektil-vermittelte Abgabe, DNA-Injektion, Elektroporation und dergleichen, eingeführt. Stärker bevorzugt werden Expressionsvektoren eingeführt in Pflanzengewebe unter Verwendung der Mikroprojektilvermittelten Abgabe mit der Biolistik-Vorrichtung. Siehe zum Beispiel Tomes et al. „Direct DNA transfer into intact plant cells via microprojectile bombardment" in: Gamborg and Phillips (Hrsg.) Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Springer-Verlag, Berlin (1995).
Die Vektoren der Erfindung können nicht nur zur Expression von Strukturgenen verwendet werden, sondern können auch in der Exon-Trap-Klonierung oder in Promotor-Trap-Verfahrensweisen zum Detektieren einer differenziellen Genexpression in Gewebearten verwendet werden, K. Lindsey et al., 1993 „Tagging Genomic Sequences That Direct Transgene Expression by Activation of a Promotor Trap in Plants", Transgenic Research 2:33–47. D. Auch & Reth, et al., „Exon Trap Cloning: Using PCR to Rapidly Detect and Clone Exons from Genomic DNA Fragments", Nucleic Acids Research, Bd. 18, Nr. 22, S. 6743.
Die Identifizierung des Kernpromotors beruht zum Teil auf der Entdeckung, dass eine GC-reiche „TATA bis Beginn"- bzw. „TATA bis Start"-Region in einem Pflanzenpromotor als sehr starker nicht gewebespezifischer Kernpromotor wirkt, der eine konstitutive Expression in Pflanzenzellen induziert. Das TATA-Element von Pflanzenpromotoren von polII-Genen weist allgemein die Sequenz TATA(A/T)A(A/T)A, SEQ ID NO:3, auf, wohingegen der Konsensus des Beginns der Transkription aus der Sequenz 5'...TYYTCAT(A/C)AA..3', SEQ ID NO:3, besteht, wobei das A die Ausgangsbase für die Transkription bezeichnet. Die typische Pflanzenpromotorsequenz ist in 1 dargestellt.
Es ist gezeigt worden, dass Sequenzen, eingeschaltet zwischen das TATA-Element und den Beginn der Transkription eine bedeutende Rolle bei der Transkriptionsaktivierungseffizienz spielen. Es ist gezeigt worden, dass das TATA-Bindungsprotein mit der kleinen Furche der Doppelhelixbindung an das TATA-Motiv wechselwirkt, wobei es zur Seite der großen Furche gebogen wird (Kim, et al. 1993, Nature, 365:512–520). Es folgt somit, dass Sequenzen stromabwärts des TATA-Motivs, die eine Auswirkung auf diese Feststellung haben, die Effizienz der Bildung eines stabilen Transkriptionskomplexes und schlussendlich der Expression beeinflussen werden. Überwachungen der „TATA bis Beginn"- bzw. „TATA bis Start"-Regionen von Pflanzenpromotoren zeigen einen signifikant höheren Level von AT-reichen Sequenzen, die zum Potential bzw. zur Möglichkeit der Kompression der kleinen Furche führen (Yaurawj et al. Biological Abstracts Bd. 47, Ausg. 8, Verweis 144712, "Consensus Sequences for Plant Minimal Promotors" Annual Meeting of the American Society of Plant Physiologists, 29. Juli bis 2. August 1995, Plant Physiology 108 [2 Nachträge] 1995, 114). Im Allgemeinen zeigen tierische Promotoren eine GC-reiche „TATA bis Beginn"- bzw. „TATA bis Start"-Sequenz, die zu einer Kompression der großen Furche führt, was nahe legt, dass durchschnittliche pflanzliche und tierische Kernpromotor-Transkriptionskomplexe eine geringfügig unterschiedliche „TATA bis Beginn"- bzw. „TATA bis Start"-Struktur mit entsprechendem Sequenzunterschied erkennen und damit Wechselwirken. Überaschenderweise hat die Anmelderin festgestellt, dass ein GC-reicher synthetischer Promotor vom Tiertyp sehr gut in Pflanzen funktioniert.
Während die Erfindung nicht an eine beliebige Theorie gebunden ist, ist es möglich, dass sich das AT-reiche TATA-Motiv, das in einer GC-reichen Sequenz vorhanden ist, „selbst" vorherrschender dem TATA-bindenden Komplex „präsentieren" kann, und zwar mittels einer scharfen Abgrenzung des TATA-Motivs, das stärker mit dem TATA-bindenden Komplex Wechselwirken würde. Dieses würde die Effizienz des Beginns der Transkription verbessern, indem das Gleichgewicht der Bindung zu einer stabilisierteren Form verschoben wird, während bei der „nichtgebundenen TATA"-Version, d.h. mit einem höheren Level an AT-reichen Sequenzen, flankierend das TATA-Motiv, der TATA-bindende Komplex möglicherweise 5' oder 3' zur Startstelle gleiten oder stottern würde („slide or stutter 5' or 3' to the start side") und die Bindungseffizienz effektiv verringern würde, wodurch die Transkription schlussendlich verringert wird. Es sind wenige Daten hinsichtlich dieser Region von Pflanzenpromotoren verfügbar, abgesehen von simplen bzw. groben Deletionen und einigen Punktmutationen. Der offensichtliche Entwurf eines synthetischen Kernpromotors zur Pflanzenexpression würde die AT-reiche „TATA bis Beginn"- bzw. „TATA bis Start"-Sequenz, basierend auf Überwachungen bekannter Pflanzenpromotoren, einschließen. Jedoch wird auf der Basis des „gebundenen” Mechanismus durch den Mechanismus der Erfindung postuliert, dass ein effizienterer Kernpromotor ein Ergebnis eines TATA-Motivs, eingebettet in eine GC-reiche Sequenz, ist.
2 stellt die Syn II-Kernpromotorsequenz, SEQ ID NO:1, dar, wobei Beispiele für Pflanzenkernpromotoren am Hauptbeginn der Transkription angeglichen sind. Ein weiteres Beispiel eines Pflanzenpromotors, 35S von CaMV (SEQ ID NO:4), ist unter Angabe des prozentualen GC-Gehalts der Sequenzen auf der rechten Seite in Klammern gezeigt. Die Syn II-Kernsequenz zeigt keine signifikante Sequenzhomologie zu Sequenzen in den öffentlichen Datenbanken.
Die Syn II-Kernpromotorsequenz zeigt eine 64% GC-reiche „TATA bis Beginn"- bzw. „TATA bis Start"-Sequenz, die von der insgesamt 40% GC-reichen Sequenz, die in traditionellen Pflanzenpromotoren (zum Beispiel CaMV35S) vorhanden ist, verschie den ist. Der natürlich vorkommende und isolierte UBI-Kernpromoter, der sehr hohe Level der Aktivität in Monocotylen ermöglicht, zeigt üblicherweise eine 64% GC-reiche „TATA bis Beginn"- bzw. „TATA bis Start"-Sequenz, die zu tierischen Promotoren ähnlicher ist. Derartige Beispiel gaben den Anstoß zum Entwurf einer hoch GC-reichen „TATA bis Beginn"- bzw. „TATA bis Start"-Sequenz zur effizienten Transkription, gegensätzlich zum gegenwärtigen Dogma über Pflanzenkernpromotoren.
Somit umfasst der Promotor der Erfindung eine synthetische Pflanzenkernpromotorsequenz, umfassend ein TATA-Motiv und eine „TATA bis Beginn"- bzw. „TATA bis Start"-Region, die 64% oder mehr GC-reich ist. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Promotor Restriktionsendonuclease-Zielstellen zur leichten Klonierung umfassen. In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist die Sequenz die von SEQ ID NO:1. Wie von Fachleuten auf dem Gebiet geschätzt werden wird, können mehrere Basenumwandlungen innerhalb von SEQ ID NO:1 auftreten, die den prozentualen GC-Gehalt erhalten und innerhalb des Rahmens dieser Erfindung liegen sollen. Zum Beispiel können Guanine durch Cytosine ersetzt werden und umgekehrt, ohne die insgesamte Wirksamkeit des Promotors zu beeinträchtigen, solange der prozentuale GC-Gehalt erhalten bleibt.
Beschrieben ist auch ein synthetisches stromaufwärtiges Element, positioniert 5' zu einem beliebigen natürlich vorkommenden oder synthetischen Promotor zur Verwendung in Pflanzen, insbesondere bei der Maisgenexpression.
Ausgehend von der Aktivität zahlreicher Promotoren sind die grundlegenden Elemente (Bindungsstellen) definiert worden. Diese umfassen zum Beispiel AT-reiche Regionen aus Hitzeschockpromotoren und ASF-1-Bindungsstelle (AS-1) -Elemente, die in Octopinsynthase (OCS) und Blumenkohlmosaikvirus- Protomoren vorhanden sind. AS-1 ist eines der besser bekannten stromaufwärtigen Elemente und seine Bindungssequenz (OCS-Element) ist in vielen konstitutiven Pflanzenpromotoren, wie den CaMV35S-, A. tumefaciens-, NOS- und OCS-Weizenhiston-Promotoren, vorhanden. Das OCS-Element wurde zuvor zuerst als ein Enhancer-Element im Promotor des OCS-Gens isoliert, wo es als Palindromsequenz von 16 Basenpaaren identifiziert wurde (Ellis et al. (1987) EMBO J. 6:11–16), ist jedoch in seinen wesentlichen Merkmalen auf ein TGACG-Motiv reduziert worden. Siehe US-Patent Nr. 4,990,607 . Das in den Promotoren der Erfindung vorhandene stromaufwärtige Element weist eine 71%ige Identität zu dem Promotor-Enhancer-Element auf, das im US-Patent 5,023,179 , erteilt an Lam et al., offenbart wurde. Die zwei Sequenzen sind hinsichtlich ihrer flankierenden Sequenzen, die das TGACG-Motiv umgeben, recht verschieden, wobei gezeigt wurde, dass diese Regionen den Grad der Transkriptionsverstärkung beeinflussen. Die transkriptionsverstärkende Aktivität des OCS-Elements korreliert mit der in vitro-Bindung eines Transkriptionsfaktors. Ähnliche Elemente wurden auch in den Promotorregionen von sechs anderen cDNA-Genen identifiziert, die an der Opinsynthese beteiligt sind, und in drei pflanzenviralen Promotoren, einschließlich des CaMV 35S-Promotors (Bouchez et al. 1989), supra. Es wurde gezeigt, dass diese Elemente den OCS-Transkriptionsfaktor in vitro binden, und die Transkription in Pflanzenzellen verstärken.
In Tabak wurde gezeigt, dass ein DNA-Bindefaktor, TGA1, spezifisch mit dem AS-1-Element, entweder alleine oder in Verbindung mit anderen Promotorelementen, wechselwirkt. (Katagiri et al. 1989, Nature 340:727–730). Es wurde auch gezeigt, dass dieser Faktor auf eine Wurzel-bevorzugte Weise („rootpreferred manner") in Tabakpflanzen exprimiert wird. Kernpromotoren mit ein oder zwei Kopien des stromaufwärtigen OCS-Elements neigen dazu, die Genexpression zu ermöglichen, wohingegen vier oder mehr Wiederholungen dieses Elements eine mehr oder weniger konstitutive Aktivität erzeugen, die trotzdem relativ zu intakten 35S-Promotoren niedrig ist.
Somit wird auch ein synthetisches stromaufwärtiges Element beschrieben, das mit dem hierin beschriebenen Kernpromotor oder anderen Kernpromotoren verwendet werden kann, um die Genexpression zu verstärken. Dieses Element umfasst drei OCS-ähnliche Motive und neue zwischengeschaltete bzw. intervenierende Sequenzen, welche die Genexpression verstärken.
3, SEQ ID NO:2, zeigt die vollständige Sequenz des synthetischen stromaufwärtigen Elements Rsyn7, welches wenigstens drei OSC-ähnliche Motive, TGACG, SEQ ID NO:5, umfasst, die in Fettschrift angezeigt sind.
Es ist gezeigt worden, dass Sequenzen, die viele Elemente flankieren, wie das TGACG-SEQ ID NO:5-Motiv, große Auswirkungen auf die Bindungsaffinitäten von DNA-bindenden Faktoren aufweisen und somit eine ebenso wichtige Rolle wie die zentralen Motive selbst spielen. (Burrows et al. 1992, Plant Molecular Biology 19:665–675, Shinder et al. 1992, Plant Cell 4:1309–1319, Foster et al. 1994, FASEBJ 8:192–200). Die neuen Sequenzen, die die TGACG-Motive im Rsyn7-Promotor flankieren, sind bestimmt worden und es ist eine deutliche Verstärkung der Transkriptionsaktivität bei zahlreichen Promotoren, insbesondere bei Verwendung mit dem Syn II-Kernpromotor, etabliert worden.
Das stromaufwärtige Rsyn7-Element ist stromaufwärts des Syn II-Kernpromotors, der ein GUS-Konstrukt steuert, kloniert worden und hat Level der GUS-Aktivität in transgenen Maispflanzen ergeben, die näherungsweise zehnmal höher sind als die (des) Ubiquitinpromotors, des bis dato stärksten Maispromotors.
Im Promotor der Erfindung ist eine stromaufwärtige aktivierende Region (UAR), die von dem synthetischen stromaufwärtigen Element verschieden ist, funktionell mit dem synthetischen Kernpromotor verknüpft. Beschrieben wird auch, dass die UAR alleine oder in Kombination mit dem hierin beschriebenen synthetischen stromaufwärtigen Element verwendet werden kann. Vorzugsweise wird die stromaufwärtige aktivierende Region des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) 35S-Promotors verwendet. Weiterhin können Sequenzen, die eine Sequenzähnlichkeit zu dieser UAR aufweisen, eingesetzt werden, solange derartige Sequenzen die Fähigkeit zur Verstärkung der Promotoraktivität beibehalten. Die Verstärkung kann mittels Austesten der Level der Transkripte oder alternativ der Proteinproduktion gemessen werden.
CaMV 35S-UARs sind im Stand der Technik gut untersucht worden. Die vollständige Nucleotidsequenz der zirkulären doppelsträngigen CaMV-DNA ist im Stand der Technik etabliert worden. Siehe Guilley et al. (1980) Cell 21:285–294. Der 35S-Promotor transkribiert das große 35S-RNA-Iranskript aus dem zirkulären viralen Genom durch Kern-RNA-Polymerase II. Siehe Guilley et al. (1982) Cell 30:763–773. Darüber hinaus können die 35S-UARs mit einem heterologen Promotor funktionieren und die Expression eines Gens von Interesse in Zellen und transgenen Pflanzen erhöhen. Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Mehrfache cis-Regulatorelemente für die Aktivität des CaMV 35S-Promotors sind identifiziert worden. Siehe Odell et al. (1985) Nature 313:810–812, Fang et al. (1989) Plant Cell 1:141–150.
In der vorliegenden Erfindung kann ein großes Fragment der stromaufwärtigen aktivierenden Regionen (UARs) des CaMV 35S-Promotors eingesetzt werden, um die Aktivität des synthetischen Kernpromotors zu verstärken. Die Größe der UARs kann zum Beispiel von etwa 15 Basenpaaren bis zu etwa 850 Basenpaaren, vorzugsweise von etwa 20 bis etwa 500, stärker bevorzugt von etwa 20–25 bis etwa 50–200 Basenpaaren, reichen. Eine bevorzugte Region der stromaufwärtigen 35S-CaMV-Region umfasst Sequenzen von etwa –421 bis etwa –90. Es wird anerkannt, dass Modifikationen in der Länge und Nucleotidsequenz an der Region durchgeführt werden können und noch in einer verstärkten Aktivität des synthetischen Kernpromotors resultieren werden. Derartige Modifikationen können auf eine Auswirkung auf die Aktivität untersucht werden, indem Expressionssysteme verwendet werden, wie im experimentellen Abschnitt der vorliegenden Anmeldung dargelegt. Die Zahlen des UAR-Sequenzdiagramms geben die Position stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle oder +1-Position des 35S-Strukturgens an. Zum Beispiel bedeutet –25 eine Position 25 Basenpaare stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle des 35S-Strukturgens.
Die stromaufwärtige aktivierende Region des Mais-Ubiquitingens Ubi-1 ist ebenfalls beschrieben. Die Sequenz der Ubi-1-Gentranskriptionsregulationsregion ist im US-Patent Nr. 5,510,474 offenbart. Siehe auch Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675–689; Cornejo et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23:567–581; Takimoto et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26:1007–1012; und Christensen et al. (1996) Transgenic Res. 5:213–218. Die UAR des Ubi-1-Genpromotors umfasst vorzugsweise (die Positionen) von etwa –867 bis etwa –54. Wie oben für die 35S-UAR angegeben, sind Modifikationen der Ubi-1-UAR, die noch unter Verstärkung der Aktivität des Kernpromotors funktionieren, ebenfalls beschrieben.
Während die vollständige Sequenz des Ubiquitinpromotors veröffentlicht worden ist, ist dies die erste Offenbarung der Ubi-UAR. Somit wird die UAR des Ubiquitinpromotors sowie die Ubi-UAR in Kombination mit einem beliebigen Promotor offenbart. Weiterhin werden Verfahren zur Verwendung der Ubi-UAR zur Verstärkung der Aktivität von Promotoren beschrieben.
Die stromaufwärtigen aktivierenden Regionen, wie hierin beschrieben, können mit dem synthetischen Kernpromotor und/oder anderen stromaufwärtigen Elementen verknüpft werden, und zwar mittels eines beliebigen herkömmlichen Verfahrens, das auf dem Fachgebiet allgemein bekannt ist, solange ein operatives Element oder ein operativer Promotor konstruiert wird. Die stromaufwärtigen aktivierenden Regionen werden allgemein mit dem 5'-Ende des Kernpromotors verknüpft. Wenn das synthetische stromaufwärtige Element ebenfalls vorhanden ist, können die stromaufwärtigen aktivierenden Regionen entweder mit dem 5'-Ende des synthetischen stromaufwärtigen Elements, dem 3'-Ende des synthetischen Kernpromotors verknüpft oder zwischen dem synthetischen stromaufwärtigen Element und dem synthetischen Kernpromotor inseriert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die stromaufwärtigen aktivierenden Regionen in dichter Nähe mit bzw. zu den synthetischen stromaufwärtigen Element und dem synthetischen Kernpromotor verknüpft. Mit dichte Nähe ist innerhalb von etwa 1 bis etwa 50 Nucleotiden gemeint. Es wird jedoch anerkannt, dass mehr als 50 Nucleotide die Elemente trennen können. Die stromaufwärtigen aktivierenden Regionen können in der 5'-nach-3'-Richtung oder der 3'-nach-5'-Richtung, jedoch bevorzugt in der 5'-nach-3'-Richtung, am 5'-Ende des synthetischen Kernpromotors oder des synthetischen stromaufwärtigen Elements sein.
Beschrieben wird auch, dass eine oder mehrfache Kopien der stromaufwärtigen aktivierenden Regionen verwendet werden können. Wenn mehrfache Kopien verwendet werden, können sie Tandem-Repeats bzw. Tandem-Wiederholungen von einer UAR oder Kombinationen von mehrere UARs sein. Auf diese Weise kann der Level der Expression die Nucleotidsequenz von Interesse durch die Zahl von UARs, die in dem Promotorkonstrukt vorhanden sind, kontrolliert werden, da die Ergebnisse anzeigen, dass erhöhte Expressionslevel mit einer erhöhten Zahl von UARs erhalten werden. Somit stellt die Erfindung Verfahren zum Regulieren der Level der Expression eines Gens oder einer Nucleotidsequenz von Interesse bereit.
Wie angegeben wird beschrieben, dass mehrfache Kopien einer UAR verwendet werden können, um die Aktivität des funktionell verknüpften Promotors zu verstärken. Wie bemerkt können mehrfache Kopien der gleichen oder verschiedener UARs eingesetzt werden.
Die Promotoren der Erfindung mit einer UAR, wie oben beschrieben, können in Expressionskassetten bereitgestellt werden, und derartige Kassetten können in Plasmid- oder viralen Vektoren enthalten sein. Derartige Vektoren können zur Transformation von Bakterien und Pflanzenzellen verwendet werden. Transgene Pflanzen können schlussendlich aus derartigen transformierten Pflanzenzellen regeneriert werden.
Die in Pflanzenpromotoren eingebauten UARs können die Transkriptionsaktivität der transgenen Pflanzen wesentlich verstärken. Die Promotorkonstrukte der Erfindung können mit einer beliebigen Nucleotidsequenz oder einem beliebigen Gen von Interesse funktionell verknüpft sein. Das Promotorkonstrukt kann zum Beispiel verwendet werden, um die Oxalatoxidasegenexpression in transgenen Pflanzen zu verstärken. Oxalatoxidase ist ein Pflanzenenzym, das an Abwehrmechanismen der Pflanze gegen Pathogenbefall beteiligt ist. Das Enzym baut die chemische Verbindung Oxalsäure, die von Pflanzenpathogenen ausgeschieden wird, ab. Siehe zum Beispiel die PCT Veröffentlichung Nr. WO 92/14824 . Die Erhöhung des Oxalatoxidasespiegels in Pflanzen, wie Sonnenblume, wird zu einer erhöhten Pflanzenresistenz gegenüber Pflanzenpathogenen führen.
Die folgenden Beispiele dienen nur zu Zwecken der Erläuterung und sollen den Rahmen oder die Anwendung der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken. Fachleute auf dem Gebiet werden einsehen, dass viele Permutationen erreicht werden können und tatsächlich in den Rahmen der Erfindung fallen sollen.
BEISPIEL 1
Plasmide wurden unter Verwendung der Mehrfachklonierungsstelle von pBlueScriptIIKS+ von Stratagene entworfen bzw. konzipiert. (Zur Erleichterung der Klonierung der verschiedenen Kombinationen von Elementen). Oligonucleotide, die die Sequenzen der Elemente enthalten, wurden mit Restriktionsendonucleasestellen an den Enden synthetisiert. Somit konnten die Elemente nach Bedarf hinzugefügt oder entfernt und ersetzt werden. GUS und Luciferase wurden als Reportergene verwendet.
Für transiente Assays wurde Plasmid-DNA mittels Partikelbombardierung in intakte 3 Tage alte Maissämlinge eingeführt. Nach 16 Stunden der Inkubation bei 25°C im Dunklen wurde die Expression mit Messung der GUS-Enzymaktivität in Wurzel- und Schösslingsextrakten aus jedem Sämling untersucht, um festzustellen, ob eine gewebebevorzugte Expression gezeigt wurde. Die GUS-Aktivität wurde unter Verwendung eines GUS-Light-Assay-Kits von Tropix (47 Wiggins Avenue, Bedford, MA 01730) gemessen.
Konstrukte, die hohe Level der Expression ergaben, wurden in eine Zelllinie eingeführt, um stabile Transformanten zu erzeugen. Diese stabilen Transformanten (TO) wurden untersucht mittels PCR, um das Vorhandensein des GUS-Gens festzustellen, mittels MUG (4-Methylumbelliferylglucuronid) -Assay, um den Aktivitätslevel des gebildeten GUS-Proteins zu quantifizieren. Als die Pflanzen reif für den Transfer in das Gewächs haus waren, wurden sie histochemisch mit X-gluc untersucht, um festzustellen, wo das GUS-Produkt synthetisiert wurde. Pflanzen, die bevorzugte Expressionslevel zeigten, wurden im Gewächshaus bis zur V6-Stufe gezogen bzw. wachsen gelassen.
BEISPIEL 2
Konstruktion von Plasmiden, die den Syn II-Kernpromotor enthalten.
Molekularbiologische Standardtechniken wurden gemäß Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., ausgeführt. Alle in der Erfindung eingesetzten Plasmide können gemäß den Anweisungen der Beschreibung von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet ohne unzumutbares Experimentieren unter Verwendung von Materialien, die auf dem Fachgebiet leicht zugänglich sind, hergestellt werden.
Die Oligos N306, SEQ ID NO:6,5'-TCGACACTGC AGCTCTAGGG ATGGTAGCGC AGGGTGCGTA GGTACGTATT TATAGCCGCT CGAGTG-3', und N307, SEQ ID NO:7,5'-GATCCACTCG AGCGGCTATA AATACGTACC TACGCACCCT GCGCTACCAT CCTAGAGCT GCAGTG-3' wurden gemäß der Anweisungen auf einem automatischen DNA-Synthesegerät (wie das DNA-Synthesegerät 380B von Applied Biosystems Inc.) hergestellt. Diese automatisierten Synthesegeräte sind im Handel erhältlich. Die Oligos wurden dann mit dem BamHI-Fragment des pBlueScriptIIKS+-Plasmids, umfassend das β-Glucuronidasegen, unterbrochen durch die Mais-ADH1-Intron 1-Region, ligiert. Eine Plasmidkarte, die sowohl den Syn II-Kernpromotor als auch das stromaufwärtige Element enthält, ist als 4 offenbart. Mehrere andere Plasmide sind in 5 dargestellt. Plasmidnummern sind auf der rechten Seite jeder Promotordarstellung angegeben, wobei die entsprechende Legende unterhalb der Darstellungen angeordnet ist. Die oben befindliche Darstellung zeigt die vollständige Transplantat-Transkriptionseinheit („transplant transcriptional unit"), wobei sich die nachfolgenden Darstellungen auf die ausgeprägten Unterschiede zwischen dem 35S- und dem Syn II-Kernpromotor konzentrieren. Die Legende zeigt die Zahl und Natur der verschiedenen Promotor-Teilelemente, die Sequenz, sofern sie relativ kurz ist, die Quelle des Elements und die Position relativ zum Beginn der Transkription.
Die Sequenz des Kernpromotors besteht aus 35 Basenpaaren mit Enzymstellen stromaufwärts einer TATA-Box und einem Beginn der Transkription mit 10 bis 15 Basenpaaren stromabwärts. Stromaufwärtige Elemente (Gal 4-Bindungsstellen, Rsyn, AT-GBL usw.) wurden mit dem ADHI-Intron und verschiedenen Markergenen (LUC oder GUS) an die Kernsequenz fusioniert, und es wurde gezeigt, dass beide in transienten Assays funktionell sind (6) und Rsyn Pflanzen stabil transformierte (7).
BEISPIEL 3
Konstruktion des stromaufwärtigen Elements Rsyn7, fusioniert mit dem Syn II-Kernpromotor, resultierend in den Plasmiden PHP5903 und PHP6086.
Oligos zum Konstruieren des Rsyn7-Promotor-Teilelements N1965: (SEQ ID NO:8) GATCCTATGA CGTATGGTAT GACGTGTGTT CAAGATGATG ACTTCAAACC TACCTATGAC GTATGGTATG ACGTGTGTCG ACTGATGACT TA-3' und N1966: (SEQ ID NO:9) GATCTAAGTC ATCAGTCGAC ACACGTCATA CCATACGTCA TAGGTAGGTT TGAAGTCATC ATCTTGAACA CACGTCATAC CATACGTCA TAG-3' wurden wie vorher beschrieben synthetisiert. Die Oligos wurden angelagert und in ein PHP3398-Plasmid stromaufwärts der Syn II-Kernsequenz kloniert und resultierten in mehreren Versionen der ursprünglichen Rsyn7-Sequenz aufgrund spontaner Deletionen. Die Rsyn7- 2-Version wies eine Einzelbasendeletion auf, die in einem 3X-wiederholenden TGACG-Motiv stromaufwärts des Syn II-Kernpromotors resultierte (Rsyn7::LUC, P5903). Die für LUC codierende Sequenz wurde durch die für GUS codierende Sequenz ersetzt, um das Rsyn7::GUS-Konstrukt P6086 zu erzeugen. P6086 wurde später in transgene Maispflanzen eingeführt, was in hohen Leveln konstitutiver Aktivität in vier der sechs untersuchten wirksamen Ereignisse resultierte (7).
Die Nachkommenschaft von T0-Pflanzen aus mehreren Transformationsereignissen wurde untersucht und die GUS-Aktivität reichte von 1 bis 400 PPM (Mikrogramm GUS-Enzym/GFW in Wurzelgewebe eines 7 Tage alten Sämlings), 8. Diese TO- und T1-Pflanzen erzeugten allgemein eine 4X–10X höhere GUS-Aktivität als Pflanzen, die das Ubiquitin::GUS-Reportergen beherbergten.
BEISPIEL 4
Transformation und Expression mit dem Syn II-Kernpromotor und/oder dem stromaufwärtigen Rsyn7-Element.
Unter Verwendung von transienten Bombardierungsassays wurde die Syn II-Kernpromotorsequenz mit der 35S-Kernsequenz entweder alleine oder in Verbindung mit zahlreichen Aktivierungselementen verglichen. 6 ist eine Darstellung von Daten aus einem transienten Assay, wobei die Plasmide, die die hierin beschriebenen Kernpromotorsequenzen enthalten, verwendet wurden. Gezeigt wird eine transiente GUS- oder LUC-Aktivität in drei Tage alten Maiswurzeln oder BMS-Kallus, bombardiert mit chimären Promotor::GUS- oder LUC-Konstrukten. Die Versionen der synthetischer Promotor::GUS (oder LUC) – Konstrukte mit –33 CaMV35S im Syn II-Kernpromotor wurden mittels Bombardierung in die drei Tage alten Wurzeln (oder kultivierte BMS-Kalli, wie hiernach beschrieben) eingeführt und 20 Stunden nach der Bombardierung auf Enzymaktivität untersucht. Die gezeigten Daten sind die Rohenzymeinheiten einer Erfassung von wenigstens drei Experimenten und sind aufgrund der inhärenten Variabilität der transienten Assays in keiner Weise normalisiert worden. Die Kontrollplasmide 1654 und 3537 sind die LUC-Konstrukte, getestet in Mais-BMS-Kalli. Es besteht näherungsweise ein 4- bis 20-facher Unterschied hinsichtlich der transienten Aktivität zwischen den 35S- und Syn II-Kernversionen. Die Y-Achse ist in logarithmischem Maßstab. Beide Kernpromotoren steuerten ein GUS-enthaltendes Konstrukt (4 und 5) und erzeugten einen basalen Level der Aktivität (6). Als Aktivatorelemente jedoch stromaufwärts des TATA-Motivs platziert wurden, stellte der Syn II-Kern(promotor) allgemein höhere Level der Aktivität (2- bis 4-mal besser) in Maiszellen bereit, als bei Platzierung der Aktivatorelemente stromaufwärts des 35S-Kern(promotors) (6).
Es ist gezeigt worden, dass die Syn II-Kernsequenz die Aktivität in stabil transformierten Pflanzen verstärkt bzw. erhöht.
Die 7 und 8 zeigen GUS-Aktivitätslevel aus isolierten Geweben von VT-Stufe-T0-Pflanzen bzw. Wurzelgewebe aus T1-Sämlingen. Diese Daten zeigen, dass diese Kernsequenz an der Ermöglichung sehr hoher Level der Aktivität als ein funktioneller Partner für die aktiven chimären Promotoren beteiligt sein kann. 7 zeigt die Rsyn7::GUS(6086)-Aktivität in T0-Maispflanzen. Pflanzen der VT-Stufe mit Kolben 3 bis 8 Tage nach der Bestäubung („post pollinated 3 to 8 days") wurden dissektiert und auf GUS-Aktivität untersucht. 7A stellt die GUS-Expression in den ausgewiesenen Geweben dar. 7B stellt ein Schema einer Maispflanze mit angegebenen Stellen der Messung dar. Pflanzen aus T0-Ereignissen die einen Bereich der Aktivitäten mit Rsyn7-Promotor zeigten, wurden un tersucht. Wiederum ist der logarithmische Maßstab zu bemerken. Der Aktivitätsbereich für UBI::GUS-Pflanzen ist auf der rechten Seite des Diagramms für Vergleiche angegeben. Diese Daten zeigen, dass der Rsyn7-Promotor die Aktivität auf das 10-Fache über die Level des Ubiquitinpromotors erhöhen kann, jedoch kaum Gewebebevorzugung zeigt, was Rsyn7 als starken konstitutiven Promotor geeignet macht.
8 stellt die GUS-Aktivität in Wurzelsegmenten einer aufspaltenden Population von transgenen T1-Maissämlingen, enthaltend das Rsyn7::GUS(6086)- oder das UBI::GUS(3953)-Konstrukt, dar. Wurzelsegmente von 1 cm wurden aus sechs bis sieben Tagen alten transgenen Maissämlingen dissektiert, gewogen und unter Verwendung des GUS-Light-Kits auf GUS untersucht. Die Aktivität ist als Parts per million des Frischgewichts dargestellt. Die Wurzelaktivität von mehreren T1-Pflanzen, die den Rsyn7::GUS-Promotor beherbergen, zeigt eine höhere Aktivität als viele der Aktivitätslevel, die durch den UBI-Promotor erzeugt wurden. Dies ist in Übereinstimmung mit Daten aus transgenen T0-Pflanzen. Die Aktivitätslevel in Rsyn7::GUS-enthaltenden jungen Blättern sind ebenfalls viel höher als die Aktivitätslevel von UBI::GUS-enthaltenden jungen Blättern (Daten nicht gezeigt). Es wurde gezeigt, dass die Syn II-Kernsequenz gut mit einer Vielzahl von stromaufwärtigen Elementen einschließlich der GAL 4-Bindungsstellen, Rsyn7-Elemente, GBL-Elemente usw. funktioniert.
9 zeigt die GUS-Expression der drei synthetischen Promotoren in transgenen TO-Maispflanzen. Das dissektierte Gewebe (siehe 7B) aus transgenen T0-Pflanzen der VT-Stufe, beherbergend Rsyn7 (Rsyn), Atsyn oder die Syn II-Kern-allein (syn-core) -Promotor::GUS-Konstrukte, wurden quantitativ auf GUS-Aktivität untersucht. Jeder Kreis stellt einen Durchschnitt der Gewebeaktivität von transgenen Maispflanzen aus einem einzelnen Transformationsereignis dar. Das TGACG-Motiv entspricht der Rsyn7-Sequenz und das „AT-com"-Motiv bezieht sich auf das Konsensus-AT-ähnliche-zusammengesetzte-Element („consensus AT-like composite element"), Atcom, aus W. Gurley, et al. 1993. In: Control of Plant Gene Expression., hrsg. von Desh Pal Verma. CRC press, Boca Raton, FL, S. 103-123. Syn-core bezieht sich auf die Syn II-Kernpromotorsequenz, die das TATA-Element und den Beginn der Transkription enthält.
BEISPIEL 5
Konstruktion des Rsyn7-Promotors mit den stromaufwärtigen aktivierenden Regionen aus dem CaMV 35S-Gen und dem Mais-Ubi-1-Gen.
Um einen Expressionsvektor mit 35SU (stromaufwärtige aktivierende Regionen aus dem 35S-Gen)-Rsyn7-Promotor zu konstruieren, wurde PHP413 mit BglII und EcoRV verdaut. Die versetzten/kohäsiven Enden („staggered/stickt ends") des linearisierten Vektors wurden mittels Klenow in Gegenwart von dNTP aufgefüllt. Das 2x CaMV-Fragment wurde stumpfendig in BamH1-verdautem PHP6086 nach Auffüllung der BamH1-Enden ligiert. Dann wurde das CaMV 35S-Rsyn7-Element aus dem neuen Konstrukt mittels Verdau mit Xba1 und Pst1 ausgeschnitten und in den 4 kb großen Xba1-Pst1-Vektor aus PHP9925 ligiert, wodurch der Expressionsvektor 35SU-Rsyn7::GUS(PHP9778) gebildet wurde.
Um einen Expressionsvektor mit UbiU (stromaufwärtige Aktivierungselemente aus dem Mais-Ubi-1-Gen)-Rsyn7-Promotor zu konstruieren, wurde das Xba1-Spe1-Fragment aus PHP8277 in die Xba1-Stelle von PHP6086 unter Bildung von PHP10539, in die Xba1-Stelle von PHP10970 unter Bildung von PHP10971 und in die Xba1-Stelle von PHP10971 unter Bildung des Expressionsvektors Ubi-1-Rsyn7::GUS(PHP10972) ligiert.
Die ansonsten nicht ausgewiesenen Sequenzen umfassen:
SEQ ID NO:11, die die 35S-UAR darstellt;
SEQ ID NO:12, die die SCP1-Promotorsequenz darstellt (35S-UAR funktionell verknüpft mit dem Kernpromotor von SEQ ID NO:1);
SEQ ID NO:13, die die Ubi1-UAR darstellt;
SEQ ID NO:14, die SCP1, funktionell verknüpft mit der codierenden Sequenz von Oxalatoxidase, funktionell verknüpft mit dem PinII-Terminator, darstellt;
SEQ ID NO:16, die die UCP2-Promotorsequenz (2 Kopien der Ubi1-UAR, funktionell mit dem Kernpromotor) darstellt;
SEQ ID NO:18, die die UCP4-Promotorsequenz (4 Kopien der Ubi1-UAR, funktionell mit dem Kernpromotor) darstellt.
BEISPIEL 6
Transformation und Expression von Promotorkonstrukten.
Die verschiedenen Promotor::GUS-Fragmente wurden in einen binären Vektor, Bin9, kloniert, der ALS3::NPTII als Selektionsmarker enthält, um transgenen Sonneblumenkallus oder transgene Arabidopsis zu erzeugen.
Zur transienten Expression wurden SMF3-Sonnenblumensamen ins Gewächshaus gepflanzt. 15 Tage alte Samen nach der Bestäubung wurden von den Pflanzen gesammelt und in transienten Expressionssystemen verwendet. Nach Entfernung des Pericarps wurden die Keimblätter mit den Samenhüllen mittels Inkubation in 20%iger Bleiche bei RT für 15 Minuten sterilisiert und viermal mit sterilem doppelt destilliertem Wasser gewaschen. Die Keimblätter wurden dann über Nacht auf 3MM-Filterpapier, befeuchtet mit MS-Medium, inkubiert, bevor sie gemäß des Verfahrens, das von Klein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6681–6685 offenbart wurde, bombardiert wurden. Die GUS-Aktivität wurde 20 Stunden nach der Bombardierung unter Verwendung des GUS-Light-Assay-Kits von Tropix gemäß dem Protokoll des Herstellers analysiert.
Zur Blattscheibentransformation wurden junge ausgebreitete bzw. expandierte SMF3-Sonnenblumenblätter von einer 30 Tage alten Sonnenblume geerntet und in 20%iger Bleiche mit einigen Tropfen Tween 200 für 20 Minuten sterilisiert. Die Blattscheiben wurden aus den sterilen Blättern präpariert, nachdem diese viermal in sterilem doppelt destilliertem Wasser gewaschen worden waren. Die Blattscheiben wurden dann für 10 Minuten in Inokulationsmedium (12,5 mM MES, 1 g/l NH₄Cl und 0,3 g/l MgSO₄), enthaltend Agrobakterium (EHA105), das mit den zu testenden Vektorkonstrukten transformiert war, bei A600 = 0,75, inkubiert. Die Blattscheiben wurden dann für 3 Tage in nichtselektivem Medium wachsen gelassen und wurden dann auf Selektivmedium transferiert.
Um Arabidopsis zu transformieren wurde Arabidopsis im Gewächshaus bis zu dem Stadium wachsen gelassen, in dem Schösslinge („bolts") beginnen, zu 15 Pflanzen/Topf aufzulaufen. Die auflaufenden Schösslinge wurden abgezwickt, um das Wachstum mehrfacher sekundärer Schösslinge anzuregen. Nach 7 Tagen waren die Pflanzen für die Infiltration bereit. Agrobakterium (EHA105), das das zu testende Konstrukt trägt, wurde bei 28°C bis zu einer A600 zwischen 0,65 und 0,8 kultiviert. Die Zellen wurden in Inokulationsmedium (4,3 g/l MS-Salz, 0,5 mg/l Nikotinsäure, 0,5 mg/l Pyridoxin-HCl, 1 mg/l Thiamin-HCl, 0,1 g Myo-Inosit, 1 g/l Casaminosäuren, 0,01 mg BAP, 68,5 g/l Saccharose und 36 g/l Glucose) bei A600 von 7,5 geerntet.
Die zu transformierenden abgezwickten Pflanzen wurden unter Umkehren in ein 250 ml-Becherglas, enthaltend die obige Agrobakteriumlösung, eingebracht. Das Becherglas wurde in eine Glasglocke eingebracht und ein Vakuum wurde angelegt, bis sich Blasen an der Blatt- und Stengeloberfläche bildeten. Nach 15 Minuten der Infiltration wurde das Vakuum abgebaut und die Pflanzen wurden aus dem Becherglas entnommen, auf der Seite in eine Kunststoffwanne gelegt und mit einer Kunststofffolie abgedeckt. Die Pflanzen wurden aufrecht gestellt und im Gewächshaus für vier Wochen gezogen, bevor Samen geerntet wurden. Transgene Samen wurden selektiert, indem die Samen auf einer Mediumplatte, enthaltend 65 μg/ml Kanamycin, eingepflanzt wurden.
In transienten Expressionsassays weist der Rsyn7-Promotor in PHP10464 15% der 35S-Promotor (PHP9925) -Aktivität auf, wohingegen der 35SU-Rsyn7-Promotor (PHP9778) (im Nachfolgenden SCP1-Promotor) etwa 107% der 35S-Promotoraktivität aufweist (10). Somit erhöhte die stromaufwärtige aktivierende Region des CaMV 35S-Gens die Rsyn7-Aktivität etwa um das 6-Fache.
Das Mais-Ubi-1-stromaufwärtige Element (UbiU) hat in transienten Assays ähnliche Wirkungen auf den Rsyn7-Promotor. Als die stromaufwärtige aktivierende Region (UAR) von Mais-Ubi-1 mit Rsyn7 fusioniert wurde, erhöhte sich die GUS-Enzymaktivität mit der Zahl der Kopien der UAR. In Gegenwart von 3 Kopien von UbiU erhöhte sich die GUS-Aktivität etwa um das 4-Fache. Diese additive Wirkung von UbiU wurde nicht beobachtet, wenn es im Kontext des Mais-Ubiquitin-Promotors (PHP11974) platziert war. Dies legt nahe, dass die Ersetzung des Mais-Ubi1-Kernpromotors durch Rsyn7 den monocotylen Ubi1-Promotor in einen Promotor umwandeln kann, der in dicotylen Pflanzen hochgradig aktiv ist (11).
In stabil transformiertem Sonnenblumenkallus ist die GUS-Expression hinter bzw. unter der Kontrolle des 35SU-Rsyn7 (SCP1-Promotor) -Promotors 20% höher als hinter bzw. unter der Kontrolle des 35S CaMV-Promotors (12).
Die Ergebnisse des Assays an transgenem Kallus sind in 13 wiedergegeben. Der Rsyn7-Promotor, enthaltend eine einzelne Kopie von UbiU (2HP10991) (im Nachfolgenden UCP1-Promotor) (SEQ ID NO:15), zeigte eine Promotoraktivität, die etwa das dreifache der des 35SU-Rsyn7 (SCP1) -Promotors (PHP10940) war. Drei Kopien von UbiU (PH210993) erhöhten die Rsyn7-Promotoraktivität auf etwa das 7-Fache der des 35SU-Rsyn7-Promotors. Der 3xUbiU-Rsyn7 (UCP3-Promotor) (SEQ ID NO:17) ist bei weitem der stärkste Promotor in Sonnenblumengeweben.
Um die Aktivität und Gewebespezifität der verstärkten Rsyn7-Promotoren zu bestimmen, wurden stabil transformierte Sonnenblumen- und Arabidopsis-Pflanzen mittels Agrobakteriumvermittelter Transformation erzeugt. Die histochemische Färbung der GUS-Expression im transgenen T1-Arabidopsis zeigt an, dass 35SU-Rsyn7 (SCP1-Promotor) (PHP10940) eine zum 35S CaMV-Promotor (PHP10989) identische Gewebespezifität und ähnliche Aktivität hat. Beide Promotoren exprimieren GUS in Blatt-, Stamm- bzw. Stengel-, Petiolen- und Blütenteilen. UbiU-Rsyn7 (USCP1-Promotor) (PHP10991) zeigt in Arabidopsis-Stängel- und -blattgeweben eine höhere Aktivität als der Mais-Ubi-1-Promotor (PHP11031).
Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in der Beschreibung genannt sind, zeigen das Niveau der Fachleute auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, an.
Obgleich die voranstehende Erfindung auf dem Wege der Erläuterung und auf dem Wege von Beispielen zu Zwecken der Klarheit und des Verständnisses beschrieben worden ist, wird es offensichtlich sein, dass gewisse Änderungen und Modifikationen innerhalb des Rahmens der angehängten Ansprüche durchgeführt werden können.
SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Synthetische Pflanzenpromotor-DNA-Sequenz, wobei die Sequenz umfasst: ein TATA-Motiv; eine Transkriptionsstartstelle; eine Region zwischen dem TATA-Motiv und der Startstelle, die mindestens 64% GC-reich ist; ein stromaufwärtiges Element; und eine stromaufwärtige Aktivierungsregion, wobei die Promotorsequenz eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) einer in SEQ ID NO:12 angegebenen Nukleotidsequenz und b) einer Nukleotidsequenz, die mindestens 90% Sequenzidentität mit a) aufweist, umfasst.
Synthetische Pflanzenpromotor-DNA-Sequenz nach Anspruch 1, umfassend eine in SEQ ID NO:12 angegebenen Nukleotidsequenz.
Synthetische Pflanzenpromotor-DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die Sequenz in funktioneller Verknüpfung umfasst: eine synthetische Kernpromotorsequenz, umfassend die in SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:10 angegebene Sequenz; ein synthetisches stromaufwärtiges Element in funktioneller Verknüpfung mit dem synthetischen Kernpromotor, wobei das synthetische stromaufwärtige Element die in SEQ ID NO:2 angegebene Sequenz umfasst; und eine stromaufwärtige Aktivierungsregion.
Synthetische Pflanzenpromotor-DNA-Sequenz nach Anspruch 3, wobei die stromaufwärtige Aktivierungsregion eine stromaufwärtige Aktivierungsregion aus CaMV 35S umfasst.
Synthetische Pflanzenpromotor-DNA-Sequenz nach Anspruch 4, wobei die stromaufwärtige Aktivierungsregion aus CaMV 35S Nukleotid –430 bis Nukleotid –90 des CaMV 35S-Gens umfasst.
Synthetische Pflanzenpromotor-DNA-Sequenz nach Anspruch 4, wobei die stromaufwärtige Aktivierungsregion aus CaMV 35S die in SEQ ID NO:11 angegebene Sequenz umfasst.
Expressionskassette, umfassend: eine synthetische DNA-Promotorsequenz nach einem der vorstehenden Ansprüche; ein Strukturgen in funktioneller Verknüpfung mit dem Promotor; und ein Transkriptionsendstelle-Polyadenylierungssignal.
Expressionskassette nach Anspruch 7, wobei das Strukturgen ein Oxalatoxidasegen ist.
Nukleinsäurevektor, umfassend den Promotor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in funktioneller Verknüpfung mit einem Strukturgen.
Vektor nach Anspruch 9, wobei der Vektor ein Klonierungsvektor ist.
Vektor nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Vektor ein Expressionsvektor ist.
Vektor nach einem der Ansprüche 9 bis 11, weiterhin umfassend ein Markergen zur Selektion transformierter Zellen.
Vektor nach Anspruch 12, wobei das Markergen ein Antibiotikaresistenzgen ist.
Vektor nach einem der Ansprüche 9 bis 13, weiterhin umfassend ein Polyadenylierungssignal.
Prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, die mit dem Nukleinsäurevektor nach einem der Ansprüche 9 bis 14 transformiert ist.
Verfahren zum Kontrollieren des Levels der Expression einer transgenen Nukleotidsequenz in einer Pflanzenzelle, wobei das Verfahren Transformieren der Pflanzenzelle mit einer Expressionskassette nach Anspruch 7 oder 8 umfasst.
Transgene Pflanze, umfassend eine Pflanzenzelle oder einen Vorfahren davon, die/der mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 9 bis 14 transformiert worden ist.
Transformierte Pflanze, die in ihrem Genom die Expressionskassette nach Anspruch 7 oder 8 enthält.
Pflanze nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Pflanze eine monokotyle Pflanze ist.
Pflanze nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Pflanze eine dikotyle Pflanze ist.
Pflanze nach Anspruch 20, wobei die Pflanze Sonnenblume ist.
Transgene Pflanze, die ein exogenes Oxalatoxidasegen auf einem hohen Level exprimiert, wobei das Oxalatoxidasegen unter der Transkriptionskontrolle des rekombinanten Promotors nach einem der Ansprüche 1 bis 6 steht.
Transgene Pflanze nach Anspruch 22, wobei die Pflanze eine dikotyle Pflanze ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 23, wobei die dikotyle Pflanze Sonnenblume ist.
Samen der Pflanze nach einem der Ansprüche 17 bis 24, wobei der Samen in seinem Genom den rekombinanten Promotor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält.