CN105143248A - 玉蜀黍胁迫相关转录因子18及其用途 - Google Patents

玉蜀黍胁迫相关转录因子18及其用途 Download PDF

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Abstract

截短的胁迫响应性转录因子可在不引起不利多效性效应的情况下过度表达。所述截短物可导致缺失核定位信号。所述截短物可导致缺失一个或多个调控基序。所述截短的转录因子可在组成型启动子或组织偏好的启动子的控制下表达。所述转录因子可来自玉蜀黍。

Description

玉蜀黍胁迫相关转录因子18及其用途
背景技术
植物胁迫耐受性反映对环境的生理、生化和/或分子响应，有助于提高植物适应力。对胁迫作出响应的基因调节包括对编码代谢蛋白质的基因的活化，以及对编码调节下游基因表达的信号蛋白质的基因的活化。此类信号蛋白质可以是转录因子，其与靶基因的启动子区内的元件相互作用，从而诱导或扩增这些靶基因的表达而改善胁迫耐受性。这种功能性级联的可能意味着转录因子的转基因操纵可作为改善作物胁迫耐受性和最终产量表现的重要途径。
发明内容
本公开的部分实施例如下所示：
1.一种改善植物的非生物胁迫耐受性的方法，所述方法包括用构建体转化所述植物，所述构建体包含有效连接到编码截短的DREB转录因子的多核苷酸的启动子。
2.实施例1的方法，其中所述截短的DREB转录因子不含功能性N端CBF结构域。
3.实施例1的方法，其中所述截短移除截短之前存在于DREB转录因子中的至少一个核定位信号。
4.实施例1的方法，其中所述截短的DREB转录因子不含截短之前存在于DREB转录因子中的功能性N端CBF结构域或功能性核定位信号。
5.实施例1的方法，其中所述截短的DREB转录因子不含截短之前存在于DREB转录因子中的功能性N端CBF结构域和至少一个核定位信号。
6.实施例1的方法，其中所述截短的DREB转录因子不含截短之前存在于DREB转录因子中的功能N端CBF结构域和所有核定位信号。
7.实施例1的方法，其中所述多核苷酸编码作为ZmSRTF18(SEQIDNO：1)或ZmDREB2A(SEQIDNO：8)的截短物或变体的多肽。
8.实施例7的方法，其中所述所编码的多肽的序列为SEQIDNO：2、3、4、5、6、7或19。
9.实施例1-8中任一项的方法，其中所述启动子驱动组成型表达。
10.实施例1-8中任一项的方法，其中所述启动子驱动组织偏好的表达。
11.实施例1-8中任一项的方法，其中所述植物产生相对于对照增加的种子产量。
12.实施例1-8中任一项的方法，其中所述植物为玉蜀黍、小麦、水稻或高粱。
13.实施例11的方法，其中种子产量在非生物胁迫的条件下增加。
14.实施例13的方法，其中非生物胁迫包括高盐浓度。
15.实施例13的方法，其中非生物胁迫包括受寒或冷冻。
16.实施例13的方法，其中非生物胁迫包括在开花期时或大约在开花期时或者在灌浆期时降低的水供应。
17.实施例13的方法，其中非生物胁迫包括降低的氮供应。
18.一种改善植物的非生物胁迫耐受性的方法，包括用构建体转化植物，所述构建体包含有效连接到编码包含截短的DREB转录因子的多肽的多核苷酸的启动子，其中所述截短保留AP2结构域N端的至少12个但少于65个氨基酸。
19.实施例18的方法，其中所述多核苷酸编码作为ZmSRTF18(SEQIDNO：1)或ZmDREB2A(SEQIDNO：8)的截短物或变体的多肽。
20.实施例18或19的方法，其中所述所编码的多肽具有SEQIDNO：2、3、4、19、20、21、24、25、26或28的多肽序列。
21.一种降低由DREB转录因子的异位表达所引起的多效性的方法，包括所述转录因子的截短形式的表达。
22.实施例21的方法，其中所述截短形式不含存在于非截短DREB转录因子中的至少一个核定位信号。
23.实施例21的方法，其中所述截短使所述多肽的第一个外显子缺失。
24.实施例21的方法，其中所述截短使所述多肽的前两个外显子缺失。
25.一种编码来自玉蜀黍的DREB转录因子的截短物或变体的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸在玉蜀黍植物中的过度表达增加了谷粒产量并且所述玉蜀黍植物没有多效性效应。
26.一种编码来自玉蜀黍的DREB转录因子的截短物或变体的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸在玉蜀黍植物中的过度表达增加了在干旱或降低的氮供应的条件下的谷粒产量。
27.一种改善植物的非生物胁迫耐受性的方法，所述方法包括用构建体转化所述植物，所述构建体包含有效连接到编码不含功能性N端CBF结构域或功能性核定位信号的DREB转录因子的多核苷酸的启动子。
28.实施例13的方法，其中所述植物为玉蜀黍、小麦、水稻或高粱。
29.实施例12的方法，其中种子产量在非生物胁迫的条件下增加。
30.实施例12的方法，其中非生物胁迫包括高盐浓度。
31.实施例12的方法，其中非生物胁迫包括受寒或冷冻。
32.实施例12的方法，其中非生物胁迫包括在开花期时或大约在开花期时或者在灌浆期时水供应的降低。
33.实施例12的方法，其中非生物胁迫包括氮供应的降低。
34.实施例12的方法，其中所述截短导致丧失一个或多个核定位信号。
35.一种改善植物的非生物胁迫耐受性的方法，包括用构建体转化所述植物，所述构建体包含有效连接到编码截短的DREB转录因子的多核苷酸的启动子，其中所述截短保留AP2结构域N端的至少12个但少于65个氨基酸。
36.实施例35的方法，其中所述多核苷酸编码作为ZmSRTF18(SEQIDNO：1)或ZmDREB2A(SEQIDNO：8)的截短物或变体的多肽。
37.实施例35的方法，其中所述所编码的多肽不包含N端CBF结构域。
38.一种编码来自玉蜀黍的DREB转录因子的截短物或变体的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸在玉蜀黍植物中的过度表达增加了谷粒产量并且所述玉蜀黍植物不表现出多效性效应。
39.一种编码来自玉蜀黍的DREB转录因子的截短物或变体的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸在玉蜀黍植物中的过度表达增加了在干旱或降低的氮供应的条件下的谷粒产量。
40.实施例1的方法，其中所述多核苷酸为ZmSRTF18的同源物。
41.实施例40的方法，其中所述多核苷酸从高粱或珍珠粟分离。
42.实施例40的方法，其中所述多核苷酸与SEQIDNO：24或25具有至少90％同一性。
43.实施例41的方法，其中所述多核苷酸的序列为SEQIDNO：24或25。
44.实施例40的方法，其中所述多核苷酸不含存在于非截短同源物中的至少一个核定位信号。
45.实施例40的方法，其中所述多核苷酸不含功能性N端CBF结构域。
46.权利要求1的方法，其中所述DREB转录因子为DREB2型转录因子。
47.权利要求1的方法，其中所述DREB转录因子不含截短之前DREB1/CBF特征序列中的一者或多者。
附图说明
图1是玉蜀黍近交系B73中天然ZmSRTF18的RT-PCR数据。数据表明，干旱未引起强烈诱导(图板A)；寒冷引起轻微诱导(图板B)；以及叶(L)、中脉(MR)、未成熟雌穗(IE)、茎(S)和穗丝(SI)组织中有相似的表达水平，而籽粒(K)组织中有略微低的表达(图板C)。图中还提供了肌动蛋白表达数据作为对照。诱导可能难以经由RT-PCR来测量，因为植物可通过产生更高比例的功能性剪接变体而对胁迫作出响应。
图2示出了天然ZmSRTF18基因及剪接变体1.1、1.2、1.3、1.4和提前终止的错误剪接变体的结构。
图3提供ZmSRTF18剪接变体1.1(亦称SPLVAR1；SEQIDNO：5)、ZmSRTF18剪接变体1.4(亦称SPLVAR4；SEQIDNO：6)、ZmDREB2A(SEQIDNO：8；Qinetal.(2007)PlantJournal50(1)：54-69(Qin等人，2007年，《植物杂志》，第50卷，第1期，第54-69页))及称作ZmSRTF18-del的ZmSRTF18完全截短形式(SEQIDNO：2)的比对。
图4提供用ABA(脱落酸)处理会增加ZmSRTF18的表达的证据。
图5(5A、5B、5C)提供荧光显微图像，证实了核定位信号对蛋白质的亚细胞定位的影响。
图6(6A、6B)提供凝胶迁移测定法的结果以评价ZmSRTF18蛋白质变体结合DNA的能力。用于这些测定法的DNA是玉蜀黍RAB17启动子的包含DRE核心元件的区域。图6A示出未添加DTT时测定的结果。图6B示出在存在1mMDTT的情况下测定的结果。
图7提供蛋白质印迹数据，示出了由于用组成型启动子产生的过度表达，在转基因事件的叶子中有可检测的ZmSRTF18蛋白质，但无效对照的叶子中没有可检测的ZmSRTF18蛋白质。
图8提供ZmSRTF18和两种其他DREB蛋白质的若干截短物的N端区的比对。
序列简述
表1.序列说明
具体实施方式
用于增强胁迫耐受性的转录因子的CBF和DREB家族成员的组成型过度表达，通常与负多效性效应相关。例如，拟南芥DREB1或DREB2在拟南芥中的组成型过度表达导致生长缓慢(Liuetal，1998，PlantCell10：1391-1406(Liu等人，1998年，《植物细胞》，第10卷，第1391-1406页))。烟草CBF1在番茄中的组成型过度表达导致生长缓慢(Hsiehetal，2002，PlantPhysiol129：1086-1094(Hsieh等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1086-1094页))。水稻OsDREB1A在拟南芥中的组成型过度表达导致生长缓慢(Dubouzetetal，2003，PlantJ33：751-763(Dubouzet等人，2003年，《植物杂志》，第33卷，第751-763页))。小麦TaDREB1在水稻中的组成型过度表达导致生长缓慢(Shenetal，2003，TheorApplGenet106：923-930(Shen等人，2003年，《理论与应用遗传学》，第106卷，第923-930页))。拟南芥DREB1A在烟草中的组成型过度表达导致生长缓慢(Kasugaetal，2004，PlantCellPhysiol45：346-350(Kasuga等人，2004年，《植物细胞生理学》，第45卷，第346-350页))。玉蜀黍ZmDREB2A在拟南芥中的组成型过度表达导致生长缓慢(Qinetal，2007，PlantJ50：54-69(Qin等人，2007年，《植物杂志》，第50卷，第54-69页))。水稻OsDREB2B在拟南芥中的组成型过度表达导致生长缓慢(Matsukuraetal，2010，MolGenetGenomics283：185-196(Matsukura等人，2010年，《分子遗传学与基因组学》，第283卷，第185-196页))。已使用胁迫诱导型启动子来克服以转基因方式表达转录因子时的多效性。
令人惊讶的是，根据发现，截短的玉蜀黍DREB2(称为ZmSRTF18)的组成型过度表达改善了在有利环境中、在降低的氮供应的条件下及在干旱条件下的玉蜀黍谷粒产量，而无显著负多效性效应。此外，该玉蜀黍DREB2展示出多个剪接变体。所选择的剪接变体或截短物的组成型表达或靶向表达可提高调节转录因子影响的精确度，从而提供改善的植物性能，尤其是在非生物胁迫的条件下。
AP2/ERF转录因子家族的成员包含约58个氨基酸的高度保守的AP2结构域(SEQIDNO：10)。AP2/ERF家族分为四个亚家族：AP2、RAV、DREB和ERF。有关综述，请参见Mizoietal.(2012)Bioch.Biophys.Acta1819：86-96(Mizoi等人，2012年，《生物化学与生物物理学报》，第1819卷，第86-96页)。
DREB(脱水响应元件结合)转录因子分别结合于如下胁迫响应性基因的启动子中的C重复序列/DRE核心元件：TGGCCGAC或A/GCCGAC。参见例如，Srivastavetal.(2010)PlantSignalingandBehavior5(7)：775-784(Srivastav等人，2010年，《植物信号传导与行为》，第5卷，第7期，第775-784页)。DREB亚家族进一步分为两个亚组：DREB1和DREB2。DREB1(也称为CBF)蛋白质的典型特征是N端核定位信号、AP2结构域和C端活化结构域。
DREB1/CBF蛋白质包含特征序列PKKP/RAGRxKFxETRHP(简称PKKPAGR)和DSAWR，它们分别位于AP2/ERFDNA结合结构域的上游和下游。Canellaetal.(2010)BiochimBiophysActa.1799(5-6)：454-62(Canella等人，2010年，《生物化学与生物物理学报》，第1799卷，第5-6期，第454-462页)。这些特征序列在来自多样植物物种的DREB1/CBF蛋白质中是高度保守的。这两个CBF特征序列可统称为CBF结构域。与DREB1/CBF蛋白质不同，DREB2型蛋白质不包含DREB1/CBF特征序列。Qin，etal.(2007)PlantJ.50：54(Qin等人，2007年，《植物杂志》，第50卷，第54页)。
ZmSRTF18已从玉蜀黍分离；它是DREB2亚组的成员，包含4个外显子。图2显示，所预测的ZmSRTF18剪接变体1.1、1.2和1.3高度相似，包含4个外显子每者的全部或一部分，并且编码功能性蛋白质。剪接变体1.4(也称为SPLVAR4)仅包含外显子1和4，但有功能。
另一种包含外显子1、2和4的玉蜀黍剪接变体包含翻译提前终止密码子；所编码的蛋白质没有功能。剪接变体1.3、1.4和提前终止的转录物大致对应于大麦和小麦中识别的变体。
剪接变体1.3和1.4已通过PCR克隆和测序来确认。确认剪接变体1.1和1.2的存在在技术上有难度，因为它们彼此相似并与剪接变体1.3相似，而且还因为存在大量错误剪接变体。
截短变体，称为ZmSRTF18-del，比最短的天然存在的功能性剪接变体要短71个氨基酸。ZmSRTF18-del不含由外显子1、2和3编码的所有氨基酸，并且不含由外显子4编码的52个氨基酸。外显子4的这种部分丧失导致丧失两个推定的核定位信号(NLS)。参见图3。
操纵这些变体和/或其他ZmSRTF18变体的表达，有助于提供改善的植物性能，包括种子产量，尤其是在非生物胁迫诸如干旱或低氮条件下。
提到的所有参考文献均以引用方式并入本文。
除非另外明确定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非另外提出，否则本文所采用或所考虑的技术是本领域普通技术人员所熟知的标准方法。材料、方法和实例仅为示例性的而不是限制性的。以下内容以举例说明的方式给出，而非意在限制本发明的范围。
借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，这些公开内容所属领域的技术人员将会想到本文所述公开内容的许多修改形式和其他实施例。因此，应当理解，本公开不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在所附权利要求的范围内。虽然本文中采用特定术语，但所述术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。
除非另外指明，否则本发明的实施将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这些技术处于本领域技能范围内。
单位、前缀和符号可以它们SI接受的形式表示。除非另外指明，否则分别地，核酸以5’至3’取向从左向右书写；氨基酸序列以氨基向羧基取向从左向右书写。数值范围包括限定该范围的数字。氨基酸在本文中可通过它们通常知道的三字母符号表示或通过IUPAC-IUB生化命名委员会(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可通过它们通常接受的单字母密码表示。下面定义的术语通过参考本说明书整体进行更完整的定义。
在描述本发明时，将采用下面的术语，并旨在以如下所示进行定义。
所谓“微生物”意指任何微生物(包括真核微生物和原核微生物)，诸如真菌、酵母、细菌、放线菌、藻类和原生动物以及其他单细胞结构。
所谓“扩增”意指构建核酸序列的多个拷贝或与该核酸序列互补的多个拷贝，该构建是利用所述核酸序列中的至少一者作为模板进行。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链式反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，安大略省米西索加市加拿大基因公司(Cangene，Mississauga，Ontario))、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA)。参见例如DiagnosticMolecularMicrobiology：PrinciplesandApplications，Persing，etal.，eds.，AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，DC(1993)(《诊断分子微生物学：原理和应用》，Persing等人编辑，美国微生物学会，华盛顿特区，1993年)。扩增的产物称为扩增子。
术语“保守修饰的变体”同时适用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定核酸序列而言，保守修饰的变体指编码氨基酸序列的相同的或保守修饰的变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码丙氨酸这种氨基酸。因而，在每个由密码子规定的丙氨酸的位置，可将该密码子变更为所描述的相应密码子的任一种而不会改变所编码的多肽。这种核酸变异为“沉默变异”，代表保守修饰变异的一种。本文中编码多肽的每种核酸序列还描述了该核酸的每种可能的沉默变异。普通技术人员将认识到，可修饰核酸中的每种密码子(AUG除外，其通常为甲硫氨酸的唯一密码子；一个例外是红色微球菌(Micrococcusrubens)，对于其来说GTG是甲硫氨酸密码子(Ishizuka，etal.，(1993)J.Gen.Microbiol.139：425-32(Ishizuka等人，1993年，《普通微生物学杂志》，第139卷，第425-432页))以获得功能上相同的分子。因此，编码本发明多肽的核酸的每种沉默变异均隐含在每种所描述的多肽序列中并以引用方式并入本文。
至于氨基酸序列，技术人员会认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列的各个单独置换、缺失或添加(其使被编码的序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸变更、添加或缺失)在该变更导致氨基酸被化学上相似的氨基酸置换时，为“保守修饰变体”。因而，还可变更选自1至15的整数的任何数目的氨基酸残基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10个变更。保守修饰的变体通常提供与它们所源自的未经修饰的多肽序列类似的生物活性。例如，对于其天然底物而言，底物特异性、酶活性或配体/受体结合通常为天然蛋白的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，优选60-90％。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域所熟知的。
下面的六个组各自含有对彼此而言是保守置换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
另参见Creighton，Proteins，W.H.FreemanandCo.(1984)(Creighton，《蛋白质》，W.H.弗里曼公司，1984年)。
如本文所用，“基本上由...组成”意指在如下情况下目标多核苷酸或多肽可包括额外的序列：额外的序列不会实质影响受权利要求保护的多核苷酸或多肽序列的基本功能。
术语“构建体”用来主要指多核苷酸序列的人工组合，即在自然界中不会发生的、通常包含一个或多个调节元件和一个或多个编码序列的组合。该术语可包括指表达盒和/或载体序列，视上下文而定。
“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供度量其中已针对所关注基因实现了遗传变更(诸如转化)的受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。受试植物或植物细胞可从作了如此变更的植物或细胞遗传而来，且会包含该变更。
对照植物或植物细胞可包括例如：(a)野生型植物或细胞，即与用于进行遗传变更得到受试植物或细胞的原始材料有相同的基因型；(b)与原始材料有相同的基因型、但已转化了无效(null)构建体(即转化了对所关注性状已知没有作用的构建体，如包含标记基因的构建体)的植物或植物细胞；(c)属受试植物或植物细胞的子代中非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与受试植物或植物细胞相同、但不被暴露于会诱导所关注基因的表达的条件或刺激的植物或植物细胞或者(e)处于所关注基因不被表达的条件下的受试植物或植物细胞本身。对照植物还可以是用另选的构建体转化的植物。
就指定的核酸而言，所谓“编码”意指包含翻译成指定蛋白质的信息。编码蛋白质的核酸可以包含在所述核酸的翻译区内的非翻译序列(例如内含子)或可以缺少这种居间的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。据以编码蛋白质的信息是通过使用密码子来确定的。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遗传密码来编码。然而，当使用这些生物体表达该核酸时，可以使用诸如在某些植物、动物和真菌线粒体、细菌山羊支原体(Mycoplasmacapricolum)(Yamao，etal.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：2306-9(Yamao等人，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第2306-2309页))或纤毛虫大核(ciliateMacronucleus)中存在的通用密码的变体。
当通过合成法制备或改变核酸时，可利用将在其中表达核酸的预期宿主的已知密码子偏好性。例如，尽管本发明的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达，但可对序列进行修饰以考虑单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性，因为这些偏好性已被证实不同(Murray，etal.，(1989)NucleicAcidsRes.17：477-98(Murray等人，《核酸研究》，第17卷，第477-498页)，该文献以引用方式并入本文)。因而，具体氨基酸的玉蜀黍偏好密码子可由来自玉蜀黍的已知基因序列得出。关于来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍密码子用法在Murray等人(出处同上)的表4中列出。
如本文所用，术语“内源”在参考基因使用时意指通常存在于指定生物体的细胞的基因组中并且以其常态存在于细胞中(即，以其通常存在于自然中的状态存在于基因组中)的基因。
术语“外源”在本文中是指被引入细胞的任何材料。术语“外源核酸分子”或“转基因”是指通常不存在于细胞基因组中或被引入细胞中的任何核酸分子。此类外源核酸分子通常为使用如本文所公开的重组DNA方法或者本领域中已知的其他方式生成的重组核酸分子。在各种实施例中，如本文所公开的转基因非人类生物体可包含，例如，第一转基因和第二转基因。此类第一和第二转基因可引入到细胞中，例如，转基因生物体的祖细胞，作为单独核酸分子或作为单个单元(例如，分别包含在不同载体或包含在单个载体中)。在任一种情况下，可确定待从中得到转基因生物体的细胞包含使用常规和已知方法诸如标记基因的表达，或核酸杂交或PCR分析的两种转基因。作为另外一种选择或除此之外，转基因存在的确定可较晚进行，例如，在植物由推定的转化细胞再生后进行。
如本文所用，针对核酸的“异源”为起源于外来物种的核酸，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行了实质性修饰的核酸。例如，有效连接至异源结构基因的启动子是来自不同于该结构基因衍生自的物种的物种，或者如果是来自相同的物种，则对一者或二者由其初始形式进行了实质性修饰。异源蛋白质可起源于外来物种，或者，如果起源于相同物种，则通过蓄意的人为干预对其初始形式进行了实质性修饰。
所谓“宿主细胞”意指包含本发明的异源核酸序列、含有载体并能支持该表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞如酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞，包括但不限于玉蜀黍、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、水稻、棉花、卡诺拉油菜、大麦、小米和番茄。特别优选的单子叶宿主细胞是玉蜀黍宿主细胞。
术语“杂交复合物”包括指涉由相互选择性杂交的两条单链核酸序列形成的双链核酸结构。
在将核酸插入细胞的语境中，术语“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并包括指涉将核酸并入真核或原核细胞中，其中该核酸可并入细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
术语“分离的”指诸如核酸或蛋白质之类的物质，该物质实质上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的通常与其相伴随或与其相互作用的组分。术语“非天然存在的”、“突变的”、“重组的”、“重组表达的”、“异源的”或“异源表达的”是不存在于其天然存在的环境中的代表性生物物质。
就植株来说，所谓的“株系”意指遗传上相同植株的集合。
术语“NUE核酸”意指包含编码完全长度或部分长度多肽的多核苷酸(“NUE多核苷酸”)的核酸。
如本文所用，“核酸”包括指涉单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物：其以与天然存在的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式杂交至单链核酸。
所谓“核酸文库”意指分离的DNA或RNA分子的集合，它们包含且实质上代表指定生物体的基因组的整个被转录的部分。示例性的核酸文库如基因组文库和cDNA文库的构建在标准的分子生物学参考书有教导，如BergerandKimmel，(1987)GuideToMolecularCloningTechniques，fromtheseriesMethodsinEnzymology，vol.152，AcademicPress，Inc.，SanDiego，CA(Berger和Kimmel，1987年，《分子克隆技术指南》，选自丛书《酶学方法》，第152卷，学术出版社，加州圣地亚哥)；Sambrook，etal.，(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual，2nded.，vols.1-3(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，第1-3卷)；以及CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel，etal.，eds，CurrentProtocols，ajointventurebetweenGreenePublishingAssociates，Inc.andJohnWiley&Sons，Inc.(1994Supplement)(《最新分子生物学实验方法汇编》，Ausubel等人编辑，《最新实验方法汇编》，格林出版公司和约翰威立父子公司的合资公司，1994年增刊)。
本文所用的“有效连接”包括指第一序列(诸如启动子)和第二序列之间的功能连接，其中该启动子序列引发和介导对应于该第二序列的DNA的转录。一般来讲，有效连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白编码区的话，是连续的且在相同的阅读框内。
如本文所用，术语“植物”包括指涉整个植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子和植物细胞和它们的子代。如本文所用，植物细胞包括但不限于存在于植物组织中或与植物组织分离的细胞，包括种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本发明方法的植物种类通常与适用于转化技术的高等植物种类一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物，包括以下属的种：南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、马珠草属(Majorana)、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、蛾蝶花属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、布洛华丽属(Browaalia)、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、葱属(Allium)和小麦属(Triticum)。特别优选的植物是玉米(Zeamays)。
本文所用的“产量”可包括指收获时每英亩谷类作物的蒲式耳数，该值针对谷粒水分(例如，对于玉蜀黍通常是15％)和/或所产生的生物量的体积(对于草料作物诸如苜蓿而言，以及复种作物的植株根尺寸)进行了调整。谷粒水分是在收获时的谷粒中测量。谷粒的经调整的测试重量确定为针对收获时的谷粒水分水平进行了调整的重量，单位为磅/蒲式耳。生物量被测量为所产生的可收获植物材料的重量。
如本文所用，“多核苷酸”包括指涉脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其类似物，所述类似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性质：在严格杂交条件下其所杂交的核苷酸序列与天然存在的核苷酸所杂交的核苷酸序列实质上相同，和/或可翻译成与天然存在的核苷酸所翻译的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构基因或调控基因的全长序列或其子序列。除非另外指明，否则该术语可包括指特定的序列及其互补序列。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
本文所用的“启动子”包括指涉在转录起始的上游的DNA区域，该区域涉及RNA聚合酶和其他蛋白的识别和结合以起始转录。“植物启动子”是能够引发在植物细胞中的转录的启动子。示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基因的细菌(诸如农杆菌属(Agrobacterium)或根瘤菌属(Rhizobium))获得的那些启动子。例子为优先起始在某些组织，例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织中的转录的启动子。这种启动子称为“组织偏好的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一种或多种器官中的某些细胞类型(例如，根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”或“调控型”启动子是处于环境控制下的启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的例子包括无氧条件或光的存在。另一类型的启动子是发育调节启动子，例如在花粉发育过程中驱动表达的启动子。组织偏好的、细胞类型特异性的、发育调节的和诱导型的启动子是“非组成型”启动子类别的成员。“组成型”启动子为在发育或细胞分化的大多数环境条件和状态下，在植物的基本上所有组织中都有活性的启动子。
术语“多肽”指一条或多条氨基酸序列。该术语还包括其片段、变体、同源物、等位基因或前体(例如原前蛋白或前蛋白)。“NUE蛋白质”包含多肽。除非另有规定，否则术语“NUE核酸”意指包含编码多肽的多核苷酸(“NUE多核苷酸”)的核酸。
如本文所用，“重组的”包括指涉已通过引入异源核酸进行修饰的细胞或载体，或者源于经这样修饰过的细胞的细胞。因而，例如，重组细胞表达不以天然(非重组)形式的细胞内的相同形式存在的基因，或因为蓄意人为干预而表达原本异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因，或可具有减低的或消除的天然基因表达。如本文所用，术语“重组的”不涵盖通过天然发生的事件(例如自发突变、天然转化/转导/转座)进行的细胞或载体的变更，所述事件为例如在没有蓄意人为干预的情况下发生的那些。
如本文所用，“重组表达盒”是具有一系列规定核酸元件的通过重组法或合成法产生的核酸构建体，其允许特定核酸在靶细胞中转录。重组表达盒可掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了别的序列以外，表达载体的重组表达盒部分还包含待转录的核酸和启动子。
术语“选择性杂交”包括指涉在严格杂交条件下核酸序列与指定的核酸靶序列杂交的程度比其与非靶序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)，并且实质上排除非靶核酸。选择性杂交的序列通常相互具有约至少40％的序列同一性，优选60-90％的序列同一性，且最优选100％的序列同一性(即，互补性)。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的情况中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可识别与探针最高可达100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调节严格条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。优选地，探针长为大约500个核苷酸，但长度可变化很大，从小于500个核苷酸到等于靶序列的整个长度。
通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少约30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件也可通过添加去稳定剂诸如甲酰胺或或登哈特试剂(Denhardt’s)来实现。示例性的低严格条件包括在37℃用30％至35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50℃至55℃于1X至2XSSC(20XSSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格条件包括在37℃于40％至45％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中杂交和在55℃至60℃于0.5X至1XSSC中洗涤。示例性的高严格条件包括在37℃于50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中杂交，以及在60℃至65℃于0.1XSSC中洗涤。特异性通常随杂交后的洗涤而变化，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可根据MeinkothandWahl，(1984)Anal.Biochem.，138：267-84(Meinkoth和Wahl，1984年，《分析生物化学》，第138卷，第267-284页)的公式估计：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm为50％的互补靶序列杂交至完全匹配的探针时的温度(在确定的离子强度和pH下)。每1％错配，Tm降低约1℃，因而，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件以与具有所需同一性的序列杂交。例如，如果需要具有≥90％同一性的序列，则Tm可降低10℃。一般来讲，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)1、2、3或4℃下杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)6、7、8、9或10℃下杂交和/或洗涤；低严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)11、12、13或14、15或20℃下杂交和/或洗涤。利用所述公式、杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员应当理解，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度，从而可以使用更高的温度。有关核酸的杂交的详尽指南见于以下文献：Tijssen，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes，partI，chapter2，“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays”，Elsevier，NewYork(1993)(Tijssen，《生物化学和分子生物学实验技术——与核酸探针的杂交》，第I部分，第2章，“有关杂交原理和核酸探针分析策略的综述”，爱思唯尔，纽约，1993年)；以及CurrentProtocolsinMolecularBiology，chapter2，Ausubel，etal.，eds，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork(1995)(《最新分子生物学实验方法汇编》，第2章，Ausubel等人编辑，格林出版和Wiley-Interscience出版公司，纽约，1995年)。除非另外指明，否则在本专利申请中，高严格性定义为在65℃下在4XSSC、5X登哈特试剂(500ml水中的5gFicoll，5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)、0.1mg/ml煮沸鲑精DNA和25mM磷酸钠中杂交，并在65℃下在0.1XSSC、0.1％SDS中洗涤。
本文所用的“转基因植物”包括指在其基因组中包含异源多核苷酸的植物。一般来讲，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内使得该多核苷酸得以传递到连续世代。可将异源多核苷酸单独整合进基因组中或作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。“转基因”在本文中用于包括其基因型已因异源核酸的存在而改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株，包括那些最初经如此改变的转基因植物以及通过有性杂交或无性繁殖从最初的转基因植物产生的那些。如本文所用，术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件(如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)进行的基因组(染色体或染色体外)变更。
如本文所用，“载体”包括指涉用于转染宿主细胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。载体常常是复制子。表达载体容许插入其中的核酸的转录。
以下术语用于说明两个或更多个核酸或多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分数”和(e)“实质同一性”。
如本文所用，“参考序列”是用作序列比较基准的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全体；例如，作为全长cDNA或基因序列的区段，或者完全的cDNA或基因序列。
如本文所用，“比较窗口”意在包括指涉多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中该多核苷酸序列可与参考序列比较，并且其中该比较窗口中的该多核苷酸序列的部分相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两个多核苷酸的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续核苷酸，任选可为30、40、50、100个或者更长。本领域技术人员应当理解，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
将核苷酸和氨基酸序列进行比对以作比较的各种方法是本领域公知的。SmithandWaterman，(1981)Adv.Appl.Math2：482(Smith和Waterman，1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页)的局部同源算法(BESTFIT)可对用于比较的序列进行最佳比对；通过如下方法进行：NeedlemanandWunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-53(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的同源比对算法(GAP)；PearsonandLipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444(Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化执行，包括但不限于：Intelligenetics(加利福尼亚州山景城(MountainView，California))的PC/Gene程序中的CLUSTAL、WisconsinGeneticsSoftware第8版(可得自GeneticsComputerGroup(程序(Accelrys公司(加利福尼亚州圣地亚哥(SanDiego，CA)))中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。CLUSTAL程序在以下文献中得到很好的描述：HigginsandSharp，(1988)Gene73：237-44(Higgins和Sharp，1988年，《基因》，第73卷，第237-244页)；HigginsandSharp，(1989)CABIOS5：151-3(Higgins和Sharp，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)；Corpet，etal.，(1988)NucleicAcidsRes.16：10881-90(Corpet等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第10881-10890页)；Huang，etal.，(1992)ComputerApplicationsintheBiosciences8：155-65(Huang等人，1992年，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-165页)以及Pearson，etal.，(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-31(Pearson等人，1994年，《分子生物学方法》，第24卷，第307-331页)。用于多个序列的最佳全局比对的优选程序是PileUp(FengandDoolittle，(1987)J.Mol.Evol.，25：351-60(Feng和Doolittle，1987年，《分子进化学杂志》，第25卷，第351-360页)，其类似于HigginsandSharp，(1989)CABIOS5：151-53(Higgins和Sharp，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)中描述的方法，该文献以引用方式并入本文)。可用于数据库相似性搜索的BLAST家族程序包括：BLASTN，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；BLASTX，用于核苷酸查询序列针对蛋白数据库序列进行查询；BLASTP，用于蛋白查询序列针对蛋白数据库序列进行查询；TBLASTN，用于蛋白查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；以及TBLASTX，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询。参见CurrentProtocolsinMolecularBiology，Chapter19，Ausubeletal.，eds.，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork(1995)(《最新分子生物学实验方法汇编》，第19章，Ausubel等人编辑，格林出版公司和威利-英特科学出版公司，纽约，1995年)。
GAP利用Needleman和Wunsch(出处同上)的算法来寻找两个完整序列的比对，该比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它使得可以提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，都必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。WisconsinGenetics软件包第10版中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。空位产生罚分和空位延伸罚分可以表述为选自0至100的整数。因而，例如，空位产生和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更大。
GAP给出该家族中的具有最佳比对的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因子：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了比对序列而最大化的度量(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将相应于空位的符号忽略。当一对符号的打分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，对相似性打分。威斯康星遗传学软件包版本10中所用的打分矩阵为BLOSUM62(参见HenikoffandHenikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页))。
除非另外指明，否则本文所提供的序列同一性/相似性值指用BLAST2.0程序包，采用默认参数获得的值(Altschul，etal.，(1997)NucleicAcidsRes.25：3389-402(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页))。
如本领域普通技术人员将会理解的，BLAST搜索假定蛋白可以随机序列建模。然而，许多真实蛋白包含非随机序列区，该非随机序列可为同聚段、短周期重复或富含一种或多种氨基酸的区域。这种低复杂性区域可在不相关的蛋白之间比对，尽管该蛋白的其他区域完全不相似。可采用多种低复杂性过滤程序来减少这种低复杂性比对。例如，可单独使用或联合使用SEG(WootenandFederhen，(1993)Comput.Chem.17：149-63(Wooten和Federhen，1993年，《计算化学杂志》，第17卷，第149-163页))和XNU(ClaverieandStates，(1993)Comput.Chem.17：191-201(Claverie和States，1993年，《计算化学杂志》，第17卷，第191-201页))低复杂性过滤程序。
在两条多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。如果序列差别在于保守置换，则可上调序列同一性百分数以校正置换的保守性质。差异在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的手段是本领域技术人员熟知的。通常，这涉及将保守置换打分为部分错配而不是完全错配，从而提高序列同一性百分数。因此，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。例如，根据MeyersandMiller，(1988)ComputerApplic.Biol.Sci.4：11-17(Meyers和Miller，1988年，《计算机在生物科学中的应用》，第4卷，第11-17页)的算法计算保守置换的分数，(例如)如在程序PC/GENE(美国加利福尼亚州山景城Intelligenetics公司(Intelligenetics，MountainView，California，USA))中所实现的。
本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
术语多核苷酸序列的“基本上相同”意指包含这样的序列的多核苷酸，该序列与参考序列相比具有50-100％序列同一性，任选地至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性，所述比较是使用所描述的比对程序中的一种并采用标准参数进行的。技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这些值以确定两个核苷酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的实质同一性通常意指55-100％之间的序列同一性，诸如至少55％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、最高至100％的同一性。
在肽的情形中术语“实质同一性”指肽包含在指定比较窗口上与参考序列具有55-100％之间的序列同一性，诸如与参考序列具有至少55％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、最高至100％的序列同一性的序列。优选地，利用Needleman和Wunsch(出处同上)的同源比对算法进行最佳比对。两条肽序列实质上相同的指示是，一种肽可与针对第二种肽所产生的抗体发生免疫反应。因而，例如，如果某种肽与第二种肽差别仅在于保守置换的话，则这两种肽实质上相同。此外，当某种肽与第二种肽差别在于非保守变化时，如果抗体识别的表位实质上相同，则它们实质上相同。“实质上相似的”肽共有如上所述的序列，例外的是不相同的残基位置差别可在于保守氨基酸变化。
核酸的构建
可用(a)标准的重组方法、(b)合成技术或二者的组合产生分离的本发明核酸。在一些实施例中，本发明的多核苷酸将从真菌或细菌克隆、扩增或以别的方式构建。
UTR和密码子偏好性
一般而言，已发现翻译效率受RNA的5’非编码区或非翻译区(5’UTR)中的特定序列元件的调控。正序列基序包括翻译起始共有序列(Kozak，(1987)NucleicAcidsRes.15：8125(Kozak，1987年，《核酸研究》，第15卷，第8125页))和5<G>7甲基GpppGRNA帽结构(Drummond，etal.，(1985)NucleicAcidsRes.13：7375(Drummond等人，1985年，《核酸研究》，第13卷，第7375页))。负元件包括稳定的分子内5’UTR茎-环结构(Muesing，etal.，(1987)Cell48：691(Muesing等人，1987年，《细胞》，第48卷，第691页))和5’UTR中的AUG序列或前面有适当AUG的短开放阅读框(Kozak(出处同上)，Rao，etal.，(1988)Mol.andCell.Biol.8：284(Rao等人，1988年，《分子与细胞生物学》，第8卷，第284页))。因此，本发明提供了用于调节异源编码序列的翻译的5’和/或3’UTR区。
另外，可修饰本发明多核苷酸的多肽编码区段以改变密码子使用。可采用改变了的密码子用法，来改变翻译效率和/或优化编码序列在所需宿主中的表达或为了在玉蜀黍中表达而优化异源序列中的密码子用法。本发明的多核苷酸的编码区中的密码子用法可用可商购获得的软件包(诸如可得自威斯康星大学遗传学计算机组(UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup)的“密码子偏好性(CodonPreference)”)进行统计分析。参见Devereaux，etal.，(1984)NucleicAcidsRes.12：387-395(Devereaux等人，1984年，《核酸研究》，第12卷，第387-395页)或MacVector4.1(康涅狄格州纽黑文的伊士曼柯达公司(EastmanKodakCo.，NewHaven，Conn.))。因而，本发明提供了本发明多核苷酸中的至少一者的编码区的密码子使用频率特性。可用于确定密码子使用频率的多核苷酸的数目(每个氨基酸3个核苷酸)可以为从3至本文所提供的本发明多核苷酸的数目的任何整数。任选地，多核苷酸将为全长序列。用于统计分析的序列的示例性数目可以为至少1、5、10、20、50或100。
序列改组
本发明提供了使用本发明多核苷酸进行序列改组的方法以及由此得到的组合物。序列改组在PCT专利公布No.1996/19256中有描述。另参见Zhang，etal.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-9(Zhang等人，1997年，《美国国家科学院院刊》，第94卷，第4504-4509页)和Zhao，etal.，(1998)NatureBiotech16：258-61(Zhao等人，1998年，《自然生物技术》，第16卷，第258-261页)。一般来讲，序列改组提供用于产生具有所需特性的多核苷酸的文库的手段，可对该文库进行选择或筛选。从一群包含具有实质序列同一性并可在体外或体内进行同源重组的序列区的相关序列多核苷酸产生重组多核苷酸的文库。序列重组的多核苷酸的群体包含具有所需的或有利的特性并且可通过合适的选择或筛选方法来选择的多核苷酸的亚群。所述特性可以为任何能够在筛选系统中被选择或检测的性质或属性，可包括：所编码的蛋白质、转录元件、控制转录的序列、RNA加工、RNA稳定性、染色质构象、基因或转基因的翻译或其他表达性质、复制元件、蛋白质结合元件等等的性质，例如赋予可选择或可检测性质的任何特征。在一些实施例中，选择的特性将是相对于本文所提供的野生型蛋白质而言改变了的Km和/或Kcat。在其他实施例中，序列改组所产生的蛋白质或多核苷酸具有的配体结合亲和力将比非改组的野生型多核苷酸的高。在另外其他实施例中，与非改组的野生型多核苷酸相比，序列改组所产生的蛋白质或多核苷酸将具有改变了的最佳pH。这类性质的提高可为野生型值的至少110％、120％、130％、140％或高于150％。
重组表达盒
本发明还提供包含本发明的核酸的重组表达盒。可将编码所需的本发明多核苷酸的核酸序列，例如编码长度足以编码本发明的活性蛋白质的多肽的cDNA或基因组序列用于构建重组表达盒，可将该表达盒引入所需的宿主细胞。重组表达盒将通常包含有效连接至转录起始调控序列的本发明多核苷酸，所述转录起始调控序列将引导所述多核苷酸在预期的宿主细胞(诸如转化植物的组织)中的转录。
例如，植物表达载体可包含(1)处于5′和3′调控序列的转录控制下的克隆植物基因和(2)显性选择性标记。如果需要，这种植物表达载体还可含有启动子调控区(例如，赋予诱导型表达或组成型表达，由环境或发育调节的表达，或细胞或组织特异性/选择性表达的启动子调控区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
启动子、终止子、内含子
可采用会引导本发明多核苷酸在再生植物的基本上所有组织中表达的植物启动子片段。这种启动子在本文中称为“组成型”启动子并且在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下是活跃的。组成型启动子的例子包括源于根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的T-DNA的1’-或2’-启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利No.5,683,439)、Nos启动子、Rubisco启动子、GRP1-8启动子、来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，如Odell，etal.，(1985)Nature313：810-2(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页)中所述；水稻肌动蛋白启动子(McElroy，etal.，(1990)PlantCell163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第163-171页))；泛素(Christensen，etal.，(1992)PlantMol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen，etal.，(1992)PlantMol.Biol.18：675-89(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；pEMU(Last，etal.，(1991)Theor.Appl.Genet.Genet.81：581-8(Last等人，1991年，《理论与应用遗传学》，第81卷，第581-588页))；MAS(Velten，etal.，(1984)EMBOJ.3：2723-30(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页))和玉蜀黍H3组蛋白(Lepetit，etal.，(1992)Mol.Gen.Genet.231：276-85(Lepetit等人，1992年，《分子和普通遗传学》，第231卷，第276-285页)和Atanassvoa，etal.，(1992)PlantJournal2(3)：291-300(Atanassvoa等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第3期，第291-300页))；ALS启动子，如PCT专利申请No.WO1996/30530中所述；以及本领域技术人员所知的来自多种植物基因的其他转录起始区。对于本发明而言，泛素启动子是用于单子叶植物中表达的优选启动子。
或者，植物启动子可指导本发明的多核苷酸在特定组织中的表达或者可另外在更精确的环境或发育控制下的表达。此类启动子可为“诱导型”启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件包括病原体攻击、无氧条件或光的存在。诱导型启动子的例子是Adh1启动子(其可通过低氧或寒冷胁迫诱导)、Hsp70启动子(其可通过热胁迫诱导)和PPDK启动子(其可通过光诱导)。在昼夜节律期间的不同时间都有活性的昼夜启动子也是已知的(美国专利申请公布No.2011/0167517，以引用方式并入本文)。
在发育控制下的启动子的例子包括仅仅或优先在某些组织(诸如叶、根、果实、种子或花)中起始转录的启动子。取决于启动子在基因组的位置，启动子的操作也可以变化。因而，诱导型启动子在某些位置可变为完全或部分组成型的。
如果多肽表达是所需的，则通常期望在多核苷酸编码区的3’-端包括多腺苷酸化区。该多腺苷酸化区可源于多种植物基因，或源于T-DNA。待添加的3’端序列可源于(例如)胭脂氨酸合酶或章鱼氨酸合酶基因，或者源于另一植物基因，或较不优选地，源自任何其他真核基因。这些调控元件的例子包括但不限于3’末端和/或聚腺苷区域，诸如根瘤农杆菌胭脂氨酸合酶(nos)基因的那些(Bevan，etal.，(1983)NucleicAcidsRes.12：369-85(Bevan等人，1983年，《核酸研究》，第12卷，第369-385页))；马铃薯蛋白酶抑制剂II(PINII)基因(Keil，etal.，(1986)NucleicAcidsRes.14：5641-50(Keil等人，1986年，《核酸研究》，第14卷，第5641-5650页)和An，etal.，(1989)PlantCell1：115-22(An等人，1989年，《植物细胞》，第1卷，第115-122页))和CaMV19S基因(Mogen，etal.，(1990)PlantCell2：1261-72(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页))。
可将内含子序列添加至部分编码序列的5’非翻译区或编码序列以增加胞质溶胶中积聚的成熟信息的量。在植物和动物表达构建体中的转录单位中包含可剪接的内含子，已证实在mRNA水平上和蛋白质水平上都能增加基因表达最高达1000倍(BuchmanandBerg，(1988)Mol.CellBiol.8：4395-4405(Buchman和Berg，1988年，《分子细胞生物学》，第8卷，第4395-4405页)；Callis，etal.，(1987)GenesDev.1：1183-200(Callis等人，1987年，《基因研究》，第1卷，第1183-1200页))。当设置在接近转录单位的5’端时，这种基因表达的内含子增强通常是最大的。玉蜀黍内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的使用是本领域已知的。一般参见TheMaizeHandbook，Chapter116，FreelingandWalbot，eds.，Springer，NewYork(1994)(《玉蜀黍手册》，第116章，Freeling和Walbot编辑，斯普林格出版社，纽约，1994年)。
信号肽序列
包括但不限于如下的植物信号序列可用于本发明中：编码将蛋白质靶向植物细胞的胞外基质的DNA/RNA序列的信号肽(Dratewka-Kos，etal.，(1989)J.Biol.Chem.264：4896-900(Dratewka-Kos等人，1989年，《生物化学杂志》，第264卷，第4896-4900页))，诸如皱叶烟草(Nicotianaplumbaginifolia)延伸基因(DeLoose，etal.，(1991)Gene99：95-100(DeLoose等人，1991年，《基因》，第99卷，第95-100页))；将蛋白质靶向液泡的信号肽，诸如甘薯贮藏蛋白基因(Matsuka，etal.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：834(Matsuka等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第834页))和大麦凝集素基因(Wilkins，etal.，(1990)PlantCell，2：301-13(Wilkins等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第301-313页))；促使蛋白质被分泌的信号肽，诸如PRIb信号肽(Lind，etal.，(1992)PlantMol.Biol.18：47-53(Lind等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第47-53页))或大麦α淀粉酶(BAA)(Rahmatullah，etal.，(1989)PlantMol.Biol.12：119(Rahmatullah等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第119页)；或者将蛋白质靶向质体的信号肽，诸如油菜籽烯酰-Acp还原酶信号肽(Verwaert，etal.，(1994)PlantMol.Biol.26：189-202(Verwaert等人，1994年，《植物分子生物学》，第26卷，第189-202页))。
标记
包含来自本发明多核苷酸的序列的载体将通常包含标记基因，该标记基因可在植物细胞上赋予选择性表型。选择性标记基因可编码抗生素抗性，合适的基因包括编码对抗生素壮观霉素的抗性的基因(例如aada基因)、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因。同样有用的是编码对能抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂(特别是磺酰脲型除草剂)的抗性的基因(例如含有导致这种抗性的突变，特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)，编码对能抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂(诸如草胺膦或basta)的抗性的基因(例如bar基因)，或者本领域已知的其他此类基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，ALS基因编码对除草剂氯磺隆的抗性。
本文所述的构建体可包含编码报告基因或标记产物的所关注多核苷酸。本领域已知的合适的报告分子多核苷酸的例子可见于例如以下文献：Jeffersonetal.(1991)inPlantMolecularBiologyManual，ed.Gelvinetal.(KluwerAcademicPublishers)，pp.1-33(Jefferson等人，1991年，载于《植物分子生物学手册》，Gelvin等人编辑，克吕维尔学术出版社，第1-33页)；DeWetetal.Mol.Cell.Biol.7：725-737(1987)(DeWet等人，《分子细胞生物学》，第7卷，第725-737页，1987年)；Goffetal.EMBOJ.9：2517-2522(1990)(Goff等人，《欧洲分子生物学组织杂志》，第9卷，第2517-2522页，1990年)；Kainetal.BioTechniques19：650-655(1995)(Kain等人，《生物技术》，第19卷，第650-655页，1995年)；以及Chiuetal.CurrentBiology6：325-330(1996)(Chiu等人，《当代生物学》，第6卷，第325-330页，1996年)。在某些实施例中，所关注的多核苷酸编码选择性报告基因。这些多核苷酸可包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的多核苷酸。合适的选择性标记多核苷酸的例子包括但不限于编码对氯霉素、甲氨蝶呤、潮霉素、链霉素、壮观霉素、博来霉素、磺酰胺、溴苯腈、草甘膦和膦丝菌素的抗性的基因。
在一些实施例中，本文公开的表达盒包含编码可评分的或可筛选的标记的所关注多核苷酸，其中所述多核苷酸的存在产生可测量的产物。例子包括β-葡糖苷酸酶或uidA基因(GUS)，其编码各种显色底物已知的酶(例如，美国专利No.5,268,463和No.5,599,670)；氯霉素乙酰转移酶和碱性磷酸酶。其他可筛选的标记包括花青素/类黄酮多核苷酸，包括例如编码调控植物组织中花青素色素(红色)的产生的产物的R-基因座多核苷酸，控制类黄酮色素的生物合成的基因，诸如玉蜀黍C1和C2、B基因、p1基因和Bronze基因座基因等。由所关注多核苷酸编码的合适的标记的另外的例子包括青色荧光蛋白(CYP)基因、黄色荧光蛋白基因、编码荧光素酶的发光基因(其存在可使用例如，X光片、闪烁计数、荧光光度法、微光摄像机、光子计数照相机或多孔发光测定法来检测)、绿色荧光蛋白(GFP)和DsRed2(克隆技术公司(Clontechniques)，2001年)，其中用标记基因转化的植物细胞为红色，并因而为视觉上可选择的。另外的例子包括编码各种显色底物(例如，PADAC、显色头孢菌素)已知的酶的p-内酰胺酶基因、编码可转化显色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶的xylE基因、α-淀粉酶基因和编码能够将酪氨酸氧化为多巴和多巴醌(其继而缩合以形成易于检测的化合物黑色素)的酶的酪氨酸酶基因。
表达盒还可包含用于选择转化的细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，诸如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物为例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。另外的选择性标记包括表型标记如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)(Suetal.(2004)BiotechnolBioeng85：610-9(Su等人，2004年，《生物技术与生物工程》，第85卷，第610-9页)和Fetteretal.(2004)PlantCell16：215-28(Fetter等人，2004年，《植物细胞》，第16卷，第215-28页))，青色荧光蛋白(CYP)(Bolteetal.(2004)J.CellScience117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-54页)和Katoetal.(2002)PlantPhysiol129：913-42(Kato等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第913-42页))和黄色荧光蛋白(得自Evrogen公司的PhiYFPTM，参见Bolteetal.(2004)J.CellScience117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-54页))。对于另外的选择性标记，通常参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511(Yarranton，1992年，《生物技术新观点》，第3卷，第506-511页)；Christophersonetal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页)；Yaoetal.(1992)Cell71：63-72(Yao等人，1992年，《细胞》，第71卷，第63-72页)；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422(Reznikoff，1992年，《分子微生物学》，第6卷，第2419-2422页)；Barkleyetal.(1980)inTheOperon，pp.177-220(Barkley等人，1980年，载于《操纵子》，第177-220页)；Huetal.(1987)Cell48：555-566(Hu等人，1987年，《细胞》，第48卷，第555-566页)；Brownetal.(1987)Cell49：603-612(Brown等人，1987年，《细胞》，第49卷，第603-612页)；Figgeetal.(1988)Cell52：713-722(Figge等人，1988年，《细胞》，第52卷，第713-722页)；Deuschleetal.(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86：5400-5404(Deuschle等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第5400-5404页)；Fuerstetal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-2553(Fuerst等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第2549-2553页)；Deuschleetal.(1990)Science248：480-483(Deuschle等人，1990年，《科学》，第248卷，第480-483页)；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg(Gossen，1993年，德国海德尔堡大学博士论文)；Reinesetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-1921(Reines等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第1917-1921页)；Labowetal.(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356(Labow等人，1990年，《分子细胞生物学》，第10卷，第3343-3356页)；Zambrettietal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-3956(Zambretti等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第3952-3956页)；Baimetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072-5076(Baim等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第5072-5076页)；Wyborskietal.(1991)NucleicAcidsRes.19：4647-4653(Wyborski等人，1991年，《核酸研究》，第19卷，第4647-4653页)；Hillenand-Wissman(1989)TopicsMol.Struc.Biol.10：143-162(Hillenand-Wissman，1989年，《分子结构生物学主题》，第10卷，第143-162页)；Degenkolbetal.(1991)Antimicrob.AgentsChemother.35：1591-1595(Degenkolb等人，1991年，《抗微生物剂与化学疗法》，第35卷，第1591-1595页)；Kleinschnidtetal.(1988)Biochemistry27：1094-1104(Kleinschnidt等人，1988年，《生物化学》，第27卷，第1094-1104页)；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg(Bonin，1993年，德国海德尔堡大学博士论文)；Gossenetal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-5551(Gossen等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第5547-5551页)；Olivaetal.(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36：913-919(Oliva等人，1992年，《抗微生物剂与化学疗法》，第36卷，第913-919页)；Hlavkaetal.(1985)HandbookofExperimentalPharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)(Hlavka等人，1985年，《实验药理学手册》，第78卷，施普林格出版社，柏林)；Gilletal.(1988)Nature334：721-724(Gill等人，1988年，《自然》，第334卷，第721-724页)。这些公开内容以引用的方式并入本文。以上选择性标记基因的列表并不意指是限制性的。任何选择性标记基因均可用于本文所公开的组合物和方法中。
可用于在高等植物中表达基因的典型载体是本领域公知的，包括衍自根瘤农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体，如Rogers，etal.，(1987)Meth.Enzymol.153：253-77(Rogers等人，1987年，《酶学方法》，第153卷，第253-277页)所述。这些载体是植物整合型载体，因为在转化时，这些载体将载体DNA的一部分整合进宿主植物的基因组中。可用于本文的示例性根瘤农杆菌载体是质粒pKYLX6和pKYLX7，如Schardl，etal.，(1987)Gene61：1-11(Schardl等人，1987年，《基因》，第61卷，第1-11页)和Berger，etal.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：8402-6(Berger等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第8402-8406页)中所述。可用于本文的另一种载体是质粒pBI101.2，其可得自加利福尼亚州帕罗奥图的科隆达生物技术实验室有限公司(CLONTECHLaboratories，Inc.(PaloAlto，CA))。
蛋白质在宿主细胞中的表达
使用本发明的核酸，可以在重组工程改造的细胞诸如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或优选植物细胞中表达本发明的蛋白质。这类细胞在非天然条件(例如，在数量、组分、位置和/或时间方面)下产生蛋白质，因为它们已通过人为干预被遗传改变成在非天然条件下产生蛋白质。
可以预期，本领域的技术人员知晓多种可用于表达编码本发明的蛋白质的核酸的表达系统。无意于详细描述已知用于在原核生物或真核生物中表达蛋白的各种方法。
简单概括而言，编码本发明蛋白质的分离核酸的表达通常可通过使例如DNA或cDNA有效连接至启动子、然后整合进表达载体中来实现。该载体可适合于在原核生物或真核生物中复制和整合。典型的表达载体含有可用于调控本发明的DNA的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。为了获得克隆基因的高水平表达，需要构建表达载体，该表达载体在最低程度上含有用以指导转录的强启动子(诸如泛素启动子)、用于翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止子。组成型启动子被分类为可提供一系列组成型表达。因而，某些是弱组成型启动子，而另一些是强组成型启动子。一般来讲，所谓“弱启动子”意指驱动编码序列以低水平表达的启动子。所谓“低水平”意指处于约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平。相反，“强启动子”以“高水平”或者约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物来驱动编码序列的表达。
技术人员将认识到，可对本发明的蛋白质进行修饰而不减低其生物活性。可进行某些修饰以有利于目标分子的克隆、表达或掺入进融合蛋白中。这种修饰是本领域技术人员所熟知的，包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位点，或在任一端设置额外的氨基酸(例如多聚His)以产生便利地定位的限制性位点或终止密码子或纯化序列。
在原核生物中的表达
原核细胞可用作表达的宿主。原核生物最通常由大肠杆菌的多种菌株代表；然而，也可使用其他微生物株。在本文中定义为包括用于转录起始的启动子(任选具有操纵子)以及核糖体结合位点序列的常用原核控制序列，包括诸如β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Chang，etal.，(1977)Nature198：1056(Chang等人，1977年，《自然》，第198卷，第1056页))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，etal.，(1980)NucleicAcidsRes.8：4057(Goeddel等人，1980年，《核酸研究》，第8卷，第4057页))和λ衍生的PL启动子之类的常用启动子，以及N-基因核糖体结合位点(Shimatake，etal.，(1981)Nature292：128(Shimatake等人，1981年，《自然》，第292卷，第128页))。在转染进大肠杆菌中的DNA载体中包含选择标记也是有用的。这种标记的例子包括对氨苄青霉素、四环素或氯霉素有特定抗性的基因。
对载体进行选择以使得将所关注基因引入到适当的宿主细胞中。细菌载体通常是质粒或噬菌体起源的。将适当的细菌细胞用噬菌体载体颗粒感染或用裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，则将细菌细胞用质粒载体DNA转染。用于表达本发明的蛋白质的表达系统可使用芽孢杆菌属(Bacillussp.)和沙门氏菌属(Salmonella)提供(Palva，etal.，(1983)Gene22：229-35(Palva等人，1983年，《基因》，第22卷，第229-235页)；Mosbach，etal.，(1983)Nature302：543-5(Mosbach等人，1983年，《自然》，第302卷，第543-545页))。得自法玛西亚(Pharmacia)的pGEX-4T-1质粒载体是本发明的优选大肠杆菌表达载体。
在真核生物中的表达
多种真核表达系统诸如酵母、昆虫细胞系、植物和哺乳动物细胞是本领域技术人员已知的。如下面简单解释的，本发明可在这些真核系统中表达。在一些实施例中，将转化的/转染的植物细胞(如下文所论述)用作表达系统，用于产生本发明的蛋白质。
异源蛋白质在酵母中的合成是众所周知的。Sherman，etal.，(1982)MethodsinYeastGenetics，ColdSpringHarborLaboratory(Sherman等人，1982年，《酵母遗传学方法》，冷泉港实验室出版社)是描述多种可用于在酵母中产生蛋白质的方法的广泛认可的著作。两种广泛采用的用于产生真核蛋白质的酵母是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。用于在酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)中表达的载体、菌株和方案是本领域已知的并可从商业供应商(例如英杰公司(Invitrogen))获得。根据需要，合适的载体通常具有表达控制序列，例如启动子(包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶)和复制起始区、终止序列等等。
本发明的蛋白质，一旦表达，可通过裂解细胞并向溶胞产物或离心沉淀物应用标准蛋白质分离技术来从酵母分离。可通过使用蛋白质印迹技术或其他标准免疫测定技术的放射免疫测定法来完成对纯化过程的监测。
还可将编码本发明的蛋白质的序列连接到多种用于转染例如哺乳动物、昆虫或植物来源的细胞培养物的表达载体。哺乳动物细胞系统通常会是单层细胞的形式，但也可使用哺乳动物细胞悬浮液。本领域已开发了多种能够表达完整蛋白质的合适宿主细胞系，包括HEK293、BHK21和CHO细胞系。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，诸如复制起点、启动子(例如CMV启动子、HSVtk启动子或pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子)、增强子(Queen，etal.，(1986)Immunol.Rev.89：49(Queen等人，1986年，《免疫学评论》，第89卷，第49页))和必要的加工信息位点(诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点(例如SV40大TAg多聚A添加位点))，以及转录终止子序列。可用于产生本发明的蛋白的其他动物细胞可从例如美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)CatalogueofCellLinesandHybridomas(《细胞系和杂交瘤目录》)(第7版，1992年)获得。
用于在昆虫细胞中表达本发明的蛋白质的适当载体通常源于SF9杆状病毒。合适的昆虫细胞系包括蚊幼虫、蚕、行军虫、蛾和果蝇(Drosophila)细胞系，诸如Schneider细胞系(参见例如Schneider，(1987)J.Embryol.Exp.Morphol.27：353-65(Schneider等人，1987年，《胚胎学和实验形态学杂志》，第27卷，第353-365页))。
与酵母一样，当采用高等动物或植物宿主细胞时，通常将多腺苷酸化或转录终止子序列掺入进载体中。终止子序列的例子是来自牛生长激素基因的多腺苷酸化序列。还可包括用于转录物的精确剪接的序列。剪接序列的一个例子是来自SV40的VP1内含子(Sprague，etal.，(1983)J.Virol.45：773-81(Sprague等人，1983年，《病毒学杂志》，第45卷，第773-781页))。另外，可将控制在宿主细胞中的复制的基因序列掺入到载体，诸如牛乳头瘤病毒类型的载体中存在的那些(Saveria-Campo，“BovinePapillomaVirusDNAaEukaryoticCloningVector”，inDNACloning：APracticalApproach，vol.II，Glover，ed.，IRLPress，Arlington，VA，pp.213-38(1985)(Saveria-Campo，“牛乳头瘤病毒DNA：一种真核克隆载体”，载于《DNA克隆：一种实用方法》，第II卷，Glover编辑，IRL出版社，弗吉尼亚州阿灵顿，第213-238页，1985年)。
另外，可将置于适当植物表达载体中的所关注基因用于转化植物细胞。然后可从植物愈伤组织分离多肽或可将转化的细胞用于再生转基因植物。可收获这种转基因植物，并可对适当的组织(例如，种子或叶)采用大规模蛋白提取和纯化技术。
植物转化方法
多种用于将外源基因引入植物中的方法是公知的并可用来将多核苷酸插入植物宿主中，这包括生物学和物理学的植物转化方案。参见例如Mikietal.，“ProcedureforIntroducingForeignDNAintoPlants”，inMethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology，GlickandThompson，eds.，CRCPress，Inc.，BocaRaton，pp.67-88(1993)(Miki等人，“将外来DNA引入植物中的程序”，载于《植物分子生物学和生物技术方法》，Glick和Thompson编辑，CRC出版社，波卡拉顿，第67-88页，1993年)。所选择的方法随宿主植物而变化，并且包括化学转染方法，诸如磷酸钙介导的基因转移、微生物介导的基因转移如农杆菌介导的基因转移(Horsch，etal.，(1985)Science227：1229-31(Horsch等人，1985年，《科学》，第227卷，第1229-1231页))、电穿孔、显微注射和基因枪轰击。
用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达盒和载体以及体外培养方法是已知的并且可以获得的。参见例如Gruber，etal.，“VectorsforPlantTransformation”，inMethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology，supra，pp.89-119(Gruber等人，“用于植物转化的载体”，载于《植物分子生物学和生物技术方法》，出处同上，第89-119页)。
可通过一种或多种通常用于直接递送进细胞的技术将分离的多核苷酸或多肽引入植物中。根据要进行基因修饰的生物体、细胞、植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)，这种方案可不同。转化植物细胞的合适方法包括：显微注射(Crossway，etal.，(1986)Biotechniques4：320-334(Crossway等人，1986年，《生物技术》，第4卷，第320-334页)和美国专利No.6,300,543)、电穿孔(Riggs，etal.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5602-5606(Riggs等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第5602-5606页))、直接基因转化(Paszkowskietal.，(1984)EMBOJ.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页))和弹道粒子加速(参见例如Sanford等人的美国专利No.4,945,050、WO1991/10725和McCabe，etal.，(1988)Biotechnology6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页))。还可参见Tomes，etal.，“DirectDNATransferintoIntactPlantCellsViaMicroprojectileBombardment”。pp.197-213inPlantCell.TissueandOrganCulture.FundamentalMethods.eds.GamborgandPhillips.Springer-VerlagBerlinHeidelbergNewYork，1995(Tomes等人，“通过微粒轰击直接将DNA转移到完整植物细胞中”，第197-213页，载于《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg和Phillips编辑，施普林格出版社，柏林/海德堡/纽约，1995年)；美国专利No.5,736,369(分生组织)；Weissinger，etal.，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weisinger等人，1988年，《遗传学年评》，第22卷，第421-477页)；Sanford，etal.，(1987)ParticulateScienceandTechnology5：27-37(Sanford等人，1987年，《粒子科学和技术》，第5卷，第27-37页)(洋葱)；Christou，etal.，(1988)PlantPhysiol.87：671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页)(大豆)；Datta，etal.，(1990)Biotechnology8：736-740(Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页)(水稻)；Klein，etal.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉蜀黍)；Klein，etal.，(1988)Biotechnology6：559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第559-563页)(玉蜀黍)；WO91/10725(玉蜀黍)；Klein，etal.，(1988)PlantPhysiol.91：440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页)(玉蜀黍)；Fromm，etal.，(1990)Biotechnology8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页)和Gordon-Kamm，etal.，(1990)PlantCell2：603-618(Gordon-Kamm等人，1990年，《(植物细胞》，第2卷，第603-618页)(玉蜀黍)；Hooydaas-VanSlogterenandHooykaas，(1984)Nature(London)311：763-764(Hooykaas-VanSlogteren和Hooykaas，1984年，《自然》(伦敦)，第311卷，第763-764页)；Bytebierm，etal.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-5349(Bytebierm等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合科)；DeWet，etal.，(1985)InTheExperimentalManipulationofOvuleTissues，ed.G.P.Chapman，etal.，pp.197-209.Longman，NY(DeWet等人，1985年，载于《胚珠组织的实验操作》，G.P.Chapman等人编辑，朗文出版社，纽约，第197-209页)(花粉)；Kaeppler，etal.，(1990)PlantCellReports9：415-418(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)和Kaeppler，etal.，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年，《理论与应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(晶须介导的转化)；美国专利No.5,693,512(超声处理)；D’Halluin，etal.，(1992)PlantCell4：1495-1505(D′Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)(电穿孔)；Li，etal.，(1993)PlantCellReports12：250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页)和ChristouandFord，(1995)AnnalsofBotany75：407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页)(水稻)；Osjoda，etal.，(1996)NatureBiotech.14：745-750(Osjoda等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)；农杆菌介导的玉蜀黍转化(美国专利No.5,981,840)；碳化硅晶须方法(Frame，etal.，(1994)PlantJ.6：941-948(Frame等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第941-948页))；激光方法(Guo，etal.，(1995)PhysiologiaPlantarum93：19-24(Guo等人，1995年，《植物生理学》，第93卷，第19-24页))；超声处理方法(Bao，etal.，(1997)UltrasoundinMedicine&Biology23：953-959(Bao等人，1997年，《生物医学超声》，第23卷，第953-959页)；FinerandFiner，(2000)LettApplMicrobiol.30：406-10(Finer和Finer，2000年，《应用微生物学通讯》，第30卷，第406-410页)；Amoah，etal.，(2001)JExpBot52：1135-42(Amoah等人，2001年，《实验植物学杂志》，第52卷，第1135-1142页))；聚乙二醇方法(Krens，etal.，(1982)Nature296：72-77(Krens等人，1992年，《自然》，第296卷，第72-77页))；单子叶植物和双子叶植物细胞的原生质体可使用电穿孔(Fromm，etal.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：5824-5828(Fromm等人，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第5824-5828页))和显微注射(Crossway，etal.，(1986)Mol.Gen.Genet.202：179-185(Crossway等人，1986年，《分子和普通遗传学》，第202卷，第179-185页))转化，这些文献全部以引用的方式并入本文。
农杆菌介导的转化
将表达载体引入植物中的最广泛使用的方法是基于农杆菌的天然转化系统。根瘤农杆菌和毛根农杆菌(A.rhizogenes)是植物病原性土壤细菌，其能遗传转化植物细胞。根瘤农杆菌和毛根农杆菌的Ti和Ri质粒各自携带负责植物的遗传转化的基因。参见例如Kado，(1991)Crit.Rev.PlantSci.10：1(Kado，1991年，《植物科学评论》，第10卷，第1页)。以下文献提供了有关用于农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体系统和方法的描述：Gruber等人(出处同上)；Miki等人(出处同上)和Moloney，etal.，(1989)PlantCellReports8：238(Moloney等人，1989年，《植物细胞报道》，第8卷，第238页)。
相似地，可将基因分别插入源于根瘤农杆菌或毛根农杆菌的Ti或Ri质粒的T-DNA区。因而，可使用这些质粒，如上所述构建表达盒。已知有许多控制序列，其在偶联至异源编码序列并转化进宿主生物体中时，在初始编码序列的组织/器官特异性方面显示出基因表达的保真性。参见例如BenfeyandChua，(1989)Science244：174-81(Benfey和Chua，1989年，《科学》，第244卷，第174-181页)。用于这些质粒中的特别合适的控制序列是用于基因在各种靶植物中的组成型或组织优选的表达的启动子。其他可用的控制序列包括来自胭脂氨酸合酶基因(NOS)的启动子和终止子。NOS启动子和终止子存在于质粒pARC2中，该质粒可得自美国典型培养物保藏中心，指定的ATCC存放号为67238。如果使用这种系统，则来自Ti或Ri质粒的毒力(vir)基因必须也存在，要么与T-DNA部分一起存在，要么通过双元系统存在，在该系统中vir基因存在于一个另外的载体上。这类系统、在其中使用的载体以及转化植物细胞的方法在如下文献中有所描述：美国专利No.4,658,082；1986年10月1日提交的美国专利申请No.913,914，如1993年11月16日公布的美国专利申请No.5,262,306中所引用；以及Simpson，etal.，(1986)PlantMol.Biol.6：403-15(Simpson等人，1986年，《植物分子生物学》，第6卷，第403-415页)(也在‘306专利中引用)，这些文献全文均以引用方式并入本文。
一旦构建，可将这些质粒置于毛根农杆菌或根瘤农杆菌中，并将这些载体用于转化通常易受镰孢属(Fusarium)或链格孢属(Alternaria)感染的植物物种的细胞。本发明还考虑到了若干其他转基因植物，包括但不限于大豆、玉米、高粱、苜蓿、水稻、三叶草、卷心菜、香蕉、咖啡、芹菜、烟草、豇豆、棉花、甜瓜和胡椒。根瘤农杆菌或者毛根农杆菌的选择将取决于用其转化的植物。通常，根瘤农杆菌是用于转化的优选生物体。大多数双子叶植物、一些裸子植物和少数单子叶植物(例如百合目(Liliales)和天南星目(Arales)的某些成员)易受根瘤农杆菌感染。毛根农杆菌也具有广泛的宿主，包括大多数双子叶植物和一些裸子植物，其包括豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成员在内。也可转化单子叶植物。欧洲专利申请No.604662A1公开了用农杆菌转化单子叶植物的方法。欧洲专利申请No.672752A1公开了使用未成熟胚的盾片以农杆菌转化单子叶植物的方法。Ishida等人论述了通过使未成熟胚暴露于根瘤农杆菌来转化玉蜀黍的方法(NatureBiotechnology14：745-50(1996)(《自然生物技术》，第14卷，第745-750页，1996年))。
一旦转化，可将这些细胞用于再生转基因植物。例如，可通过使植物产生伤口，然后将载体引入该伤口位点，以用这些载体感染整个植物。可使植物的任何部分产生伤口，包括叶、茎和根。或者，可将外植体形式的植物组织诸如子叶组织或叶圆片用这些载体接种，并在可促进植物再生的条件下培养。再生植物组织的此类方法的例子公开于Shahin，(1985)Theor.Appl.Genet.69：235-40(Shahin，1985年，《理论与应用遗传学》，第69卷，第235-240页)；美国专利No.4,658,082；Simpson等人(出处同上)以及同时于1986年10月1日提交的美国专利申请No.913,913和913,914，如公布于1993年11月16日的美国专利No.5,262,306中所引用，上述文献的全部公开内容以引用方式并入本文。
直接基因转移
尽管农杆菌介导的转化的宿主范围广泛，但一些主要的谷类作物物种和裸子植物总体上对该基因转移模式是顽拗的，虽然最近已在水稻方面获得了一些成功(Hiei，etal.，(1994)ThePlantJournal6：271-82(Hiei等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第271-282页))。已开发了几种植物转化的方法(统称为直接基因转移)作为对农杆菌介导的转化的替代方案。
一般适用的植物转化方法是微粒介导的转化，其中DNA携带在约1-4μm的微粒的表面上。用基因枪装置(biolisticdevice)将表达载体引入植物组织中，该基因枪装置将微粒加速至300-600m/s的速度，该速度足以穿透植物细胞壁和膜(Sanford，etal.，(1987)Part.Sci.Technol.5：27(Sanford等人，1987年，《粒子科学与技术》，第5卷，第27页)；Sanford，(1988)TrendsBiotech6：299(Sanford，1988年，《生物技术趋势》，第6卷，第299页)；Sanford，(1990)Physiol.Plant79：206(Sanford，1990年，《植物生理学》，第79卷，第206页)以及Klein，etal.，(1992)Biotechnology10：268(Klein等人，1992年，《生物技术》，第10卷，第268页))。
物理递送DNA至植物的另一种方法是对靶细胞进行超声处理，如Zang，etal.，(1991)BioTechnology9：996(Zang等人，1991年，《生物技术》，第9卷，第996页)中所述。作为另一种选择，已使用脂质体或原生质球融合将表达载体引入植物中。参见例如Deshayes，etal.，(1985)EMBOJ.4：2731(Deshayes等人，1985年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第4卷，第2731页)和Christou，etal.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：3962(Christou等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第3962页)。利用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸直接将DNA摄入原生质体中也已有报道。参见例如Hain，etal.，(1985)Mol.Gen.Genet.199：161(Hain等人，1985年，《分子和普通遗传学》，第199卷，第161页)和Draper，etal.，(1982)PlantCellPhysiol.23：451(Draper等人，1982年，《植物细胞生理学》，第23卷，第451页)。
原生质体和完整细胞和组织的电穿孔也已有描述。参见例如Donn，etal.，(1990)AbstractsoftheVIIthInt’l.CongressonPlantCellandTissueCultureIAPTC，A2-38，p.53(Donn等人，1990年，《IAPTC第七届国际植物细胞与组织培养大会摘要》，A2-38，第53页)；D’Halluin，etal.，(1992)PlantCell4：1495-505(D’Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)以及Spencer，etal.，(1994)PlantMol.Biol.24：51-61(Spencer等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第51-61页)。
降低多肽的活性和/或水平
提供了通过用表达可抑制多肽的表达的多核苷酸的表达盒转化植物细胞来降低或消除本发明的多肽的活性的方法。该多核苷酸可通过防止信使RNA的转录或翻译来直接抑制多肽的表达，或者通过编码能抑制编码多肽的基因的转录或翻译的多肽来间接抑制多肽的表达。用于抑制或消除基因在植物中的表达的方法是本领域所公知的，任何这种方法可用于本发明中来抑制多肽的表达。
根据本发明，可抑制多肽的表达，使得多肽的蛋白质水平为，例如该同一多肽在未经过遗传修饰或诱变以抑制该多肽的表达的植物中的蛋白质水平的不到70％。在本发明的具体实施例中，该多肽在根据本发明的经修饰的植物中的蛋白质水平，为该同一多肽在不属于突变体的植物或者未经过遗传修饰以抑制该多肽的表达的植物中的蛋白质水平的不到60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％、不到5％或不到2％。多肽的表达水平可例如通过测定在植物细胞或植物中表达的多肽的水平来直接测量，或者例如通过测量该多肽在植物细胞或植物中的氮吸收活性或通过测量植物中的表型变化来间接测量。进行这种测定的方法在本文的其他地方进行了描述。
在本发明的其他实施例中，通过用表达盒转化植物细胞来降低或消除多肽的活性，所述表达盒包含编码可抑制多肽活性的多肽的多核苷酸。如果该多肽的活性为，例如该同一多肽在未经过修饰以抑制该多肽的活性的植物中的活性的不到70％，则根据本发明多肽的活性受到了抑制。在本发明的具体实施例中，该多肽在根据本发明的经修饰的植物中的活性，为该同一多肽在未经过修饰以抑制该多肽的表达的植物中的活性的不到60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％或不到5％。当多肽的活性不能通过本文其他地方所描述的测定法检测时，则根据本发明该活性被“消除”了。检测多肽的活性的改变的方法在本文其他地方描述。
在其他实施例中，可通过破坏编码多肽的基因来降低或消除多肽的活性。本发明涵盖携带基因中的突变的诱变的植物，其中所述突变减少基因的表达或抑制编码的多肽的活性。
因而，有许多方法可用于降低或消除多肽的活性。此外，有不止一种方法可用于减少单一多肽的活性。
1.基于多核苷酸的方法：
在本发明的一些实施例中，用表达盒转化植物，该表达盒能够表达可抑制本发明的多肽的表达的多核苷酸。本文所用的术语“表达”指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。例如，出于本发明的目的，能够表达可抑制至少一种多肽的表达的多核苷酸的表达盒，是能够产生可抑制本发明的至少一种多肽的转录和/或翻译的RNA分子的表达盒。蛋白质或多肽从DNA分子“表达”或“产生”指该编码序列转录和翻译而产生该蛋白质或多肽，而蛋白质或多肽从RNA分子“表达”或“产生”指该RNA编码序列翻译而产生蛋白质或多肽。
可抑制多肽的表达的多核苷酸的例子在下面给出。
i.有义抑制/共抑制
在本发明的一些实施例中，多肽表达的抑制可通过有义抑制或共抑制获得。对于共抑制，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子以“有义”取向对应于编码多肽的信使RNA的全部或部分。该RNA分子的过表达可导致天然基因的表达减少。因此，对用该共抑制表达盒转化的多个植物株系进行筛选以识别那些显示出所需的多肽表达抑制程度的植物株系。
用于共抑制的多核苷酸可对应于编码多肽的序列的全部或部分、多肽转录物的5’和/或3’非翻译区的全部或部分，或者编码多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的全部或部分。在其中该多核苷酸包含多肽的编码区的全部或部分的一些实施例中，将表达盒设计为消除该多核苷酸的起始密码子，使得不会翻译出蛋白质产物。
共抑制可用来抑制植物基因的表达以产生对于由这些基因编码的蛋白质而言具有不可检测的蛋白质水平的植物。参见例如Broin，etal.，(2002)PlantCell14：1417-1432(Broin等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1417-1432页)。共抑制还可用来抑制同一植物中的多种蛋白的表达。参见例如美国专利No.5,942,657。使用共抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在以下文献和专利中有所描述：Flavell，etal.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：3490-3496(Flavell等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第3490-3496页)；Jorgensen，etal.，(1996)PlantMol.Biol.31：957-973(Jorgensen等人，1996年，《植物分子生物学》，第31卷，第957-973页)；JohansenandCarrington，(2001)PlantPhysiol.126：930-938(Johansen和Carrington，2001年，《植物生理学》，第126卷，第930-938页)；Broin，etal.，(2002)PlantCell14：1417-1432(Broin等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1417-1432页)；Stoutjesdijk，etal.，(2002)PlantPhysiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1723-1731页)；Yu，etal.，(2003)Phytochemistry63：753-763(Yu等人，2003年，《植物化学》，第63卷，第753-763页)；以及美国专利No.5,034,323、5,283,184和5,942,657，这些文献和专利中的每一者以引用方式并入本文。共抑制的效率的提高可通过在表达盒中在有义序列的3′和多腺苷酸化信号的5′位置包括多聚dT区来实现。参见美国专利申请公布No.2002/0048814，该申请以引用方式并入本文。通常，这种核苷酸序列与内源基因的转录物的序列具有实质上的序列同一性，优选的是高于约65％的序列同一性，更优选的是高于约85％的序列同一性，最优选的是高于约95％的序列同一性。参见美国专利No.5,283,184和No.5,034,323，这些专利以引用方式并入本文。
ii.反义抑制
在本发明的一些实施例中，对多肽表达的抑制可通过反义抑制获得。对于反义抑制，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子与编码多肽的信使RNA的全部或部分互补。该反义RNA分子的过表达可导致靶基因的表达减少。因此，对用该反义抑制表达盒转化的多个植物株系进行筛选以识别那些显示出所需的多肽表达抑制程度的植物株系。
用于反义抑制的多核苷酸可对应于编码多肽的序列的互补序列的全部或部分、靶转录物的5′和/或3′非翻译区的互补序列的全部或部分，或者编码多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的互补序列的全部或部分。此外，反义多核苷酸可与靶序列完全互补(即与靶序列的互补序列100％相同)或部分互补(即与靶序列的互补序列的同一性低于100％)。反义抑制还可用来抑制同一植物中的多种蛋白质的表达。参见例如美国专利No.5,942,657。此外，反义核苷酸的部分可用来破坏靶基因的表达。一般来讲，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、400、450、500、550或更多个核苷酸的序列。使用反义抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在(例如)如下文献和专利中有所描述：Liu，etal.，(2002)PlantPhysiol.129：1732-1743(Liu等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1732-1743页)，以及美国专利No.5,759,829和No.5,942,657，这些文献和专利中的每一者以引用方式并入本文。反义抑制的效率的提高可通过在表达盒中在反义序列的3′和聚腺苷酸化信号的5′位置处包括多聚dT区来实现。参见美国专利申请公布No.2002/0048814，该申请以引用方式并入本文。
iii.双链RNA干扰
在本发明的一些实施例中，对多肽表达的抑制可通过双链RNA(dsRNA)干扰来获得。对于dsRNA干扰，有义RNA分子(如上文针对共抑制所描述)和与该有义RNA分子完全或部分互补的反义RNA分子在同一细胞中表达，从而导致对应的内源信使RNA的表达的抑制。
有义和反义分子的表达可通过将表达盒设计为同时包含有义序列和反义序列来实现。或者，可将单独的表达盒分别用于有义序列和反义序列。对用(一个或多个)dsRNA干扰表达盒转化的多个植物株系进行筛选以识别显示出所需的多肽表达抑制程度的植物株系。使用dsRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法在以下文献和专利中有所描述：Waterhouse，etal.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：13959-13964(Waterhouse等人，1998年，《美国国家科学院院刊》，第95卷，第13959-13964页)，Liu，etal.，(2002)PlantPhysiol.129：1732-1743(Liu等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1732-1743页)，以及WO1999/49029、WO1999/53050、WO1999/61631和WO2000/49035，这些文献和专利中的每一者以引用方式并入本文。
iv.发夹RNA干扰和含内含子的发夹RNA干扰
在本发明的一些实施例中，对多肽表达的抑制可通过发夹RNA(hpRNA)干扰或含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰来获得。这些方法在抑制内源基因表达方面是高度有效的。参见WaterhouseandHelliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第29-38页)及其中引用的参考文献。
对于hpRNA干扰，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子自身杂交而形成包括单链环区和碱基配对茎的发夹结构。该碱基配对茎区包含对应于由要对其表达进行抑制的基因编码的内源信使RNA的全部或部分的有义序列和与该有义序列完全或部分互补的反义序列。或者，碱基配对茎区可对应于控制其表达待抑制的基因的表达的启动子序列的一部分。因而，该分子的碱基配对茎区通常决定了RNA干扰的特异性。hpRNA分子在抑制内源基因的表达方面是高度有效的，并且它们诱导的RNA干扰被植物的后代遗传。参见例如ChuangandMeyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：4985-4990(Chuang和Meyerowitz，2000年，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第4985-4990页)；Stoutjesdijk，etal.，(2002)PlantPhysiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1723-1731页)，以及WaterhouseandHelliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第29-38页)。使用hpRNA干扰来抑制或沉默基因表达的方法在(例如)以下文献和专利中有所描述：ChuangandMeyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：4985-4990(Chuang和Meyerowitz，2000年，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第4985-4990页)；Stoutjesdijk，etal.，(2002)PlantPhysiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1723-1731页)；WaterhouseandHelliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第29-38页)；Pandolfinietal.，BMCBiotechnology3：7(Pandolfini等人，《BMC生物技术》，第3卷，第7页)，以及美国专利申请公布No.2003/0175965，这些文献和专利中的每一者以引用方式并入本文。hpRNA构建体沉默体内基因表达的效率的瞬时测定法已在如下文献中有所描述：Panstruga，etal.，(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140(Panstruga等人，2003年，《分子生物学报道》，第30卷，第135-140页)，该文献以引用方式并入本文。
对于ihpRNA，干扰分子具有与hpRNA相同的总体结构，但该RNA分子另外包含内含子，该内含子能够在表达该ihpRNA的细胞中被剪接。内含子的使用使得发夹RNA分子中的环的大小在剪接后最小化，这可提高干扰的效率。参见例如，Smith，etal.，(2000)Nature407：319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320页)。事实上，Smith等人证实使用ihpRNA介导的干扰，内源基因表达受到100％抑制。使用ihpRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法(例如)在以下文献和专利中有所描述：Smith，etal.，(2000)Nature407：319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320页)；Wesley，etal.，(2001)PlantJ.27：581-590(Wesley等人，2001年，《植物杂志》，第27卷，第581-590页)；WangandWaterhouse，(2001)Curr.Opin.PlantBiol.5：146-150(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1723-1731页)；WaterhouseandHelliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第29-38页)；HelliwellandWaterhouse，(2003)Methods30：289-295(Helliwell和Waterhouse，2003年，《方法》，第30卷，第289-295页)，以及美国专利申请公布No.2003/0180945，这些文献和专利中的每一者以引用方式并入本文。
还可对用于hpRNA干扰的表达盒进行设计，使得有义序列和反义序列不对应于内源RNA。在这个实施例中，该有义和反义序列在这样的环序列的旁侧，该环序列包含对应于靶基因的内源信使RNA的全部或部分的核苷酸序列。因而，是环区决定了RNA干扰的特异性。参见例如WO2002/00904；Mette，etal.，(2000)EMBOJ19：5194-5201(Mette等人，2000年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第19卷，第5194-5201页)；Matzke，etal.，(2001)Curr.Opin.Genet.Devel.11：221-227(Matzke等人，2001年，《遗传学与发育新观点》，第11卷，第221-227页)；Scheid，etal.，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA99：13659-13662(Scheid等人，2002年，《美国国家科学院院刊》，第99卷，第13659-13662页)；Aufsaftz，etal.，(2002)Proc.Nat’l.Acad.Sci.99(4)：16499-16506(Aufsaftz等人，2002年，《美国国家科学院院刊》，第99卷，第4期，第16499-16506页)；Sijen，etal.，Curr.Biol.(2001)11：436-440(Sijen等人，《当代生物学》，2001年，第11卷，第436-440页))，这些文献和专利中的每一者以引用方式并入本文。
v.扩增子介导的干扰
扩增子表达盒包含源自植物病毒的序列，该序列含有靶基因的全部或部分但通常不含有该天然病毒的全部基因。存在于表达盒的转录产物中的病毒序列使得该转录产物能指导其自身的复制。由扩增子产生的转录物相对于靶序列(即多肽的信使RNA)可以是有义或反义的。利用扩增子来抑制内源植物基因的表达的方法在(例如)如下文献中有所描述：AngellandBaulcombe，(1997)EMBOJ.16：3675-3684(Angell和Baulcombe，1997年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第16卷，第3675-3684页)，AngellandBaulcombe，(1999)PlantJ.20：357-362(Angell和Baulcombe，1999年，《植物杂志》，第20卷，第357-362页)以及美国专利No.6,646,805，这些参考文献中的每一者以引用方式并入本文。
vi.核酶
在一些实施例中，由本发明的表达盒表达的多核苷酸是多肽的信使RNA特异性的催化性RNA或具有多肽的信使RNA特异性的核酶活性。因而，该多核苷酸引起内源信使RNA的降解，从而导致多肽的表达的降低。这个方法在例如美国专利No.4,987,071中进行了描述，该专利以引用方式并入本文。
vii.小干扰RNA或微RNA
在本发明的一些实施例中，多肽表达的抑制可通过表达编码微RNA(miRNA)的多核苷酸经RNA干扰获得。miRNA是由约22个核糖核苷酸组成的调控剂，其在抑制内源基因表达方面很高效。参见例如Javier，etal.，(2003)Nature425：257-263(Javier等人，2003年，《自然》，第425卷，第257-263页)，该文献以引用方式并入本文。
对于miRNA干扰，将表达盒设计成表达模仿内源miRNA基因的RNA分子。例如，该miRNA基因编码可形成发夹结构的RNA，该发夹结构含有与内源基因(靶序列)互补的22核苷酸序列。为了抑制NUE表达，从NUE转录物序列选择该22核苷酸序列，其含有有义取向的所述NUE序列的22个核苷酸和与该有义序列互补的相应反义序列的21个核苷酸。育性基因，无论内源还是外源，均可为miRNA靶基因。miRNA分子在抑制内源基因表达方面很高效，并且它们诱导的RNA干扰被植物子代继承。
2.基因表达的基于多肽的抑制
在一个实施例中，所述多核苷酸编码与编码多肽的基因结合的锌指蛋白，从而导致所述基因的表达降低。在特定实施例中，该锌指蛋白结合至基因的调控区。在其他实施例中，该锌指蛋白结合至编码多肽的信使RNA并防止其翻译。选择被锌指蛋白靶向的位点的方法已在例如美国专利No.6,453,242中进行了描述，利用锌指蛋白来抑制植物中的基因表达的方法在例如美国专利申请公布No.2003/0037355中进行了描述，这些专利中的每一者以引用方式全文并入本文。
3.蛋白质活性的基于多肽的抑制
在本发明的一些实施例中，多核苷酸编码抗体，该抗体结合至少一条多肽并且降低多肽的活性。在另一个实施例中，抗体的结合导致由细胞质量控制机制进行的抗体-多肽复合物的周转增加。抗体在植物细胞中的表达以及通过抗体表达并结合至植物细胞中的蛋白质来抑制分子途径是本领域公知的。参见例如ConradandSonnewald，(2003)NatureBiotech.21：35-36(Conrad和Sonnewald，2003年，《自然生物技术》，第21卷，第35-36页)，其以引用方式并入本文。
4.基因破坏
在本发明的一些实施例中，通过破坏编码多肽的基因，降低或消除多肽的活性。可通过本领域已知的任何方法来破坏编码多肽的基因。例如，在一个实施例中，通过转座子标签法破坏所述基因。在另一个实施例中，通过利用随机诱变或定向诱变来对植物进行诱变处理并选择具有减低了的氮利用活性的植物来破坏所述基因。
i.转座子标签法
在本发明的一个实施例中，使用转座子标签法降低或消除一个或多个多肽的活性。转座子标签法包括在内源基因内插入转座子以降低或消除所述多肽的表达。
在该实施例中，通过在编码多肽的基因的调控区或编码区内插入转座子来降低或消除一种或多种多肽的表达。处于基因的外显子、内含子、5′或3′非翻译序列、启动子或任何其他调控序列内的转座子可用于降低或消除所编码多肽的表达和/或活性。
用于对植物中的特定基因进行转座子标签的方法是本领域公知的。参见例如Maes，etal.，(1999)TrendsPlantSci.4：90-96(Maes等人，1999年，《植物科学趋势》，第4卷，第90-96页)；DharmapuriandSonti，(1999)FEMSMicrobiol.Lett.179：53-59(Dharmapuri和Sonti，1999年，《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》，第179卷，第53-59页)；Meissner，etal.，(2000)PlantJ.22：265-274(Meissner等人，2000年，《植物杂志》，第22卷，第265-274页)；Phogat，etal.，(2000)J.Biosci.25：57-63(Phogat等人，2000年，《生物科学杂志》，第25卷，第57-63页)；Walbot，(2000)Curr.Opin.PlantBiol.2：103-107(Walbot，2000年，《植物生物学新见》，第2卷，第103-107页)；Gai，etal.，(2000)NucleicAcidsRes.28：94-96(Gai等人，2000年，《核酸研究》，第28卷，第94-96页)；Fitzmaurice，etal.，(1999)Genetics153：1919-1928(Fitzmaurice等人，1999年，《遗传学》，第153卷，第1919-1928页)。此外，用于选择选定基因中的Mu插入序列的TUSC过程已在如下文献中进行了描述：Bensen，etal.，(1995)PlantCell7：75-84(Bensen等人，1995年，《植物细胞》，第7卷，第75-84页)；Mena，etal.，(1996)Science274：1537-1540(Mena等人，1996年，《科学》，第274卷，第1537-1540页)以及美国专利No.5,962,764，这些参考文献及专利中的每一者以引用方式并入本文。
ii.活性降低的突变体植物
用于降低或消除植物中内源基因的表达的另外的方法是本领域已知的，并且可类似地应用于本发明。这些方法包括其他形式的诱变，注入甲磺酸乙酯诱导的诱变、缺失诱变和快中子缺失诱变，快中子缺失诱变以反向遗传学方式(使用PCR)用于识别其中内源基因已缺失的植物株系。这些方法的例子参见Ohshima，etal.，(1998)Virology243：472-481(Ohshima等人，1998年，《病毒学》，第243卷，第472-481页)；Okubara，etal.，(1994)Genetics137：867-874(Okubara等人，1994年，《遗传学》，第137卷，第867-874页)，以及Quesada，etal.，(2000)Genetics154：421-436(Quesada等人，2000年，《遗传学》，第154卷，第421-436页)，这些参考文献中的每一者以引用方式并入本文。此外，一种用于筛选化学诱导的突变的快速且可自动化的方法TILLING(TargetingInducedLocalLesionsInGenomes(靶向诱导基因组局部突变))也适用于本发明，该方法利用变性HPLC或者对选定的PCR产物的选择性内切核酸酶消化。参见McCallum，etal.，(2000)Nat.Biotechnol.18：455-457(McCallum等人，2000年，《自然生物技术》，第18卷，第455-457页)，该文献以引用方式并入本文。
影响基因表达或干扰所编码的蛋白质的功能的突变是本领域公知的。基因外显子中的插入突变通常导致无效突变体。保守残基的突变在抑制所编码的蛋白质的活性方面是特别有效的。植物多肽的适于以消除活性为目标的诱变的保守残基已得到描述。可根据熟知的程序分离这种突变体，并且可通过遗传杂交对不同基因座中的突变进行堆叠。参见例如Gruis，etal.，(2002)PlantCell14：2863-2882(Gruis等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第2863-2882页)。
在本发明的另一个实施例中，显性突变体由于基因倒位和重复基因座的重组可用于引发RNA沉默。参见例如Kusaba，etal.，(2003)PlantCell15：1455-1467(Kusaba等人，2003年，《植物细胞》，第15卷，第1455-1467页)。
本发明涵盖另外的用于降低或消除一种或多种多肽的活性的方法。用于改变或突变植物中的基因组核苷酸序列的其他方法的例子是本领域已知的，包括但不限于使用RNA：DNA载体、RNA：DNA突变载体、RNA：DNA修复载体、混合双链寡核苷酸、自互补RNA：DNA寡核苷酸以及重组工程寡核碱基(recombinogenicoligonucleobase)。这种载体和使用方法是本领域已知的。参见例如美国专利No.5,565,350，No.5,731,181，No.5,756,325，No.5,760,012，No.5,795,972和No.5,871,984，这些专利中的每一者以引用方式并入本文。另参见WO1998/49350、WO1999/07865、WO1999/25821和Beetham，etal.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：8774-8778(Beetham等人，1999年，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第8774-8778页)，这些文献和专利中的每一者以引用方式并入本文。
iii.调节氮利用活性
在特定的方法中，通过在植物中增加多肽的水平或活性来降低植物中NUE调节因子的水平和/或活性。负调控分子的表达增加可降低下游造成改善的NUE表型的一个或多个基因的表达水平。
提高植物中的多肽的水平和/或活性的方法在本文其他地方进行了论述。简而言之，此类方法包括提供本发明的多肽给植物，从而增加该多肽的水平和/或活性。在其他实施例中，可通过这种方式来提供编码多肽的NUE核苷酸序列：向植物中引入包含本发明的NUE核苷酸序列的多核苷酸，表达该NUE序列，提高该多肽的活性，并因此减少植物或植物部分中的组织细胞的数目。在其他实施例中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
在其他方法中，植物组织的生长通过降低植物中多肽的水平和/或活性而增加。这种方法在本文其他地方进行了详细公开。在一个这样的方法中，将NUE核苷酸序列引入植物中，所述NUE核苷酸序列的表达降低了多肽的活性，从而增加植物或植物部分中的组织生长。在其他实施例中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
如上面所论述，技术人员将认识到用于调节植物中的NUE的水平/活性的适当启动子。在本文其他地方已经公开了该实施例的示例性启动子。
在其他实施例中，此类植物在其基因组中已稳定地掺入了包含本发明的NUE核苷酸序列的核酸分子，该NUE核苷酸序列有效连接至驱动在该植物细胞中的表达的启动子。
iv.调节根发育
提供了用于调节植物中的根发育的方法。所谓“调节根发育”意指在与对照植物比较时植物根的发育的任何改变。根发育的这种改变包括但不限于：初生根的生长速率、根鲜重、侧根和不定根形成的程度、维管系统、分生组织发育或径向扩张。
提供了用于调节植物中的根发育的方法。所述方法包括调节多肽在植物中的水平和/或活性。在一种方法中，将本发明的序列提供给植物。在另一种方法中，通过这种方式来提供核苷酸序列：将包含本发明的核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该序列，从而修改根发育。在另外其他的方法中，引入植物中的核苷酸构建体被稳定掺入到植物的基因组中。
在其他方法中，通过改变多肽在植物中的水平或活性来调节根发育。活性的改变可导致以下对根发育的改变中的至少一项或多项：包括但不限于根生物量的改变和长度的改变。
本文所用的“根生长”涵盖单子叶植物和双子叶植物中构成根系的不同部分在根系发育的不同阶段的生长的所有方面。应当理解，根生长增强可由其各部分(包括初生根、侧根、不定根等)中的一者或多者的生长增强引起。
测量根系中的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如美国专利申请公布No.2003/0074698和Werner，etal.，(2001)PNAS18：10487-10492(Werner等人，2001年，《美国国家科学院院刊》，第18卷，第10487-10492页)，这两篇文献以引用方式并入本文。
如上面所论述，技术人员将认识到用于调节植物中的根发育的适当启动子。用于这个实施例的示例性启动子包括组成型启动子和根偏好的启动子。示例性的根偏好的启动子已在本文别处公开。
通过降低多肽的活性和/或水平来刺激根生长和增加根的重量也在改善植物的抗倒伏性方面得到应用。术语“耐倒伏性”或“抗倒伏性”指植物使其自身固定至土壤的能力。对于具有竖立或半竖立生长习性的植物，该术语还指在不利环境条件下保持直立位置的能力。该性状涉及根系的尺寸、深度和形态。此外，通过改变多肽的水平和/或活性来刺激根生长和增加根重量在促进外植体的体外繁殖方面得到应用。
此外，较高的根生物量产出对产量具有直接影响，并且对由根细胞或转基因根细胞或所述转基因根细胞的细胞培养物产生的化合物的生成具有间接影响。在根培养物中产生的令人感兴趣的化合物的一个例子是紫草素(shikonin)，其产量可通过所述方法有利地增强。
因此，本发明还提供了与对照植物的根发育相比较时具有受调节的根发育的植物。在一些实施例中，本发明的植物具有提高了的本发明的多肽的水平/活性和具有增强了的根生长和/或根生物量。在其他实施例中，这种植物在其基因组中稳定掺入了包含本发明的核苷酸序列的核酸分子，该序列有效连接至能驱动在该植物细胞中的表达的启动子。
v.调节苗和叶发育
还提供了用于调节植物中的苗和叶发育的方法。所谓“调节苗和/或叶发育”其意指植物苗和/或叶的发育的任何改变。根和/或叶发育的这种改变包括但不限于苗分生组织发育、叶数量、叶大小、叶和茎维管系统、节间长度和叶衰老的改变。本文所用的“叶发育”和“苗发育”涵盖在单子叶植物和双子叶植物中分别构成叶系统和苗系统的不同部分在它们系统发育的不同阶段中的生长的所有方面。测量苗和叶系统中的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如Werner，etal.，(2001)PNAS98：10487-10492(Werner等人，2001年，《美国国家科学院院刊》，第98卷，第10487-10492页)和美国专利申请公布No.2003/0074698，这两篇文献中的每一者以引用方式并入本文。
调节植物中苗和/或叶发育的方法包括调节本发明的多肽的活性和/或水平。在一个实施例中，提供了本发明的序列。在其他实施例中，可按这种方式提供该核苷酸序列：将包含本发明的核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该序列，从而修改苗和/或叶发育。在其他实施例中，引入植物中的核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
在具体的实施例中，通过改变多肽在植物中的水平和/或活性来调节苗或叶发育。活性的变化可导致与对照植物相比，苗和/或叶发育发生以下改变中的至少一项或多项：包括但不限于叶数量的变化、叶表面的改变、维管结构的改变、节间和植物生长以及叶衰老的改变。
如上面所论述，技术人员将认识到用于调节植物的苗和叶发育的适当启动子。用于这个实施例的示例性启动子包括组成型启动子、苗偏好的启动子、苗分生组织偏好的启动子和叶偏好的启动子。示例性的启动子已在本文别处公开。
增加植物中本发明的多肽的活性和/或水平可导致节间和生长的改变。因此，本发明的方法可用于产生经修饰的植物。另外，如上面所论述，植物中的活性同时调节根和苗生长。因而，本发明还提供了用于改变根/苗比的方法。可通过改变植物中的多肽的水平和/或活性，来进一步调节苗或叶发育。
因此，本发明还提供与对照植物相比较时具有受调节的苗和/或叶发育的植物。在一些实施例中，本发明的植物具有提高了的本发明的多肽的水平/活性。在其他实施例中，本发明的植物具有降低了的本发明的多肽的水平/活性。
vi.调节生殖组织发育
提供了用于调节生殖组织发育的方法。在一个实施例中，提供了用于调节植物中的花发育的方法。所谓“调节花发育”意指与其中多肽的活性或水平还未受调节的对照植物相比，植物的生殖组织的结构的任何改变。“调节花发育”还包括与其中多肽的活性或水平未受调节的对照植物相比，植物生殖组织发育的时刻的任何改变(例如花发育时刻的延迟或提前)。生殖发育时刻的变化可导致雄性和雌性生殖组织的发育的同步改变。宏观改变可包括在环境胁迫时的如下变化：生殖器官的尺寸、形状、数目或位置，这些结构形成的发育时间周期，或者维持或经历开花过程的能力。微观改变可包括构成生殖器官的细胞的类型或形状的改变。
调节植物中的花发育的方法包括调节植物中的活性。在一个方法中，提供了本发明的序列。可通过这种方式提供核苷酸序列：将包含本发明的核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该序列，从而修改花的发育。在其他实施例中，引入植物中的核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
在具体的方法中，通过增加多肽在植物中的水平或活性来调节花发育。活性的变化可导致与对照植物相比，花发育发生以下改变中的至少一项或多项：包括但不限于开花的改变、花数量的变化、雄性不育的修饰和结籽的改变。诱导开花延迟或抑制开花可用于增强诸如苜蓿之类的饲料作物的产量。用于测量花发育的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如Mouradov，etal.，(2002)ThePlantCellS111-S130(Mouradov等人，2002年，《植物细胞》，第S111-S130页)，该文献以引用方式并入本文。
如上面所论述，技术人员将认识到用于调节植物中的花发育的适当启动子。用于该实施例的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、苗偏好的启动子以及花序偏好的启动子。
在其他方法中，通过改变本发明的序列的水平和/或活性来调节花发育。这种方法可包括将核苷酸序列引入植物中并改变多肽的活性。在其他方法中，引入植物中的核苷酸构建体被稳定掺入植物的基因组中。改变本发明的序列的表达可调节胁迫期间的花发育。此类方法在本文别处进行了描述。因此，本发明还提供与对照植物的花发育相比具有受调节的花发育的植物。组合物包括具有改变的本发明的多肽的水平/活性且具有改变的花发育的植物。组合物还包括具有经修饰的本发明多肽水平/活性的植物，其中该植物在胁迫期间保持或继续进行开花过程。
还提供了使用本发明的序列来增加种子尺寸和/或重量的方法。该方法包括提高植物或植物部分(诸如种子)中的序列的活性。种子大小和/或重量的增加包括种子大小或重量增加和/或一个或多个种子部分(包括例如胚芽、胚乳、种皮、糊粉或子叶)的大小或重量增加。
如上面所论述，技术人员将认识到用于增加种子大小和/或种子重量的适当启动子。该实施例的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、种子偏好的启动子、胚偏好的启动子和胚乳偏好的启动子。
用于改变植物中的种子尺寸和/或种子重量的方法可增加植物中的活性。在一个实施例中，可按这种方式提供核苷酸序列：将包含本发明的核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该序列，从而影响种子重量和/或大小。在某些实施例中，引入植物中的核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
还认识到，增加种子大小和/或重量可以还伴随有幼苗生长速度的增加或早期活力的增加。如本文所用，术语“早期活力”是指植物在早期发育过程中快速生长的能力，涉及到萌发之后发育良好的根系和发育良好的光合器的成功建立。此外，当与对照比较时，种子大小和/或重量的增加还可导致植物产量的增加。
因此，本发明还提供与对照植物相比具有增加的种子重量和/或种子大小的植物。在其他实施例中，还提供了具有增加的活力和植物产量的植物。在一些实施例中，本发明的植物具有经修饰的本发明的多肽的水平/活性和具有增加了的种子重量和/或种子尺寸。在其他实施例中，这种植物在其基因组中稳定掺入了包含本发明的核苷酸序列的核酸分子，该序列有效连接至能驱动在该植物细胞中的表达的启动子。
vii.多核苷酸、表达盒和另外的多核苷酸的使用方法
本文所公开的核苷酸、表达盒和方法可用于调控任何异源核苷酸序列在宿主植物中的表达以便改变植物表型。多种表型变化是值得关注的，包括修饰植物中的脂肪酸组成、变更植物的氨基酸含量、变更植物的病原体防御机制等等。这些结果可通过在植物中表达异源产物或增加内源产物的表达来实现。或者，这些结果可通过在植物中减少一种或多种内源产物(特别是酶或辅因子)的表达来实现。这些改变导致转化植物的表型变化。
所关注的基因反映作物开发参与者的商业市场和利益。所关注作物和市场在变化，并且随着发展中国家打开世界市场，也将出现新的作物和技术。另外，随着我们对农学性状和特性诸如产量和杂种优势的理解的增加，对用于转化的基因的选择将会相应变化。所关注基因的大体类别包括例如涉及信息的那些基因(诸如锌指)、涉及通信的那些基因(诸如激酶)和涉及看家的那些基因(诸如热休克蛋白)。转基因的更具体类别包括例如编码对农艺学、昆虫抗性、病害抗性、除草剂抗性、不育性、籽粒特性和商业产品重要的性状的基因。一般而言，所关注基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些以及影响籽粒大小、蔗糖载量等的那些。
在某些实施例中，可将本发明的核酸序列与所关注的其他多核苷酸序列联合(“堆叠”)使用，以便产生具有所需表型的植物。生成的组合可包括所关注多核苷酸中的任何一者或多者的多个拷贝。有效连接到所关注多核苷酸序列的启动子可为在植物细胞中活跃的任何启动子。在一些实施例中，使用在植物的生殖组织(例如，雄蕊或子房)中活跃(或可被激活)的启动子是特别有利的。同样地，启动子可为，例如，组成型活性启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或发育阶段特异性启动子。另外，外源核酸分子的启动子可与第二外源核酸分子的启动子相同或不同。
本发明的多核苷酸可与任何基因或基因的组合堆叠以产生具有多种所需的性状组合的植物，包括但不限于对动物饲料而言理想的性状如高油基因(例如，美国专利No.6,232,529)；平衡的氨基酸(例如大麦硫堇(美国专利No.5,990,389；5,885,801；5,885,802和5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson，etal.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页)和WO1998/20122)以及高甲硫氨酸蛋白(Pedersen，etal.，(1986)J.Biol.Chem.261：6279(Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》，第261卷，第6279页)；Kiriharaetal.，(1988)Gene71：359(Kirihara等人，1988年，《基因》，第71卷，第359页)和Musumura，etal.，(1989)PlantMol.Biol.12：123(Musumura等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第123页))；提高的消化性(如经修饰贮藏蛋白(于2001年11月7日提交的美国专利申请No.10/053,410)和硫氧还蛋白(于2001年12月3日提交的美国专利申请No.10/005,429))，上述公开内容以引用方式并入本文。本发明的多核苷酸还可与昆虫、病害或除草剂抗性所需的性状进行堆叠(如：苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)毒蛋白(美国专利No.5,366,892；5,747,450；5,737,514；5723,756；5,593,881；Geiser，etal.，(1986)Gene48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页))；凝集素(VanDamme，etal.，(1994)PlantMol.Biol.24：825(VanDamme等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第825页))；伏马毒素解毒基因(美国专利No.5,792,931)；无毒性和病害抗性基因(Jones，etal.，(1994)Science266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)；Martin，etal.，(1993)Science262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)；Mindrinos，etal.，(1994)Cell78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页))；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，诸如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂，诸如草胺膦或basta(如bar基因)；以及草甘膦抗性(EPSPS基因))；以及与加工或工艺产品所需的性状进行堆叠，诸如：高油(如美国专利No.6,232,529)；经修饰的油(如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利No.5,952,544；WO1994/11516))；经修饰的淀粉(如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))和聚合物或生物塑料(如美国专利No.5,602,321；β-酮硫解酶、聚羟基丁酯合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert，etal.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页))有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达)，上述公开内容以引用方式并入本文。还可以将本发明的多核苷酸与影响诸如雄性不育(如参见美国专利No.5.583,210)、茎秆强度、开花时间之类的农艺性状或诸如细胞周期调控或基因靶向(如WO1999/61619；WO2000/17364；WO1999/25821)之类的转化技术性状的多核苷酸组合，上述文献以引用方式并入本文。
本发明的包括或源于植物细胞或原生植物的转基因植物还可用堆叠性状增强，如具有由本文公开的DNA的表达结合除草剂耐性和/或害虫抗性性状得到的性状增强的作物植物。例如，具有改变的所关注性状的植物可与农艺学所关注的其他性状(诸如提供除草剂抗性和/或昆虫抗性的性状)堆叠，诸如利用来自苏云金芽孢杆菌的基因提供对鳞翅目(lepidopteran)、鞘翅目(coleopteran)、同翅目(homopteran)、半翅目(hemiopteran)和其他昆虫中的一者或多者的抗性。已知的赋予对除草剂(诸如，生长素、HPPD、草甘膦、麦草畏、草胺膦、磺酰脲类、溴苯腈和达草灭除草剂)的耐受性的基因可作为分子堆叠或育种堆叠与表达本文所公开性状的植物堆叠。编码涉及除草剂耐性的蛋白质的多核苷酸分子包括但不限于：编码美国专利No.39,247、6,566,587中所公开并用于赋予草甘膦耐性的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的多核苷酸分子；编码也用于提供草甘膦耐性的美国专利No.5,463,175中所公开的草甘膦氧化还原酶(GOX)以及美国专利No.7,622,641、7,462,481、7,531,339、7,527,955、7,709,709、7,714,188和7,666,643中所公开的草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT)的多核苷酸分子；美国专利No.7,022,896和WO2007/146706A2中所公开的用于提供麦草畏耐性的麦草畏单氧酶；编码用于提供生长素除草剂(2，4-D)耐受性的美国专利申请公布No.2005/731044或WO2007/053482A2中所公开的AAD12或者美国专利申请公布No.2011/0124503A1或美国专利No.7,838,733中所公开的AAD1的多核苷酸分子；编码用于提供HPPD抑制剂(如，羟基苯丙酮酸双加氧酶)耐受性的例如美国专利No.7,935,869、美国专利申请公布No.2009/0055976A1和No.2011/0023180A1中所公开的羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的多核苷酸分子；各专利公布以引用方式并入本文。
可与本文公开的性状结合的除草剂耐性性状的其他例子包括由编码外源草丁膦乙酰转移酶的多核苷酸赋予的那些性状，如美国专利No.5,969,213、5,489,520、5,550,318、5,874,265、5,919,675、5,561,236、5,648,477、5,646,024、6,177,616和5,879,903中所述。包含外源草丁膦乙酰转移酶的植物可表现出对抑制谷氨酰胺合成酶的草胺膦除草剂的改善的耐受性。除草剂耐性性状的其他例子包括由赋予改变的原卟啉原氧化酶(protox)活性的多核苷酸所赋予的那些性状，如美国专利No.6,288,306B1、6,282,837B1和5,767,373以及国际专利公布WO2001/12825中所述。包含此类多核苷酸的植物可对靶向原卟啉原氧化酶(也称为“原卟啉原氧化酶抑制剂”)的多种除草剂中的任一种表现出改善的耐受性。
在一个实施例中，所关注序列改善植物生长和/或作物产量。例如，所关注序列包括可导致初生根系或侧根系改善的农学上重要的基因。这类基因包括但不限于营养物质/水转运蛋白和生长诱导物。此类基因的例子包括但不限于：玉蜀黍质膜H+-ATP酶(MHA2)(Frias，etal.，(1996)PlantCell8：1533-44(Frias等人，1996年，《植物细胞》，第8卷，第1533-1544页))；AKT1，即拟南芥中钾摄取组织的组分(Spalding，etal.，(1999)JGenPhysiol113：909-18(Spalding等人，1999年，《普通生理学杂志》，第113卷，第909-918页))；激活根尖细胞中的细胞分裂周期的RML基因(Cheng，etal.，(1995)PlantPhysiol108：881(Cheng等人，1995年，《植物生理学》，第108卷，第881页))；玉蜀黍谷氨酰胺合成酶基因(Sukanya，etal.，(1994)PlantMolBiol26：1935-46(Sukanya等人，1994年，《植物分子生物学》，第26卷，第1935-1946页))和血红蛋白(Duff，etal.，(1997)J.Biol.Chem27：16749-16752(Duff等人，1997年，《生物化学杂志》，第27卷，第16749-16752页)，Arredondo-Peter，etal.，(1997)PlantPhysiol.115：1259-1266(Arredondo-Peter等人，1997年，《植物生理学》，第115卷，第1259-1266页)；Arredondo-Peter，etal.，(1997)PlantPhysiol114：493-500(Arredondo-Peter等人，1997年，《植物生理学》，第114卷，第493-500页)以及其中引用的参考文献)。所关注序列还可用于表达负面影响根发育的基因的反义核苷酸序列。
另外，除了使用传统的育种方法之外，还可从遗传学上改变对农学而言重要的性状如油含量、淀粉含量和蛋白质含量。修饰包括增加油酸、饱和或不饱和油的含量、增加赖氨酸和硫的水平、提供必需氨基酸以及淀粉的修饰。美国专利No.5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389中描述了大麦硫堇蛋白修饰，这些专利以引用方式并入本文。另一个例子是美国专利No.5,850,016中所描述的由大豆2S白蛋白编码的富赖氨酸和/或富硫种子蛋白，以及Williamson，etal.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页)所述的源自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，以上公开内容以引用方式并入本文。可通过定点诱变产生编码序列的衍生物来增加预选的氨基酸在所编码的多肽中的水平。例如，编码大麦高赖氨酸多肽的基因(BHL)源于大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂，参见于1996年11月1日提交的美国专利申请No.08/740,682和WO1998/20133，这两篇文献的公开内容以引用方式并入本文。其他蛋白质包括富含甲硫氨酸的植物蛋白质，诸如来自向日葵籽(Lilley，etal.，(1989)ProceedingsoftheWorldCongressonVegetableProteinUtilizationinHumanFoodsandAnimalFeedstuffs，ed.Applewhite(AmericanOilChemistsSociety，Champaign，Illinois)，pp.497-502(Lilley等人，1989年，《关于人类食物和动物饲料中植物蛋白利用的世界大会论文集》，Applewhite编辑(美国油脂化学家协会，伊利诺州尚佩恩)，第497-502页)，其以引用方式并入本文)；玉米(Pedersen，etal.，(1986)J.Biol.Chem.261：6279(Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》，第261卷，第6279页)；Kirihara，etal.，(1988)Gene71：359(Kirihara等人，1988年，《基因》，第71卷，第359页)，这两篇文献均以引用方式并入本文)和水稻(Musumura，etal.，(1989)PlantMol.Biol.12：123(Musumura等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第123页)，其以引用方式并入本文)。其他农学上重要的基因编码胶乳、Floury2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。
昆虫抗性基因可以编码针对严重影响产量的害虫诸如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等的抗性。这类基因包括例如苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因(美国专利No.5,366,892、5,747,450、5,736,514、5,723,756、5,593,881以及Geiser，etal.，(1986)Gene48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页))等。
编码病害抗性性状的基因包括：解毒基因，诸如对抗伏马毒素的基因(美国专利No.5,792,931)；无毒性(avr)和病害抗性(R)基因(Jones，etal.，(1994)Science266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)；Martin，etal.，(1993)Science262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)以及Mindrinos，etal.，(1994)Cell78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页))等。
除草剂抗性性状可包括编码针对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的除草剂(特别是磺酰脲类除草剂)的抗性的基因(如含有导致这种抗性的突变，特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码针对起到抑制谷氨酰胺合酶作用的除草剂诸如草丁膦或basta的抗性的基因(如bar基因)，或本领域已知的其他这类基因。所述bar基因编码针对除草剂basta的抗性，nptII基因编码针对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，ALS基因突变体编码针对除草剂氯磺隆的抗性。
不育基因也可编码在表达盒中，为物理去雄提供另选方案。可以这类方式使用的基因的例子包括雄性组织偏好的基因和具有雄性不育表型的基因如QM，其在美国专利No.5,583,210中进行了描述。其他基因包括激酶和编码对雄性或者雌性配子体发育有毒的化合物的那些基因。
谷粒的质量反映在诸如以下性状中：饱和及不饱和油的含量和类型、必需氨基酸的质量和数量、纤维素的含量。在玉米中，经修饰的大麦硫堇蛋白在美国专利No.5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389中进行了描述。
还可在一个或多个基因上编码商业性状，所述基因可增加例如用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白质的表达。转化植物的另一重要的商业用途是生产聚合物和生物塑料，诸如在美国专利No.5,602,321中描述的。诸如β-酮基硫解酶、PHB酶(聚羟基丁酸合酶)和乙酰乙酰辅酶A还原酶(参见Schubert，etal.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页))等基因有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。
外源产物包括植物酶和产物以及来自包括原核生物和其他真核生物在内的其他来源的那些产物。这类产物包括酶、辅因子、激素等。可增加蛋白质，特别是具有改善的氨基酸分布以改善植物营养价值的修饰蛋白质的水平。这可通过表达具有提高的氨基酸含量的这类蛋白来实现。
基因组编辑和诱导的诱变
一般来讲，修改或改变宿主内源基因组DNA的方法是可用的。这包括改变宿主天然DNA序列或预先存在的转基因序列，所述转基因序列包括调控元件、编码和非编码序列。这些方法也用于使核酸靶向基因组中预先工程改造的靶标识别序列。例如，本文所述的经过基因改良的细胞或植物使用“定制的”大范围核酸酶生成，所述大范围核酸酶的产生用于修饰植物基因组(参见例如WO2009/114321；Gao，etal.，(2010)PlantJournal1：176-187(Gao等人，2010年，《植物杂志》，第1卷，第176-187页))。其他定点工程改造通过使用限制性酶的限制特性结合的锌指结构域识别。参见例如Urnov，etal.，(2010)NatRevGenet.11(9)：636-46(Urnov等人，2010年，《自然综述遗传学》，第11卷，第9期，第636-646页)；Shukla，etal.，(2009)Nature459(7245)：437-41(Shukla等人，2009年，《自然》，第459卷，第7245期，第437-441页)。
“TILLING”或“靶向诱导基因组局部突变”是指用于生成和/或识别并且最终分离具有受调节的表达和/或活性的特定核酸的诱变变体的诱变技术(McCallum，etal.，(2000)，PlantPhysiology123：439-442(McCallum等人，2000年，《植物生理学》，第123卷，第439-442页)；McCallum，etal.，(2000)NatureBiotechnology18：455-457(McCallum等人，2000年，《自然生物技术》，第18卷，第455-457页)和Colbert，etal.，(2001)PlantPhysiology126：480-484(Colbert等人，2001年，《植物生理学》，第126卷，第480-484页))。TILLING的方法是本领域中所公知的(美国专利No.8,071,840)。
也可采用其他诱变方法将突变引入所公开的基因。用于将基因突变引入植物基因并且选择具有所需性状的植物的方法是公知的。例如，可根据标准技术用诱变化学物质处理种子或其他植物材料。此类化学物质包括但不限于：硫酸二乙酯、乙烯亚胺和N-亚硝基-N-乙基脲。或者，可使用来自诸如X射线或γ射线等来源的电离辐射。
本发明的实施例确定了：生物体的基因型可经修饰以包含显性抑制因子等位基因或转基因构建体，所述显性抑制因子等位基因或转基因构建体抑制(即，减少但不消除)基因的活性，其中生物体的表型基本上不受影响。
杂交种子生产需要消除由雌性亲本产生的花粉或使其失活。花粉的不完全移除或失活提供了自交的可能性，提高了不经意自花授粉的种子将被无意中收获并且与杂交种子包装在一起的风险。一旦种植种子后，即可识别并选择自交植物；所述自交植物与用于产生杂交种的雌性近交系在遗传上是等同的。通常，自交植物基于其相对于杂交植物减少的活力来进行识别和选择。例如，玉蜀黍的雌性自交植物通过其较少活力的植物外观和/或生殖特性，包括较短的植物高度、小的穗尺寸、穗和籽粒形状、穗轴颜色或其他特性来识别。自交系也可使用分子标记分析来识别(参见例如，SmithandWych，(1995)SeedSci.Technol.14：1-8(Smith和Wych，1995年，《种子科学与技术》，第14卷，第1-8页))。使用此类方法，自花授粉系的纯合性可通过分析在基因组中的不同基因座处的等位基因组成来验证。
因为杂交植物是重要和有价值的大田作物，所以植物育种工作者一直致力于开发基于稳定自交系的农学上无害的高产杂交体。此类杂交体的可用性允许通过所用的投入产生最大量的作物，同时尽量减少对昆虫和环境胁迫的敏感性。要实现此目标，植物育种工作者必须通过识别并选择出现在分离群体中的基因独特个体来开发用于制备杂交体的优良自交亲本系。本发明有助于实现此目标，例如通过提供在杂交时生成雄性不育子代的植物，其可用作生成杂交植物的雌性亲本植物。
使用传统方法和较新的高通量方法，大量基因在其表达模式中已被识别为穗丝优选的。当方法限于经典的正向或反向基因突变分析时，想要确定这些基因的功能与最终产生功能性花粉的重要生物化学或发育过程之间的相关性是困难的。如本文所公开的，玉蜀黍中的抑制方法提供另选的识别与玉蜀黍中的花粉发育直接相关的基因的快速方式。
根据需要，用于表达目的核酸分子的启动子可以为已知在植物或动物中有效的众多天然存在的启动子中的任一个。引导在植物的雄性或雌性生殖器官的细胞中表达的启动子可用于生成转基因植物或本发明植物的育种对。可用于本发明的启动子可包括：组成型启动子，其一般在植物的大多数或所有组织中有活性；诱导型启动子，其通常为失活的或表现出低的基础表达水平，并且可在用适当的诱导剂接触细胞时被诱导达到相对高的活性；组织特异性(或组织优选的)启动子，其通常仅在一种或少量特定细胞类型(如，植物花药细胞)中表达；以及发育特异性或阶段特异性启动子，其仅在植物生长或发育期间的限定时期内是活性的。如有必要，通常可修饰启动子以改变表达水平。某些实施例包括被操纵的物种外源的启动子。例如，引入到ms45ms45玉蜀黍种质中的Ms45基因可由分离自另一植物物种的启动子驱动；然后发夹构建体可被设计为靶向外源植物启动子，从而降低发夹结构与非靶标的内源玉蜀黍启动子相互作用的可能性。
示例性组成型启动子包括：35S花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子(Odell，etal.，(1985)Nature313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页))、玉蜀黍泛素启动子(Christensen，etal.，(1989)PlantMol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen，etal.，(1992)PlantMol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；WO1999/43838和美国专利No.6,072,050中所公开的Rsyn7启动子和其他组成型启动子的核心启动子；水稻肌动蛋白(McElroy，etal.，(1990)PlantCell2：163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第163-171页))；pEMU(Last，etal.，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588(Last等人，1991年，《理论与应用遗传学》，第81卷，第581-588页))；MAS(Velten，etal.，(1984)EMBOJ.3：2723-2730(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页))；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)；水稻肌动蛋白启动子(美国专利No.5,641,876；WO2000/70067)；玉蜀黍组蛋白启动子(Brignon，etal.，(1993)PlantMolBio22(6)：1007-1015(Brignon等人，1993年，《植物分子生物学》，第22卷，第6期，第1007-1015页)；Rasco-Gaunt，etal.，(2003)PlantCellRep.21(6)：569-576(Rasco-Gaunt等人，2003年，《植物细胞报道》，第21卷，第6期，第569-576页))等。其他组成型启动子包括，例如在美国专利No.5,608,144和No.6,177,611以及PCT专利公布No.WO2003/102198中所述的那些启动子。
组织特异性、组织偏好的或阶段特异性调控元件还包括：例如，在成花诱导时活化的AGL8/FRUITFULL调控元件(Hempel，etal.，(1997)Development124：3845-3853(Hempel等人，1997年，《发育》，第124卷，第3845-3853页))；根特异性调控元件，诸如来自RCP1基因和LRPl基因的调控元件(TsugekiandFedoroff，(1999)Proc.Natl.Acad，USA96：12941-12946(Tsugeki和Fedoroff，1999年，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第12941-12946页)；SmithandFedoroff，(1995)PlantCell7：735-745(Smith和Fedoroff，1995年，《植物细胞》，第7卷，第735-745页))；花特异性调控元件，诸如来自LEAFY基因和APETALA1基因的调控元件(Blazquez，etal.，(1997)Development124：3835-3844(Blazquez等人，1997年，《发育》，第124卷，第3835-3844页)；Hempel等人，出处同上，1997年)；种子特异性调控元件，诸如来自油质蛋白基因的调控元件(Plant，etal.，(1994)PlantMol.Biol.25：193-205(Plant等人，1994年，《植物分子生物学》，第25卷，第193-205页))以及开裂区特异性调控元件。另外的组织特异性或阶段特异性调控元件包括：Zn13启动子，其为花粉特异性启动子(Hamilton，etal.，(1992)PlantMol.Biol.18：211-218(Hamilton等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第211-218页))；异常花器官(UNUSUALFLORALORGANS，UFO)启动子，其在顶端苗分生组织中有活性；苗分生组织中有活性的启动子(Atanassova，etal.，(1992)PlantJ.2：291(Atanassova等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第291页))；cdc2启动子和cyc07启动子(参见例如，Ito，etal.，(1994)PlantMol.Biol.24：863-878(Ito等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第863-878页)；Martinez，etal.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA89：7360(Martinez等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第7360页))；分生组织偏好的meri-5和H3启动子(Medford，etal.，(1991)PlantCell3：359(Medford等人，1991年，《植物细胞》，第3卷，第359页)；Terada，etal.，(1993)PlantJ.3：241(Terada等人，1993年，《植物杂志》，第3卷，第241页))；大麦中Myb相关基因的分生组织和韧皮部偏好的启动子(Wissenbach，etal.，(1993)PlantJ.4：411(Wissenbach等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第411页))；拟南芥cyc3aAt和cyc1At(Shaul，etal.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93：4868-4872(Shaul等人，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第4868-4872页))；长春花(C.roseus)细胞周期蛋白CYS和CYM(Ito，etal.，(1997)PlantJ.11：983-992(Ito等人，1997年，《植物杂志》，第11卷，第983-992页))；以及烟草属细胞周期蛋白B1(Trehin，etal.，(1997)PlantMol.Biol.35：667-672(Trehin等人，1997年，《植物分子生物学》，第35卷，第667-672页))；在花分生组织中有活性的APETALA3基因的启动子(Jack，etal.，(1994)Cell76：703(Jack等人，1994年，《细胞》，第76卷，第703页)；Hempel等人，出处同上，1997年)；Agamous样(AGL)家族成员例如AGL8的启动子，其在过渡到开花时在苗分生组织中有活性(Hempel等人，出处同上，1997年)；花离区启动子；L1特异性启动子；增强催熟的番茄聚半乳糖醛酸酶启动子(Nicholass，etal.，(1995)PlantMol.Biol.28：423-435(Nicholass等人，1995年，《植物分子生物学》，第28卷，第423-435页))；E8启动子(Deikman，etal.，(1992)PlantPhysiol.100：2013-2017(Deikman等人，1992年，《植物分子生物学》，第100卷，第2013-2017页))以及果实特异性2A1启动子、来自玉蜀黍的U2和U5snRNA启动子、来自编码Z422kD玉米醇溶蛋白的基因的Z4启动子、来自编码10kD玉米醇溶蛋白的基因的Z10启动子、来自编码27kD玉米醇溶蛋白的基因的Z27启动子、来自编码19kD玉米醇溶蛋白的基因的A20启动子等。另外的组织特异性启动子可使用熟知的方法进行分离(参见例如，美国专利No.5,589,379)。苗偏好的启动子包括：苗分生组织偏好的启动子，诸如Weigel，etal.，(1992)Cell69：843-859(Weigel等人，1992年，《细胞》，第69卷，第843-859页)中公开的启动子(登录号M91208)；登录号AJ131822；登录号Z71981；登录号AF049870以及McAvoy，etal.，(2003)ActaHort.(ISHS)625：379-385(McAvoy等人，2003年，《园艺学报》，国际园艺学会(ISHS)，第625卷，第379-385页)中公开的苗偏好的启动子。花序偏好的启动子包括：查尔酮合成酶的启动子(VanderMeer，etal.，(1992)PlantJ.2(4)：525-535(VanderMeer等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第4期，第525-535页))；花药特异性LAT52(Twell，etal.，(1989)Mol.Gen.Genet.217：240-245(Twell等人，1989年，《分子和普通遗传学》，第217卷，第240-245页))；花粉特异性Bp4(Albani，etal.，(1990)PlantMolBiol.15：605(Albani等人，1990年，《植物分子生物学》，第15卷，第605页)；玉蜀黍花粉特异性基因Zm13(Hamilton，etal.，(1992)PlantMol.Biol.18：211-218(Hamilton等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第211-218页)；Guerrero，etal.，(1993)Mol.Gen.Genet.224：161-168(Guerrero等人，1993年，《分子和普通遗传学》，第224卷，第161-168页))；小孢子特异性启动子诸如apg基因启动子(Twell，etal.，(1993)Sex.PlantReprod.6：217-224(Twell等人，1993年，《有性植物繁殖》，第6卷，第217-224页))和绒毡层特异性启动子诸如TA29基因启动子(Mariani，etal.，(1990)Nature347：737(Mariani等人，1990年，《自然》，第347卷，第737页)；美国专利No.6,372,967)，以及其他雄蕊特异性启动子诸如MS45基因启动子、5126基因启动子、BS7基因启动子、PG47基因启动子(美国专利No.5,412,085；美国专利No.5,545,546；PlantJ3(2)：261-271(1993)(《植物杂志》，第3卷，第2期，第261-271页，1993年))、SGB6基因启动子(美国专利No.5,470,359)、G9基因启动子(美国专利No.5,8937,850；美国专利No.5,589,610)、SB200基因启动子(WO2002/26789)等。组织偏好的所关注启动子还包括向日葵花粉表达基因SF3(Baltz，etal.，(1992)ThePlantJournal2：713-721(Baltz等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第713-721页))、甘蓝型油菜(B.napus)花粉特异性基因(Arnoldo，etal.，(1992)J.Cell.Biochem，AbstractNumberY101204(Arnoldo等人，1992年，《细胞生物化学杂志》，摘要编号Y101204))。组织偏好的启动子还包括如下文献所报道的那些启动子：Yamamoto，etal.，(1997)PlantJ.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页)(psadb)；Kawamata，etal.，(1997)PlantCellPhysiol.38(7)：792-803(Kawamata等人，1997年，《植物细胞生理学》，第38卷，第7期，第792-803页)(PsPAL1)；Hansen，etal.，(1997)Mol.GenGenet.254(3)：337-343(Hansen等人，1997年，《分子和普通遗传学》，第254卷，第3期，第337-343页)(ORF13)；Russell，etal.，(1997)TransgenicRes.6(2)：157-168(Russell等人，1997年，《转基因研究》，第6卷，第2期，第157-168页)(糯性蛋白或ZmGBS；27kDa玉米醇溶蛋白ZmZ27；osAGP；osGT1)；Rinehart，etal.，(1996)PlantPhysiol.112(3)：1331-1341(Rinehart等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第3期，第1331-1341页)(来自棉花的Fbl2A)；VanCamp，etal.，(1996)PlantPhysiol.112(2)：525-535(VanCamp等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第525-535页)(烟草属SodA1和SodA2)；Canevascini，etal.，(1996)PlantPhysiol.112(2)：513-524(Canevascini等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第513-524页)(烟草属ltp1)；Yamamoto，etal.，(1994)PlantCellPhysiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)(松属(Pinus)cab-6启动子)；Lam，(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20：181-196(Lam，1994年，《细胞变异研究结果与问题》，第20卷，第181-196页)；Orozco，etal.，(1993)PlantMolBiol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页)(菠菜二磷酸核酮糖羧化酶活化酶(Rca))；Matsuoka，etal.，(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)(PPDK启动子)和Guevara-Garcia，etal.，(1993)PlantJ.4(3)：495-505(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页)(农杆菌pmas启动子)。在雄性或雌性生殖器官的细胞中是活性的组织偏好的启动子可在本发明的某些方面特别有用。
“种子偏好的”启动子包括“种子发育”启动子(在种子发育期间活跃的那些启动子，例如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子萌发”启动子(在种子萌发期间活跃的那些启动子)。参见Thompson，etal.，(1989)BioEssays10：108(Thompson等人，1989年，《生物学论文集》，第10卷，第108页)。这种种子偏好的启动子包括但不限于：Cim1(细胞分裂素诱导信息)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米醇溶蛋白)；mi1ps(肌醇-1-磷酸合酶)；参见WO2000/11177和美国专利No.6,225,529。γ-玉米醇溶蛋白是胚乳特异性启动子。球蛋白-1(Glob-1)是代表性的胚特异性启动子。对于双子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于菜豆β-菜豆蛋白、油菜籽蛋白(napin)、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白等。对于单子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白、糯性蛋白、超甜蛋白1、超甜蛋白2、球蛋白1等。另参见WO2000/12733和美国专利No.6,528,704，其中公开了来自end1和end2基因的种子偏好的启动子。另外的胚特异性启动子在如下文献中公开：Sato，etal.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93：8117-8122(Sato等人，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第8117-8122页)(水稻同源盒，OSH1)和Postma-Haarsma，etal.，(1999)PlantMol.Biol.39：257-71(Postma-Haarsma等人，1999年，《植物分子生物学》，第39卷，第257-271页)(水稻KNOX基因)。另外的胚乳特异性启动子在如下文献中公开：Albani，etal.，(1984)EMBO3：1405-15(Albani等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第1405-1415页)；Albani，etal.，(1999)Theor.Appl.Gen.98：1253-62(Albani等人，1999年，《理论与应用遗传学》，第98卷，第1253-1262页)；Albani，etal.，(1993)PlantJ.4：343-55(Albani等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第343-355页)；Mena，etal.，(1998)ThePlantJournal116：53-62(Mena等人，1998年，《植物杂志》，第116卷，第53-62页)(大麦DOF)；Opsahl-Ferstad，etal.，(1997)PlantJ12：235-46(Opsahl-Ferstad等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第235-246页)(玉蜀黍Esr)以及Wu，etal.，(1998)PlantCellPhysiology39：885-889(Wu等人，1998年，《植物细胞生理学》，第39卷，第885-889页)(水稻GluA-3、GluB-1、NRP33、RAG-1)。
诱导型调控元件是能够响应诱导物而直接或者间接激活一个或者多个DNA序列或者基因的转录的调控元件。诱导物可以是化学剂诸如蛋白、代谢物、生长调节剂、除草剂或者酚类化合物，或生理胁迫(诸如通过热、冷、盐或有毒元素直接施加的，或通过病原体或病害物诸如病毒的作用间接施加的)，或其他生物或物理因素或环境条件。可通过这种方式使含有可诱导调控元件的植物细胞暴露于诱导物：通过将该诱导物例如通过喷雾、喷淋、加热或类似方法而外施于该细胞或者植物。用于诱导来自诱导型启动子的表达的诱导剂基于特定的诱导型调控元件进行选择。出于对暴露于诱导剂下的响应，来自诱导型调控元件的转录通常被从头引发或增加至高于基础或组成表达水平。通常特异性结合到诱导型调控元件以激活转录的蛋白质因子以失活形式存在，然后由诱导物将其直接或间接转化为活性形式。任何诱导型启动子均可用于本发明(参见Ward，etal.，(1993)PlantMol.Biol.22：361-366(Ward等人，1993年，《植物分子生物学》，第22卷，第361-366页))。
诱导型调控元件的例子包括金属硫蛋白调控元件、铜诱导型调控元件或四环素诱导型调控元件，来自所述调控元件的转录可分别响应于二价金属离子、铜或四环素而实现(Furst，etal.，(1988)Cell55：705-717(Furst等人，1988年，《细胞》，第55卷，第705-717页)；Mett，etal.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA90：4567-4571(Mett等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第4567-4571页)；Gatz，etal.，(1992)PlantJ.2：397-404(Gatz等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第397-404页)；Roder，etal.，(1994)Mol.Gen.Genet.243：32-38(Roder等人，1994年，《分子和普通遗传学》，第243卷，第32-38页))。诱导型调控元件还包括：蜕皮激素调控元件或糖皮质类固醇调控元件，来自所述调控元件的转录可响应于蜕皮激素或其他类固醇而实现(Christopherson，etal.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《(美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页)；Schena，etal.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10421-10425(Schena等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第10421-10425页)；美国专利No.6,504,082)；冷响应调控元件或热休克调控元件，所述调控元件的转录可分别响应于暴露在冷或热下而实现(Takahashi，etal.，(1992)PlantPhysiol.99：383-390(Takahashi等人，1992年，《植物生理学》，第99卷，第383-390页))；醇脱氢酶基因的启动子(Gerlach，etal.，(1982)PNASUSA79：2981-2985(Gerlach等人，1982年，《美国国家科学院院刊》，第79卷，第2981-2985页)；Walker，etal.，(1987)PNAS84(19)：6624-6628(Walker等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第19期，第6624-6628页))，其可由无氧条件诱导；以及源自豌豆rbcS基因或豌豆psaDb基因的光诱导型启动子(Yamamoto，etal.，(1997)PlantJ.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页))；光诱导型调控元件(Feinbaum，etal.，(1991)Mol.Gen.Genet.226：449(Feinbaum等人，1991年，《分子和普通遗传学》，第226卷，第449页)；LamandChua，(1990)Science248：471(Lam和Chua，1990年，《科学》，第248卷，第471页)；Matsuoka，etal.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)；Orozco，etal.，.(1993)PlantMol.Bio.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页))；植物激素诱导型调控元件(Yamaguchi-Shinozaki，etal.，(1990)PlantMol.Biol.15：905(Yamaguchi-Shinozaki等人，1990年，《植物分子生物学》，第15卷，第905页)；Kares，etal.，(1990)PlantMol.Biol.15：225(Kares等人，1990年，《植物分子生物学》，第15卷，第225页))等。诱导型调控元件还可为玉蜀黍In2-1或In2-2基因的启动子，其响应于苯磺酰胺除草剂安全剂(Hershey，etal.，(1991)Mol.Gen.Gene.227：229-237(Hershey等人，1991年，《分子和普通遗传学》，第227卷，第229-237页)；Gatz，etal.，(1994)Mol.Gen.Genet.243：32-38(Gatz等人，1994年，《分子和普通遗传学》，第243卷，第32-38页))和转座子Tn10的Tet阻遏子(Gatz，etal.，(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237(Gatz等人，1991年，《分子和普通遗传学》，第227卷，第229-237页))。胁迫诱导型启动子包括：盐/水胁迫诱导型启动子，诸如P5CS(Zang，etal.，(1997)PlantSciences129：81-89(Zang等人，1997年，《植物科学》，第129卷，第81-89页))；寒冷诱导型启动子，诸如cor15a(Hajela，etal.，(1990)PlantPhysiol.93：1246-1252(Hajela等人，1990年，《植物生理学》，第93卷，第1246-1252页))、cor15b(Wlihelm，etal.，(1993)PlantMolBiol23：1073-1077(Wlihelm等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第1073-1077页))、wsc120(Ouellet，etal.，(1998)FEBSLett.423：324-328(Ouellet等人，1998年，《欧洲生化学会联合会快报》，第423卷，第324-328页))、ci7(Kirch，etal.，(1997)PlantMolBiol.33：897-909(Kirch等人，1997年，《植物分子生物学》，第33卷，第897-909页))、ci21A(Schneider，etal.，(1997)PlantPhysiol.113：335-45(Schneider等人，1997年，《植物生理学》，第113卷，第335-345页))；干旱诱导型启动子，诸如Trg-31(Chaudhary，etal.，(1996)PlantMol.Biol.30：1247-57(Chaudhary等人，1996年，《植物分子生物学》，第30卷，第1247-1257页))、rd29(Kasuga，etal.，(1999)NatureBiotechnology18：287-291(Kasuga等人，1999年，《自然生物技术》，第18卷，第287-291页))；渗透诱导型启动子，诸如Rab17(Vilardell，etal.，(1991)PlantMol.Biol.17：985-93(Vilardell等人，1991年，《植物分子生物学》，第17卷，第985-993页))和渗透蛋白(Raghothama，etal.，(1993)PlantMolBiol23：1117-28(Raghothama等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第1117-1128页))；以及热诱导型启动子，诸如热休克蛋白(Barros，etal.，(1992)PlantMol.19：665-75(Barros等人，1992年，《植物分子生物学》，第19卷，第665-675页)；Marrs，etal.，(1993)Dev.Genet.14：27-41(Marrs等人，1993年，《发育遗传学》，第14卷，第27-41页))、smHSP(Waters，etal.，(1996)J.ExperimentalBotany47：325-338(Waters等人，1996年，《实验植物学杂志》，第47卷，第325-338页))和来自欧芹泛素启动子的热休克诱导型元件(WO03/102198)。其他胁迫诱导型启动子包括rip2(美国专利No.5,332,808和美国专利申请公布No.2003/0217393)和rd29a(Yamaguchi-Shinozaki，etal.，(1993)Mol.Gen.Genetics236：331-340(Yamaguchi-Shinozaki等人，1993年，《分子和普通遗传学》，第236卷，第331-340页))。某些启动子通过创伤诱导，包括农杆菌pmas启动子(Guevara-Garcia，etal.，(1993)PlantJ.4(3)：495-505(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页))和农杆菌ORF13启动子(Hansen，etal.，(1997)Mol.Gen.Genet.254(3)：337-343(Hansen等人，1997年，《分子和普通遗传学》，第254卷，第3期，第337-343页))。
在某些实施例中，启动子基于例如是雄性育性还是雌性育性会受到影响来选择。因而，在雄性育性会受到影响的情况下，(例如，BS7基因和SB200基因)，启动子可为，例如，MS45基因启动子(美国专利No.6,037,523)、5126基因启动子(美国专利No.5,837,851)、BS7基因启动子(WO2002/063021)、SB200基因启动子(WO2002/26789)、TA29基因启动子(Nature347：737(1990)(《自然》，第347卷，第737页，1990年))、PG47基因启动子(美国专利No.5,412,085；美国专利No.5,545,546；PlantJ3(2)：261-271(1993)(《植物杂志》，第3卷，第2期，第261-271页，1993年))、SGB6基因启动子(美国专利No.5,470,359)、G9基因启动子(美国专利No.5,837,850和美国专利No.5,589,610)等。在雌性育性会受到影响的情况下，启动子可靶向雌性生殖基因，例如子房特异性启动子。在某些实施例中，可使用引导在目的组织中的表达的任何启动子，包括例如，组成型活性启动子，诸如泛素启动子，其通常影响在大多数或所有植物细胞中的转录。
在植物细胞中活跃并且可用于本发明的方法或组合物的另外的调控元件包括，例如，菠菜亚硝酸盐还原酶基因调控元件(Back，etal.，(1991)PlantMol.Biol.17：9(Back等人，1991年，《植物分子生物学》，第17卷，第9页))；γ玉米醇溶蛋白启动子、油质蛋白ole16启动子、球蛋白I启动子、肌动蛋白I启动子、肌动蛋白cl启动子、蔗糖合成酶启动子、INOPS启动子、EXM5启动子、球蛋白2启动子、b-32、ADPG-焦磷酸化酶启动子、LtpI启动子、Ltp2启动子、油质蛋白ole17启动子、油质蛋白ole18启动子、肌动蛋白2启动子、花粉特异性蛋白启动子、花粉特异性果胶裂解酶基因启动子或PG47基因启动子、花药特异性RTS2基因启动子、SGB6基因启动子、或G9基因启动子、绒毡层特异性RAB24基因启动子、邻氨基苯甲酸合酶α亚基启动子、α玉米醇溶蛋白启动子、邻氨基苯甲酸合酶β亚基启动子、二氢吡啶二羧酸合酶启动子、Thil启动子、醇脱氢酶启动子、cab结合蛋白启动子、H3C4启动子、RUBISCOSS淀粉分支酶启动子、肌动蛋白3启动子、肌动蛋白7启动子、调节蛋白GF14-12启动子、核糖体蛋白L9启动子、纤维素生物合成酶启动子、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶启动子、过氧化物歧化酶启动子、C-激酶受体启动子、磷酸甘油酸变位酶启动子、根特异性RCc3mRNA启动子、葡萄糖-6磷酸异构酶启动子、焦磷酸-果糖6-磷酸-l-磷酸转移酶启动子、β-酮乙基-ACP合酶启动子、33kDa光合体系11启动子、含氧蛋白质启动子、69kDa空泡ATP酶亚基启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、ABA-和成熟-诱导样蛋白启动子、苯丙氨酸解氨酶启动子、三磷酸腺苷酶S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶启动子、查尔酮合酶启动子、玉米醇溶蛋白启动子、球蛋白-1启动子、生长素结合蛋白启动子、UDP葡萄糖类黄酮糖基-转移酶基因启动子、NTI启动子、肌动蛋白启动子和opaque2启动子。
适合本发明目的的植物可为单子叶植物或双子叶植物，并且包括但不限于玉蜀黍、小麦、大麦、裸麦、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、卷心菜、花椰菜、西兰花、芜菁甘蓝、小红萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、夏南瓜、南瓜、大麻、西葫芦、苹果、梨、柑橘、甜瓜、李子、樱桃、桃子、蜜桃、杏子、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高梁、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、水稻、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥和木本植物诸如针叶树和落叶树。因而，本发明的转基因植物或经过遗传修饰的植物细胞可以为被子植物或裸子植物。
被子植物基于子叶数目被分为两大类，子叶为通常贮存或吸收食物的种子叶；单子叶被子植物具有单个子叶，而双子叶被子植物具有两个子叶。被子植物产生各种有用的产品，包括材料诸如木材、橡胶和纸；纤维诸如棉花和亚麻；药草和药物诸如奎宁和长春碱；观赏花卉诸如玫瑰和包括在本发明范围内的兰花，以及食品诸如谷粒、油、水果和蔬菜。被子植物涵盖各种开花植物，包括例如谷类植物、豆科植物、油料植物、阔叶树、结实作物和观赏花卉，其一般类别不一定具有排他性。谷类植物，其产生可食用谷粒，包括例如，玉米、水稻、小麦、大麦、燕麦、裸麦、鸭茅、羊草和高粱。豆科植物包括碗豆家族(豆科(Fabaceae))的成员并且产生已知为豆类的特征性果实。豆科植物的例子包括，例如，大豆、豌豆、鹰嘴豆、乌头叶菜豆、蚕豆、菜豆、利马豆、兵豆、豇豆、干豆和花生，以及苜蓿、百脉根、三叶草和红豆草。具有用作油的来源的种子的油料植物包括大豆、向日葵、油菜籽(卡诺拉油菜)和棉籽。被子植物还包括阔叶树，其为通常具有单个茎(干)的多年生木本植物。此类树的例子包括桤木、白蜡树、山杨、椴木(椴树)、山毛榉、桦木、樱桃树、三角叶杨、榆树、桉树、山核桃树、刺槐、槭树、橡树、柿子树、白杨、悬铃木、胡桃、红杉和柳树。树可用作，例如，纸浆、纸、结构材料和燃料的来源。
被子植物产生包围在成熟子房内的种子。被子植物果实可适用于人类或动物食用或适用于种子的收集以繁殖物种。例如，蛇麻子为因其在麦芽酒中的风味而享有美誉的桑树科的成员。结实被子植物还包括葡萄、橙、柠檬、柚子、鳄梨、海枣、桃子、樱桃、橄榄、李子、椰子、苹果和梨树，以及黑莓、蓝莓、覆盆子、草莓、菠萝、番茄、黄瓜和茄子植物。观赏花卉为栽培用作装饰用花的被子植物。商业上重要的观赏花卉的例子包括玫瑰、百合、郁金香和菊花、金鱼草、山茶花、康乃馨和矮牵牛花植物并且可包括兰花。将认识到本发明还可使用裸子植物实践，其不会在果实中产生种子。
纯合性这种遗传条件存在于当相同的等位基因位于同源染色体上的对应基因座时。杂合性这种遗传条件存在于当不同的等位基因位于同源染色体上的对应基因座时。半合子状态这种遗传条件存在于当仅有基因(或一组基因)的一个拷贝，而在姊妹染色体上没有对应等位基因时。
本文所用的植物育种方法是本领域技术人员公知的。有关植物育种技术的讨论，参见Poehlman，(1987)BreedingFieldCropsAVIPublicationCo.，WestportConn.(Poehlman，1987年，《培育田间作物》，AVI出版公司，康涅狄格州韦斯特波特)。在该方法中最优选的许多植物是通过利用植物的授粉方法的技术来培育的。
可使用回交方法将基因引入植物。该技术已使用了数十年以将性状引入植物。描述该技术的例子以及人们所熟知的其他植物育种方法可在如下参考文献中找到，例如PlantBreedingMethodology，edit.NealJensen，JohnWiley&Sons，Inc.(1988)(《植物育种方法》，NealJensen编辑，约翰威立国际出版公司，1988年)等参考文献中找到。在典型的回交方案中，初始所关注品种(回交亲本)与携带待转移的单个所关注基因的第二品种(非回交亲本)杂交。然后将这次杂交所得的子代再次与回交亲本杂交，并且重复该过程直至获得植物，其中除了来自非回交亲本的单个转移基因之外，回交亲本的基本所有所需形态和生理特性都在该转换的植物上恢复。
转基因是指已通过基因工程技术被引入细胞的基因组的任何核酸序列。转基因可为天然DNA序列或异源DNA序列。术语天然DNA序列可指天然存在于细胞中但可能已由其初始形式进行了修饰的核苷酸序列。
使用熟知的技术，可基于其序列同源性分离另外的启动子序列。在这些技术中，将已知的启动子序列的全部或者一部分用作探针，所述探针与来自所选生物体的克隆的基因组DNA片段群体(即基因组文库)中存在的其他序列选择性杂交。可使用本领域易得的核酸序列杂交方法来获得与包括但不限于如下的物种的这些启动子序列对应的序列：玉蜀黍(玉米；Zeamays)、卡诺拉油菜(甘蓝型油菜(Brassicanapus、芜菁(Brassicarapassp.))、苜蓿(Medicagosativa)、水稻(Oryzasativa)、黑麦(Secalecereale)、高粱(Sorghumbicolor，Sorghumvulgare)、向日葵(Helianthusannuus)、小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、烟草(Nicotianatabacum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、落花生(Arachishypogaea)、棉花(Gossypiumhirsutum)、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Cofeaspp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠萝(Ananascomosus)、柑橘(Citrusspp.)、可可(Theobromacacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(Musaspp.)、鳄梨(Perseaamericana)、无花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidiumguajava)、芒果(Mangiferaindica)、橄榄(Oleaeuropaea)、燕麦、大麦、蔬菜类、观赏植物类和针叶树类。优选地，植物包括玉蜀黍、大豆、向日葵、红花、卡诺拉油菜、小麦、大麦、裸麦、苜蓿和高粱。
整个启动子序列或其一部分可用作能够与对应的启动子序列特异性杂交的探针。为实现在多种条件下的特异性杂交，这类探针包括独特的序列，并且优选地长为至少约10个核苷酸，并且最优选地长为至少约20个核苷酸。此类探针可用于通过熟知的聚合酶链反应(PCR)的过程来扩增来自所选的生物体的对应启动子序列。该技术可用于从所需的生物体分离另外的启动子序列，或用作诊断分析以确定启动子序列在生物体中的存在。例子包括杂交筛选所铺板的DNA文库(菌斑或菌落，参见例如Innis，etal.，(1990)PCRProtocols，AGuidetoMethodsandApplications，eds.，AcademicPress(Innis等人编辑，1990年，《PCR方案：方法与应用的指南》，学术出版社))。
一般来讲，对应于本发明的启动子序列并且与本文公开的启动子序列杂交的序列将与所公开的序列具有至少50％同源性、55％同源性、60％同源性、65％同源性、70％同源性、75％同源性、80％同源性、85％同源性、90％同源性、95％同源性和甚至98％同源性或更多。
可操作本文所公开的具体启动子序列的片段以促进可操作地连接的分离的核苷酸序列的花粉优选的表达。这些片段将包含本文所公开的具体启动子核苷酸序列的至少约20个连续核苷酸、优选地至少约50个连续核苷酸、更优选地至少约75个连续核苷酸、甚至更优选地至少约100个连续核苷酸。这类片段的核苷酸将通常包含该具体启动子序列的TATA识别序列。可通过使用限制性酶切割本文所公开的天然存在的启动子序列来获得此类片段，或通过由天然存在的DNA序列合成核苷酸序列或通过使用PCR技术来获得此类片段。具体参见Mullis，etal.，(1987)MethodsEnzymol.155：335-350(Mullis等人，1987年，《酶学方法》，第155卷，第335-350页)和Erlich，ed.(1989)PCRTechnology(StocktonPress，NewYork)(Erlich编辑，1989年，《PCR技术》，纽约斯托克顿出版社)。此外，这些片段的变体，诸如得自定点诱变的那些，都涵盖在本发明的组合物中。
启动子序列的生物活性变体也涵盖在本发明的组合物中。调控“变体”是启动子的一种修饰形式，其中一个或多个碱基已经被修饰、移除或添加。例如，移除DNA序列的一部分的常规方法为结合DNA扩增使用核酸外切酶以生成双链DNA克隆的单向嵌套缺失。用于该目的的商业试剂盒以商品名Exo-SizeTM(美国马萨诸塞州贝弗利的新英格兰生物实验室公司(NewEnglandBiolabs，Beverly，Mass.))销售。简单地说，该程序需要将核酸外切酶III与DNA一起温育，以在3′至5′方向上在DNA模板的5′突出端、钝端或切口处逐步移除核苷酸。然而，核酸外切酶III不能移除3′，4-碱基突出端的核苷酸。用该酶对克隆的定时酶切产生单向嵌套缺失。
调控序列变体的一个例子是通过在较大启动子中引起一个或多个缺失形成的启动子。最多至转录起始位点附近的TATA框的启动子的5′部分的缺失，可以在实现的同时而不会消除启动子活性，如Zhu，etal.，(1995)ThePlantCell7：1681-89(Zhu等人，1995年，《植物细胞》，第7卷，第1681-1689页)所述。此类变体应保持启动子活性，特别是驱动在特定组织中表达的能力。生物活性变体包括例如本发明的具有一个或多个核苷酸置换、缺失或插入的天然调控序列。可通过RNA印迹分析测量活性，当使用转录融合体时测量报告基因活性等等。参见例如Sambrook，etal.，(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual(2nded.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港)，其以引用方式并入本文。
本发明中公开的花粉优选的启动子的核苷酸序列及其变体和片段在与分离的核苷酸序列可操作地连接时可用于任何植物的遗传操纵，所述分离的核苷酸序列的表达将受控制以实现所需的表型响应。
可操作地连接至本文公开的调控元件的核苷酸序列可以为目标基因的反义序列。“反义DNA核苷酸序列”意在指与该核苷酸序列的5’-至-3’正常取向成相反取向的序列。当被递送到植物细胞中时，反义DNA序列的表达能防止目标基因的DNA核苷酸序列的正常表达。该反义核苷酸序列所编码的RNA转录物与目标基因的DNA核苷酸序列的转录所产生的内源信使RNA(mRNA)互补并能够与该内源信使RNA杂交。在这个情况下，由目标基因编码的天然蛋白质的产生被抑制，以实现所需的表型响应。因此，受本文权利要求保护的调控序列可有效连接至反义DNA序列以降低或抑制植物中天然或外源蛋白质的表达。
基因表达的调控可根据其对各个细胞的影响来测量。性状的成功调控可通过高严格性，例如影响在特定细胞类型的所有或几乎所有细胞中的表达，或通过低严格性而实现。例如，在特定组织内对98％、95％、90％、80％或更少细胞中的表达的调控可产生所需的表型。
所谓“开花胁迫”是指在开花期或开花期前后植物没有水分供应而出现干旱胁迫。
所谓“灌浆胁迫”是指在种子积累贮藏产物(碳水化合物、蛋白质和/或油)的时期植物没有水分供应而出现干旱胁迫。
所谓“雨养条件”是指没有故意地不供应水，也没有人工补充水。
所谓“良好浇灌条件”是指可供给植物的水通常足以保证最佳生长。
可控制玉蜀黍的干旱胁迫条件以实现有目标的减产。例如，通过在植物发育的特定时期提供测定量的水，可实现对照植物的产量下降达20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多。
调节植物中的干旱耐受性的方法也是本发明的特征。将不同程度的干旱耐受性引入到植物中的能力给本发明的使用提供了灵活性：例如在具有较长或较干燥的生长季节的地区引入强干旱耐受性以改进灌浆或进行青贮，相比之下在具有较短生长季节的农业地区引入中等的干旱耐受性以进行青贮。
除了与对照植物相比提高本发明植物对干旱胁迫的耐受性之外，本发明还实现了本发明植物的更高密度种植，从而提高了每英亩玉米的产量。在上个世纪，每英亩玉米增加的产量大部分来自于提高对密度的耐受性，而这对植物是一种胁迫。调节植物胁迫应答的方法，例如提高对密度的耐受性，也是本发明的一个特征。
将植物在正常和干旱胁迫条件下进行田间栽培。在正常条件下，给植物浇水，水量足以获得最佳的生长和产量。对于干旱胁迫植物，在授粉前大约一周开始并继续至授粉后三周的时间段内水可能是受限制的。在限制水供应的时间段内，受干旱胁迫的植物可能显示出萎蔫和卷叶的可见迹象。胁迫的程度可相对于在良好浇灌的条件下获得的产量按产量下降百分数计算。用便携式TPS-1光合系统(马萨诸塞州埃姆斯伯里的PP系统公司(PPSystems，Amesbury，MA))测定蒸腾作用、气孔导度和CO2同化。例如在授粉后四十天，可测量植物上的每片叶子。数值通常表示为六次测定的平均值。
除了相比于对照植物提高本发明植物对干旱胁迫的耐受性和改善密度胁迫耐受性之外，本发明还可提供更高的氮利用效率(NUE)。NUE得到改进的植物可在氮供应充足的可比条件下比对照植物具有更高的生产率，和/或可在氮供应显著降低的情况下维持生产率。改进的NUE可反映在一个或多个属性，如生物量提高、谷粒产量提高、收获指数提高、光合速率提高和对生物或非生物胁迫的耐受性提高。特别是，改进在玉蜀黍中的NUE将提高每单位输入氮肥的可收获产量，这在氮肥供应有限的发展中国家和在氮使用水平高的发达国家都如此。
实例1.通过过度表达截短的ZmSRTF18来提高谷粒产量。
用构建体转化玉蜀黍，所述构建体包含驱动编码ZmSRTF18新型截短形式(SEQIDNO：2)的多核苷酸的组成型启动子。该截短形式ZmSRTF18-del比已知最短的天然功能性剪接变体(1.4，SEQIDNO：6)要短71个氨基酸。ZmSRTF18-del不含由外显子1、2和3编码的所有氨基酸，并且不含由外显子4编码的52个氨基酸。外显子4的这种部分丧失导致丧失两个推定的核定位信号。参见图3。
用包含驱动ZmSRTF18-del的组成型启动子的构建体转化的玉蜀黍植物与野生型(WT)对照植物相比未展示出明显表型变化。然而，该转化的玉蜀黍植物确实表现出了比对照植物更高的谷粒产量。
以每个位置4-6个重复样的方式收集产量数据。产量分析通过ASREML(VSN国际公司(VSNInternationalLtd))、计算BLUP(最佳线性无偏预测)(Cullis，B.Retal(1998)Biometrics54：1-18(Cullis，B.R等人，1998年，《生物统计学》，第54卷，第1-18页)；Gilmour，A.R.etal(2009).ASRemlUserGuide3.0(Gilmour，A.R.等人，2009年，《ASReml用户指南3.0》)；Gilmour，A.R.，etal(1995)Biometrics51：1440-50(Gilmour，A.R.等人，1995年，《生物统计学》，第51卷，第1440-50页))来进行。使用混合模型框架执行单位置和多位置分析。
在单位置分析中，构建体的主要效应被视为随机效应。分区因子诸如重复样和重复样内的incblock(不完全区组设计)被视为随机的。对田间的空间变化进行校正。在多位置分析中，位置、构建体及位置x构建体相互作用的主要效应被视为固定效应。事件及其与位置的相互作用的主要效应被视为随机效应。分区因子诸如重复样和重复样内的incblock被视为随机的。
执行单位置和多位置分析，并对每个事件计算blup(最佳线性无偏预测)。在双尾检验中使用0.1的p值，计算事件与WT之间的显著性。
在针对三种测试环境的第一评价中，包含六个转化事件中的五个中的任何一者的测交杂种植物，平均产生比对照多3.4％至6.0％的谷粒产量。这些测试环境包括(1)对于花期干旱胁迫的受控胁迫环境；(2)对于灌浆期干旱胁迫的受控胁迫环境；(3)不具有受控胁迫的环境的目标群体之一。在第一测试环境中，对于所有六个事件，相比于对照的产量改善从统计结果来看都非常明显。六个事件中的五个的多位置产量改善从统计结果来看也非常明显，这主要由第一测试环境的结果驱动。
在采用两个测交近交系的五个测试环境中的第二评价中，包含十个转化事件中的七个中的任何一者的测交杂种植物，产生的谷粒产量与对照相比统计上显著增加2.0％至4.0％。观察到收获时谷粒水分略微增加。
在第二评价中，两个不同杂种组合中的相同事件的测试对于谷粒产量一般是中性到略负，其中一个事件显示出统计上显著增加4.1％。
十个组成型ZmSRTF18-del事件的第三评价中的产量测试显示，在3个低氮环境中的2个中，与批量无效对照(bulk-nullcontrol)相比产量始终增加，在所有三个低氮环境中构建体的平均优势为3.4蒲式耳/英亩(达显著水平，P≤0.01)。
虽然不受任何理论束缚，但已提出ZmSRTF18-del在玉蜀黍中的组成型表达增加了谷粒产量，同时不会诱导剧烈的表型变化，因为核定位信号的缺少可能减少了蛋白质向细胞核中的转运，并且作为另外一种选择或除此之外，还因为截短蛋白质结合于更少启动子元件和/或结合力更弱。细胞核中的低蛋白质丰度和对启动子的较弱结合的组合，可导致与使用非截短野生型ZmSRTF18的组成型表达得出的结果相比，更少下游基因被表达和/或下游基因的表达水平更低。因此，ZmSRTF18-del的组成型表达可影响下游基因表达，这种影响对植物性能更有利。
作为另外一种选择或除此之外，转录因子的截短形式可以负显性方式作用，通过例如如下方式使转录复合物失活：防止天然的非截短蛋白质进入复合物，使其较弱结合于复合物中的相互作用蛋白质，或因为截短物改变了复合物中另一种蛋白质的构象。
作为另外一种选择或除此之外，保守半胱氨酸残基可影响转录因子功能。生成了ZmSRTF18的变体以评价该方面。如表1中所示，ZmSRTF18-del(ALT3)使截短蛋白质修复了保守半胱氨酸残基，可能需要该残基来形成正常功能所需的二硫键。当在不存在二硫苏糖醇(DTT)以避免还原二硫键的情况下使用图6的凝胶迁移测定法时，结果显示，与ZmSRTF18-del蛋白质相比，ZmSRTF18-del(ALT3)蛋白质对DNA的结合增强。ZmSRTF18-del(ALT2)修复了在珍珠粟的同源物(Pg-DREB2A；SEQIDNO：11)、大麦的同源物(HvDRF1.3；SEQIDNO：12)、水稻的同源物(OsDREB2B；SEQIDNO：13)；小麦的同源物(TaDREB1，SEQIDNO：14)和拟南芥的同源物(AtDREB2A，SEQIDNO：15)中保守的16氨基酸区。该16氨基酸区包含保守半胱氨酸残基和推定的核定位信号。
作为另外一种选择或除此之外，在水分充足条件下，截短的转录因子自身可较弱结合于DRE启动子元件，但在胁迫条件下，可诱导相互作用蛋白质，让其结合于截短蛋白质并提高其结合DRE启动子元件的能力。
实例2.ZmSRTF18-del的亚细胞定位的确定。
如实例1中所指出，缺失了两个推定的核定位信号的截短物可降低ZmSRTF18-del蛋白质朝细胞核的运动，导致相对于在组成型过度表达后将获得的非截短蛋白质的丰度而言，细胞核处的截短蛋白质的丰度更低。这可导致谷粒产量增加而不会诱导通常与DREB2转录因子的组成型过度表达相关的不利表型变化。为了进一步评价亚细胞定位，设计了序列SV40NLS-ZmSRTF18-del(SEQIDNO：9)。该序列在ZmSRTF18-del的N端包含异源核定位信号。
制备了构建体，该构建体包含编码融合到荧光蛋白TagRFP的ZmSRTF18-del或SV40NLS-ZmSRTF18-del蛋白质的DNA。还制备了对照构建体，该对照构建体仅包含TagRFP，而无Zm-SRTF18-del。融合构建体中包含短接头，并使用组成型启动子。用构建体转化玉蜀黍胚盾片组织。例如，将编码红色荧光蛋白标签(TagRFP)的DNA连接到编码ZmSRTF18-del的DNA，并用该构建体转化玉蜀黍胚盾片组织。单独地，用相似但还包含核定位信号的构建体(SV40NLS-ZmSRTF18-del)转化玉蜀黍胚盾片组织。用单独的TagRFP序列进行的转化提供对照。通过荧光显微术监测经转化的盾片组织中的瞬时表达，确定三种构建体中的每一者所产生的蛋白质的亚细胞定位。
结果在图5中显示。在左图中，在整个细胞中都观察到了TagRFP。相似地，在中间图中，ZmSRTF18-del-TagRFP定位于整个细胞，包括细胞核。相比之下，SV40NLS-ZmSRTF18-del-TagRFP仅定位于细胞内的细胞核中(右图)。在细胞核中观察到更强烈的染色。该研究表明，SV40NLS-ZmSRTF18-del-TagRFP构建体中的异源核定位信号有效地使融合蛋白质定向于细胞核。此外，该研究表明，并非所有ZmSRTF18-del-TagRFP蛋白质都定位于细胞核中，并且ZmSRTF18-del-TagRFP蛋白质在细胞核中可影响下游基因转录。
用由组成型启动子驱动的SV40NLS-ZmSRTF18-del基因转化GS3XGaspe玉蜀黍植物。尽管事实是SV40NLS有效地使ZmSRTF18-del定向于细胞核，但并未观察到植物生长的持续显著减弱。该结果表明，在用由组成型启动子驱动的ZmSRTF18-del转化的玉蜀黍植物中未观察到多效性，可能不能完全归咎于核定向的丧失。
实例3.截短物对启动子结合的影响
如实例1中所指出，截短蛋白质ZmSRTF18-del可结合于更少启动子元件和/或结合力更弱，从而导致相对于野生型ZmSRTF18的组成型过度表达而言，更少基因被诱导，或基因表达更弱。可使用凝胶迁移测定法研究截短物对启动子结合活性的影响，揭示截短物对下游基因的调节的影响。
在凝胶迁移测定法(也称为电泳迁移率变动测定法(EMSA))中，带有结合蛋白质的DNA比不带结合蛋白质的DNA更慢穿过凝胶。因此，凝胶迁移测定法可揭示蛋白质是否结合于特定DNA片段。使用MolecularProbesTMEMSA试剂盒(E33075)执行图6的凝胶迁移测定法，该试剂盒提供用于凝胶迁移实验的背景信息、材料和方法。因为还不确定哪种条件能最准确反映体内条件，所以在存在或不存在DTT(二硫苏糖醇)的情况下进行测定。根据制造商方案用Green对DNA进行染色。
通过用来自的pET28载体在大肠杆菌中表达，来获得用于凝胶迁移测定法的ZmSRTF18蛋白质变体。将蛋白质与包含6个组氨酸的20氨基酸N端标签一起表达，并且通过钴柱亲和色谱法进行蛋白质纯化。
用于图6凝胶迁移测定法的DNA为34核苷酸区(SEQIDNO：16)，包括从玉蜀黍RAB17启动子获得的DRE元件ACCGAC，如Srivastavetal.(2010)PlantSignalingandBehavior5(7)：775-784(Srivastav等人，2010年，《植物信号传导与行为》，第5卷，第7期，第775-784页)所鉴定。参见Rab17启动子序列的SEQIDNO：17。
下列ZmSRTF18蛋白质变体用于凝胶迁移测定法，从最短到最长氨基酸序列依次为：
ZmSRTF18-del是所用的最严重截短的蛋白质(参见图3和SEQIDNO2)。
ZmSRTF18-del(ALT3)(SEQIDNO：4)在该截短蛋白质的N端添加三个氨基酸(MGC)。该添加恢复了可形成正常功能所需的二硫键的保守半胱氨酸残基。
ZmSRTF18-del(ALT2)(SEQIDNO：3)恢复了在珍珠粟、大麦、水稻、小麦和拟南芥的同源物中高度保守的16氨基酸区，并且还添加了起始甲硫氨酸。该区域包含ZmSRTF18-del(ALT3)说明中提及的保守半胱氨酸，并且还包含推定的核定位信号(关于NLS定位，参见图3)。
ZmSRTF18(SPLVAR4)是包含外显子1和4全部并且没有其他缺失的功能性天然剪接变体(参见图3)。
ZmSRTF18(SPLVAR4)(C71S)在71位置处将保守半胱氨酸替换为丝氨酸，其他方面与ZmSRTF18(SPLVAR4)相同。
凝胶迁移测定法的结果在图6中示出。在不存在DTT的情况下，严重截短的蛋白质ZmSRTF18-del似乎不结合DNA。然而，ZmSRTF18-del(ALT3)显示相对于ZmSRTF18-del而言对DRE核心元件增强的结合。因此，在ZmSRTF18-del的N端添加仅3个氨基酸对功能有较大影响。其他三种蛋白质均有效地结合DNA并且显示出明显的凝胶迁移。在存在DTT的情况下，ZmSRTF18-del和ZmSRTF18-del(ALT3)蛋白质较弱地结合DNA。其他蛋白质具有对DNA的强结合，且观察到明显凝胶迁移。因此在存在或不存在DTT的情况下，与非截短蛋白质ZmSRTF18(SPLVAR4)相比，严重截短的蛋白质ZmSRTF18-del更弱地结合DNA。
为了确定DNA结合是否是特异性的并且为了检测较不严重截短的蛋白质ZmSRTF18-del(ALT5)(SEQIDNO：26)和ZmSRTF18-del(ALT6)(SEQIDNO：27)的结合，在存在DTT的情况下，以相同的34bpDNA片段，或以DRE元件ACCGAC已突变为TTTTTT的对应片段，进行进一步的凝胶迁移实验。还通过添加300mMKCl和剪切的鲑鱼DNA来优化条件，以减少非特异性结合。观察到ZmSRTF18(SPLVAR4)、ZmSRTF18(SPLVAR4)(C71S)和ZmSRTF18-del(ALT6)的强特异性结合，但未观察到ZmSRTF18-del、ZmSRTF18-del(ALT2)、ZmSRTF18-del(ALT3)或ZmSRTF18-del(ALT5)的强特异性结合。
实例4.ZmSRTF18的表达谱
ZmDREB2A在拟南芥中的组成型过度表达增强了多种胚胎形成晚期丰富(LEA)蛋白基因和热休克蛋白基因以及其他基因的表达。鉴于ZmSRTF18-del对核心启动子元件的结合减弱，相对于野生型ZmSRTF18的过度表达所引起的诱导而言，可诱导较少的下游基因。为了测试该假设，使用平台(加利福尼亚州圣地亚哥的亿明达公司(Illumina，Inc.，SanDiego，CA))分析了对于驱动ZmSRTF18-del的组成型启动子所转基因的营养生长后期植物的叶子的基因表达谱，所述叶子在水分充足和干旱胁迫条件下采样。识别出两簇基因，在干旱胁迫条件下这些基因在转基因叶子中具有与无效叶子相比明显不同的表达。一簇包含47个基因，对于转基因叶子和无效叶子而言，这些基因在干旱条件下的表达相对于水分充足条件都有所增加，但转基因叶子的表达增加量比无效叶子要大。另一簇包含56个基因，对于转基因叶子和无效叶子而言，这些基因在干旱条件下的表达相对于水分充足条件都有所减少，但转基因叶子的表达减少量比无效叶子要大。所考虑的47和56个基因是p值≤0.1的基因。
第一簇中的基因的两个具体例子是编码Δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶或P5CS的两个基因，P5CS是控制通过脯氨酸生物合成途径的通量的关键酶。在来自干旱胁迫条件的叶子中，一个P5CS基因在转基因叶子中的表达是在无效叶子中的大约两倍。在干旱胁迫叶子中，另一个P5CS基因在转基因叶子中的表达比无效叶子多大约50％。在转基因叶子和无效叶子中测定脯氨酸含量。在转基因叶子中观察到增加的脯氨酸含量，这与P5CS基因表达增加相符。DREB1和DREB2基因之前在拟南芥或烟草中的过度表达增加了脯氨酸表达或者脯氨酸和P5CS基因表达两者(Gilmouretal(2000)PlantPhysiol124：1854(Gilmour等人，2000年，《植物生理学》，第124卷，第1854页)；Chenetal(2007)BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications353：299(Chen等人，2007年，《生物化学和生物物理研究通讯》，第353卷，第299页))。过度表达截短的DREB2基因ZmSRTF18-del增加了脯氨酸和P5CS基因表达，这与之前非截短的DREB蛋白质的过度表达一样，该观察结果表明，截短的ZmSRTF18-del充当功能性转录因子，不太可能以负显性方式起作用而妨碍天然非截短的ZmSRTF18基因的功能。
实例5.ZmSRTF18-del转基因玉蜀黍植物的形态测量。
在标准田间条件下种植对于包含驱动ZmSRTF18-del的组成型启动子的构建体所转基因的玉蜀黍测交杂种植物。测量了代表两个独立转基因事件的每株植物的雌穗叶长、雌穗叶宽、雌穗叶面积和节数，并与对照相比较。与对照相比，未发现所测量的性状有显著差异。此外，对于多个事件而言，在转基因植物与对照植物之间未观察到株高、雌穗高或到开花的时间有显著差异。这些结果与ZmDREB2A基因在拟南芥中组成型过度表达后所观察到的严重矮化和缓慢生长表型截然不同(Qinetal，2007，PlantJ50：54(Qin等人，2007年，《植物杂志》，第50卷，第54页))。
为了评估非截短的ZmSRTF18在玉蜀黍中组成型过度表达的效应，用ZmSRTF18(SPLVAR1)(SEQIDNO.5，由组成型启动子驱动)转化GS3XGaspe玉蜀黍。观察到了玉蜀黍生长和发育的严重延迟，正如花粉散发的时间延长所指示的。ZmSRTF18-del基因的截短物似乎使与非截短的ZmSRTF18的组成型过度表达相关的这种不利表型最小化。
为了确定对ZmSRTF18-delN端添加16个氨基酸加上起始甲硫氨酸是否会影响生长和发育，测量了组成型过度表达ZmSRTF18-del(ALT2)(SEQIDNO：3)的转基因玉蜀黍近交植物。在V5、V11或V15生长阶段测量的转基因植物与无效植物之间未观察到株高有显著差异。
概括地说，非截短的ZmSRTF18(SPLVAR1)使玉蜀黍的生长和发育严重延迟，而两种不同截短蛋白质ZmSRTF18-del和ZmSRTF18-del(ALT2)在组成型过度表达时并未延迟玉蜀黍生长和发育。
实例6.ABA处理后增加的ZmSRTF18表达。
为了确定天然ZmSRTF18表达是否受到激素处理的影响，将营养生长后期的非转基因玉蜀黍杂种植物的叶盘漂浮在水上，或漂浮在包含ABA(脱落酸)或乙烯利的溶液上(图4)。使用和荧光探针方法，通过实时定量PCR测定ZmSRTF18转录物的相对丰度(CaoandShockey(2012)JAgricFoodChem60：12296(Cao和Shockey，2012年，《农业化学与食品化学杂志》，第60卷，第12296))。似乎存在初始创伤效应，因为在3小时时，即使在水对照叶盘中，表达也很高。然而，在6小时和24小时时，与水对照组相比，ABA处理引起明显更多的ZmSRTF18转录物。探针区位于ZmSRTF18的外显子4中，因此将检测所有剪接变体的转录物。
实例7.通过蛋白质印迹检测蛋白质。
使用兔多克隆抗体探测来自组成型表达ZmSRTF18-del基因的转基因事件或对应的事件无效对照的叶蛋白质提取物的蛋白质印迹(图7)。针对与来自图3的P303至D320的区域相对应的短肽，来制备抗体。泳道2到5具有不同浓度的标准蛋白质，所述不同浓度通过在大肠杆菌中表达具有20氨基酸N端标签的ZmSRTF18-del蛋白质而获得，所述20氨基酸N端标签包含用于以钴柱纯化的6个组氨酸。在所检测的五个事件中的四个中，在转基因事件(泳道6、8、10和12)中检测到ZmSRTF18-del蛋白质，但未在对应事件无效对照(泳道7、9、11和13)中检测到。这证实截短蛋白质可积累，并且截短物似乎不会破坏蛋白质的稳定性。在转基因事件和无效对照中还检测到一种不相关的交叉反应蛋白质。
实例8.通过过度表达SRTF18改善耐霜性。
在籽苗测定法中测试了用包含驱动ZmSRTF18-del的组成型启动子的构建体转化的玉蜀黍植物的耐霜性。籽苗耐霜性预计在全株水平有耐霜性并且在整个植物生殖期诸如灌浆期间有耐霜性。在一个实施例中，将转基因种子和对照(无效或野生型)种子播种在4”盆中作为温室中相匹配的对。将来自所关注构建体的转化株系随机分布在10个浅箱中，每个浅箱中15个盆。使用完全随机区组设计在盆和浅箱水平对转基因植物和无效植物分区。
使籽苗生长到V3阶段，然后转移到生长室中以约10℃在光照下进行5小时低温驯化并且以约4℃在无光照下进行16小时低温驯化。在低温驯化后，在-3℃下对籽苗进行冷冻处理最多5.5小时。在冷冻处理及正常室温下3-4天恢复期后，对籽苗的存活率进行评分。
对存活使用“1”或对死亡植物使用“0”的二元逻辑回归模型提供存活/死亡概率比的对数。无效假设是转基因植物具有与对照相同的存活率。如果转基因植物具有比对照更高的存活率，处于0.05或0.1水平，则否决无效假设。结果在表2中提供。
表2.S％＝处理后存活的植物％。Rep#＝测试中的匹配对(转基因植物 和对照植物)数量。CK＝对照。TG+＝转基因。
实例9.待测试的ZmSRTF18构建体。
将评价针对产量增加来优化ZM-SRTF18表达的另外构建体。评价了具有多种驱动ZmSRTF18-del表达的启动子的构建体，所述启动子包括与实例1的组成型启动子相比更强或更弱的组成型启动子、干旱诱导型启动子、强效绿色组织叶肉细胞启动子、根偏好的启动子以及雌穗偏好的启动子。
·驱动ZmSRTF18(SPLVAR1)表达的干旱诱导型启动子。
·驱动ZmSRTF18-del表达的干旱诱导型启动子。
·驱动ZmSRTF18-del表达的组成型启动子。
·驱动ZmSRTF18-del(ALT2)表达的组成型启动子。
·驱动ZmSRTF18-del(ALT3)表达的组成型启动子。
·驱动ZmSRTF18-del(ALT5)表达的组成型启动子。
·驱动具有异源核定位信号的ZmSRTF18-del表达的组成型启动子。
·驱动具有与ZmSRTF18-del中相同的截短物的珍珠粟同源物表达的组成型启动子。
·驱动具有与ZmSRTF18-del中相同的截短物的高粱同源物表达的组成型启动子。
·驱动ZmSRTF18-del表达的强效绿色组织叶肉细胞启动子。
·驱动ZmSRTF18-del表达的根偏好的启动子。
·驱动ZmSRTF18-del表达的雌穗偏好的启动子。
·被设计为通过RNAi策略降低ZmSRTF18表达的构建体。
实例10.ZmSRTF18N端截短物及其与AP2结构域的接近度的简述。
DREB转录因子具有高度保守的58氨基酸DNA结合结构域，称为AP2结构域(SEQIDNO：10和图3)。制备了不同长度的若干ZmSRTF18N端截短物。表3中对截短蛋白质汇总了缺失氨基酸的数量及AP2结构域N端保留的氨基酸的数量。使用ZmSRTF18(SPLVAR4)氨基酸序列(SEQIDNO：6和图3)作为参考，制备了缺失范围在18至71个氨基酸内的截短蛋白质。这些截短蛋白质保留了AP2结构域N端的12至65个氨基酸。如实例3中所述，在凝胶迁移测定法中，在存在1mMDTT的情况下，保留AP2结构域N端的12至52个氨基酸的截短蛋白质均不能强效特异性结合于DRE启动子元件。保留AP2结构域N端的65个氨基酸的最不严重截短的蛋白质强效并特异性地结合DRE启动子元件，这与ZmSRTF18(SPLVAR4)蛋白质一样。最严重截短的蛋白质ZmSRTF18-del增加了杂种玉蜀黍产量(如实例1中所述)并且在组成型表达时未显示出对生长的不利效应(如实例5所述)。ZmSRTF18-del(ALT2)在组成型表达时也未显示出对玉蜀黍近交系的生长的不利影响(如实例5所述)。因此，尽管在体外采用纯化蛋白质时观察到减弱的启动子结合，N端截短物可帮助避免对生长的不利影响，同时还使得产量增加。可在其他DREB转录因子中制备类似的N端截短物。作为具体例子，我们在与高粱(SEQIDNO：24)和珍珠粟(SEQIDNO：25)的DREB2蛋白质的ZmSRTF18-del截短物相同的位置处制备了截短物。
表3.ZmSRTF18N端截短物的说明。

Claims (52)

1.一种改善植物的非生物胁迫耐受性的方法，所述方法包括用构建体转化所述植物，所述构建体包含有效连接到编码截短的DREB转录因子的多核苷酸的启动子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述截短的DREB转录因子不含功能性N端CBF结构域。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述截短影响截短之前存在于所述DREB转录因子中的至少一个核定位信号。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述截短的DREB转录因子不含功能性N端CBF结构域或不含截短之前存在于所述DREB转录因子中的功能性核定位信号。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述截短的DREB转录因子不含功能性N端CBF结构域和截短之前存在于所述DREB转录因子中的至少一个核定位信号。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述截短的DREB转录因子不含功能N端CBF结构域和截短之前存在于所述DREB转录因子中的所有核定位信号。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸编码作为ZmSRTF18(SEQIDNO：1)或ZmDREB2A(SEQIDNO：8)的截短物或变体的多肽。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述所编码的多肽的序列为SEQIDNO：2、3、4、5、6、19、20、21、26或28。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述启动子驱动组成型表达。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述启动子驱动组织偏好的表达。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述植物产生相对于对照增加的种子产量。
12.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述植物为玉蜀黍、小麦、水稻或高粱。
13.根据权利要求11所述的方法，其中种子产量在非生物胁迫的条件下增加。
14.根据权利要求13所述的方法，其中非生物胁迫包括高盐浓度。
15.根据权利要求13所述的方法，其中非生物胁迫包括受寒或冷冻。
16.根据权利要求13所述的方法，其中非生物胁迫包括在开花期时或大约在开花期时或者在灌浆期时降低的水供应。
17.根据权利要求13所述的方法，其中非生物胁迫包括降低的氮供应。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述截短包含N端缺失，所述N端缺失保留所述AP2结构域N端的至少12个但少于65个氨基酸。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述截短保留所述AP2结构域N端的12、14、28或52个氨基酸。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述截短的DREB转录因子具有SEQIDNO：2、3、4、19、20、21、24、25、26或28的多肽序列。
21.一种降低由DREB转录因子的异位表达所引起的多效性的方法，包括所述转录因子的截短形式的表达，其中所述截短导致下列特征中的至少一者：(i)丧失功能性核定位信号；(ii)丧失功能性CBF结构域；(iii)改变所述转录因子的结合性质。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述截短形式不含存在于所述非截短DREB转录因子中的至少一个核定位信号。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述截短使所述多肽的第一个外显子缺失。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述截短使所述多肽的头两个外显子缺失。
25.一种编码来自玉蜀黍的DREB转录因子的截短物或变体的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸在玉蜀黍植物中的过度表达增加了谷粒产量并且所述玉蜀黍植物不表现出多效性效应。
26.一种编码来自玉蜀黍的DREB转录因子的截短物或变体的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸在玉蜀黍植物中的过度表达增加了在干旱或降低的氮供应的条件下的谷粒产量。
27.一种改善植物的非生物胁迫耐受性的方法，所述方法包括用构建体转化所述植物，所述构建体包含有效连接到编码不含功能性N端CBF结构域或功能性核定位信号的DREB转录因子的多核苷酸的启动子。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸编码作为ZmSRTF18(SEQIDNO：1)或ZmDREB2A(SEQIDNO：8)的截短物或变体的多肽。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述所编码的多肽的序列为SEQIDNO：2、3、4、5、6、19、20、21、26或28。
30.根据权利要求13所述的方法，其中所述植物为玉蜀黍、小麦、水稻或高粱。
31.根据权利要求12所述的方法，其中种子产量在非生物胁迫的条件下增加。
32.根据权利要求12所述的方法，其中非生物胁迫包括高盐浓度。
33.根据权利要求12所述的方法，其中非生物胁迫包括受寒或冷冻。
34.根据权利要求12所述的方法，其中非生物胁迫包括在开花期时或大约在开花期时或者在灌浆期时降低的水供应。
35.根据权利要求12所述的方法，其中非生物胁迫包括降低的氮供应。
36.根据权利要求2所述的方法，其中所述截短导致丧失一个或多个核定位信号。
37.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸为ZmSRTF18的同源物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述多核苷酸从高粱或珍珠粟分离。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述多核苷酸与SEQIDNO：24或25具有至少90％同一性。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述多核苷酸的序列为SEQIDNO：24或25。
41.根据权利要求37所述的方法，其中所述多核苷酸不含存在于所述非截短同源物中的至少一个核定位信号。
42.一种改善玉蜀黍植物的胁迫耐受性的方法，所述方法包括表达编码包含ZmSRTF18的截短形式(SEQIDNO：2)的多肽的多核苷酸，其中所述截短物导致丧失所述多肽的功能性核定位信号并且其中所述玉蜀黍植物在种植于正常或干旱条件下时不表现出显著的多效性表型。
43.一种改善玉蜀黍植物的胁迫耐受性的方法，所述方法包括在编码与ZmSRTF18具有至少85％同一性的多肽(SEQIDNO：2)的内源基因组DNA中制造定点改变，其中所述定点改变导致丧失所述多肽的功能性N端CBF结构域或功能性核定位信号并且其中所述玉蜀黍植物在种植于正常或干旱条件下时不表现出显著的多效性表型。
44.一种植物，所述植物包含编码包含ZmSRTF18的截短形式(SEQIDNO：2)的多肽的多核苷酸，其中所述截短物导致丧失所述多肽的功能性核定位信号并且其中所述玉蜀黍植物在种植于正常或干旱条件下时不表现出显著的多效性表型。
45.一种玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物包含编码包含ZmSRTF18的截短形式(SEQIDNO：2)的多肽的多核苷酸，其中所述截短物导致丧失所述多肽的功能性核定位信号并且其中所述玉蜀黍植物在种植于正常或干旱条件下时不表现出显著的多效性表型。
46.一种种子，所述种子包含编码包含ZmSRTF18的截短形式(SEQIDNO：2)的多肽的多核苷酸，其中所述截短物导致丧失所述多肽的功能性核定位信号并且其中所述玉蜀黍植物在种植于正常或干旱条件下时不表现出显著的多效性表型。
47.一种植物细胞，所述植物细胞包含编码包含ZmSRTF18的截短形式(SEQIDNO：2)的多肽的多核苷酸，其中所述截短物导致丧失所述多肽的功能性核定位信号并且其中所述玉蜀黍植物在种植于正常或干旱条件下时不表现出显著的多效性表型。
48.一种植物，所述植物在编码与ZmSRTF18具有至少85％同一性的多肽(SEQIDNO：2)的内源基因组DNA中包含定点改变，其中所述定点改变导致丧失所述多肽的功能性N端CBF结构域或功能性核定位信号并且其中所述玉蜀黍植物在种植于正常或干旱条件下时不表现出显著的多效性表型。
49.一种玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物在编码与ZmSRTF18具有至少85％同一性的多肽(SEQIDNO：2)的内源基因组DNA中包含定点改变，其中所述定点改变导致丧失所述多肽的功能性N端CBF结构域或功能性核定位信号并且其中所述玉蜀黍植物在种植于正常或干旱条件下时不表现出显著的多效性表型。
50.一种种子，所述种子在编码与ZmSRTF18具有至少85％同一性的多肽(SEQIDNO：2)的内源基因组DNA中包含定点改变，其中所述定点改变导致丧失所述多肽的功能性N端CBF结构域或功能性核定位信号并且其中所述玉蜀黍植物在种植于正常或干旱条件下时不表现出显著的多效性表型。
51.一种植物细胞，所述植物细胞在编码与ZmSRTF18具有至少85％同一性的多肽(SEQIDNO：2)的内源基因组DNA中包含定点改变，其中所述定点改变导致丧失所述多肽的功能性N端CBF结构域或功能性核定位信号并且其中所述玉蜀黍植物在种植于正常或干旱条件下时不表现出显著的多效性表型。
52.根据权利要求21所述的方法，其中多效性呈现出选自如下的一种或多种特性：相对于对照而言，萌发不良、生长矮化、开花延迟、花期不遇、光合速率降低、节间伸长、节间缩短、分蘖期改变以及根生长减缓。
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