HU220773B1 - Eljárás termő transzgenikus kukoricanövények előállítására - Google Patents

Description

A találmány tárgyát eljárások képezik Zea mays (a továbbiakban kukorica) fajhoz tartozó termékeny transzgenikus növények előállítására érintetlen, regenerálható Zea majAs-sejtek mikrorészecske-bombázásával, majd ezt követően szelekciós technika alkalmazásával.

A találmány szerinti eljárások alkalmasak előnyös tulajdonságú, termékeny, transzgenikus kukoricanövények előállítására, amelyek széles körben előnyösen alkalmazhatók a mezőgazdaságban.

A növények génsebészeti úton történő befolyásolása, ami a genetikai anyag (általában DNS vagy RNS) izolálását és manipulálását, valamint azt követően a manipulált genetikai anyagnak egy növénybe vagy növényi sejtbe való bejuttatását jelenti, nagyon ígéretes eljárás a modem mezőgazdaság és növénynemesítés számára. A termény megnövekedett élelmiszer-ipari értéke, magasabb terméshozamok, tápértékek, csökkentett termelési költségek, kártevő rezisztencia, stressztűrés, gyógyászati hatóanyagok, kémiai anyagok és biológiai anyagok előállítása, valamint egyéb előnyös tulajdonságok mind elérhetők a génsebészeti technikák alkalmazásával. Ha egy gént egyszer azonosítottak, klónoztak és mesterségesen megváltoztattak, akkor még mindig szükség van arra, hogy a számunkra fontos növénybe bejuttassuk, oly módon hogy a keletkező növény legyen mind termékeny, mind pedig alkalmas arra, hogy a bejuttatott gént tovább adja az utódainak.

Számos különböző módszert fejlesztettek ki, és jelenleg is hozzáférhetők, amelyek alkalmasak különböző növények és növényi sejtek DNS-sel való transzformálására. Ezek a növények általában kétszikűek, és bizonyos sikerekről is beszámoltak néhány egyszikű gabonanövény esetében. Azonban eddig néhány fajt semmilyen módszer alkalmazásával sem sikerült transzformálni, így, az ebben a leírásban ismertetett felfedezés előtt nem volt ismert olyan technológia, amellyel lehetséges volt a Zea znayj-növények stabil transzformációja a bejuttatott rekombináns DNS-sel, amelyet legalább egy teljes szexuális cikluson keresztül sikerült tovább adni. Ezt a szakmai kudarcot jól dokumentálja a szakirodalom, és számos új összefoglalóban tárgyalják [I. Potrykus, Trends in Biotechnology, 7, 269 (1989); K. Weising et al., Ann. Rév. of Genetics, 22, 421 (1988); F. Cocking et al., Science, 236. 1259 (1987)].

A DNS bejuttatására alkalmazott számos kipróbált, vagy javasolt technika közé tartozik az elektroporáció, mikroinjektálás, mikrobombázás, liposzómafuzió, Agrobacteriummal közvetített transzfer, makroinjekciózás, és tiszta DNS-sel való érintkeztetés oldatban.

Például J. DeWet és munkatársai [Experimental Manipulation of Ovule Tissue, G. Chapman et al. eds., Longman, Inc., New York (1985), 197-269. oldal] valamint Y. Ohta, [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 83, 715 (1986)] leírják, hogy sikerült DNS-t bejuttatni kukoricába, oly módon hogy pollenszemeket kevertek el DNS-oldattal, és a pollent a kukorica selymére vitték. Ezekben a közleményekben nincs olyan molekuláris adat, amely megerősítené azt, hogy idegen DNS jutott be a kukoricasejtekbe. Amtzen és munkatársai a 275 069 számú európai szabadalmi leírásban közük azt, hogy a DNS-t kukorica pollenjével inkubálták, és ezután a kukorica csövét beporozták vele, majd magok keletkeztek. Az ezekből a magvakból származó növényekről leírták, hogy tartalmazzák a bejuttatott DNS-t, de nem gondolták, hogy a bejuttatott DNS egy teljes szexuális cikluson átjut.

A. Graves és munkatársai [Plánt Mól. Bioi., 3., 43 (1986)] a Zea znays-palánták Agrobacteriummal közvetített transzformálását írják le. A bizonyítékok olyan vizsgálatokon alapulnak, amelyek nem mindig megbízhatók. A mai napig nem írtak le újabb sikeres transzformációt sem pollennel sem Agrobacteriummal közvetített transzfertechnikák alkalmazásával.

A mikrobombázásról leírták, hogy transzformált kukoricasejteket eredményez. A technikát Sanford és munkatársai írják le [Part. Sci. and Techn., 5, 27 (1987); 331 855 számú európai szabadalmi leírás, ami a 07/161 807 szériaszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésen alapul, amelyet 1988. február 28-án jelentettek be. Klein és munkatársai [Plánt Physiol., 91, 440 (1989)] leírják a transzformált kukoricasejtek előállítását, mikrobombázás alkalmazásával. A használt sejtek azonban nem voltak képesek növényekké regenerálódni. Tehát még nem közöltek kísérleti leírást, amelyben a DNS-t a bombázási technikával juttatják be bármilyen típusú regenerálható kukoricasejtbe. Semmilyen génnek nem írták le kukoricakallusz bombázásából származó stabil bejuttatását kukoricasejtbe, valamint nem sikerült elérni, hogy ezt követően termékeny növényeket regeneráljanak a kalluszból, és a bejuttatott gént a transzformált növény egy szexuális cikluson átjuttatta volna. D. McCabe és munkatársai a 270 356 számú európai szabadalmi leírásban leírják a kukorica virágpor-DNS-sel való bombázását, a virágpornak a selyemre való juttatását, és olyan magvak képződését, amelyek tartalmazzák az idegen DNS-t. Arra azonban nincs bizonyíték, hogy a DNS átjutott egy teljes szexuális cikluson, és a csoport további eredményeket sem közölt.

A kukoricaprotoplasztok elektroporációjáról leírták, hogy transzformált sejteket eredményezett [Μ. E. Fromm et al., Natúré, 319, 791 (1986)], jóllehet ezekből a sejtekből nem lett később regenerálódott növény. A kukoricaprotoplasztok elektroporációját Rhodes és munkatársai is leírták [Science et al., 240, 204 (1988)]. Bár a recipiens sejteket transzformálták, és ez utóbbi esetben a sejtek képesek voltak növényekké regenerálódni, a növények maguk sterilek maradtak. Ezenkívül, a Rhodes és munkatársai által a sejtvonalak előállítására használt módszerek nem voltak reprodukálhatók.

Egy további buktató a termékeny transzgenikus kukoricanövények előállításában a néhány transzformánsnak a kiválasztása, oly módon hogy a transzformánsoknak sem a regenerálókapacitása (a protoplasztok vagy sejttenyészetek esetében), sem a termékenysége ne romoljon el. A transzformációs technikákkal általában előállított kisszámú transzformáns következtében gyakran van szükség valamilyen szelekciós eljárásra. A szelekció azonban általában bizonyos toxikus anyagok, például herbicidek vagy antibiotikumok használa2

HU 220 773 Bl tát jelenti, ami romboló hatással lehet vagy a regenerálhatóságra, vagy a keletkező növény termékenységére.

Másrészről, az ismert volt, hogy a nemtranszformált kukoricaprotoplasztok, a tenyésztett sejtek és a kallusz legalább regenerálható, és a keletkező növények általában termékenyek. Például R. D. Shillito és munkatársai [Bio/Technology, 7, 581 (1989)], valamint L.M. Prioli és munkatársai [Bio/Technology, 7, 589 (1989)] leírják protoplasztok előállítását sejttenyészetekből, majd ezekből termékeny növények felnevelését. C. A. Rhodes és munkatársai [Bio/Technology, 6, 56 (1988)] olyan kísérleteket közölnek, amelyek során embrionális kukoricasejtek tenyészetéből izolált protoplasztokat sikerült regenerálniuk.

A szakembereknek azonban nem sikerült meghatározni, hogy mely kukoricaszövetek vagy -tenyészetek a megfelelő befogadói az idegen DNS-nek, azaz melyek tartalmaznak elegendő számú befogadóképes sejtet, amelyekbe a DNS stabilan integrálódik, ugyanakkor részét képezik a csírasejtvonalnak, azaz annak a sejtvonalnak, amely a következő növénygenerációt hozza létre.

A szakma tehát egy dilemmával állt szemben. Miközben bizonyos transzformációs technikákat javasoltak, vagy írtak le transzformáns kukoricasejtek előállítására, és bizonyos sejteket, illetve szöveteket javasoltak potenciális befogadóknak, mivel képesek voltak regenerálódni, a szakterületen dolgozók nem voltak képesek a technikáknak egy olyan kombinációját eltalálni, amellyel sikeresen lehetett volna olyan transzformált kukoricanövényt előállítani, amelyek a beléjük juttatott DNS-t képesek lettek volna egy teljes szexuális cikluson keresztül örökíteni.

A jelen találmány tárgya tehát termékeny, stabilan transzgenikus Zea mays-nóvények előállítása, valamint ezekből olyan magvak begyűjtése, amelyek a bejuttatott gént képesek az utódoknak tovább adni. A találmány tárgya továbbá ilyen stabilan transzgenikus növények és magvak előállítása mikrorészecske-bombázással, valamint szelekciós eljárás, amely a transzformált sejteknek legalább egy részének magas szintű életképességet biztosít. A találmány tárgya továbbá kukorica mellett más, magvas gabonanövényekből termékeny, stabilan transzgenikus növények előállítása.

Az alábbiakban felsorolt irodalmi hivatkozásokat referenciaként használjuk a továbbiakban.

Armstrong, CL, et al., Planta 164, 207-214 (1985);

Callis, J. et al., Genes and Develop. 1, 1183-1200 (1987);

M. Bevan et al., Nucleic Acids Research, 11, 36a (1983);

Chu, CC, et al., Sci. Sin. (Peking) 18, 659-668 (1975);

Cocking, F. et al., Science, 236, 1259-1262 (1987);

DeWet et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82, 7870-7873 (1985);

Freeling, JC, et al., Maydica XXI, 97-112 (1976);

Graves, A. et al., Plánt Mól. Bioi., 7, 43-50 (1986);

Green, C. et al., Crop Sci., 15, 417-421 (1975);

Green, C. et al., Maize fór Biological Research, Plánt Mól. Bioi. Assoc., 367-372 (1982);

Gritz, L. et al., Gene, 25, 179-188 (1983);

Guilley, H. et al., Cell, 30, 763-773 (1982);

Hallauer, AR, et al., Com and Com Improvement, 3^rd ed. Agronomy Society of America, 469-564 (1988);

Jefferson, R. et al., EMBO J., 6, 3901-3907 (1987);

Kamo, K. et al., Bot. Gaz., 146, 327-334 (1985); Klein, T. et al., Plánt Physiol., 91, 440-444 (1989); Klein, T. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 4305-9 (1988a);

Klein, T. et al., Bio/Technology, 6, 559-563 (1988b);

Lu, C. et al., Theor. Appl. Génét., 62, 109-112 (1982);

McCabe, D. et al., Bio/Technology, 6, 923-926 (1988);

Murashige, T. et al., Physiol. Plánt, 15, 473 -497 (1962);

Neuffer, M., Maize fór Biological Research, Plánt Mól. Bioi. Assoc., 19-30 (1982);

Phillips, R. et al., Com and Com Improvement, 3^rd ed., Agronomy Society of America, 345-387 (1988);

Potrykus, I., Trends in Biotechnology, 7, 269-273 (1989);

Rhodes, CA. et al., Science, 240, 204-7 (1988); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring

Harbor, NY (1989);

Sanford J. et al., Part. Sci. and Techn., 5, 27-37 (1987);

Weising, K. et al., Ann. Rév. of Genetics, 22, 421-478 (1988);

Yanisch-Perron, L. et al., Gene, 33, 109-119 (1985).

A jelen találmány tárgyát rekombináns DNS-t, előnyösen kromoszomálisan integrálódott rekombináns DNS-t tartalmazó termékeny transzgenikus Zea maysnövények képezik, amelyekben a bevitt rekombináns DNS tovább öröklődik.

A találmány tárgyát képezik továbbá mindazon termékek, amelyek transzgenikus Zea zways-növényekből, növényi sejtekből, növényi részekből, illetve magvakból származnak.

A találmány tárgyát képezik továbbá olyan transzgenikus Zea mayy-magvak, amelyek stabilan integrálódott rekombináns DNS-t tartalmaznak, és ezeknek azok az utódai, amelyek örökölték a rekombináns DNS-t. A találmány tárgya továbbá a transzgenikus növények nemesítése, valamint a rekombináns DNS ezt követő beépítése bármely Zea znays-növénybe vagy -vonalba.

A találmány tárgya továbbá eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó termékeny transzgenikus Zea maysnövények előállítására. Az eljárás mikrorészecskebombázáson, szelekción, a növények regenerálásán, valamint konvencionális visszakeresztezési technikákon alapul.

HU 220 773 Bl

A találmány tárgya továbbá eljárás Zea znayvtől eltérő, termékeny transzgenikus pázsitíuszerű transzformáit növények előállítására, amelyeket a tradicionális módszerekkel, mint például elektroporációval, Agrobacteriummal, injektálással és a korábbi ballisztikus technikákkal nem lehetett megbízhatóan transzformálni.

A találmány tárgyát képezik továbbá transzformált embriogenikus szövetből, az ezekből nyert transzgenikus magvakból, valamint az RÍ és egyéb generációkból nyert regenerált termékeny növények.

A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módját képezi egy termékeny, transzgenikus kukoricanövény, amelyet stabilan transzformáltak egy rekombináns, kiméragénnel, és ez a gén mag-tartalékfehéqeként stabilan expresszál egy fehérjét, például a 10 kD méretű zein fehérjét, oly módon hogy legalább egy aminosavszintje magasabb, mint ami a szülői, nemtranszformált sejtvonalban található. Az említett gén többszörös kópiájának expressziója, illetve a túlexpressziója lényegesen megváltoztatja bizonyos aminosavak szintjét a magban, például a lizinét, metioninét, treoninét és a hasonlókét. A továbbiakban a „lényegesen megnövekedett’’ szakkifejezés azt jelenti, hogy egy adott aminosav szintje legalább 10-20%-kal magasabb mint abban a kiindulási növényben vagy növényi részben, amelyet nem transzformáltunk az említett magtartalékfehéije génjével. Az előnyös megvalósítási módok szerint a találmány szerinti eljárással termékeny, transzgenikus növényeket állítunk elő morzsalékos embriogén kalluszcsomóinak rekombináns DNS-sel borított mikrorészecske-bombázásával, majd a transzformáit kalluszvonalak szabályozott tápközegben való növesztésével.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

Az 1 A. ábrán Az I. példában használt pHYGIl plazmid vektor térképét láthatjuk. Az IB. ábrán láthatjuk a linearizált pHYGIl plazmid megfelelő részét, amely a HPT kódoló szekvenciát és a kapcsolódó szabályozóelemeket tartalmazza. A bázispárok számozása a jelzett restrikciós enzimek felismerési helyének 5’ nukleotidjánál indul, a CaMV 35S promoter 5’ végénél levő EcoRI hellyel kezdődve.

A 2A. ábrán az I. példában használt pBII221 plazmid vektor térképét láthatjuk. A 2B. ábrán láthatjuk a linearizált pBII221 plazmidot, a HindlII hasítási helytől az EcoRI hasítási helyig.

A 3. ábrán a PH1 kalluszvonalból és egy transzformálatlan kontroll-kalluszvonalból izolált DNS Southemblotja, valamint a vizsgálatban használt pHYGIl próbák sematikus ábrázolása látható.

A 4. ábrán a PH1 kalluszvonalból és egy transzformálatlan kontroll-kalluszvonalból regenerált R0 növények leveleiből izolált levél-DNS Southem-blotja, valamint a vizsgálatban használt pHYGIl próbák sematikus ábrázolása látható.

Az 5. ábrán a PH1 R0 növények és a transzformálatlan R0 növény RÍ utódainak leveleiből izolált Southemblot, valamint a vizsgálatban használt pHYGIl próbák sematikus ábrázolása látható.

A 6. ábrán a PH2 kalluszvonalból és egy transzformálatlan kontroll-kalluszvonalból izolált DNS Southemblotja, valamint a vizsgálatban használt pHYGIl próbák sematikus ábrázolása látható.

A 7A. ábrán a II. példában használt pZ27Z10 plazmid vektor térképe látható. A 7B. ábrán a linearizált pZ27Z10 plazmid látható, amely a zlO kódoló szekvenciát, valamint a kapcsolódó szabályozóelemeket tartalmazza.

A 8. ábrán a PCR indító molekuláknak a kiméra z27-zl0 génben való lokalizációja látható, sematikusan ábrázolva.

A jelen találmány tárgya a Zea ways-fajba tartozó termékeny transzgenikus növények és magvak előállítása, illetve tárgyát képezik az ilyen transzgenikus növényekből előállított növények, növényi szövetek és magvak, valamint az utódok, és az ezekből származó termékek, előnyösen azok a transzgenikus Zea mays-növények, amelyek javított élelmi- vagy tápértékkel rendelkeznek. Az alábbiakban előállított transzgenikus növények közé tartoznak ennek a fajnak az összes növényei, beleértve a takarmánykukoricát „field com”, a pattogatni való kukoricát „pop com”, a csemegekukoricát „sweet com”, a kemény magú kukoricát „fiint com” és a lófogú kukoricát „dent com”.

A „transzgenikus” szakkifejezés jelentése a továbbiakban bármely olyan sejt, sejtvonal, kallusz, szövet, növényi rész vagy növény, amelynek a genotípusát egy rekombináns DNS jelenlétén keresztül megváltoztatták, amely DNS-t a génsebészetben „heterológ DNS”ként, „exogén DNS”-ként vagy „idegen DNS”-ként említik, és amely DNS-t a növény genetikai anyagába a génsebészet módszereinek alkalmazásával juttatták be, illetve eredetileg egy ilyen módszer alkalmazásával juttatták be egy szülői növény genetikai anyagába, és azt követően a későbbi generációkba szexuális keresztezéssel vagy aszexuális szaporítással vitték át. A továbbiakban a „genotípus” szakkifejezés jelentése a sejtben található összes genetikai anyag, akár kromoszomális vagy extrakromoszomális eredetű. Ezek szerint a „transzgenikus” szakkifejezésnek az alábbiakban való használata nem fedi a Zea mays genotípusának szokványos nemesítési módszerekkel való megváltoztatását, illetve a természetben előforduló eseményeket, például a random keresztbetermékenyítést, vírusfertőzést vagy spontán mutációt.

Az „örökletes” szakkifejezés alatt azt értjük, hogy a DNS a növénynek legalább egy teljes szexuális ciklusán át átadódik, azaz az egyik növényről a másikra a gamétákon keresztül adódik át.

A jelen találmány szerinti transzgenikus növényeket előállíthatjuk (i) egy regenerálható sejttenyészet, előnyösen egy laza embriogén kallusz létrehozásával;

(ii) az említett sejttenyészetet mikrorészecske-bombázási technika alkalmazásával transzformáljuk;

(iii) a transzformált sejteket azonosítjuk vagy szelektáljuk, és (iv) a transzformált sejtekből termékeny transzgenikus növényeket regenerálunk.

HU 220 773 Bl

Néhány, a jelen találmány szerinti növény előállítható a transzgenikus magvakból, amelyeket a termékeny transzgenikus növényekből állítottunk elő szokványos keresztezés! technikák alkalmazásával transzgenikus elit vonalak és variánsok előállítása céljából, illetve kommersz hibrid magvakból, amelyek a rekombináns DNS-t tartalmazzák.

1. Növényi vonalak és szövettenyészetek

A termékeny transzgenikus kukoricanövények előállítására különösen alkalmas sejtek azok a kalluszsejtek, amelyek regenerálhatok mind a szelekciós körülmények között való növesztés előtt, mind az után, amint azt az alábbiakban részletesen ismertetjük. Ezek a sejtek általában a merisztémás szövetből származnak, amelyek véglegesen még nem differenciálódott sejteket tartalmaznak. A pázsitfű jellegű magvakban általában, különösen a kukoricában ezek azok a szövetek, amelyek a fiatal levelek bazális régióiban, az éretlen címerekben, az éretlen embriókban és a sziklevélhüvely csomóiban találhatók. Előnyösen az éretlen embriókat alkalmazzák. Az ezekből a szövetekből és növénytípusokból való kalluszkészítés és fenntartás módszerei jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára, és hozzáférhetők a szakirodalomban [lásd Phillips et al., (1988)], amely leírásra a továbbiakban referenciaként hivatkozunk.

A specifikus kalluszoknak képeseknek kell lenniük arra, hogy termékeny növényekké regenerálódjanak. Egy specifikus kallusznak a regenerációs kapacitása fontos az alábbiakban alkalmazott bombázási/szelekciós eljárás szempontjából, mivel a szelekció során és után a regenerációs kapacitás jelentősen lecsökkenhet. Ezért fontos olyan tenyészetekkel indulni, amelyek a lehető legnagyobb regenerációs kapacitással rendelkeznek. A legalább 3 hónapos és maximum 36 hónapos kalluszt találtuk elég magas regenerációs szinttel rendelkezőnek, és ezért ezt részesítjük előnyben. Egy adott tenyészet regenerációs kapacitása könnyen meghatározható, ha mintákat viszünk át belőle a regeneráló táptalajra, és figyeljük a hajtások, gyökerek és palánták kialakulását. A Petri-csészénként, vagy egy gramm friss szövetből keletkező palánták száma használható a regenerációs kapacitás durva becslésére. Általában az a tenyészet az előnyös, amely legalább egy növényt eredményez egy gramm kalluszszövetből.

Miközben kallusztenyészet indítható számos különböző növényi szövetből, az alábbiakban használatos tenyészetek előnyösen éretlen kukoricaembriókból származnak, amelyeket egy kalásznak a magjáról távolítottunk el, amikor az embriók körülbelül 1-3 mm hosszúak. Ez a hosszúság általában a beporzás után 9-14 nappal jelentkezik. Aszeptikus körülmények között az embriókat szokványos szilárd táptalajra tesszük, az embrió tengelyével lefelé, (pajzsocska fölfelé). A kalluszszövet néhány nap vagy néhány hét alatt fejlődik ki a pajzsocskából. Miután a kallusz eléggé megnőtt, a sejteknek a pajzsocskából való szaporodása a morzsolódó, laza konzisztenciáig valamint a jól definiált embriók megjelenéséig értékelhető. A Jól definiált konzisztencia” azt jelenti, hogy a szövet könnyen szétoszlatható anélkül, hogy ezzel megsértenénk a sejteket. Az ezzel a morfológiával rendelkező szövetet azután friss táptalajra visszük át, és rutinszerűen új tenyészeteket indítunk róla minden második héten. Szitálást alkalmazhatunk arra, hogy csökkentsük az összecsapzódást, és/vagy megnöveljük a sejtek összfelszínét az átoltási periódusban.

A kalluszt indító táptalaj előnyösen szilárd táptalaj. Az előnyös megvalósítási mód szerint az indító/fenntartó táptalaj tipikusan a Chu és munkatársai szerinti N6 sókon alapul (1975), amint azt Armstrong és munkatársai közlik (1985), illetve a Murashige és munkatársai szerinti MS sókon. Az alaptáptalajt szacharózzal és 2,4-diklórfenoxi-ecetsawal (2,4-D) egészítjük ki. A kiegészítőkről, úgymint az L-prolinról és a kazeinhidrolizátumról azt találtuk, hogy megjavítják a kallusztenyészetek iniciációs frekvenciáját, morfológiáját és növekedését. A tenyészeteket általában sötétben tartjuk, bár kis mennyiségű fény is alkalmazható. A fenntartáshoz és szaporításhoz szükséges 2,4-D szintetikus hormon mennyisége általában körülbelül 0,3 és 3,0 mg/1 között van.

Jóllehet az alábbiakban laza embriogén kallusszal sikeres transzformációt és regenerációt értünk el, ez nem jelenti, hogy más transzformálható regenerálható sejtek, szövetek vagy szervek nem használhatók a jelen találmány szerinti termékeny transzgenikus növények előállítására. Az egyedüli aktuális megkötés a transzformált sejteket illetően az, hogy a transzformálás után képeseknek kell lenniük egy növénnyé való regenerálódásra, amely tartalmazza a rekombináns DNS-t, az aktuálisan használt adott szelekció vagy szűrővizsgálat után.

Használhatók például folyadék szuszpenziós tenyészetben növekvő sejtek. Ezeknek a tenyészeteknek a létrehozásához a Π-es típusú kalluszt 4-6 hónap elteltével folyadék táptalajra visszük át. A regenerálható szuszpenziós folyadéktenyészetek előállításához szükséges módszereket és referenciákat a következő közleményekben találjuk meg [C. E. Green et al., Maize fór Biological Research, Plánt Molecular Bioi. Assoc., 367-372 (1982); R. Phillips et al., Com and Com Improvement, Agronomy Soc. Amer., (3^rd ed) 345-387 (1988); I. Vasil, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, I, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 152-158 (1984)]. Tipikus esetben a szuszpenziós tenyészetekhez használt folyadék táptalajok összetétele ugyanaz, mint a szilárd kalluszindukciós táptalajoké. ABA-t (abszcizinsavat) adhatunk 10~⁷ mol/liter mennyiségben a folyadék táptalajhoz, hogy megnöveljük a regenerációs kapacitást és javítsuk a tenyészet életképességét. Az előnyös, ha a kalluszt nem szűrjük meg mielőtt a folyadék táptalajba juttatjuk.

A folyadék táptalajokban levő tenyészeteket tovább oltjuk, amint az az aktív növekedés és a regeneratív tulajdonságaik fenntartásához szükséges. Az előnyös megvalósítási módok szerint a tenyészeteket hetente egyszer átoltjuk, friss táptalajjal 1:8-9 arányban hígítva.

11. A transzformáláshoz használt DNS

A továbbiakban a „rekombináns DNS” szakkifejezés arra a DNS-re vonatkozik, amelyet bármely forrás5

HU 220 773 Bl ból származik vagy izoláltunk, amely ezt követően kémiai módszerekkel megváltoztatható, és amelyet később Zea zways-növényekbe juttatunk. Egy példa a rekombináns DNS-re, amely „származik” egy forrásból egy olyan DNS-szekvencia, amely egy adott szervezeten belül hasznos fragmentként van azonosítva, és amelyet azután kémiai úton szintetizálunk lényegében tiszta formában. Egy példa a rekombináns DNS-re, amelyet „izoláltunk” egy fonásból egy olyan hasznos DNS-szekvencia, amelyet az említett forrásból kémiai módszerekkel, például restrikciós enzimekkel kivágtunk, úgyhogy tovább manipulálható, például amplifikálható a találmány szerinti felhasználás céljából, a génsebészet módszereinek alkalmazásával.

Tehát a „rekombináns DNS” lehet teljesen szintetikus DNS, félszintetikus DNS, biológiai forrásból izolált DNS, valamint bevitt RNS-ből származó DNS. A rekombináns DNS általában nem tartózkodik eredetileg a Zea mays genotípusban, ami a DNS befogadója, de a találmány oltalmi körébe tartozik, hogy egy gént egy adott Zea mays genotípusból izoláljunk, majd ezt követően ennek a génnek több másolatát juttassuk be ugyanabba a genotípusba, azaz megnöveljük egy adott géntermék termelődését, például egy tartalékfehérjéét.

A rekombináns DNS nem korlátozódik növényi gének DNS-ére hanem lehetnek nem növényi gének, például a baktériumokból, élesztőkből, állatokból vagy vírusokból származó, módosított gének, géndarabok, kiméragének, beleértve azokat a géneket, amelyek ugyanabba, illetve eltérő Zea mays genotípusba tartoznak.

Az alábbiakban transzformációra használt rekombináns DNS lehet cirkuláris vagy lineáris, kétszálú vagy egyszálú. A DNS általában kiméra-DNS formájában fordul elő, ilyen például a plazmid-DNS, amely tartalmazhat kódolórégiókat, amelyeket a kapott kukoricanövényben levő rekombináns DNS expresszióját elősegítő szabályozószekvenciák határolnak. Például a rekombináns DNS maga is tartalmazhat egy promotert, amely aktív a Zea maysben, vagy használhat egy olyan promotert, amely már jelen van a Zea mays genotípusában, azaz a transzformáció célpontjában.

A szakterületen jártas szakember számára jól ismert bizonyos növényeket transzformálni képes rekombináns DNS-ek összetétele és előállítási módja, és ugyanilyen összetételek valamint készítési módok használhatók az alábbiakban használható DNS-ek előállítására. A DNS specifikus összetétele nem központi jelentőségű a jelen találmány szempontjából, és a találmány nem függ a használt specifikus rekombináns DNS összetételétől. K. Weising és munkatársai [Ann. Rév. Genetics, 22, 421 (1988)] leírnak alkalmas DNSkomponenseket, szelekciós genetikai bélyegeket, riportergéneket és hasonlókat, valamint megfelelő referenciákkal szolgálnak az összetételüket illetően. J. Sambrook és munkatársai [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)] alkalmas módszereket közölnek a készítéshez. A rekombináns DNS általában kicsi, azaz körülbelül 30 kb-nál kisebb, hogy minimalizáljuk a fizikai, kémiai vagy enzimatikus roncsolódás lehetőségét, amelyről ismert, hogy nő, amint a DNS mérete nő.

Az alábbiakban használható rekombináns DNS-ek közé tartozik minden olyan DNS, amely a keletkező transzgenikus kukoricanövénynek valamilyen előnyös tulajdonságot ad át, illetve elősegíti annak megnyilvánulását. A DNS kódolhat fehérjéket vagy antiszensz RNS-transzkriptumokat, abból a célból, hogy elősegítse a javított élelmiérték, magasabb termés, kártevő rezisztencia, betegségekkel szembeni rezisztencia, herbicid rezisztencia és hasonlók létrejöttét. A DNS kódolhat például egy DHP szintetázt, azaz a dapA gént, aminek a következménye lehet a megnövekedett lizintermelés, Bacillus thuringiensis (Bt) delta-endotoxint vagy proteázinhibitort a rovarok elleni rezisztencia biztosítására, bakteriális EPSP szintetázt a glifozát herbicid elleni rezisztencia biztosítására, valamint kitinázt vagy glükán-endo-l,3-p-glükozidázt a fungicid tulajdonságok biztosítására.

Az élelmi- vagy tápérték biztosítása szempontjából fontosak azok a gének, amelyek magas szinten tartalmaznak esszenciális aminosavakat. Például csirkék tápérték szempontjából megfelelő, optimális növekedést biztosító táplálásához a kukorica-szójaliszt csirketápot általában kiegészítik szintetikus metioninnal vagy metioninanalóggal. Olyan kukoricavonalak kifejlesztése, amelyek több metionint tartalmaznak, csökkenthetik a metionin kiegészítő iránti igényt. Az ilyen magas metionintartalmú kukorica-sejtvonalak kifejlesztését oly módon végezhetjük, hogy a kukoricagenomba erősen expresszálódó gént vagy géneket juttatunk be, amelyek magas metionintartalmú fehéijét kódolnak.

A magas metionintartalmú fehérjéket kódoló gének közé tartoznak például:

1. a kukorica 15 kD-os zein fehérjéjét kódoló gén (11% metionin), [Pedersen et al., Journal of Biological Chemistry, U261U, 6279 (1986)];

2. a Brazil dió tartalékfehérjéjét kódoló gén (18% metionin), [Altenbach et al., Plánt Mól. Bioi., 8, 239 (1987)]; és

3. a kukorica 10 kD-os zein fehérjéjét kódoló gén (22,5% metionin) [Kirihara et al., Gene, 71, 359 (1988)].

Az előnyben részesített gén a 10 kD-os zein fehérjét kódoló gén, mivel ez egy endogén kukoricagén, amelynek a fehéijeterméke normális körülmények között akkumulálódik a magban, és kétszer annyi metionint tartalmaz mint a 15 kD-os zein fehérje. Ahhoz, hogy erősen expresszáljon a magban, a gén kódolószekvenciáját adott esetben egy erősen expresszálódó, magspecifikus génszabályozó szekvenciájával fuzionáltatjuk. Egy másik módszer szerint, ha az érintetlen endogén 10 kD-os zein gént több példányban juttatjuk be a kukorica genomjába, akkor ezzel is megnövelhetjük a kukoricamagok metionintartalmát.

A lizin, ami egy esszenciális része az emberek és egygyomrú állatok étrendjének, a fő terményekben, főleg a gabonákban előforduló három leginkább korlátozott mennyiségű aminosavhoz tartozik. Ennek következtében a gabonaalapú étrendeket ki kell egészíteni

HU 220 773 Bl szintetikus lizinnel, illetve lizintartalmú olajosmagfehérjeliszttel. Továbbá, mivel az olajos magvak lisztjei magukban is általában nem tartalmaznak elegendő lizint, ezért ha a tápkeveréket lizin miatt egészítjük ki velük, ez gyakran ahhoz vezet, hogy olyan tápot kapunk, amelynek túl magas az egyéb kevésbé fontos tápanyagtartalma. Tehát, akár a gabonamagvak, akár az olajos növények magjának, akár mindkettőnek a lizintartalmát növelve lényeges tápérték-növekedést kaphatunk, valamint jelentős költségmegtakarítást érhetünk el a végfelhasználónál, azaz a sertés- és csirketenyésztőnél.

Az egyik megközelítés a gabonák lizintartalmának növelésére, ha dereguláljuk a bioszintézisutat, és lehetővé tesszük, hogy szabad lizin halmozódjon fel. Az Escherichia coli dapA génje dihidropikolinsav-szintetázt (DHPS) kódol, ami kulcs-szabályozóenzim, amelynek aktivitását a növényekben erősen gátolja a lizin. A baktériumeredetű enzim körülbelül 200-szor kevésbé érzékeny a lizines gátlásra. A dapA gén bejuttatása és expressziója a növényi sejtekben lehetővé teszi a szabad lizin szintézisét azután is, hogy a természetes növényi DHPS már teljesen gátlódik.

Különös jelentőséggel bír a kukorica terméshozamának fenntartásában, és lényegesen hozzájárul a kukorica termesztési költségeinek csökkentéséhez, ha a kukoricát megvédjük a kártevő rovarok támadásától. Az Amerikai Egyesült Államokban a kukorica fő kártevői a különböző Lepidoptera fajok, például a Coleoptera fajok, úgymint a Diabrotica alfaj. A kukorica megvédése a rovarok elleni támadástól költséges a termesztő számára, és mérgező kémiai inszekticidek alkalmazását követeli meg meghatározott időközökben. Mivel a növénynemesítés és szelekció tradicionális módszerei nem tették lehetővé az olyan új kukoricavonalak kifejlesztését, amelyek lényegében rezisztensek a fő rovarkártevőkkel szemben, ezért a jelen találmány szerinti rovarrezisztencia-gének vagy -szekvenciák bejuttatása és továbbörökítése a kukoricában csökkentené a termesztő költségeit, csökkentené a mérgező kémiai inszekticidek felhasználását, és sokkal hatékonyabban nyomná el a rovarkártevők működését.

A jelen találmány lényeges elemei a rovarrezisztencia-gének bejuttatása a kukoricasejtekbe, a gén mitotikus replikációja úgy, hogy a gén beépül a teljes kukoricanövénybe, és végül öröklődik a növény utódaiba, a mitotikus és meiotikus osztódás folyamatában.

A Bacillus thuringiensis (vagy „Bt”) baktériumok közé közel 50 alfaj tartozik, amelyek olyan endotoxin polipeptideket termelnek, amelyek abban az esetben, ha számos különböző rovarfaj megemészti, akkor toxikus a rovarra nézve. Az endotoxin fehérjék (Bt-fehérjék) biológiáját és molekuláris biológiáját nemrégiben foglalták össze Whitely és munkatársai [Annual Review of Microbiology, 40, 549 (1986)], valamint H. Hofte és munkatársai [Microbiological Reviews, 53, 242 (1989)]. A különböző Bt-fehérjéket kódoló géneket klónozták és szekvenciájukat meghatározták. A kutatás igazolta, hogy a Bt-fehérje egyik szegmentuma lényeges a különböző Lepidoptera fajokkal szembeni toxicitás szempontjából, és ez a szegment a Bt-polipeptidmolekulának az első 50%-ban található. Ennek következtében egy csonkított Bt-gén által kódolt csonkított Bt-polipeptid számos esetben megtartja a toxicitását számos Lepidoptera rovarkártevővel szemben. A HD73 és HD1 Bt-polipeptidekről kimutatták, hogy toxikusak az Amerikai Egyesült Államokban honos kukoricanövények fontos Lepidoptera rovarkártevőinek lárváival szemben, azaz az európai magfiiró, a bagolypille és a gyapotbagolypille lárváival szemben. A HD1 és HD73 Bt-polipeptideket kódoló géneket klónozták és szekvenciájukat meghatározták [M. Geiser et al., Gene, 48, 109 (1986); M. J. Adang et al., Gene, 36, 289 (1985)], és a törzsgyűjteményekben található HD1 és HD73 törzsekből klónozhatok (például a Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, Ohio, vagy USDA Bt Stock Collection, Peoria, Illinois), standard eljárások alkalmazásával.

Az új, eddig még nem jellemzett Bt-toxinokat kódoló DNS klónozható a gazda Bacillus mikroorganizmusból, a korábban a Bt-gén klónozására alkalmazott eljárások alkalmazásával. Ezek közé tartozik egy Bacillus mikroorganizmusból izolált DNS-könyvtár készítése egy megfelelő plazmid- vagy fágvektorban, amely a megfelelő gazdaszervezetben szaporodik, majd a Btfehéije elleni antitestek alkalmazása, illetve a homológ Bt-génszekvenciából izolált DNS-szekvencia alkalmazása a klónozott Bt-szekvenciát tartalmazó transzformánsok azonosítására. A Bt kódoló szekvencia közelítő helyét először a klónozott DNS deléciós elemzésével lehet meghatározni. A Bt kódoló szekvencia pontos helyét számos különböző standard módszerrel határozhatjuk meg, beleértve a klónozott DNS-szegment szekvenciájának meghatározását, az esetleg a Bt-t kódoló nagy nyitott leolvasási keret jelenlétének meghatározását ebben a szekvenciában, és a DNS-nek a Bt-t kódoló természetének az igazolása a szekvencia alapján meghatározott aminosavszekvencia és a Bt-fehéqe részleges aminosavszekvenciájának összehasonlításával.

A jelen találmány szerinti eljárásban jól használható kiméra Bt-gén tartalmaz egy 5’ DNS-szekvenciát, ami egy kukoricanövényben lehetővé teszi az utána található Bt-szekvencia transzkripciójának iniciálását és transzlációját („promoter”). A kiméra Bt-gén tartalmaz még egy 3’ DNS-szekvenciát, amely egy kukoricában expresszálódó gén 3’ nemkódoló régiójából származó szekvenciát tartalmazza. A legfontosabb, hogy a kiméra Bt-gén egy olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a Bacillus thuringiensis által termelt toxikus Bt-polipeptidet, vagy annak toxikus részét, vagy azzal jelentős aminosavszintű hasonlósággal rendelkező polipeptidet kódol. A Bt-t kódoló szekvencia lehet:

(i) a kukorica rovarkártevői ellen aktív Bt-endotoxinokkal lényeges homológiával rendelkező, inszekticid aktivitással rendelkező fehéqéket kódoló DNS-szekvenciák, például a HD73 vagy HD1 Bt szekvenciák;

(ii) a Bt endotoxin polipeptid inszekticid aktivitással rendelkező polipeptid szegmentjeit, például a karboxivagy N-terminális végén csonkított HD73 vagy HD1 polipeptidet kódoló szekvencia;

HU 220 773 BI (iii) egy csonkított Bt-szekvencia, leolvasási keretben fuzionáltatva olyan szekvenciákkal, amelyek további előnyöket jelentenek a növény számára, például:

(a) szelektálható gének, például antibiotikumok vagy herbicidek elleni rezisztenciát biztosító gének;

(b) riportergének, amelyeknek a terméke könnyen kimutatható vagy mérhető, például a luciferáz vagy B-glükuronidáz;

(c) olyan DNS-szekvenciák, amelyek a Bt-fehéije lebomlásával szembeni stabilizációt biztosító, vagy Bt-fehéije rovarellenes hatását fokozó fehéijét kódolnak, például proteázinhibitorokat; és (d) olyan szekvenciák, amelyek segítik, hogy a Btfehérje a kukoricasejtek megfelelő részébe jusson, ilyen például a szignál szekvencia.

A Bt-fehéije kukoricában való optimális szintézisének eléréséhez az is alkalmas módszer lehet, hogy a Btgén szekvenciáját úgy változtatjuk meg, hogy jobban hasonlítson azokra a génekre, amelyek hatékonyan expresszálódnak kukoricában. Mivel számos Bt-génben, beleértve a HD73 és HD1 géneket is, a kodonhasznosítás sokkal inkább a Bacillus fajok kodonhasznosítására hasonlít mint a kukoricában expresszálódó génekére, a Bt-gének kukoricában való expressziója javítható, ha ezeket a ritkán használt Bacillus kodonokat olyanokkal helyettesítjük, amelyeket a kukorica sokkal gyakrabban használ [Murray et al., Nucleic Acids Research, 17, 477 (1989)]. A kodonok ilyen helyettesítése megköveteli, hogy a nukleotidbázisokat úgy cseréljük ki, hogy közben a keletkező Bt-polipeptid aminosavszekvenciája ne változzon. A Bt-polipeptid szekvenciája azonos lehet a bakteriális génével, vagy annak szegmentjeivel. A teljes Bt kódoló szekvencia, vagy annak szekciói, amelyek nagyobb részben tartalmazzák a kukorica által előnyben részesített kodonokat mint az eredeti baktériumgén, standard kémiai módszerekkel szintetizálható, majd standard módszerekkel bejuttatható a Bt-génekbe, illetve Bt-génekké állíthatók össze, ilyen például a helyspecifikus mutagenezis, a DNS-polimerizáció és ligálás valamint a hasonló eljárások.

A rekombináns DNS-szekvenciák mellett, amelyek transzkripciós egységként vagy azok részeiként szolgálnak, a hasznos rekombináns DNS lehet nem transzlálódó is, szabályozóvagy strukturális feladatokat látva el. A DNS emellett bejuttatható még azzal a céllal is, hogy genetikai eszközként működjön, hozzon létre mutánsokat és/vagy segítse a kukorica DNS-szegmentjeinek azonosítását, genetikai megjelölését vagy izolálását. A további példák Weising idézett publikációjában találhatók [Ann. Rév. Genetics, 22, 421 (1988)].

A növényi sejtekbe bejuttatandó rekombináns DNS általában tartalmaz még egy szelektálható genetikai bélyeget vagy riportergént, vagy mindkettőt, hogy lehetővé tegye a transzformált sejtek azonosítását és szelekcióját. Egy másik kiviteli mód szerint a szelektálható genetikai bélyeg lehet egy másik DNS-darabon, és kotranszformációs eljárásban alkalmazzuk. Mind a szelektálható genetikai bélyegeket, mind a riportergéneket megfelelő szabályozószekvenciák határolhatják, amelyek lehetővé teszik, hogy a szekvencia expresszálódjon kukoricában. A használható szelekciós markerek jól ismertek a szakterületen, ilyenek például az antibiotikum- és herbicid rezisztenciagének.

A szelekciós markerek specifikus példái Weising és munkatársai idézett művében találhatók [Ann. Rév. Genetics, 22, 421 (1988)]. Egy előnyös szelekciós genetikai bélyeg a higromicin-foszfotranszferáz enzimet (HPT) kódoló szekvencia, amely származhat Escherichia coliból, és amely a higromicin B antibiotikummal szemben biztosít rezisztenciát. Más szelekciós genetikai bélyeg lehet például a Tn5 transzpozon aminoglikozidfoszfotranszferáz génje (AphII), ami a kanamicinnel, neomicinnel és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát kódol, valamint azok a gének, amelyek a glifozát, 2,2-diklór-propionsav, metotrexát, imidazolinon herbicidek, szulfonil-karbamid herbicidek, bromoxinil, foszfinotricin és más herbicid vegyületekkel szembeni rezisztenciát vagy tűrőképességet kódolnak. Azok a szelekciós genetikai bélyegek, amelyek ezek ellen a fitotoxikus vegyületek ellen rezisztenciát vagy tűrőképességet biztosítanak a keletkező transzformált növényben, szintén kereskedelmi értékkel rendelkeznek. A fitotoxikus vegyületekkel szemben rezisztenciát biztosító enzimeket kódoló szelektálható genetikai bélyegek génjeit az alábbi, 1. táblázatban soroljuk fel.

1. táblázat

Szelektálható genetikai bélyegek

Rezisztenciagén vagy enzim	Rezisztenciát biztosit	Referencia
Neomicin-foszfotranszferáz (neo)	G-418, neomicin kanamicin	P. J. Southern et al., J. Mól. Appl. Gén., 1, 327 (1982)
Higromicin-foszfotranszferáz (hpt vagy hyg)	Higromicin B	Y. Shimizu et al., Mól. Cell. Bioi., 6, 1074, (1986)
Dihidrofolát-reduktáz (dhfr)	Metotrexát	W. W. Kwok et al., PNAS USA, 4552 (1986)
F oszfinotricin-acetil-transzferáz (bar)	Foszfinotricin	M. DeBlock et al., EMBO J., 6, 2513 (1987)
2,2-Diklórpropionsav-dehalogenáz	2,2-diklórpropionsav (Dalapon)	V. Buchanan-Wollaston et al., J. Cell. Biochem., Supp. 13D, 330 (1989)

HU 220 773 Β1

1. táblázat (folytatás)

Rezisztenciagén vagy enzim	Rezisztenciát biztosít	Referencia
Acetohidroxisav-szintetáz	Szulfonilkarbamid, imidazolinon és triazolopirimidin herbicidek	P. C. Andersen et al., (US Patent No. 4761373); G. W. Haughn et al., Mól. Gén. Génét 211, 266(1988)
5-Enolpiruvil-sikimát-foszfát-szintetáz (aroA)	Glifozát	L. Comai et al., Natúré. 317, 741 (1985)
Haloaril-nitriláz	Bromoxinil	D. M. Stalker et al., publikált PCT bej. WO 87/04181
Acetil-koenzim A karboxiláz	Szetoxidim haloxifop	W. B. Parker et al., Plánt Physiol., 92, 1220 (1990)
Dihidro-pteroát-szintetáz (sül I)	Szulfonamid herbicidek	F. Guerineau et al., Plánt Molec. Bioi., 15, 127 (1990)
32 kD fotorendszer II polipeptid (psbA)	Triazin herbicidek	J. Hirschberg et al., Science. 222, 1346 (1983)
Antranilát-szintetáz	5-metil-triptofán	K. Hibberd et al. (US Patent No. 4581847)
Dihidropikolinsav	Aminoetil-cisztein	K. Glassman et al., W089/11789 számon publikált PCT bej.

A riportergéneket arra használják, hogy a potenciálisan transzformált sejteket azonosítsák, és hogy a szabályozószekvenciák működőképességét kiértékeljék. A könnyen vizsgálható marker fehéijéket kódoló riportergének jól ismertek a szakirodalomban. A riportergén általában egy olyan gén, amely nincs jelen, vagy nem expresszálódik a befogadó szervezetben vagy szövetben, és olyan fehéqét kódol, amelynek expressziója valamilyenjói detektálható tulajdonságban jelentkezik, azaz fenotipikus változásban vagy enzimatikus aktivitásban. Az ilyen géneket Weising és munkatársai sorolják fel idézett publikációjukban [Ann. Rév. Genetics, 22, 421 (1988)]. Az előnyös gének közé tartozik például az Escherichia coli Tn9 transzpozonjából származó klóramfenikol acetil-transzferáz (cat)-gén, a béta-glükuronidáz gén (gus) az Escherichia coli uidA lokuszából, és a szentjánosbogárból (Photinus pyralis) származó lluciferázgén. A riportergén expresszióját a DNS-nek a befogadó sejtekbe való bejuttatása után bizonyos idő elteltével vizsgáljuk. Az ilyen vizsgálatokra előnyös példa lehet az Escherichia coli béta-glükuronidáz (GUS) génje (R. Jefferson et al., EMBO J., 16, 3901 (1987)]. Az ezzel a génnel transzformált és ezt a gént expresszáló sejtek kékre festődnek, ha megfelelő szubsztráttal, az 5bróm-4-klór-3-indolil-béta-D-glükuroniddal (X-GLUC) hozzuk érintkezésbe a táptalajban.

Az alábbiakban használható szabályozószekvenciák közé tartozik bármely konstitutív, indukálható, szövet- vagy szervspecifikus, illetve fejlődésiállapot-specifikus promoter, ami egy adott sejtben expresszálható. Az alkalmas promotereket Weising és munkatársai sorolják fel idézett publikációjukban [Ann. Rév. Genetics, 22, 421 (1988)]. Az alábbiakban a felhasználható promotereknek egy részleges, reprezentatív listáját közöljük: az Agrobacterium tumefaciens T-DNS-ből származó szabályozószekvenciák, beleértve a mannopinszintetáz, nopalin-szintetáz és oktopin-szintetáz géneket; a kukorica alkohol-dehidrogenáz promotere; a fénnyel indukálható promoterek, például számos különböző fajból származó ribulóz-biszfoszfát-karboxiláz/oxigenáz kis alegységének génje; a fő klorofill a/b kötő fehéqe promoterei; a karfiol-mozaikvírus (CaMV) 35S és 19S promoterei; a kukorica fejlődés során szabályozott promoterei, például a viaszos, zein vagy bronz promoterek, ezenkívül szintetikus vagy más természetes promoterek, amelyek lehetnek indukálhatok vagy konstitutívek, beleértve azokat a promotereket, amelyek a növényben szervspecifikus vagy fejlődésiállapot-specifikus expressziót mutatnak.

Más elemek, például intronok, fokozok, poliadenilezési szekvenciák és hasonlók is képezhetik a rekombináns DNS-részét. Ezek az elemek vagy fontosak vagy nem a DNS működése szempontjából, de a DNS jobb expresszióját szolgálhatják, azáltal, hogy befolyásolják a mRNS transzkripcióját, stabilitását, vagy hasonló funkciót látnak el. Az ilyen elemeket szükség esetén belefoglalhatjuk a DNS-be, ha a transzformáló-DNS optimális működését akarjuk elérni. Például a kukorica AdhIS első intronját elhelyezhetjük a promoter és a kódolószekvencia közé, egy adott rekombináns DNS-konstrukcióban. Erről az intronról tudott, hogy ha benne van egy DNS-konstrukcióban, akkor megnöveli a fehéqe termelődését a kukoricasejtekben [J. Callis et al., Genes and Develop., 1, 1183 (1987)]. Egy szelekciós marker elegendő mértékű expresszióját azonban elérhetjük akkor is, hogy ha a konstrukció nem tartalmaz intront [T. Klein et al., Plánt Physiol., 91, 440 (1989)]. Egy másik, alkalmas intron lehet a kukorica shrunken-1 első intronja. Ezek az egyéb elemek kompantibilisek kell hogy legyenek a DNS-konstrukciók egyéb részeivel.

HU 220 773 Bl

111. DNS-bejuttatási módszerek

A rekombináns DNS bejuttatható a regenerálható kukoricatenyészetekbe, előnyösen a kallusztenyészetbe, részecskebombázási módszer alkalmazásával. Az alkalmas részecskebombázási módszert Sanford és munkatársai írták le (1987), amely leírásra az alábbiakban referenciaként hivatkozunk. Jóllehet a kukorica nem regenerálódó szuszpenziós tenyészetének bombázására használt berendezés alkalmazását közölték Klein és munkatársai (1988a, 1988b és 1989), még nem közöltek kísérleti leírást a kallusztenyészetek vagy regenerálható kukoricasejtek bombázására. Egy mikrobombázási eljárásban, amelyet biolisztikus (biolistic) eljárásnak is neveznek, a rekombináns DNS-nek a kalluszba való juttatását biológiailag semleges anyagból készült nagyon kis részecskékkel érjük el. Ha a semleges részecskéket DNS-sel borítjuk, és megfelelő sebességre felgyorsítjuk, akkor a részecskék közül egyik vagy másik képes belépni egyik vagy másik sejtbe, ahol a DNS leválik a részecskéről és expresszálódik. Egyik-másik befogadó sejt stabilan megtartja a bejuttatott DNS-t és expresszálja.

A részecskék, amelyeket mikrorészecskéknek hívnak, általában nagyon sűrű anyagból, például volfrámból vagy aranyból készülnek. Ezeket borítjuk a kiválasztott DNS-sel. A mikrolövedékeket ezután egy makrolövedék felszínére visszük, amelyet a mikrorészecskékkel együtt felgyorsítunk. Miután a makrolövedék és a mikrolövedékek elérték a megfelelő sebességet, egy blokkolóberendezésbe ütköznek, amely megakadályozza, hogy a makrolövedék tovább folytassa az útját, viszont a DNS-sel borított mikrorészecskéket nem gátolja ebben, és ezek beleütköznek a befogadó kalluszsejtekbe. A megfelelő berendezések különböző meghajtóerőt használnak, például lőport vagy lökéshullámokat egy elektromos ívkisülésből [P. Christou et al., Plánt Physiol., 87, 671 (1988)]. Jelenleg azokat a berendezéseket részesítik előnyben, amelyekben a hajtóerőt lőpor szolgáltatja, ilyet írnak le és magyaráznak el részletesen Sanford és munkatársai (1987), amely publikációra a továbbiakban referenciaként hivatkozunk.

A lőporos berendezés használatának leírását Klein és munkatársai közlik (1988a,b), és ez két fő lépésből áll. Először, a volffámrészecskéket elkeverik DNS-sel, kalcium-kloriddal és spermidinnel, megfelelő sorrendben, egy vizes oldatban. A különböző komponensek koncentrációja a leírás szerint változhat. Az előnyös eljárás pontosan azon alapul, amit Klein és munkatársai írtak le (1988b), kivéve azt, hogy az ott leírt DNSkoncentrációt meg kell duplázni. A második lépés az, hogy a DNS-sel borított mikrolövedékeket, a makrólövedéket és a befogadó sejteket megfelelő elrendezésbe hozzuk a berendezésben, és a meghajtóerőt ráadjuk a makrolövedékre. Az ebben a lépésben változtatható paraméter például a befogadó sejtek távolsága a csőtől, valamint a vákuumszint a mintakamrában. A befogadó szövetet 2-15, előnyösen 5 cm-rel a leállítólemez alá helyezzük.

Az alábbiakban transzgenikus növények előállítására használható kallusztenyészetek általában a transzfer periódusok között félidőben vannak, azaz bármely olyan „lag” fázis után, amely kapcsolódhat az új táptalajra való átvitelhez, valamint még azelőtt, hogy elérnének bármely „stacioner” fázist, ami akkor áll be, ha hosszabb időt töltenek el a tenyészetek anélkül, hogy átoltanák őket friss táptalajra. A szövetet körülbelül 30 és 80, előnyösen körülbelül 40-60 mg-os darabok formájában vannak. A csomókat egy Petri-csészére vagy egyéb felületre helyezhetjük, és lényegében mindegy, hogy hogyan rendezzük el őket, de tudni kell hogy (i) a lemez központjában levő felület kapja a legnagyobb koncentrációban a fém DNS-részecskéket, és az ott található szövet valószínűleg károsodik a bombázás során, és (ii) a szövetet elérő részecskék száma csökken a lövés középpontjától távolabb eső szöveteknél, tehát a lemez közepétől távol eső szövetet kisebb valószínűséggel érik el a lövedékek. Egy hálószövetet (amely előnyösen fémből készült) helyezhetünk a lemezre, hogy megakadályozzuk a szövet kiloccsanását vagy kilökődését. Egy másik módszer a szövet bombázásnak való alávetéséhez, ha a szövetet vékony rétegben eloszlatjuk egy szűrőlapon. A szövetet egyszer vagy többször bombázhatjuk a DNS-sel borított fémrészecskékkel.

VI. Szelekciós eljárás

Miután a kalluszokat bombáztuk a rekombináns DNS-sel, és a DNS behatolt néhány sejtbe, akkor szükség lehet arra, hogy azonosítsuk és kiválasszuk azokat a sejteket, amelyek tartalmazzák a rekombináns DNS-t, ugyanakkor még képesek regenerálódni. Két általános megközelítés létezik, amelyek ennek a feladatnak az elvégzésére alkalmasak. Először, a transzformált kalluszokat, vagy a belőlük regenerált sejteket különböző standard módszerekkel átvizsgáljuk, hogy megtalálható-e bennük rekombináns DNS, amely módszer lehet a riportergének expressziójának vizsgálata, vagy a rekombináns DNS fenotipikus hatásának megfigyelése, ha van ilyen. Egy másik, és előnyös módszer szerint, ha egy szelektálható markergént a rekombináns DNS-sel együtt, vagy annak részeként bejuttattunk a sejtekbe, akkor azokat a kalluszsejteket, amelyek transzformálódtak, a szelekciós ágens használatával azonosítani lehet, a szelektálható markergén expressziója alapján.

A megfelelő transzformánsok szelekciója egy kritikus része a sikeres transzformációs eljárásnak, mivel a szelekciós körülményeket úgy kell megválasztani, hogy azok lehetővé tegyék a transzformált sejtek növekedését és felhalmozódását, és eközben egyidejűleg gátolja a nem transzformálódott sejtek növekedését. A helyzetet bonyolítja az a tény is, hogy az egyes sejtek életképessége egy adott populációban gyakran nagyon erősen függ a szomszédos sejtek életképességétől. Emellett a szelekciós körülményeknek nem szabad olyan szigorúaknak lenniük, hogy ezzel a kalluszsejtek növényregeneráló képességét és a keletkező növények termékenységét kizárjuk. Tehát a szelekciós ágensnek a sejtek életképességére és morfológiájára gyakorolt hatását ki kell értékelni. Ezt megtehetjük úgy, hogy először kísérleti úton előállítunk egy növekedés gátlási gör10

HU 220 773 Bl bét az adott szelekciós anyagra és a transzformálandó szövetre. Ez megadja azokat a koncentrációkat, amelyek gátolják a növekedést.

Ha egy szelektálható markergént használunk, akkor a kalluszcsomókat hagyni kell, hogy magukhoz térjenek a bombázás hatásaitól nem szelektív táptalajon, illetve előnyösebb, ha közvetlenül a szelekciós anyagot tartalmazó táptalajra visszük át.

A szelekciós eljárás lehet az, hogy egy toxikus anyag hatásának tesszük ki a sejteket, és a szelekciós anyag koncentrációját fokozatosan változtathatjuk, és a szelekciót több lépésben végezzük. Az adott koncentrációkat és ciklushosszakat valószínűleg változtatni kell az egyes anyagoknál. A jelenleg előnyben részesített szelekciós eljárás szerint egy olyan szelekciós lépéssel kezdünk, amelyben viszonylag alacsony koncentrációban használjuk a toxikus anyagot, majd a későbbi lépésekben ezt a koncentrációt fokozatosan emeljük. Ez lehetővé teszi, hogy a szelekciós anyag lassan, hosszabb idő alatt fejtse ki a hatását. Előnyösen az anyag kezdeti koncentrációja akkora, hogy a növekedésgátló hatásának 5-40%-a nyilvánul meg, a növekedési görbéből megállapítható módon. A hatás lehet az, hogy lehetővé teszi a transzformált sejteknek, hogy növekedjenek és osztódjanak, míg a transzformálatlan sejteket ebben gátolja, de nem olyan mértékben, hogy ezzel a transzformálatlan sejtek növekedését gátolja. Ha egyszer a néhány transzformált sejt már osztódott néhányszor, akkor a szövetet olyan táptalajra vihetjük, amely a toxikus anyagot magasabb koncentrációban tartalmazhatja, hogy lényegében az összes nem transzformált sejtet elpusztítsuk. A magasabb koncentrációk felé való eltolás csökkenti azt, hogy a nem transzformáit sejtek adaptálódjanak az anyaghoz. A magasabb szint előnyösen a növekedés gátlásának körülbelül 30-100%-nál van. Az első szelekciós ciklus hossza lehet 1-4 hét, előnyösen körülbelül 2 hét. A későbbi szelekciós ciklusok hossza lehet 1-12 hét, előnyösen körülbelül 2-10 hét. A feltételezett kukoricatranszformánsokat általában úgy lehet azonosítani, mint egy szaporodó szektort a nem szaporodó sejtek hátterében. A kalluszt lehet nem szelektív táptalajon is tenyészteni különböző ideig, a teljes szelekciós periódus során.

Ha egyszer egy kalluszszektort azonosítottunk mint egy feltételezett transzformánst, akkor a transzformáció megtörténtét fenotípusos és/vagy genotípusos elemzés alapján lehet megerősíteni. Ha egy szelekciós ágenst használunk, akkor a fenotípusos elemzésre egy példa lehet, ha a feltételezett transzformáns nyerssúlyát méijük, és a különböző kontrollokhoz hasonlítjuk a szelektív ágens különböző koncentrációja mellett. Más elemzéseket is alkalmazhatunk, amelyek a rekombináns DNS működésén alapulnak. Például, ha egy enzimet vagy fehéqét kódol a DNS, akkor az adott enzimre vagy fehérjére specifikus enzimatikus vagy immunológiai vizsgálatokat használhatjuk. Más géntermékeket alkalmas biológiai vizsgálattal vagy kémiai vizsgálattal lehet kimutatni. Más ilyen technikák is jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára, ezeket itt nem ismételjük meg. A gén jelenlétét szokványos eljárásokkal is megerősíthetjük, például Southem-blottal, polimeráz láncreakcióval (PCR) vagy hasonlókkal.

V. A növények regenerálása és a magvak előállítása

Azokat a sejtvonalakat, amelyekről igazoltuk, hogy transzformálva vannak, növényekké kell regenerálnunk, és a kapott növények termékenységét meg kell határoznunk. Azokat a transzformált vonalakat, amelyek a genotípusos és/vagy fenotípusos elemzés alapján pozitívnak bizonyultak, olyan táptalajra visszük, amely elősegíti a szövet differenciálódását és a növény regenerálódását. A regenerálást a szakterületen jártas szakember számára jól ismert, standard módszerekkel végezhetjük. Az általában alkalmazott eljárások során csökkentjük az auxin mennyiségét, ami megszakítja a kallusz szaporodását, és elősegíti a szomatikus embrió kifejlődését vagy más szövet differenciálódást Egy ilyen regenerálódást példát Green és munkatársai közölnek (1982). A növényeket érettségig neveljük egy megfelelő szobában vagy üvegházban, és a megfelelő szexuális keresztezéseket elvégezzük Neuffer szerint (1982).

A regenerálást, jóllehet a jelen találmány szempontjából nagyon fontos, bármely szokványos módon elvégezhetjük. Ha egy szelektálható genetikai bélyeget transzformáltunk a sejtekbe, akkor a szelekciós ágenst bele lehet tenni a regeneráló táptalajba, hogy ezzel is megerősítsük azt, hogy a regenerálódó hajtások transzformálva vannak. Mivel a regenerálási technikák jól ismertek, és nem kritikusak a jelen találmány szempontjából, bármely olyan technika alkalmazható, amellyel a regenerálás létrejön, és termékeny növények keletkeznek.

VI. Az RÍ utódok vizsgálata

A transzformált kalluszból regenerálódó növényeket nevezzük az R0 generációnak vagy R0 növényeknek. Az R0 generáció különböző szexuális keresztezéseivel előállított magvakat tekintjük az RÍ utódoknak vagy RÍ generációnak. Ha az RÍ magvakat kicsíráztatjuk, akkor a keletkező növényeket RÍ generációnak tekintjük.

Abból a célból, hogy igazoljuk a rekombináns DNS sikeres átvitelét és örökölhetőségét egy teljes szexuális ciklusban, az RÍ generációt kell elemezni, hogy megerősítsük a transzformáló DNS jelenlétét. Az elemzést bármely módon elvégezhetjük, például úgy, ahogy azt az előzőkben leírtuk a bombázott kallusz elemzésére, amikor azt akartuk igazolni, hogy a transzformáció lejátszódott, számba véve azt a tényt, hogy növényt és növényi részeket használunk a kallusz helyett.

A rekombináns DNS különböző öröklődési mintázatot mutat a különböző transzformált vonalak esetében. Például a rekombináns DNS az utódokban a mendeli öröklésmenet szerint öröklődhet. Ez az öröklési mód magába foglalja a DNS átadását mind a hímivarú, mind a nőivarú ivarsejtekbe, és a kukorica DNS-be való stabil integrálódással vagy beépüléssel jár együtt. Az öröklésnek egy másik típusa az anyai öröklésmenet, mikor is a rekombináns DNS elsődlegesen, vagy kizárólagosan a nőivarú ivarsejteken keresztül adódik át. Egy

HU 220 773 Bl adott transzformáns esetében az öröklésmenetet a különböző szexuális keresztezésekből származó utódok elemzésével lehet meghatározni.

VII. A rekombináns DNS átvitele más kukoricavariánsokba

A termékeny, transzgenikus növényeket ezután szokványos kukoricanemesítési programban alkalmazhatjuk, hogy a bevitt rekombináns DNS-t bejuttassuk a kiválasztott vonalakba vagy variánsokba. A kukorica konvergens javításának módszereit Hallauer és munkatársai írták le (1988), amely publikációra a továbbiakban referenciaként hivatkozunk. A szokványos nemesítési programok által alkalmazott megközelítések között van egy konverziós lépés is (visszakeresztezés). Röviden, a konverziót úgy hajtjuk végre, hogy a kiindulási termékeny növényt elit, beltenyésztett vonalakkal keresztezzük. Az ebből a keresztezésből származó utódok úgy szegregálnak, hogy a növények közül néhány hordozza a rekombináns DNS-t, míg néhány nem. Azokat a növényeket, amelyek hordozzák a DNS-t, ismét keresztezzük elit beltenyésztett vonalakkal, így kapunk olyan utódokat, amelyek még egyszer szegregáltak. Ezt a visszakeresztezési lépést addig ismételjük, amíg az eredeti elit beltenyésztett növény egy olyan vonallá konvertálódik, amely tartalmazza a rekombináns DNS-t, ennek ellenére rendelkezik a szülőkben eredetileg előforduló összes fontos jellemzővel. Ehhez általában 6-8 generációra van szükség. Általában külön visszakeresztezési programot használnak minden egyes olyan elit vonalhoz, amelyet génsebészeti úton módosított elit vonallá akarnak konvertálni.

Az alábbiakban előállított transzformált kukorica kereskedelmi értéke akkor a legnagyobb, ha a rekombináns DNS-t számos különböző hibrid kombinációba be lehet építeni. Egy gazdálkodó tipikusan számos különböző hibridet termeszt, a különbségek alapja az érettség, az állóképesség és egyéb mezőgazdasági tulajdonságok. A gazdálkodónak a hibridet emellett a földrajzi elhelyezkedés alapján is meg kell választania, mivel az egyik régióhoz adaptált hibridek általában nem adaptálódnak egy másik régióhoz, az érettségben, betegségekre való fogékonyságban és a rovarellenállásban való különbségek miatt. Ennek következtében a rekombináns DNS-t számos szülői vonalba kell integrálni, hogy számos, a kiválasztott heterológ DNS-t tartalmazó hibrid kombinációt kapjunk.

A kukorica nemesítése, valamint a gének egyik vonalból a másikra való átvitelének technikája és gyakorlata a szakterületen jártas szakember számára jól ismert. Tehát a rekombináns DNS bejuttatását bármely más vonalba vagy variánsba ezekkel a nemesítési eljárásokkal lehet elérni.

VIII. A transzgenikus növények alkalmazása

Az alábbiakban előállított transzgenikus növényektől azt várjuk, hogy számos különböző kereskedelmi és kutatási szempontból hasznosak lehetnek. A transzgenikus növényeket elő lehet állítani azért, hogy a szokványos mezőgazdaságban használjuk, mert a termelő számára előnyös tulajdonságokat hordoz (például agronómiái tulajdonságokat, úgymint kártevő rezisztencia, herbicid rezisztencia, vagy megnőtt terméshozam), előnyös a növényről betakarított mag felhasználójának (például megnövekedett tápértékkel rendelkezik az emberi ételben vagy az állati tápban), vagy előnyös az élelmiszer-feldolgozónak (például javított feldolgozási paraméterekkel rendelkezik). Az ilyen alkalmazásokban a növényeket általában azért termelik, hogy a magvaikat az emberi vagy állati táplálékban hasznosítsák. A növénynek azonban más részei, beleértve a szárát, héját, vegetatív részét és hasonlókat is használhatók, ide tartozik az hogy állati silóként vagy díszítési célokra használják. A kukoricának és más terményeknek a kémiai összetevőit (például olajok, keményítők) extrahálják élelmiszer-ipari vagy egyéb ipari célokra, és olyan transzgenikus növényeket lehet előállítani, amelyekben az ilyen komponensek megváltoztatott vagy módosított koncentrációban fordulnak elő.

A transzgenikus növények felhasználhatók fehérjék és egyéb molekulák kereskedelmi mennyiségben való előállítására, mikor is a kiválasztott molekulát a növény részeiből, magvaiból vagy egyéb részeiből extrahálják. A növényekből származó sejteket vagy szöveteket tenyészteni, növeszteni is lehet in vitro körülmények között, vagy fermentálni az ilyen molekulák előállítása céljából.

A transzgenikus növények használhatók kereskedelmi nemesítési programokban, illetve keresztezhetők vagy nemesíthetők rokon terményfajok növényeivel. A rekombináns DNS által kódolt javított eredményeket át lehet vinni más fajokba, például protoplasztfuzióval.

A transzgenikus növényeknek számos felhasználási lehetősége van a kutatásban vagy nemesítésben, beleértve az új mutáns növények készítését inszerciós mutagenezissel, abból a célból, hogy azonosítsuk azokat az előnyös tulajdonságokkal rendelkező mutánsokat, amelyeket a későbbiekben szokványos mutációval és szelekcióval elő lehet állítani. Egy példa az említett folyamatra egy átugró, transzpozábilis elemet kódoló rekombináns DNS-szekvencia bejuttatása, amelyet genetikai variánsok készítésére lehet használni. A találmány szerinti módszereket használhatjuk olyan növények előállítására, amelyeknek egyedi „szignatúraszekvenciáik” vagy más markerszekvenciáik vannak, és amelyeket a megfelelő vonalak vagy variánsok azonosítására lehet használni.

Az alábbi, nem korlátozó jellegű példák a jelen találmányt illusztrálják. Azért mutatjuk be őket, hogy jobban elmagyarázzuk azokat az általános eljárásokat, amelyeket azoknak a jelen találmány szerinti termékeny Zea ways-növényeknek az előállítására használtunk, amelyek stabilan expresszálják a rekombináns DNS-t, és amelyek az említett DNS-t továbbadják az utódaiknak. A koncentrációadatok, százalékok súly alapján vannak megadva, hacsak külön nem jelezzük az ellenkezőjét. Az nyilvánvaló, hogy egy specifikus transzformációs esemény előfordulásának valószínűsége a transzformációs eljárásnak alávetett anyag mennyiségének a függvénye. Tehát azokban az esetekben, ami12

HU 220 773 Bl kor az ismertetett eljárásokban nem keletkezik transzformáit termék, az eljárás megismétlése szükséges.

I. példa

Termékeny transzgenikus Zea mays-növények előállítása az AB 11 kalluszvonalból

I. Olyan kukoricasejt-tenyészetek indítása és fenntartása, amelyek megőrizték a növénnyé való regenerálódás képességét.

Morzsalékos, embriogén kukorica-kallusztenyészeteket indítunk hibrid, éretlen embriókból, amelyeket az A188 növény beltenyésztett vonalának (University of Minnesota, Crop Improvement Association) a B73 növény beltenyésztett vonala (lowa State University) virágporával való beporzásával állítunk elő. A kalászokat akkor gyűjtjük be, amikor az embriók hossza eléri az 1,5-2,0 mm-t. Mindegyik kalászt a felületén sterileztük 50%-os kereskedelmi fehérítőben (2,63 súly/térfogat% nátrium-hipoklorit) 20 percig szobahőmérsékleten. A kalászokat ezután steril, desztillált, ionmentesített vízzel mossuk. Az éretlen embriókat aszeptikus körülmények között izoláljuk, és indító/fenntartó táptalajra tesszük, oly módon hogy a gyökér/hajtás tengelyt hozzuk érintézésbe a táptalajjal. Az indító/fenntartó táptalaj (a továbbiakban „F táptalaj” néven említjük) tartalmaz N6 alaptáptalajt (Chu 1975), amelyben van még 2 súly/térfogat% szacharóz, 1,5 mg/liter 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav (2,4-D), 6 mmol/liter prolin, és 0,25% Gelrite (Kelco, Inc., San Diego). A pH értékét a sterilezés előtt 6,8-ra állítjuk. Hacsak külön nem jelezzük, akkor az összes szövettenyészet manipulációt steril körülmények között végezzük.

Az éretlen embriókat 26 °C-on sötétben inkubáljuk. Az éretlen embriók pajzsocskájából származó sejtek szaporodását a morzsalékos konzisztencia és a jól definiált szomatikus embriók megléte alapján értékeljük. Az ilyen morfológiával rendelkező szövetet azután az éretlen embriók kezdeti szélesztése utáni 10-14. napon visszük át friss táptalajra. A szövetet azután minden 14-21. napon rutinszerűen átoltjuk. A körülbelül 1 g méretet elérő szövetdarabokról 60-80 mg-os mennyiségeket távolítunk el, és friss táptalajra visszük át. Az átoltás során vizuálisan alaposan ellenőrizzük, hogy biztosan csak a helyes morfológiával rendelkező szövetet tartsuk fenn. A szomatikus embriók jelenléte biztosítja, hogy a tenyészetből megfelelő körülmények között növény keletkezhet. Az ebben a példában használt, AB 11-nek nevezett sejttenyészet egy ilyen tenyészet, és 1 évvel a bombázási kísérlet előtt indítottuk.

II. Plazmidok

A pHYGIl plazmidot a pBS+ vektorban állítottuk elő (Stratagene, Inc., San Diego, CA), ami egy 3,2 kb méretű cirkuláris plazmid, standard rekombináns DNStechnikák alkalmazásával. A kukorica AdhIS első intronját tartalmazó 553 bázispár méretű Bcl-BamHI fragmentet (Callis et al., 1987) a CaMV 35S promotere és a pCHNl-1 plazmid (előállítása az V. példában leírtak alapján) higromicint kódoló szekvenciája közé illesztjük be. A pHYGIl plazmid térképét az 1. ábrán közöljük. A pHYGIl plazmidot az American Type Culture Collectionnél helyeztük letétbe (Rockville, MD, USA, 1990. március 16-án) a Budapesti Egyezmény alapján, 40774 letéti szám alatt.

A pBII221 plazmid tartalmazza az Escherichia coli β-glükuronidázt kódoló szekvenciát, amelyet az 5’ végen a CaMV 35 S promoter, a 3’ végen pedig a nos poliadenilezési szignál határolja. A plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a kukorica AdhIS első intronját a 35S promoter és a pBI221 kódoló szekvenciája közé illesztjük be (Jefferson et al., 1987). A pBII221 térképét 2. ábrán mutatjuk be.

A plazmidokat az AB 11 embriogén kallusztenyészetbe juttatjuk be, mikrorészecske-bombázási technika alkalmazásával.

111. DNS-bejuttatási módszer

Az embriogén AB 11 kukorica-kalluszvonalat 7-12 nappal a mikrorészecske-bombázás előtt átoltjuk. Az AB 11 kalluszt az alábbiak szerint készítjük elő a bombázáshoz. Öt kalluszcsomót, mindegyik körülbelül 50 mg nedvessúlyú, egy steril, 60x15 mm-es steril Petri-csészében kereszt alakban elrendezzük. A lemezeket a bombázási eljárás során egy zárt tartóban tároljuk, amely nedves papírtörülközőket tartalmaz. Tizenkét lemezt készítünk.

A plazmidokat M-10 volfrámrészecskékre visszük fel (Biolistics), pontosan Klein és munkatársai leírása alapján azzal a különbséggel, hogy (i) a javasolt DNS-mennyiség dupláját használjuk;

(ii) a DNS-t 0 °C-on csapjuk ki a részecskékre; és (iii) a DNS-sel borított volfrámrészecskéket jégen tároljuk a bombázás során.

Mindegyik cső 25 μΐ 50 mg/ml M-10 volfrámot tartalmaz vízben, valamint 25 μΐ 2,5 mol/1 CaCl₂-ot és 10 μΐ 100 mmol/1 spermidint, Összesen 5 μΐ 1 mg/ml koncentrációjú plazmid-DNS-sel. Egy cső csak a pBII221 plazmidot tartalmazza, és egy cső a TE puffért tartalmazza (lásd a 2. táblázatot a későbbiekben).

Mindegyik csövet jégen inkubáljuk 10 percig, a részecskéket centrifúgálással ülepítjük Eppendorf centrifugában szobahőmérsékleten 4 másodpercig, és a felülúszót elöntjük. A csöveket jégen tároljuk a bombázás folyamata alatt. Mindegyik készítményt maximum 5 bombázásra használjuk.

A makrolövedékeket és a leállítólemezeket a Biolistics Inc.-től vásároljuk (Ithaca, NY). Ezeket a gyártó előírásai szerint sterilezzük. A mikrolövedék-bombázó berendezést a Biolistics, Inc. cégtől vásároljuk.

A mintalemezeket 5 cm-rel a mikrolövedék-berendezés leállító lemeztálcája alatt helyezzük el, úgy, hogy a leállítólemez a csőhöz legközelebbi résben helyezkedjen el. A fentiekben leírt módon kalluszszöveteket a mintalemez közepére helyezzük el, és a Petri-csésze fedelét eltávolítjuk. Egy 7x7 cm-es négyszögletes, merev dróthálót helyezünk a nyitott csészére, hogy a szövetet visszatartsuk a bombázás során. A volfrám/DNS preparátumokat ultrahanggal besugározzuk a Biolistics Inc. leírása szerint, és a szuszpenziókból 2,5 μΐ-eket pipettázunk a makrolövedékek felszínére az egyes bombá13

HU 220 773 Bl zásokhoz. A berendezést a gyártó előírásai szerint működtetjük. A végrehajtott bombázásokat a 2. táblázatban foglaljuk össze.

2. táblázat

2xpBII221 preparátum	A tranziens expresszió frekvenciájának meghatározására
7xpHYGIl/pBII221 (1:1)	Potenciális pozitív kezelés a transzformáláshoz
3χΤ. E.«	Negatív kontrollkezelés

» 10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0„ 1 mmol/1 EDTA

A két, pBII221 plazmiddal bombázott kalluszlemezt egy az egyben F táptalajra visszük át (higromicin nélkül), majd a kalluszt sötétben tartjuk 26 °C-on. 2 nap elteltével ezt a kalluszt egy az egyben átvisszük 35 x 10 mm-es Petri-csészékre (Falcon 1008), amelyek 2 ml GUS vizsgáló puffért tartalmaznak (1 mg/ml 5-bróm-4-klór-3-indolil-p-D-glükuronid) (Research Organics), 100 mmol/1 nátrium-foszfát 7,0, 5-5 mmol/1 kálium-feiricianid, illetve kálium-ferrocianid, 10 mmol/1 EDTA és 0,06% Triton X-100. A lemezeket 37° C-on inkubáljuk 3 napig, majd a kék sejtek számát meghatározzuk. Ennek értéke az adott esetben 313 a 355-ből ezek a tranziens GUSexpresszáló sejtek, amelyek láthatók a két lemezen, jelezve, hogy a DNS bejuttatása lejátszódott a másik bombázási eljárás során is. A GUS vizsgálatban használt szöveteket tartalmazó lemezeket a számlálás után eldobjuk, mivel a GUS vizsgálat roncsoló hatású.

IV. Szelekciós eljárás

A táptalajba lemezöntés előtt higromicin-B-t teszünk, oly módon hogy a megfelelő térfogatú, szűréssel sterilezett 100 mg/ml koncentrációjú higromicin-B vizes oldatát adjuk táptalajhoz, amikor hőmérséklete 45 °C-ra csökkent.

Közvetlenül azután, hogy az összes mintát bombáztuk, az összes pHYGIl/pBII221 plazmiddal kezelt lemezről származó kalluszt, valamint két TE lemezt egy az egyben átvisszük 15 mg/ml higromicin-B-t tartalmazó F táptalajra (tíz kalluszdarab lemezenként). Ezeket nevezzük az első körből származó szelekciós lemezeknek. A TE-vel kezelt lemezekről származó kalluszt higromicint nem tartalmazó F táptalajra visszük át. Ezt a szövetet minden 2-3 hétben nem szelektív táptalajra visszük át, és ezt nevezzük nem szelektált kontrollkallusznak.

napos szelekció után a szövet lényegében azonosnak tűnik mind a szelektív, mind a nem szelektív táptalajon. A pHYGIl/pBII221 kezelésből származó mind a hét lemezről és egy TE-vel kezelt lemezről származó összes kalluszt az első szelekciós kör lemezeiről átvisszük a második szelekciós kör lemezeire, amelyek 60 mg/1 higromicint tartalmaznak. A 2. szelekciós kör mindegyik lemeze tíz db 30 mg-os kalluszt tartalmaz lemezenként, ennek következménye a lemezek számának növekedése.

A 2. szelekciós lemezeken töltött 21 nap elteltével az összes anyagot átvisszük a 3. szelekciós kör lemezeire, amelyek 60 mg/1 higromicint tartalmaznak. A bombázás után 79 nappal a 3. szelekciós kör lemezeit átvizsgáljuk, hogy van-e bennük életképes kalluszszektor. Az egyik szektor szaporodott a nekrotikus szöveti háttéren a pHYGIl/pBII221 plazmidokkal kezelt lemezeken. A szektor a PH3 jelölést kapta, és F táptalajra vittük át, amely nem tartalmazott higromicint.

nap elteltével a higromicin nélküli F táptalajon, a PH3-at F táptalajra visszük át, amely 60 mg/ml higromicint tartalmaz. A PH3-ról kiderült, hogy képes növekedni többszörös átoltás után is, 60 mg/1 higromicin jelenlétében is.

V. A transzformált kallusz igazolása

Annak igazolására, hogy a PH3 kalluszban megtalálható a higromicinrezisztencia-gén, genomiális DNS-t izolálunk a PH3 kalluszból és a szelektálatlan kontrollkalluszból az V. példa szerint, és Southem-blottal analizáljuk. Az izolált DNS-t (10 pg) BamHI (New England Biolabs) restrikciós enzimmel emésztjük, majd 0,8 tömeg/térfogat%-os agarózgélben elektroforetizáljuk 15 V feszültség mellett 16 óra hosszat TAE pufferben (40 mmol/1 TRIS-acetát, pH=7,6, 1 mmol/1 EDTA). A DNS-t Nytran membránra visszük át (Schleiher and Schüll). A transzfert, a hibridizálást és a mosási körülményeket az előállító által javasolt módon állítjuk be.

Egy ³²P-vel jelzett próbát állítunk elő random jelzőkittel (Oligo Labelling Kit, Pharmacia), az előállító előírásai szerint, a-³²P-dCTP (ICN Radiochemicals) felhasználásával. A használt templát DNS a pHYGIl 1055 bp méretű BamHI fragmentje volt, amely a teljes HPT kódoló szekvenciát tartalmazza.

A membránokat Kodak X-OMAT AR filmre exponáljuk X-OMATIC kazettában, erősítőszűrő alkalmazásával. A PH3 kallusznál egy csík figyelhető meg a várt 1,05 kb-nál, jelezve, hogy a HPT kódoló szekvencia jelen van. A kontrollkallusznál nem lehet csíkot megfigyelni.

Annak igazolására, hogy a higromicingén beépült a nagy molekulasúlyú DNS-be, a PH3 kalluszból és a kontrollkalluszból származó emésztetlen DNS-t elektroforézisnek vetjük alá, biotoljuk, és a fentiek szerint hibridizáljuk. Az emésztetlen PH3 DNS csak ott mutatott hibridizálást a próbához, ahol a mobilitás megegyezett a hasítatlan DNS-sel. Nem volt megfigyelhető hibridizálás a kontrollkallusz esetében. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a HPT kódoló szekvencia nincs jelen a PH3 kalluszban érintetlen pHYGIl vagy kis nem kromoszomális plazmid formájában. Ezek az eredmények megegyeznek azzal, hogy a higromicingén nem épül be a nagy molekulasúlyú DNS-be.

VI. Növényregenerálás és magvak előállítása

A PH3 kallusz egyes részeit közvetlenül a 60 mg/1 higromicint tartalmazó lemezekről visszük át az RM5 táptalajra, amely az MS alapsókat tartalmazza (Murashige et al., 1962) kiegészítve 0,5 mg/1 tiaminHCl-dal, 0,75 mg/1 2,4-D-vel, 50 g/1 szacharózzal,

HU 220 773 Β1

150 mg/1 aszparaginnal, és 2,5 g/1 Gelrite-tal (Kelco Inc., San Diego).

Miután 14 nap eltelt az RM5 táptalajon, a PH3 legnagyobb részét és a szelektálatlan kalluszt R5 táptalajra visszük át (összetétele ugyanaz, mint az RM5 táptalajé, csak a 2,4-D-t hagyjuk ki belőle). A lemezeket sötétben 26 °C-on inkubáljuk 7 napig, majd fényre tesszük, a megvilágítás 14 óra hosszat tart, a sötétség 10 óra hosszat, és itt tartjuk 14 napig, 26 °C-on. Ennél a pontnál az esetleg keletkező hajtásokat 100 ml R5 táptalajt tartalmazó edényekbe tesszük át. A növényeket az edényekből vermikulitra ültetjük át 7-8 nappal azelőtt, hogy talajba ültetnénk őket és érett állapotig nevelnénk őket. A PH3-ból összesen 45 növény keletkezett, a kontrollkalluszból összesen 10 növény.

Az érett PH3 növények ellenőrzött beporzását standard módszerek alkalmazásával végezzük, MBS501 (Mike Brayton Seeds), FR4326 (Illinois Foundation Research) beltenyésztett Zea mays-vonalak és a szabadalmaztatott LM1112 beltenyésztett vonal alkalmazásával. A magvakat 45 nappal a beporzás után gyűjtjük be, és további 1-2 hétig hagyjuk száradni.

VII. Az RÍ utódok elemzése

Az RÍ növényeket PCR-elemzéssel vizsgáljuk meg, hogy megtalálhatók-e bennük a HPT- és GUSgének szekvenciái. A HPT-gén expresszióját a HPTaktivitás enzimatikus mérésével határozzuk meg. Az adatokat a 3. táblázatban foglaljuk össze. Ezek az adatok igazolják a rekombináns DNS átadását és expresszióját mind a hímivarú, mind a nőivarú növényekben, és ez megegyezik a mendeli öröklődés szabályaival. Annak igazolása Southem-blottal, hogy a HPT-t kódoló szekvencia integrálódott a kiindulási kallusz nagy molekulasúlyú DNS-ébe, és kombinálása az öröklődési adatokkal azt sugallja, hogy az említett DNS-ek kromoszómába integrálódtak. A GUS-gén-szekvenciák jelenléte az RÍ utódokban azt igazolja, hogy egy nem szelektált gén együtt transzformálódott és együtt öröklődik.

3. táblázat

A PH3 RÍ utódainak analízise Transzformánsok Szülők: MBS501xPH3.4

PH3.4 növény	Enzimes HPT-vizsgálat	PCR-vizsgálat
HPT	GUS
4.1	-	-	-
4.2	+	+	+
4.3	+	+	+
4.4	-	-	-
4.5	+	+	+
4.6	+	+	+
4.7	+	+	+
4.8	-	-	-
4.9	-	-	-

Szülők: LM1112xPH3.18

HU 220 773 Bl

Táblázat (folytatás)

Növény	Enzimes HPT-vizsgálat	PCR vizsgálat
HPT	GUS
3.12	-	ND	ND
3.13	-	ND	ND
3.14	-	ND	ND
3.15	-	ND	ND
3.16	-	ND	ND
3.17	-	ND	ND
3.18	-	ND	ND
3.19	-	ND	ND
3.20	-	ND	ND
3.21	-	ND	ND
3.22	-	ND	ND
3.23	-	ND	ND
3.24	-	ND	ND

A HPT-enzim-vizsgálat az alábbi módszereken alapul: S. K. Datta et al., Bio/Technology, 8, 736 (1990); M. Staebell et al., Analytical Biochemistry, 185, 318 (1990); és E. Cabanes-Bastos, Gene, 77, 169 (1989).

0,2 g-os gyökérmintákat vágunk ki 7-10 napos hajtásokból, és cseppfolyós nitrogénben gyorsan lefagyasztjuk. A mintákat alumínium-oxiddal és 400 pl EB pufferrel eldörzsölve táljuk fel (50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,0, 10 térf/térí% glicerin, 0,1 mmol/1 PMSF) 30-60 másodpercig, eldobható mozsártörőt és csövet használva (Kontes), majd egy Eppendorf mikrocentrifugában 10 percig centrifugáljuk. A felülúszót egy Centricon 30 szűrőegységbe tesszük át, majd szögrotorban Beckman GPR centrifugával 30 percig 4 °C-on 5000/perc fordulatszámmal centrifugálva sómentesítjük. Minden egyes szűrőegység mosásához 1 ml EB-t használunk, majd újabb 60 percig centrifugáljuk 5000/perc fordulatszámmal. A visszamaradt folyadékot kinyerjük és -70 °C-on tároljuk. A transzgenikus és nem szelektált kontrollkalluszszövet 0,2 g-os mintáit a fentiek szerint feltáljuk, majd a felülúszókat használjuk pozitív és negatív kontrollként.

A fehérjék mennyiségi meghatározását Bradford módszerével végezzük [Analytical Biochemistry, 72, 248 (1976)] egy BioRad kit alkalmazásával. A gyökérkivonatokban található fehérjekoncentráció 0,2-2 pg/ml között változott.

A gyökérkivonatokat (4 pg összfehérje) egy reakcióelegyhez adjuk hozzá, amely 20 mmol/1 Tris-maleát puffért, 13 mmol/1 MgCl₂-t, 120 mmol/1 NH₄Cl-t, 0,5 mmol/1 DTT-t, 50 pmol/l ATP-t, 0,61 pg/μΙ higromicin-B-t, 25 pg/μΙ szarvasmarha-szérumalbumint és 12 pCi gamma-³²P-ATP-t tartalmaz. A reakcióelegy térfogata 33 pl. A reakcióelegyet 30 percig 37 °C-on inkubáljuk.

A reakcióelegyből egy pl-t polietilénimin-cellulóz vékonyréteg-kromatográfiás lemezre viszünk (Sigma

Chem. Co.). A lemezeket 50 mmol/1 koncentrációjú hangyasavban fejlesztjük ki, levegőn szárítjuk, majd Kodak XAR-5 filmre exponáljuk. A reakció terméke, a higromicin-B-foszfát ilyen körülmények között az oldószer-front közelében vándorol.

A PCR-vizsgálatok kivitelezéséhez 0,1 g-os mintákat veszünk a növényi szövetekből és cseppfolyós nitrogénben lefagyasztjuk. A mintákat 120-as szemcséjű szilícium-karbiddal dörzsöljük el 200 pl 0,1 mol/1 TRIS-HC1 pH=8,5, 0,1 mol/1 NaCl, 20 mmol/1 EDTA, 1% szarkozil összetételű oldatban 4 °C-on. A fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével végzett extrakció és etanol-izopropanolos kicsapások után a mintákat TEben szuszpendáljuk és polimeráz-láncreakcióval vizsgáljuk [Κ. B. Mullis, 4 683 202 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás).

A PCR-t 100 pl térfogatú oldatban hajtjuk végre, amelynek összetétele: 50 mmol/1 KC1, 10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,4, 3 mmol/1 MgCl₂, 100 pg/ml zselatin, 0,25 pmol az egyes indítómolekulákból, 0,2 mM az egyes dezoxi-nukleotid-trifoszfátokból (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 2,5 egység Taq DNS polimeráz (Cetus), valamint 10 pé a DNS-preparátumból. A reakcióelegyet ásványi olajjal felülrétegezzük, 3 percre 94 °C-ra melegítjük, majd 35 cikluson keresztül amplifikáljuk (55 °C 1 percig, 72 °C 1 percig, 94 °C 1 percig). A reakcióelegyet ezután 50 °C-on inkubáljuk 2 percig, majd 72 °C-on 5 percig. A PCR termékből 10 pl-t agarózgélen elektroforetizáljuk, majd etídium-bromiddal tesszük láthatóvá.

A HPT-gén jelenlétének igazolására egy, a 35S promoterrel komplementer PCR indító molekulát, és egy, a HPT kódoló szekvenciával komplementer indítómolekulát használunk. Tehát a megfelelő méretű PCR-termék előállításához a HPT templát DNS-nek egybefüggő 35S promoter régiót, Adhl intront és 5’ fehérje kódoló szekvenciát kell tartalmaznia.

A GUS-gén jelenlétének elemzéséhez a GUS fehérje kódoló régióban található szekvenciákkal komplementer PCR indító molekulákat használtunk. Egy 797 bp méretű PCR-termék várható, ha a templát DNS a két indító között érintetlen kódolórégiót tartalmaz.

II. példa

Termékeny transzgenikus növények az AB63S kalluszvonalból, amely egy mag-tartalékfehérjét kódoló rekombináns DNS-t tartalmaz

A 10 kd méretű zein tartalékfehérjét a kukoricamag-endospermiuma állítja elő, és egy reprezentatív tagja azoknak a fehérjéknek, amelyeket „mag-tartalékfehérjéknek” neveznek. A fehérje különlegesen nagy mennyiségben tartalmaz metionint (22,5%), és a Zpsl0/(22) gén kódolja [M. S. Benner et al., Theor. Appl. Génét., 78, 761 (1989)], amely gént a továbbiakban zlO génként említünk. Tehát a zlO gén megnövekedett expresszióját lehet arra használni, hogy a kukorica metionintartalmát megnöveljük. A kiméra zlO gént tartalmazó termékeny kukoricanövényt az I. példában leírtak alapján állíthatjuk elő, minimális módosításokkal. A II. példa azt is igazolja, hogy a re16

HU 220 773 Bl kombináns DNS-t az I. példában használttól eltérő kalluszvonalba is sikerült bejuttatni.

I. Szövettenyészet-vonalak

Az ebben a példában alkalmazott AB63S jelű embriogén kukoricakalluszt olyan éretlen embriókból állítottuk elő, amelyek az elit beltenyésztett A188, illetve B73 vonalak keresztezéséből származnak, az I. példában leírt iniciációs és fenntartási eljárások alkalmazásával. A kalluszvonalat a bombázási kísérlet előtt körülbelül 7 hónappal indítottuk. Tizenegy héttel a bombázás előtt a szövetet megszűrtük, oly módon hogy egy 1,9 mm-es szitán nyomtuk át, majd N6 fenntartó táptalajra szélesztettük. A morzsalékos, embriogén kalluszt a növekedés 1-2. hete után választottuk ki a keletkező szövetből, friss táptalajra tettük át, majd 1,5-3 hétig hagytuk növekedni, mielőtt újból megszűrtük. A morzsalékos kallusznak ezt a szűrési és kinyerési ciklusát összesen háromszor hajtjuk végre a bombázási kísérlet előtt.

II. Plazmidok

Az I. példában leírt pHYGIl és pBII221 plazmidokat használjuk ebben a példában. Emellett a DNS/volfrám készítmény készítéséhez a pZ27Z10 plazmidot is felhasználtuk. A pZ27Z10 plazmidot a pUC118 plazmidból kiindulva állítottuk elő [Vieira et al., Methods in Enzymology, 153, 2 (1987)], standard rekombináns DNS technika alkalmazásával; ez egy 3,2 kb méretű cirkuláris plazmid. A pZ27Z10 tartalmazza a kukorica 27 kd-os zein génjének [D. E. Geraghty, PhD. Thesis, University of Minnesota (1987)] 5’ transzkripciós szabályozó régióját, amit a továbbiakban z27-ként említünk, közvetlenül a kukorica 10 kD-os zein génjének [Kirihara et al., Gene, 7, 359 (1988), amelyet a továbbiakban zlO-ként említünk] kódoló szekvenciája és 3’ nemkódoló szekvenciája elé beépítve. A z27 szabályozószekvencia és a zlO kódoló- valamint 3’ szekvenciák kombinációját a továbbiakban kiméra z27-zl0 génként említjük. A CaMV genomnak a 35S promoter szomszédságából származó poli A szignált a zlO génszekvencia után helyezzük el a pZ27Z10 plazmidban. A plazmid térképét a 7. ábrán láthatjuk.

A pZ27Z10 plazmidot az American Type Culture Collectionnél (Rockville, MD) hegyeztük letétbe a Budapesti Egyezmény szerint, ATCC 40938 letéti szám alatt.

III. DNS-bejuttatási módszerek

Az AB63S kukorica embrionális kalluszvonalból származó szövetet a mikrorészecske-bombázás előtt átoltjuk. A szövetet úgy készítjük elő a bombázáshoz, hogy egy 1,9 mm-es szitán szüljük át. A megszűrt szövetet szélesztjük 5,5 cm átmérőjű Whatman No. 1 szűrőlapra vékony pázsit formájában, körülbelül 500 mg szövetet használva szűrőlaponként. Összesen 6 szövetkorongot készítettünk. A mikrorészecske-bombázás előtt a szöveteket tartalmazó szűrőkorongokat üres Petri-csészére tesszük át. A szövetet enyhén dehidratáljuk, oly módon hogy egy laminárboxban fedetlenül állni hagyjuk 20 percig. Hogy a szövet további dehidratálódását megakadályozzuk, a lemezeket a bombázáshoz való felhasználás előtt magas nedvességtartalmú tárolóban tartjuk.

A bombázáshoz használt DNS 1:1:1 súlyarányú keveréke a pHYGIl, pZ27Z10 és pBII221 plazmidoknak. A DNS-nek a volfrámrészecskékre való kicsapását az I. példában leírtak alapján végeztük.

A bombázást az I. példában leírtak alapján végeztük, azzal a különbséggel, hogy a Biolistic™ PDS 1000 (DuPont) berendezést használtuk, és a szövetek fölé nem tettünk szitát. A kalluszszövetet tartalmazó hat szűrőkorongot az alábbiak szerint kezeltük: két szűrőlapot kétszer bombáztunk, mindkétszer a DNS/volfrám preparátummal (potenciális 2X pozitív kezelés); három szűrőlapot egyszer bombáztunk a DNS/volfrám preparátummal (potenciális IX pozitív kezelés); egy szűrőlapot egyszer bombáztunk a volfrám/víz szuszpenzióval, ugyanolyan mennyiségű volfrámot használva mint a DNS/volfrám bombázási kísérletekben (negatív kontroll).

IV. A transzformált kallusz szelekciója

A bombázás után a 2X DNS kezelésből származó kalluszszöveteket tartalmazó szűrőkorongokat az 1. kör szelekciós lemezeire tesszük át: F táptalaj, 15 mg/ml higromicinnel. Az IX DNS kezelés két szűrőkorongja közül az egyiket, valamint a negatív kontrollkezelés szűrőkorongját is áttettük az 1. kör szelekciós lemezeire tesszük át. Az IX DNS kezelésből származó harmadik szűrőkorongot higromicint nem tartalmazó F táptalajra tesszük át, a nem szelektált kontrollkalluszként való felhasználáshoz. Mivel ez a nem szelektált kontrollkallusz potenciálisan pozitív volt, ezért a szelekciónak csak az első két körét hajtottuk végre, összehasonlítás céljából; ezt követően a nem bombázott AB63S kalluszt F táptalajon tartottuk fenn higromicin nélkül, és ezt használtuk nem szelektált kontrollkalluszként.

Öt nap elteltével a kalluszt kis csomókban (körülbelül 25 mg) a szűrőkorongokról friss, 1. szelekciós körhöz tartozó táptalajra visszük át. A szélesztés sűrűsége 10 csomó per lemez. Erre az időre a kallusz súlya körülbelül kétszeresére nőtt. A nem szelektált kontrollkalluszt ugyanígy visszük át higromicint nem tartalmazó F táptalajra. A bombázás utáni tizenkilencedik napon az összes szövetet az 1. szelekciós kör táptalajáról a 2. szelekciós kör táptalajára visszük át (F táptalaj, 60 mg/ml higromicinnel). A szélesztés sűrűsége ennél az átoltásnál tizennégy csomó per lemez. A kallusz térfogata körülbelül a háromszorosára nőtt az előző átoltás óta eltelt 14 nap alatt. 23 nap elteltével az összes kalluszt átoltjuk a 2. szelekciós kör táptalajáról a 3. szelekciós kör táptalajára, amely 60 mg/ml higromicint tartalmaz.

A bombázás után 59 nappal öt élő szektor figyelhető meg, amelyek szaporodtak a környező nekrotikus kalluszok között. Erről az öt szektorról azt gondoltuk, hogy a 2. szelekciós kör egyetlen kalluszcsomójából származtak, mivel egymással szomszédosak voltak az előző átoltásból származó egymást követő lemezeken. Ezek a szektorok egy 2X DNS kezelésből származtak, és a Metl kalluszvonal jelölést kapták.

HU 220 773 Bl

A Metl kalluszvonalat 60 mg/ml higromicint tartalmazó F táptalajra, valamint higromicint nem tartalmazó F táptalajra vittük át. Az inkubálás 22. napja után nem volt észlelhető különbség a szövet növkedésében vagy megjelenésében a két különböző típusú táptalajon. A Metl kalluszvonal gyorsan nőtt, és úgy tűnt, hogy nem gátolja táptalajban jelenlevő higromicin. A Metl kallusz erősen morzsalékosnak és embrionálisnak tűnt mindkét táptalajon, és szemmel nem volt megkülönböztethető a higromicint nem tartalmazó F táptalajon növekedő AB63S kontrollkallusztól.

V. A transzformált kallusz ellenőrzése

A Metl kallusszal és a kontroll AB63S kallusszal gátlási vizsgálatokat végeztünk. A gátlási vizsgálat megkezdése előtt a Metl kalluszt 21 napig higromicint nem tartalmazó F táptalajon növesztettük. A Metl és a kontroll AB63S kalluszokat F táptalajokra vittük át, amelyek 0, 15, 60, 100 és 200 mg/1 higromicint tartalmaztak. Az egyes kalluszvonalakból három lemezt készítettünk minden egyes higromicinkoncentrációhoz; mindegyik lemez 5-6 kalluszdarabot tartalmazott, egyenként 50 mg per darab a súlyuk (a lemezenkénti kallusz mennyisége körülbelül 300 mg volt).

napi inkubálás után az egyes lemezeken levő kalluszok súlyát megmértük. A százalékos növekedési gátlás mértékét úgy határoztuk meg, hogy az egyes higromicinkoncentrációknál kapott kallusz átlagos súlyát osztottuk a 0 mg/1 higromicinkoncentrációnál kapott kallusz átlagos súlyával. Az eredmények azt mutatták, hogy a Metl kallusz növekedését egyáltalán nem gátolta a 15, 60 és 100 mg/ml higromicinkoncentráció. A Metl kallusz növekedését a 200 mg/1 higromicint tartalmazó táptalaj 20%-ban gátolta. Ezzel szemben, az AB63S kallusz növekedését minden higromicinkoncentráció gátolta; 200 mg/ml higromicinkoncentrációnál az AB63S kallusz növekedése 90%-ban gátolt volt. Ezek az eredmények megerősítik, hogy a Metl kalluszvonal rezisztens a növesztő táptalajban levő higromicinre.

Annak igazolására, hogy a higromicinrezisztenciagén benne van a kallusz-DNS-ben, és hogy a kalluszban megtalálható-e a kiméra z27-zl0 gén is, Southem-blotanalízist végeztünk. A HPT kódoló szekvencia kimutatására a Metl és a kontrollkalluszból izolált DNS-t BamHI, Hindlll és BstEII restrikciós enzimekkel emésztettük. Az emésztett DNS-mintákat agarózgél-elektroforézisnek vetjük alá 0,8%-os agarózgélen, majd Nytran membránra biotoljuk az I. példában leírtak alapján. Az etídium-bromiddal festett gélnek a biotolás előtti vizuális vizsgálata azt mutatta, hogy a BamHI emésztés teljesen lejátszódott, míg sem a Hindlll, sem a BstEII enzim nem emésztette jelentős mértékben a DNS-mintákat. A blotot biotinnal jelzett, 1,05 kb méretű, a HPT-t kódoló szekvenciából származó BamHI fragmenttel vizsgáltuk meg. A hibridizáláshoz, mosáshoz és a kimutatáshoz használt körülmények azok, amelyeket a kísérletben használ BRL Photogene™ kithez megadtak.

A hibridizálás után jelzett csíkokat figyelhettünk meg a BamHI restrikciós enzimmel emésztett Metl DNS-ben, a várt 1,05 kb méretnél, valamint a körülbelül 2,7, 4,5 és 6,5 kb méreteknél is. Ez az eredmény azt mutatta, hogy a HPT-t kódoló szekvencia jelen van Metl kalluszvonalból származó DNS-ben. A 2,7, 4,5 és 6,5 kb-nál megfigyelt további csíkok azt mutatták, hogy vagy a restrikciós enzimes emésztés nem volt teljes, vagy a HPT-szekvenciának többszörös, átrendeződött kópiája van jelen. A Hindlll és BstEII emésztések esetében hibridizációs jelek voltak megfigyelhetők mindkét sávban az emésztetlen DNS-nek megfelelő pozícióban. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a HPT-t kódoló szekvencia integrálódott a Metl genom nagy molekulasúlyú DNS-ébe. A kontrollkalluszból származó DNS-nél egyik sávban sem volt megfigyelhető hibridizációs jel.

A kiméra z27-zl0 gén kimutatásához Southemblot-elemzést végeztünk, a Metl és a kontrollkalluszból izolált DNS-mintákat alkalmazva. A DNS-mintákat BamHI és EcoRI restrikciós enzimmel emésztettük. A BamHI emésztéssel egy 2,76 kb méretű fragment szabadul fel, amely a zlO-et kódoló szekvenciát tartalmazza, valamint az ebben a transzformálásban használt pZ27Z10 konstrukcióból származó 3’ nemkódoló szekvenciát. A 7,26 kb méretű pZ27Z10 plazmidon egyetlen EcoRI restrikciós hasítási hely található. A készített blotot egy olyan biotinnal jelzett próbához hibridizáltuk, amely a teljes zlO-et kódoló szekvenciát tartalmazta, a Photogene kithez (BRL) megadott körülményeket alkalmazva.

A BamHI emésztéseknél az endogén zlO szekvenciák 9 kb-nál adtak hibridizációs jeleket, és körülbelül 15 kb-nál a Metl és kontrollkallusz-DNS-t is tartalmazó sávokban. A Metl mintában egy további körülbelül 3,5 kb méretű csík figyelhető meg, de ez nincs meg a kontroll-DNS-mintákban. A Metl DNS-ben nem volt megfigyelhető a várt erős hibridizációs jel 2,76 kb-nál. Az, hogy a BamHI restrikciós enzimmel emésztett Metl DNS-ből hiányzott a jelzett 2,76 kb méretű csík, az arra utal, hogy a DNS emésztése vagy nem volt teljes, vagy a bejuttatott DNS átrendeződött.

Az EcoRI-emésztések esetében az endogén zlO szekvenciák körülbelül 12 kb-nál és 16 kb-nál adtak hibridizációs jelet mind a Metl mind a kontrollkallusz-DNS esetében. Egy további csík figyelhető meg körülbelül 14 kb-nál a Metl mintában, de nem volt megfigyelhető a kontrollkallusz-DNS-mintákban. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy azok az új zlO DNS-szekvenciák találhatók meg a Metl kalluszDNS-ben, amelyek nincsenek meg a kontrollkalluszDN S-mintákban.

Ezeket az eredményeket egy második Southemblot-elemzéssel erősítettük meg, mikor is a Metl és a kontroll-DNS-t BamHI, Ncol és Nsil restrikciós enzimekkel emésztettük. Felhasználtuk még a Metl és a kontrollkalluszból származó emésztetlen DNS-mintákat. A szűrőlapot ³²P-vei jelzett zlO-et kódoló szekvenciával vizsgáltuk át. Mindegyik emésztésben új zlO hibridizációs jelek figyelhetők meg a Metl kallusz DNS esetében, amelyek viszont hiányoznak a negatív kontrollkallusz-DNS-mintájában. Ezek az eredmények megerősítik, hogy az új zlO-t kódoló szekvenciák megtalál18

HU 220 773 Β1 hatók a Metl kalluszban. Az emésztetlen DNS-t tartalmazó sávokban hibridizációs jelek figyelhetők meg az emésztetlen DNS-nél, mind a Metl, mind a kontrollkalluszban. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a bejuttatott zlO szekvenciák integrálódtak a Metl kallusz kromoszomális DNS-ébe.

VI. A növények regenerálása és transzgenikus magvak előállítása

A Metl vonalból és az AB63S kontrollvonalból származó kalluszt RM5 táptalajra visszük, az I. példában leírtak alapján. Miután 14 napig inkubáltuk 26 °Con, sötétben, a kalluszt az I. példában leírtak szerint R5 táptalajra visszük. A kalluszt 7 napig inkubáljuk sötétben 26 °C-on, majd fényre visszük az I. példában leírtak szerinti körülmények között. 14 napig tartjuk világosban, majd a hajtásokat Meganta dobozokba tesszük át (Sigma Chemical Co.), amelyekben 100 ml R5 táptalaj van. Miután 7-14 napot töltöttek ezen a táptalajon, a hajtásokat 7 napra vermikulitra tesszük, majd földbe, és teljes kifejlettségig felneveljük. Összesen 49 növényt (jelzésük Metl-l-től Metl-49-ig teljed) regenerálunk a Metl kalluszból, és összesen 25 növényt regenerálunk a kontroll AB63S kalluszból.

A PCR-elemzést levélszövetből származó DNSmintákon végezzük el, annak igazolására, hogy a Metl kalluszból regenerált növények megtartották a bejuttatott DNS-t. Ebből a célból hat oligonukleotidból álló csoportot használunk. Ezeknek az oligonukleotidoknak a szekvenciája, orientációjuk és relatív helyzetük a 8. ábrán látható kiméra z27-zl0 génkonstrukción belül van összefoglalva a 4. táblázatban.

4. táblázat

I. Az oligonukleotidok neve/pozíciója a Z27-Z10 génben

1.	Z27-5’	nukleotid
2.	Z27-MID	nukleotid
3.	Z27-3’	nukleotid
4.	Z10-5’	nukleotid
5.	ZlO-MID	nukleotid
6.	Z10-3’	nukleotid

II. Amplifikált fragmentméretek az oligonukleotidpárokból A) Endogén vagy kiméragénpárok

(1) + (3)	972 bp
(2) + (3)	476 bp
(4) + (6)	389 bp
(4) + (5)	262 bp

B) Kiméragén-specifikus párok

(1) + (6)	1439 bp
(1) + (5)	1313 bp
(2) + (6)	943 bp
(2) + (5)	816 bp

Az oligonukleotidokat, illetve indítómolekulákat úgy terveztük, hogy az oligonukleotidpárok, amelyek egy z27 oligonukleotidból (Z27-5’ vagy Z27-MID) és egy zlO oligonukleotidból állnak (zlO-MID vagy zlO3’), használata csak a kiméra z27-zl0 génből származó fragment amplifikációját eredményezi, de nem eredményez amplifikációt az endogén kukorica z27 vagy zlO génekből. Az, hogy a PCR-reakciókban a várt méretű amplifikált fragmentek jelentek meg ezeknek a zlOz27 specifikus oligonukleotidpároknak az alkalmazásával, diagnosztikai jelentőségű a kiméra zl0-z27 géneknek az adott kallusz vagy növényi DNS-mintában való előfordulása szempontjából.

A z27 oligonukleotidpárok (Z27-5’ vagy Z27-MID a Z27-3’-vel) vagy a zlO oligonukleotid párok (a zl0-5’ a zlO-MID-del vagy z 10-3’-vei) olyan fragmentek amplifálódását eredményezte, amelyek a z27 szabályozószekvenciákat vagy zlO kódolószekvenciákat eredményezik a PCR-reakciókban, ha kontroll AB63S kalluszDNS-t vagy Metl kallusz-DNS-t vagy pZ27Z10 plazmid-DNS-t használunk templátként. Ezek a reakciók szolgálnak pozitív kontrollként az egy adott kallusz vagy növényi DNS-mintából származó endogén kukorica-génszekvencia amplifikálásakor.

A levél-DNS-t két Metl R0 növényből állítjuk elő (jelzésük Metl-1 és Metl-2), valamint egy AB63S növényből, az alábbiak szerint. A PCR-reakciókat ezekkel a DNS-mintákkal hajtjuk végre, a HPT-t kódoló szekvenciára, a kiméra z27-zl0 génre, a z27 szabályozószekvenciára és a zlO kódolószekvenciára specifikus specifikus oligonukleotidpárokkal. A PCR-reakciótermékek gélelemzése azt mutatta, hogy a várt méretű amplifikációs termékeket kapjuk mindegyik reakcióban, ha a Metl-1 DNS-t és a Metl-2 DNS-t használjuk. A kontroll AB63S DNS negatív eredményt ad a HPT-t kódoló szekvencia és a z27-zl0 kiméragén szempontjából, de pozitív eredményt ad az endogén z27 szabályozószekvencia és a zlO-et kódoló szekvencia szempontjából. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a vizsgált Metl R0 növények megtartották a bejuttatott HPT-DNS-t és a kiméra Z27-Z10 DNS-t.

További bizonyítékként, hogy a diagnosztikus jelentőségű z27-zl0 PCR-reakciótermékek mind a z27 szabályozószekvenciákat, mind a zlO kódolószekvenciákat tartalmazzák, Southem-blot-analízist végeztünk a PCR-reakciótermékeken. Southem-blot-filtereket készítünk két, azonos mintákat tartalmazó agarózgélről. A minták a fentiekben ismertetett z27 szabályozószekvenciák, a zlO kódolószekvenciák és a kiméra Z27zlO szekvenciák amplifikálásából származó PCR-reakciótermékeket tartalmazzák. Az egyik Southem-blotot egy z27 szabályozószekvenciához hibridizáljuk. Az eredmények azt mutatják, hogy a zlO kódolószekvenciából készült próba hibridizálódik a zlO-et kódolószekvenciáról készült PCR-reakciók amplifikált fragmentjeihez és a kiméra Z27-Z10 gén PCR-reakcióihoz, de nem hibridizálódik a z27 szabályozószekvencia PCRreakcióiból származó amplifikált fragmentekhez. Analóg módon, a z27 próba hibridizálódik a z27 szabályozószekvencia PCR-reakcióiból és a Z27-zl0 kiméra19

HU 220 773 Bl gén PCR-reakcióiból származó amplifikált fragmentekhez, de nem hibridizálódik a zlO-et kódoló szekvencia PCR-reakcióiból származó amplifikált fragmentekhez. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a PCRreakciókban amplifikált fragmentek tartalmazzák a várt génszekvenciákat, és a kiméra Z27-zl0 kiméragén diagnosztikus PCR-rel amplifikált termékei mind a z27 szabályozószekvenciákat, mind a zlO-et kódoló szekvenciát tartalmazzák.

Az érett Metl RO növény szabályozott beporzását beltenyésztett A188, B73, A654 és H99 kukoricavonalakkal végeztük. Emellett számos ön-, illetve rokonbeporzást végeztünk. Összesen 130 beporzást végeztünk, a Metl RO növényeket mind pollendonorokként, mind pollenrecipiensekként alkalmazva. Az érett magvakat a beporzás után 45 nappal gyűjtöttük be, majd további 12 hétig hagytuk száradni.

Az RÍ utódok elemzése

A HPT-szekvencia és a kiméra z27-zl0 gének jelenlétének igazolását az RÍ növényi szövetekből származó DNS PCR-elemzésével végeztük el, három RÍ utódcsoportban.

Az első elemzett RÍ utódcsoport a Metl-7 RO növény négy éretlen címermagja volt. Ezeket a címermagvakat úgy kaptuk, hogy a Metl-7 címeréből fejlődő kukoricahajon végeztünk nyitott beporzást. A beporzás után körülbelül 18 nappal a címermagvakat eltávolítottak a növényről és a felületükön sterileztük. Az egyes magvakból kivágtuk az endospermiumot, szárazjégen fagyasztottuk, majd -70 °C-ra tettük, amíg DNSt izoláltunk belőle.

Az egyes magvakból származó embriót R5 táptalajra tettük, és hagytuk kicsírázni. 10 nap elteltével a hajtásokat áttettük vermikulitra, ott 7 napig tartottuk, majd földbe tettük, és hagytuk hogy teljes érettségig felnőjenek. Az egyes endospermiumokból izolált DNS-sel PCR-elemzést végeztünk, a HPT-t kódoló szekvenciára, a kiméra Z27-zl0 génre és a kukorica Adhl génre specifikus oligonukleotidokat használva. A négy endosperma-DNS közül három az összes említett génszekvenciákra pozitívnak bizonyult. A negyedik endospermaDNS-minta negatív volt a HPT-t kódoló szekvenciára és a Z27-zl0 kiméragén-szekvenciára, de pozitív volt az endogén Adhl szekvenciára. Az eredmények azt mutatták, hogy mind a HPT-szekvencia, mind a kiméra Z27-zl0 gén átadódott a Metl-7 RÍ utódának.

Hasonló elemzést végeztünk az A654xMetl-l keresztezésből származó 24 maggal. A beporzás után 24 nappal a magvakat eltávolítottuk a kalászból, és a felületükön sterileztük őket. Az endospermiumokat és az embriókat ez előzőkben leírt módon izoláltuk és kezeltük. Az endosperma-DNS-minták PCR-elemzése azt mutatta, hogy a 24 utódból 9 megörökölte mind a HPTszekvenciákat, mind a kiméra Z27-zl0 gént. A többi 15 utód egyik bejuttatott génszekvenciát sem örökölte. Az RÍ utódok harmadik elemzett csoportja a Metl6 RO növény önbeporzásával kapott 28 RÍ növényből állt. A DNS-mintákat 28 kéthetes hajtás levélszöveteiből izoláltuk.

A levél-DNS-minták PCR-elemzése azt mutatta, hogy 24 RÍ utód mind a HPT-szekvenciákat, mind a kiméra Z27-zl0 géneket hordozza. A többi 4 RÍ utód egyik bejuttatott génszekvenciát sem hordozta. Az elemzések eredményeit az 5. táblázatban foglaltuk össze, és ez azt mutatja, hogy a Metl növények RÍ utódjainak jelentős része örökölte a bejuttatott DNS-t.

5. táblázat

A bejuttatott HPT-szekvencia és a kiméra Z10 gén öröklődése a Metl növények keresztezéseiből származó utódokban

Genotípus	Külső keresztezés (A654xMetl-l)	Önbeporzás (Metl-6)
Utódok száma
HPT+/z27zlO+	9/24	24/28
HPT+/Z27Z10-	0/24	0/28
HPT-/z27zl0+	0/24	0/28
HPT-/Z27Z10-	15/24	4/28

A z27zlO+/HPT+ növények és a Z27Z10-/HPTnövények aránya a külső keresztezésből származó populációban megegyezik egyetlen lókusz 1:1 arányú szegregációjával. Emellett, a z27zlO+/HPT+ növények és a Z27Z10-/HPT- növények aránya az önbeporzásból származó populációban megegyezik egyetlen lókusz 3:1 arányú szegregációjával. Ezek az adatok a bejuttatott HPT és Z27-zl0 szekvenciák kapcsoltságát mutatják.

III. példa

Egy inszekticid fehérjét kódoló rekombináns DNS-t tartalmazó AB12 kalluszvonalból származó termékeny transzgenikus növények

A Bacillus thuringiensis által kódolt fehérjékről kimutatták, hogy számos peszticid alkalmazásban jól használhatók. A specifikus heterológ Bt-géneket tartalmazó transzgenikus kukoricanövények előállítása megnövelheti a növények rezisztenciáját a specifikus kártevőkkel szemben. A rekombináns Bt-gént tartalmazó termékeny transzgenikus növényeket az I. példában leírtak alapján állítjuk elő, számos kis módosítás alkalmazásával, amint azt az alábbiakban jelezzük.

Ugyanabban az időben, amikor az I. példa kalluszvonalát indítottuk, egy másik kalluszvonalat is indítottunk. Az AB 12-t ugyanolyan szülői genotípusú növények külön keresztezésével állítottuk elő (A188xB73). Ez példa igazolja termékeny transzgenikus növények regenerálását egy harmadik kalluszvonalból, az AB 11 és az AB63S mellett, valamint azt is igazolja, hogy a termékeny transzgenikus növények előállítása nem az adott kalluszvonalak egyedi tulajdonsága volt.

Az I. példában ismertetett pHYGIl plazmidot, valamint a pMS533 plazmidot, amely a Bacillus thuringiensis endotoxin (BT)-gént tartalmazza a neomicinfoszfotranszferáz (NPTII)-génhez fuzionáltatva, használ20

HU 220 773 Bl juk a továbbiakban. A fúziós géntől 5’ irányban levő pozícióban találhatók a CaMV-gén és a nopalin szintetáz promoter DNS-einek szakaszai. A fúziós géntől 3’ irányban található a paradicsom I-es proteázinhibitorának génje valamint a nopalin szintetáz gén poli A régiója.

A kalluszt az I. példában leírtak alapján bombáztuk, azzal a különbséggel, hogy a volffám/DNS preparátumban használt DNS a pHYGIl és pMS533 plazmidokat tartalmazta. Egy cső csak öt pl TE puffért (10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0,1 mmol/1 EDTA) tartalmazott.

Az alábbi bombázási kísérleteket végeztük: 11 xpHYGIl/pMS533 (potenciális pozitív kezelés) és 3 χ TE preparátum (kontrollkezelés).

A bombázás után a pHYGIl/pMS533 kezelésekből származó kalluszt az 1-es szelekciós körbe tartozó lemezekre tesszük (F táptalaj, 15 mg/1 higromicintartalommal), lemezenként tíz darabot. Ugyanazt tesszük a két TE készítménnyel bombázott lemezzel (szelektált kontrollkallusz). Az egyik, TE preparátummal bombázott kalluszlemezt higromicint nem tartalmazó F táptalajra tesszük; ezt a kalluszt az egész kísérlet során fenntartjuk, mint a kontrollszövetek forrását (nem szelektált kontrollkallusz).

nap elteltével a kalluszt az 1-es kör szelekciós lemezéről a 2-es szelekció kör lemezeire (60 mg/1 higromicint tartalmaz) tesszük át, lemezenként 10 mg-os darabokban. 21 napig tartjuk a 2. szelekciós kör lemezein, ezalatt a kallusz teljesen gátlódott. Az összes kalluszt a 2-es kör szelekciós lemezeiről a 3-as kör szelekciós lemezeire vittük át, amelyek 60 mg/1 higromicint tartalmaztak.

A harmadik szelekciós kör lemezein tartottuk 42 napig, ezalatt hat szektor volt megfigyelhető, amelyek a környező nekrotikus szövet mellett szaporodtak, mindegyik a pHYGIl/pMS533-mal kezelt anyagból származott. A kalluszvonalakat F táptalajra tettük át.

nap elteltével egy kalluszvonal, jele CB2, mutatott lényeges növekedést. Az egyes kalluszvonalakból darabokat vittünk át i) 15 mg/1 higromicint tartalmazó F táptalajra, vagy ii) 60 mg/1 higromicint tartalmazó táptalajra. A kontrollkalluszt 15 mg/1 higromicint tartalmazó F táptalajra szélesztettük.

A hat kalluszvonal közül csak egy, a CB2 volt képes fenntartani a növekedést többszöri átoltás során is 60 mg/L higromicin jelenlétében. Ennek a kallusznak a darabjaiból DNS-t izoláltunk, és a Bt-gén jelenlétét Southem-blot-analízissel igazoltuk.

A DNS-t BamHI és Xhol restrikciós enzimek kombinációjával emésztettük. A BamHI a Bt kódoló szekvencia 5’ végén hasít, az Xhol a kódoló szekvencia 3’ végén hasít. Egy ³²P-vel jelzett próbát készítettünk az 1,8 kb méretű BamHI/XhoI pMS533 restrikciós fragmentből. A várt 1,8 kb méretű csíkot figyeltük meg hibridizálás és autoradiográfia után. Csík nem volt megfigyelhető a transzformálatlan kallusz DNS-ében.

A CB2-ből növényeket regeneráltunk, majd szabályozott beporzást végeztünk az RÍ generáció előállítására, az előzőkben leírt módon. Az RÍ növényeket megvizsgáltuk, hogy megtalálható-e bennük a HPT- és a Bt-gének szekvenciája PCR-elemzéssel, valamint enzimatikus méréssel megvizsgáltuk a HPT-gén expresszióját is, az I. példában leírtak alapján.

Az I. példában leírtak alapján PCR-elemzést végeztünk az RÍ utódok gyökérszövetéből izolált DNS-endonukleáz. Annak ellenőrzésére, hogy minden egyes DNS-minta alkalmas-e a PCR-vizsgálathoz, PCRelemzést végeztünk a kukorica természetes 10 kD-os zein génjére specifikus indítómolekulákkal. A Bt-gén PCR-elemzéséhez használt indítómolekulák a 35S promoterrel, illetve a Bt-t kódoló szekvenciával voltak komplementerek. A HPT PCR-elemzéséhez használt indítómolekulák ugyanazok, mint amelyeket az I. példában írtunk le. Ennek az elemzésnek az eredményei a 6. táblázatban láthatók. Az eredmények a bejuttatott HPT- és Bt-gének átadását mutatják mind a hímivarú, mind a nőivarú szülőkön keresztül, és a megfigyelt frekvenciák megegyeznek a mendeli frekvenciákkal. Az eredmények illeszkednek ahhoz a feltevéshez, hogy a HPT- és Bt-gének beépültek a kromoszomális DNS-be. Az is kiderült, hogy a HPT- és Bt-gének kapcsolt öröklődést mutatnak, jelezve, hogy a két gén szorosan egymás mellett, ugyanarra a kromoszómára épült be.

6. táblázat

A CB2 RÍ utódainak elemzése

A. Transzgenikus CB2.8XFR4326 Elemzés		Kontroll AB12.7XFR4326 Elemzés
Növény	lOkD PCR	HPT PCR	Bt PCR	HPT ENZ	Növény	lOkD PCR	HPT PCR	BT PCR	HPT ENZ
1	+	+	+	+		1	+	-	-	-
2	+	+	+	+		2	+	-	-	-
3	+	-	-	-
4	+	+	+	+
5	+	+	+	+

HU 220 773 Bl

6. táblázat (folytatás)

A. Transzgenikus CB2.8XFR4326 Elemzés		Kontroll AB12.7XFR4326 Elemzés
Növény	lOkD PCR	HPT PCR	Bt PCR	HPT ENZ	Növény	lOkD PCR	HPT PCR	BT PCR	HPT ENZ
6	+	-	-	-
7	+	+	+	+
8	+	-	-	-
9	+	+	+	+
10	+	-	-	-

B. Transzgenikus CB2.11xLB101 Elemzés		Kontroll AB12.4xLB101 Elemzés
Növény	lOkD PCR	HPT PCR	Bt PCR	HPT ENZ	Növény	lOkD PCR	HPT PCR	BT PCR	HPT ENZ
1	+	-	-	-		1	+	-	-	-
2	+	+	+	+		2	+	-	-	-
3	+	-	-
4	+	+	+	+
5	+	-	-	-
6	+		+	+
7	+	-	-	-
8	+	-	-	-
9	+	-	-	-
10	+	-	-	+

C. Transzgenikus CB2.7xLM1112 Elemzés		Kontroll AB12.5xLM1112 Elemzés
Növény	lOkD PCR	HPT PCR	Bt PCR	Növény	lOkD PCR	HPT PCR	BT PCR
1	+	-	-		1		-	-
2	+	+	+		2	+	-	-
3	+	-	-
4	+	-	-
5	+	+	+
6	+	+	+
7	+	+	+
8	+	+	+
9	+	-	-
10	+	-	-

HU 220 773 Bl

6. táblázat (folytatás)

HU 220 773 Β1

6. táblázat (folytatás)

F. Transzgenikus LM1112xCB2.2 Elemzés		Kontroll LM1112xAB12.6 Elemzés
Növény	lOkD PCR	HPT PCR	Bt PCR	Növény	lOkD PCR	HPT PCR	BT PCR
6	+	-	-
7	+	-	-
8	+	+	+

IV. példa

Termékeny transzgenikus növények az AB 12 kalluszvonalból, amelyek két teljes szexuális cikluson keresztül átadták a rekombináns DNS-t

I. Növényi vonalak és szövettenyészetek

Az AB 12 kalluszvonalat használtuk, amelyet a III. példában írtunk le.

II. Plazmidok

Az I. példában ismertetett pBII221 és pHYGIl plazmidokat használtuk.

III. DNS-beviteli módszerek

A kalluszt az I. példa szerint bombáztuk, azzal a különbséggel, hogy a volfrám/DNS preparátumokban használt DNS más volt. Az összes cső 25 μΐ 50 mg/ml koncentrációjú Μ-10-es volfrám vizes szuszpenzióját, 25 μΐ 2,5 mol/1 CaCl₂-ot és 10 μΐ 100 mmol/l spermidint tartalmazott összesen 5 μΐ 1 mg/ml összplazmidtartalommal. Egy cső csak a pBII221 plazmidot tartalmazta; két cső csak a pHYGIl plazmidot tartalmazta; és egy cső nem tartalmazott plazmidot, csak 5 μΐ TE puffért.

Az alábbi bombázásokat végeztük: 2xpBII221 preparátum (a tranziens expresszióhoz); 7 χ pHYGIl 1 preparátum (potenciális pozitív kezelés); és 3 χ TE preparátum (negatív kontrollkezelés).

Miután az összes bombázást elvégeztük, a pBII221 kezelésből származó kalluszt egy az egyben átvittük F táptalajra, 5 darab 50 mg-os darab formájában. Két nap elteltével a kallusz az I. példában leírtak alapján GUS vizsgáló pufferbe tettük. A tranziens expressziót mutató sejtek számát meghatároztuk (686, illetve 845 GUS pozitív sejt, jelezve, hogy a részecskebejuttatási eljárás lejátszódott a többi bombázott lemezen).

IV. A transzformált kallusz szelekciója

A bombázás után a pHYGIl kezelésből származó kalluszt az 1. szelekciós körbe tartozó lemezekre visszük (ez F táptalaj, 15 mg/ml higromicintartalommal), lemezenként 25 darabot. Ugyanezt elvégezzük a TE preparátummmal bombázott másik két lemezre is (szelektált kontrollkallusz). Egy olyan lemezt, amelyen a TE preparátummal bombázott kallusz található, higromicint nem tartalmazó F táptalajra tesszük; ezt a kalluszt az egész kísérlet során megtartjuk, mint a kontrollszövet forrását (nem szelektált kallusz).

nap elteltével az 1. szelekciós kör lemezem található kallusz nem különböztethető meg a nem szelektált kontrollkallusztól. Az 1. szelekciós kör lemezeiről származó összes kalluszt a 2. szelekciós kör lemezeire tesszük át, amelyek 60 mg/1 higromicint tartalmaznak. A lemezek száma körülbelül ötszörösére nőtt.

A 2. szelekciós kör lemezein a kallusz súlya lényegesen megnőtt 23 nap elteltével, de ekkor már közel nekrotikusnak tűnt. A 2. szelekciós körből származó összes kalluszt átvisszük a 3. szelekciós kör lemezeire, amelyek már 60 mg/1 higromicint tartalmaznak.

A bombázás után 58 nappal három élő szektor volt megfigyelhető, amely a környező elpusztult szövetek mellett szaporodott. Mind a három vonal a pHYGIl kezelésből származott, jelzésük 24C, 56A, illetve 55A.

Miután 15 napig fenntartó táptalajon tartottuk, a vonalak növekedése volt megfigyelhető. A 24C vonal jól nőtt, míg az 55A és 56A vonalak lassabban nőttek. Mind a három vonalat 60 mg/1 F táptalajra vittük át, amely 60 mg/1 higromicint tartalmaz. A fenntartó táptalajon levő nem szelektált kalluszból is vittünk át 60 mg/1 higromicint tartalmazó F táptalajra.

Miután 19 napot töltött 60 mg/1 higromicinen, a 24C vonal növekedése egyáltalán nem gátlódott, míg a kontroll a 24C vonal súlygyarapodásának csak 80%-át mutatta. Az 56C vonal teljesen nekrotikus volt, az 55A vonal pedig nagyon közel állt ahhoz, hogy nekrotikus legyen. A 24C és 55A sejtvonalakat ismét 60 mg/1 higromicint tartalmazó F táptalajra vittük át, csakúgy, mint a kontrollszövetet.

nap elteltével a 60 mg/ml higromicinen növekedő 24C vonal egyáltalán nem tűnt gátoltnak. Az 55A sejtvonal teljesen elpusztult, csakúgy, mint a második negatív kontrollkallusz, miután másodszor tettük 60 mg/1 higromicint tartalmazó F táptalajra.

V. A transzformált kallusz vizsgálata

Southem-blotot készítünk a 24C vonal BamHI restrikciós enzimmel emésztett DNS-éből, majd az I. példában leírtak alapján a HPT-próbával vizsgáltuk át. Amint az a 6. ábráról látható, a 24C-ben a várt 1,05 kb méretnél egy csíkot figyeltünk meg, és ez azt mutatja, hogy a 24C vonal tartalmazza a HPT-t kódoló szekven24

HU 220 773 BI ciát. A kontrollszövetben nem volt megfigyelhető ilyen csík. A 24C kalluszvonal a PH2 jelzést kapta ezek után.

Annak igazolására, hogy a higromicingén beépült a nagy molekulasúlyú DNS-be, a PH2 kalluszból és a kontrollkalluszból izolált DNS-t a következőképpen kezeltük:

(i) nincs restrikciós enzimes kezelés;

(ii) BamHI emésztés, az előzőkben leírt módon;

(iii) PstI emésztés, amivel a HPT-t kódoló szekvenciába egyszer belehasítunk a pHYGIl plazmidon.

A mintákat biotoljuk, majd a HPT-t kódoló szekvenciával vizsgáljuk meg, az előzőkben leírt módon.

Az emésztetlen PH2 DNS csak a hasítatlan DNS-nél mutatott hibridizálást a próba-DNS-hez, jelezve, hogy a higromicingén beépült a nagy molekulasúlyú DNS-be. A BamHI restrikciós enzimmel emésztett PH2 DNS-nél a várt 1,05 kb méretű csíkot kaptuk, amint azt már korábban jeleztük. A PstI restrikciós enzimmel emésztett PH2 DNS esetében egy 5,9 kb méretű csík várható, ha a higromicingén az érintetlen pHYGIl plazmidon található. Kettő vagy több, változó méretű csíkot (méretük függ attól, hogy a pozíciótól, amit a határoló PstI hasítási helyek foglalnak el a gazdaszervezet DNS-ében) várhatunk, ha a gén integrálódott a genomiális DNS-be. Két csíkot figyeltünk meg, amelyeknek hozzávetőleges molekulasúlya 6,0, illetve 3,0 körülbelül Ezek az adatok megegyeznek azzal, hogy a higromicingén integrálódott a nagy molekulasúlyú DNS-be. A kontrollkalluszból származó DNS-nél nem figyelhető meg hibridizáció, egyik fent említett kezelés után sem.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a HPT-t kódoló szekvencia nincs jelen a PH2 kalluszban érintetlen pHYGIl vagy egy kis nem kromoszomális plazmid formájában. Az eredmények arra utalnak, hogy a higromicingén beépült a nagy molekulasúlyú DNS-be. További Southem-blot-elemzésekkel ki lehet mutatni, hogy a HPT-t kódoló szekvencia egybefügg a 35S promoter szekvenciával.

VI. Növény regenerálása és magvak előállítása

A PH2 vonalat, a nem szelektált kontrollkallusszal együtt RM5 táptalajra tettük, hogy növényekké regeneráljuk, az I. példában leírtak alapján. 16 nap elteltével a kalluszt R5 táptalajra vittük át, az I. példában leírtak alapján. Miután 25 napig tartottuk R5 táptalajon, a hajtásokat R5 táptalajra vittük át, és 20 napig növesztettük. Ennél a pontnál a hajtásokat vermikulitra vittük át egy hétre, majd földbe ültettük át, ahol szexuális érettségig neveltük őket. A szabályozott beporzást a B73 beltenyésztett vonallal hajtottuk végre.

VII. Az RÍ utódok elemzése

A) A PH2 virágpor mint donor

A B73 χ PH2.6 keresztezésből származó tíz RÍ utódnövénynek vizsgáltuk a HPT expresszióját mind gyökérhosszabbítással, mind az elhervadt levelek expressziójának vizsgálatával. Egy pozitív növényt sikerült azonosítani. A HPT-gén jelenlétét a pozitív növényben

Southem-blot segítségével sikerült igazolni, a HPT-próba alkalmazásával, az I. példában leírtak alapján.

A gyökérhosszabbítási biológiai vizsgálat végrehajtásához a magvakat sterileztük. Kereskedelmi fehérítőszer 1:1 arányú vizes hígításával, amely még 0,1% Alconoxot is tartalmazott, 20 percig kezeltük a magvakat 125 ml-es Erlenmeyer-lombikban, majd háromszor öblítettük steril desztillált vízzel. A magvakat éjszakán át 50 mg/ml Captant tartalmazó steril vízzel duzzasztottuk, 150/perc fordulatszámmal rázatva.

A duzzasztás után az oldatot leöntjük, majd a magvakat lamináris boxokba visszük át (Flow Laboratories), amelyekben 3 lap desztillált vízzel átitatott csíráztatópapír van. Egy negyedik, vízzel telített csíráztatópapírt terítünk a magvakra. A magvakat négy napig hagyjuk csírázni.

Miután a magvak kicsíráztak, a mindegyik hajtás csíragyökeréből körülbelül 1 cm-t levágunk, majd egy olyan táptalajra tesszük, amelynek összetétele: MSsók, 20 g/1 szacharóz, 50 mg/1 higromicin, 0,25% Gelrite, és sötétben inkubáljuk 4 napig.

A gyökereket kiértékeljük, azon az alapon, hogy van-e rajtuk bőséges gyökérszőr és gyökérelágazás. A gyökereket transzgenikusnak minősítjük (higromicinrezisztens), ha rendelkeznek gyökérszőrökkel és gyökérelágazásokkal, illetve nem transzformáltnak (higromicin érzékeny), ha korlátozott számú elágazással rendelkeznek csak.

Miután a gyökerek csúcsát kivágtuk, az egyik PH2 kalász és az egyik kontrollkalász hajtásait nedves vermikulitra tesszük, és sötétben neveljük öt napig. Ennél a pontnál, az elhervadt levél vizsgálatának végrehajtásához 1 mm-es darabokat hasítunk ki a sziklevélhüvelyből, 10 másodpercig a felületén sterilezzük, majd a következő összetételű táptalajra helyezzük: MS alapsók, 20 g/1 szacharóz, 2,5 g/1 Gelrite, 0 (kontroll), illetve 100 mg/1 higromicint tartalmaz, s 18 óra hosszat sötétben inkubáljuk 26 °C-on. Mindegyik lemez dupla szekciót tartalmazott az egyes hajtásokból. A lemezeket azután világosban inkubáljuk (a világítás periódusa: 14 óra világos, 10 óra sötét) 48 óráig 26 °C-on, majd a levélszövetben található zöld színt a következő skála alapján értékeljük ki 0: minden barna; 6: minden zöld. A hajtásokat nem transzformáltnak (higromicinérzékeny) soroljuk be, ha a besorolásuk 0, és transzformáltnak soroljuk be (higromicinrezisztens), ha az értékük három vagy magasabb.

B) A PH2 mint virágpor-befogadó

80, PH2 növényből (PH 2.23 xB73 keresztezés) származó RÍ utódnövényt vizsgáltunk meg a gyökérhosszabbítási vizsgálatban, és ezek közül 26 bizonyult pozitívnak. A HPT-gén expresszióját továbbiakban azzal is igazoltuk, hogy Flow boxokban mind a 26 hajtást közvetlenül kitettük higromicint tartalmazó táptalajra. A rezisztens növények közül kettőt PCR-rel vizsgáltunk meg, és a HPT-szekvencia jelenlétét igazoltuk.

VIII. Az R2 utódok elemzése

Az RÍ transzgenikus növényeket, amelyeknél PH2 volt a szülői virágpor, érettségig neveljük, majd egy FR4326 növényt használtunk beporzásra.

HU 220 773 Bl

Az ebből a keresztezésből származó R2 magvakat kicsíráztattuk, és PCR-rel vizsgáltuk, hogy megvan-e bennük a HPT-szekvencia. A HPT-gén expresszióját a HPT-enzimatikus vizsgálattal határoztuk meg, az I. példában leírtak alapján.

A vizsgált 19 utód közül három tartalmazta a HPTgénszekvenciákat, és ugyanakkor expresszálta a HPTenzimet is. A többi sem a HPT-szekvenciát nem tartalmazta, sem enzimaktivitást nem mutatott. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a virágporral át lehet vinni és expresszáltatni lehet a genetikailag módosított DNS-t 2 egymást követő generációban is, azaz a gén stabil.

V. példa

A III. példában leírt morzsalékos, embriogén kukoricakallusztenyészetet használjuk.

A pCHNl-1 és pLUC-1 plazmidokat a pBS-ι- vektorban állítjuk elő (Stratagene, Inc., San Diego, CA), ami egy 3,2 kb méretű plazmid, standard rekombináns DNStechnika alkalmazásával. A pCHNl-1 tartalmazza az Escherichia coli higromicin B-foszfotranszferáz (HPT) kódoló szekvenciát (Gritz et al., 1983), amelyet a 3’ végen az Agrobacterium tumefaciens nopalin szintetáz (nos) poliadenilezési szekvencia határol (Chilton and Bames, 1983). Az expressziét a karfiol-mozaikvírus (CaMV) 35S promotere szabályozza (Guilley et al., 1982), amely a HPT-t kódoló szekvencia előtt helyezkedik el. Ebben a példában a pBII221 és pHYGIl plazmidokat is használjuk.

A pLUC-1 a szentjánosbogár-luciferázt kódoló szekvenciát tartalmaz (DeWet et al., 1987), amelyet az 5’ végen a CaMV 35S promoter, a 3’ végen a nos poliadenilezési szignál határol. Ezt a plazmidot kizárólag mint negatív kontroll-DNS-t használjuk. A plazmidokat mikrorészecske-bombázással juttatjuk be az AB12-be. Az

I. példában leírtak alapján 21 lemezt készítünk. Az egyik cső csak a pBII221 plazmidot tartalmazza; két cső mind a pH YGl 1 mind a pBII221 plazmidot tartalmazza; két cső mind a pCHNl-1 mind a pBII221 plazmidot tartalmazza; egy cső csak a pLUC-1 plazmidot tartalmazza. Az elvégzett bombázási kísérleteket a 7. táblázatban foglaljuk össze.

7. táblázat

2xpBII221 preparátum	A tranziens expresszió frekvenciájának meghatározására
10xpHYGIl/pBII221	Potenciális pozitív kezelés a transzformációhoz
10xpCHNl-l/pBII221	Potenciális pozitív kezelés a transzformációhoz
4 χ pLUC-1	Negatív kontrollkezelés

A két, pBII221 plazmiddal bombázott kallusz lemezén vizsgáltuk a tranziens GUS-expressziót. Meghatároztuk a kék sejtek számát, és megállapítottuk, hogy 291 és 477 tranziens GUS-t expresszáló sejt található a két lemezen, jelezve, hogy a DNS-bejuttatási folyamat lejátszódott a többi bombázott lemezen is.

Közvetlenül azután, hogy az összes mintát bombáztuk, az összes, pHYGIl/pBII221, pCHNl-l/pBII221 kezelésnek alávetett lemezről származó kalluszt, valamint a pLUC-l-gyel kezelt lemezek közül háromról a kalluszt az 1. szelekciós kör lemezeire (F táptalaj, amelyben 15 mg/1 higromicin B van) visszük át (öt kalluszdarab lemezenként). A pLUC-l-gyel kezelt, negyedik lemezről a kalluszt higromicint nem tartalmazó F táptalajra visszük át. Ezt a szövetet minden 2-3 hétben nem szelektív táptalajra visszük át, és ezt tekintjük nem szelektált kontrollkallusznak.

A szelekció után két héttel mind a kontroll, mind a nem szelektív táptalajon a szövetek lényegében azonosnak látszottak. A pHYGIl/pBII221 és a pCHNll/pBII221 kezelések nyolc-nyolc lemezéről, valamint a szelektív táptalajon tartott kontrollkallusz két lemezéről az összes kalluszt az 1. szelekciós kör lemezeiről a

2. szelekciós kör lemezeire vittük át, amelyek 60 mg/1 higromicint tartalmaztak. A 2. szelekciós kör lemezei lemezenként tíz db 30 mg-os kalluszt tartalmazta, ennek következtében a lemezek összmennyisége megnőtt.

A szelektív táptalajokon megmaradt szövetet - kétkét lemez a pHYGIl/pBII221 és a pCHNl-l/pBII221 kezelésnek alávetett szövetekből és egy a kontrollkalluszból - GUS vizsgáló pufferbe helyeztük 37 °C-on, abból a célból, hogy meghatározzuk, vajon a sejtek kék csomói megfigyelhetők-e a bombázás után két héttel. Miután 6 napot tartottuk a vizsgálópufferben, a szövetben kiértékeltük a GUS-expressziót. Az eredményeket a 8. táblázatban foglaljuk össze.

8. táblázat

Kezelés	Replikáció	Megfigyelések
pLUC-1		Nincsenek kék sejtek
pHYGIl/pBII221	1-es lemez	11 egyedi sejt, egy négysejtes csomó
	2-es lemez	5 egyedi sejt
pCHNl-l/pBII221	1-es lemez	1 egyedi sejt, két kétsejtes csomó
	2-es lemez	5 egyedi sejt, 1 kétsejtes csomó, és 2, 8-10 sejtből álló csomó

A 2-es szelekciós lemezen töltött 21 nap elteltével az anyag összes életképes részét a 3. szelekciós kör lemezeire vittük át, amelyek 60 mg/1 higromicint tartalmaznak. A 2. szelekciós kör azon lemezeit, amelyek látszólag elpusztult sejteket tartalmaztak, megőriztük. Mind a 2. mind a 3. szelekciós kör lemezeit periodikusan megfigyeltük, van-e rajtuk szaporodó szektor.

A 3. szelekciós kör lemezein töltött 35 nap elteltével mind a 2. szelekciós kör, mind a 3. szelekciós kör lemezeit átvizsgáltuk, van-e rajtuk életképes kalluszszektor. Két ilyen szektor volt megfigyelhető, amelyek a pHYGIl/pBII221 kezelésnek alávetett lemezeken

HU 220 773 Bl levő elpusztult sejteken mint háttéren növekedtek. Az első, 3AA jelzéssel ellátott szektor a lemezek 3. csoportjából származott, míg a második, PH1 jelű szektor a lemezek 2. csoportjából származott. Mindkét vonalat F táptalajra vittük át, amely nem tartalmazott higromicint.

nap elteltével a 3AA vonal nagyon gyengén nőtt a higromicint nem tartalmazó F táptalajon, míg a PH1 vonal gyorsan nőtt. Mindkettőt átoltottuk F táptalajra, és 9 napig ott tartottuk. A 3AA és PH1 vonalakat ezután 15 mg/1 higromicint tartalmazó F táptalajra tettük át, és 14 napig tartottuk ott. Ennél a pontnál a 3AA vonalról megfigyelhető volt, hogy nagyon gyengén és lassan nőtt. A PH1 vonal azonban gyorsan nőtt a 15 mg/1 higromicint tartalmazó F táptalajon; a vonalat ezután higromicint nem tartalmazó F táptalajra tettük át.

Az F táptalajon töltött 10 nap elteltével a PH1 vonal gátlási vizsgálatát indítottuk el. A PH1 kalluszt 1, 10, 30,100 és 250 mg/1 higromicin B-t tartalmazó F táptalajra tettük át. Mindegyik koncentrációból öt kallusz lemezt készítettünk, és mindegyik lemez körülbelül 50 mg-os kalluszdarabot tartalmazott. A nem szelektált kontrollszövetből egy-egy lemezt készítettünk mindegyik higromicinkoncentrációhoz.

Azt figyeltük meg, hogy a PH1 vonal képes volt növekedni 9 átoltás után is 0, 10, 30, 100 és 250 mg/1 higromicinen.

További szektorokat izoláltunk különböző időpontokban a 2. és 3. szelekciós kör lemezeiről. Ezek közül egyik sem volt képes növekedni több átoltást (kéthárom átoltás) követően higromicin jelenlétében.

Annak igazolására, hogy a PH1 kallusz megszerezte a higromicinrezisztencia-gént, a PH1 kallusznak egy Southem-blotját készítettük el, oly módon hogy a PH1ből és a nem szelektált kontrollkalluszokból DNS-t izoláltunk, a következő eljárással: 2 g kalluszt lefagyasztottunk folyékony nitrogénben majd finom porrá törtük, a port egy 30 ml-es Oak Ridge csőbe tettük át, amely 6 ml extrakciós puffért tartalmazott (7 mol/1 karbamid, 250 mmol/1 NaCl, 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0,20 mmol/1 EDTA pH=9,0,1% szarkozin). Ehhez adtuk fenol:kloroform 1:1 arányú elegyét, a csöveket összeráztuk és 15 percig 37 °C-on inkubáltuk. A mintákat 8000/perc fordulatszámmal centrifugáltuk 10 percig 4 °C-on. A felülúszót miraclothon (speciális, gézszerű szűrőanyag, Calbiochem 475855) pipettáztuk át egyszer használatos 15 ml-es csőbe (American Scientific Products, C3920-15A), amely 1 ml 4,4 mol/1 ammónium-acetátot tartalmaz (pH=5,2). 6 ml izopropanolt adtunk hozzá, a csöveket összeráztuk, majd a mintákat 15 percig inkubáltuk -20 °C-on. A DNS-t Beckman TJ-6 centrifugában ülepítjük maximális fordulatszámmal, 4 °C-on. A felülúszót elöntjük, majd az üledéket 500 μΐ TE-10-ben oldjuk (10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0, 10 mmol/1 EDTA pH=8,0), és 15 percig szobahőmérsékleten tartjuk. A mintákat azután 1,5 ml-es Eppendorf-csövekbe tesszük át, és 100 μΐ 4,4 mol/1 ammónium-acetátot (pH=5,2) és 700 μΐ izopropanolt adtunk hozzá. Ezt 15 percig -20 °C-on inkubáltuk, majd a DNS-t 5 percig Eppendorf mikrocentrifugában ülepítettük (12 000/perc). Az üledéket 70%-os etanollal mostuk, majd TE-1 pufferben (10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0,1 mmol EDTA), szuszpendáltuk.

pg izolált emésztettük BamHI restrikciós enzimmel, majd az I. példában leírtak alapján a HPT-próbával vizsgáltuk át. Amint az a 3. ábráról látható, a PH1 kalluszban a várt 1,05 kb méretnél egy csíkot figyeltünk meg, és ez azt mutatja, hogy a 24C vonal tartalmazza a HPT-t kódoló szekvenciát. A kontrollkalluszban nem volt megfigyelhető ilyen csík.

Annak igazolására, hogy a higromicingén beépült a nagy molekulasúlyú DNS-be, a PH1 kalluszból és a kontrollkalluszból izolált DNS-t a következőképpen kezeltük:

(i) nincs restrikciós enzimes kezelés;

(ii) BamHI emésztés, az előzőkben leírt módon;

(iii) PstI emésztés, amivel a HPT-t kódoló szekvenciába egyszer belehasítunk a pHYGIl plazmidon.

A mintákat biotoljuk, majd a HPT-t kódoló szekvenciával vizsgáljuk meg, az előzőkben leírt módon.

Az emésztetlen PH1 DNS csak a hasítatlan DNS-nél mutatott hibridizálást a próba-DNS-hez, jelezve, hogy a higromicingén beépült a nagy molekulasúlyú DNS-be. A BamHI restrikciós enzimmel emésztett PH1 DNS-nél a várt 1,05 kb méretű csíkot kaptuk, amint azt már korábban jeleztük. A PstI restrikciós enzimmel emésztett PH1 DNS esetében egy 5,9 kb méretű csík várható, ha a higromicingén az érintetlen pHYGIl plazmidon található. Kettő vagy több, változó méretű csíkot (méretük függ attól a pozíciótól, amit a határoló PstI hasítási helyek foglalnak el a gazdaszervezet DNS-ében) várhatunk, ha a gén integrálódott a genomiális DNS-be. Három csíkot figyeltünk meg, amelyeknek hozzávetőleges molekulasúlya 12, 5,1, illetve 4,9 körülbelül Ezek az adatok megegyeznek azzal, hogy a higromicingén integrálódott a nagy molekulasúlyú DNS-be. A 4,9 kb méretű csík intenzitása körülbelül duplája a másik két csík intenzitásának, jelezve, hogy vagy részleges emésztés történt, vagy a HPT-gén kétszer egymás után beépült a kromoszómába. A kontrollkalluszban a fenti kezelésekkel nem volt megfigyelhető hibridizálás.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a HPT kódoló szekvencia a PH1 kalluszban nem intakt pHYGIl plazmid vagy kis, nem kromoszomális plazmid formájában van jelen. Ez megegyezik azzal a feltételezéssel, hogy a higromicingén beépült a nagy molekulasúlyú DNS-be. A Southem-blot-elemzések igazolták továbbá, hogy a HPT kódoló szekvencia egybefügg a 35S promoter szekvenciával.

Az inhibíciós vizsgálatban használt összes higromicinkoncentrációról a PH1 kalluszt RM5 táptalajra visszük át, és az I. példában leírtak alapján regeneráljuk. A PH1 kalluszból összesen 65 növényt kaptunk, míg a kontrollkalluszból összesen 30 növényt kaptunk.

Annak igazolására, hogy a bejuttatott DNS-t az R0 növények megtartották a szöveteikben, Southemblotot végeztünk az előzőkben leirt módon, a PH1 három véletlenszerűen kiválasztott R0 növényének BamHI restrikciós enzimmel emésztett levél DNS-én. A blotot a HPT-próbával vizsgáltuk át, az 1. példában leírtak alap27

HU 220 773 BI ján. Amint az a 4. ábrán látható, mind a három növénynél egy 1,05 kb méretű csík figyelhető meg, jelezve, hogy a HPT-t kódoló szekvencia jelen van. Egy kontrolinövényből izolált DNS esetében nem volt csík megfigyelhető.

Az érett PH1 növények szabályozott beporzását standard módszerekkel végeztük, beltenyésztett A188, B73 és Oh43 Zea znayj-vonalakkal. A magvakat a beporzás után 45 nappal gyűjtöttük be, majd további 12 hétig hagytuk száradni.

Az higromicinrezisztencia tulajdonság jelenlétét az Rl utódokban gyökérhosszabbodási vizsgálattal, elhervadt levél vizsgálatával, majd Southem-blottal értékeltük. Az analízishez a regenerált PH1 növényből és a kontrollnövényből is két-két kalászt választottunk ki. Mindegyik kalásznál az A188 beltenyésztett vonal volt a virágpor donor. Az eredmények az 5. ábrán, valamint az alábbi 9. táblázaton láthatók.

A PH1 anyai szülőből származó két R2 utódban a

HPT-gén jelenlétét megerősítettük.

9. táblázat

A PH1 Rl növények elemzése

PH1 növény	Gyökér- vizsgálat	Levél- vizsgálat	Biot	Cont. növény	Gyökér- vizsgálat	Levél vizsgálat	Biot
3.1	+	ND	+	4.1	-	ND	ND
3.2	-	ND	-	4.2	-	ND	ND
3.3	-	ND	-	4.3	-	ND	ND
3.4	-	ND	-	4.4	-	ND	ND
3.5	-	ND	-	4.5	-	ND	ND
3.6	+	ND	+	4.6	-	ND	ND
3.7	-	ND	-	4.7 2.1	-	ND ND	ND
10.1	+	+	+	1.1	-	-	-
10.2	+	+	+	1.2	-	-	ND
10.3	-	-	ND	1.3	-	-	ND
10.4	-	-	-	1.4	-	-	ND
10.5	-	-	-	1.5	-	-	ND

9. táblázat (folyt.)

A PH1 Rl növények elemzése

PH1 növény	Gyökér- vizsgálat	Levél- vizsgálat	Biot	Cont. növény	Gyökér- vizsgálat	Levél- vizsgálat	Biot
10.6	-	-	-	1.6	-	-	ND
10.7	-	-	-	1.7	-	-	ND
10.8	ND	+	+	1.8	-	-	ND

Magyarázat: += transzgenikus; - =nemtranszgenikus; ND=nincs kísérlet

A PH 1.3.1 növényt (lásd 9. táblázat) Oh43 virágporral poroztuk be. Az ebből a keresztezésből származó kilenc magvat kicsíráztattuk, négy utódnövénynek a leveleiből DNS-t izoláltunk, és Southem-blottal analizáltuk, a HPT-t kódoló gént használva próbaként. A vizsgált négy növény közül kettő nagy kópiaszámban tartalmazta a HPT-t kódoló szekvenciát. Jóllehet a HPT-gén két növényben jelen volt, mégsem lehetett a gén expresszióját kimutatni a hervadt levél biológiai vizsgá- 55 latával.

A PH1.10.8 növényt (9. táblázat) használtuk a B73 beporzására, valamint önbeporzást is végeztünk.

A másik partnerrel végzett keresztezés utódaiból ötvenet vizsgáltunk le mind gyökér-, mind levélelemzéssel, 60 hogy expresszálja-e a HPT-t. Expresszió nem volt kimutatható. Hasonlóképpen, nyolc utódnak a DNS-ét Southem-blottal megvizsgálva nem lehetett a HPT-gén 50 jelenlétét kimutatni. Az önbeporzásból származó utódoknál kilenc utód levelében nem lehetett kimutatni a gén jelenlétét, illetve Southem-blottal sem, ezek közül négy növényben.

A rekombináns DNS-ről kimutattuk, hogy az utódok csak akkor öröklik, ha a transzgenikus növényt (mind az RO-át, mind az Rl-et) használtuk nőivarú szülőként. Ez azt sugallja, hogy a PH1 rekombináns DNS anyai úton öröklődik át.

Az összes idézett publikációt és szabadalmi dokumentumot referenciaként idéztük. A találmányt külön28

HU 220 773 Bl böző specifikus és előnyös megvalósítási módra való hivatkozással írtuk le. Az azonban nyilvánvaló, hogy számos módosítás tehető anélkül, hogy eltérnénk a találmány szellemétől és oltalmi körétől.

Claims (25)

1. Eljárás termékeny, transzgenikus Zea maysnövény előállítására, azzal jellemezve, hogy a Zea mays-növény genomjához érintetlen, regenerálható Zea mays-sejtek mikrorészecske-bombázásával DHDP-szintázt vagy mag-tartalékfehéijéjét kódoló, izolált, heterológ DNS-konstrukciót adunk hozzá, és szelektáljuk azokat a transzgenikus növényeket és/vagy adott esetben bármely generációba tartozó utódnövényeiket, amelyekben a DNS-konstrukció expresszálódása következtében a transzgenikus növény egy vagy több olyan fenotípusos jellemzőt mutat, amely lehetővé teszi azonosítását a megfelelő nemtranszformált, tehát a DNS-konstrukciót nem tartalmazó növénnyel szemben, és a DNS-konstrukció a transzgenikus Zea mays-növény teljes normális szexuális ciklusán keresztül továbbadódik a következő generációnak.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy heterológ DNS-konstrukcióként promotert is tartalmazó DNS-konstrukciót alkalmazunk.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy heterológ DNS-konstrukcióként körülbelül 30 kilobázisnál rövidebb DNS-konstrukciót alkalmazunk.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-konstrukciót az alábbi Zea mays-növények bármelyikének genomjához adjuk hozzá: takarmánykukorica („field com”), pattogatni való kukorica („popcom”), csemegekukorica („sweet com”), keménymagvú kukorica („fiint com”) vagy lófogú kukorica („dent com”).

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy heterológ DNS-konstrukcióként növényből izolált vagy onnan származó DNS-t nem tartalmazó heterológ DNS-konstrukciót alkalmazunk.

6. Az 1-5. igénypont szerinti eljárások bármelyike, azzal jellemezve, hogy a heterológ DNS-konstrukciót expresszáló, a fenotípusos jellemzőket mutató bármely generációba tartozó utódnövényt állítunk elő.

7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a Zea mays-növény genomjához egy, promotert és Zea mays magjának tartalékfehérjéjét a promoter által irányítottan kódoló régiót tartalmazó, izolált heterológ DNS-konstrukciót adunk, és a DNSkonstrukció által kódolt magi tartalékfehérje expresszáltatásával egy magi tartalékfehérje aminosavmennyiségét a transzgenikus növények magvaiban jelentősen megnöveljük olyan Zea mays-növényi magvakban meglevő mennyiséghez képest, amelyek csupán a DNSkonstrukció hiányában különböznek a transzgenikus Zea mays-növényék. magvaitól.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mag tartalékfehérjéjeként a 10 kD méretű zein fehérjét alkalmazzuk, amelynek expresszáltatásával a növény teljes magbeli metioninszintjét számottevően megnöveljük a transzgenikus Zea mays-növényiöi csupán a DNS-konstrukció hiányában különböző, megfelelő Zea mays-növény magbeli metioninszintjéhez képest.

9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy előre kiválasztott DNS-konstrukcióként szelekciós markergént vagy riportergént tartalmazó és azt expresszálni képes DNS-konstrukciót alkalmazunk.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-konstrukcióként az alábbi vegyületek bármelyike ellen rezisztenciát vagy toleranciát biztosító szelekciós markergént tartalmazó DNS-konstrukciót alkalmazunk: kanamicin, G418, 2,2-diklórpropionsav, neomicin, „sethoxydim”, „haloxyfop”, foszfotricin, glifozát, metotrexát, imidazolinon-herbicidek, szulfonilkarbamid-herbicidek, triazolopirimidin-herbicidek, s-triazin-herbicidek és bromoxinil.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelekciós markergénként hygromicin ellen rezisztenciát vagy toleranciát biztosító markergént alkalmazunk.

12. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy előre kiválasztott DNS-konstrukcióként riportergént tartalmazó és azt expresszálni képes DNS-konstrukciót alkalmazunk.

13. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként Zea mays-növényből izolált promotert alkalmazunk.

14. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy előre kiválasztott DNS-konstrukcióként kiméra DNS-konstrukciót alkalmazunk.

15. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aminosavként metionin aminosavszintjét növeljük meg.

16. Eljárás transzgenikus Zea mays utódnövény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított növénynek egy másik Zea maysnövénnyel való keresztezése útján egy, a DNS-konstrukciót expresszáló transzgenikus Zea mays utódnövényt állítunk elő.

17. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termékeny, transzgenikus Zea mays-növényi transzformált embriogén szövetből regeneráljuk.

18. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy éretlen embriókból származó sejteket bombázunk.

19. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy morzsalékos embriogén kalluszból származó sejteket bombázunk.

20. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bármely generációba tartozó utódot a termékeny, transzgenikus növénynek egy beltenyésztett vonallal végzett keresztezésével állítjuk elő.

21. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bármely generációba tartozó utódnövényből magokat nyerünk és a magból a DNS-t tartalmazó újabb utódnövényeket állítunk elő.

22. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bármely generációba tartozó utódot a bel29

HU 220 773 Β1 tenyésztett vonallal visszakeresztezzük, amivel újabb, a DNS-t tartalmazó, bármely generációba tartozó utódot állítunk elő.

23. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az újabb utódnövényből mago/ka/t nyerünk 5 és a mag/ok/ból a DNS-t tartalmazó növényt nevelünk.

24. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az újabb utódnövényt a beltenyésztett vonallal visszakeresztezzük, amivel a DNS-t tartalmazó bármely generációba tartozó utódot állítunk elő.

25. Az 1-24. igénypontok szerinti eljárások bármelyike, azzal jellemezve, hogy bármely generációba tartó zó utódnövényt állítunk elő.