CN106795515B - 用于经由rna干扰调控基因表达的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于经由RNA介导的沉默调控基因表达的组合物和方法。本公开还提供了优化将dsRNA分子加工成小RNA双链体的组合物和方法。本公开还提供了改善dsRNA分子在产生期望的小RNA和促进目标基因的沉默方面的效率的组合物和方法。

Description

用于经由RNA干扰调控基因表达的组合物和方法

序列表的并入

本申请含有经由EFS网络以电子方式与本说明书一起提交的序列表的电子等效纸件副本以及经由EFS网络以电子方式与本说明书一起提交的序列表的计算机可读形式，并且含有名为“P34087US01_SEQ.txt”的文件，并且据此全文以引用方式并入。

技术领域

本公开提供了用于经由RNA介导的沉默调控基因表达的组合物和方法。本公开还提供了优化将dsRNA分子定向加工成小RNA(sRNA)双链体的组合物和方法。

背景技术

非转基因产生的外源核酸分子，例如双链RNA(dsRNA)分子，已经表现为在将植物内源性基因局部施加于植物叶片之后或通过用含有所述核酸分子的溶液浸泡种子来触发植物内源性基因的沉默。参见美国专利公开No.2011/0296556和2013/0318657(两者全文以引用方式并入)。因此，可以通过向植物或种子中引入特异性调控负责植物性状的基因的表达的dsRNA分子来修饰那些性状。

RNA介导的序列特异性基因调控，也称为RNA干扰(RNAi)，以包含与目标基因的序列互补的RNA链的dsRNA开始。然后用RNA酶III相关酶(Dicer)将dsRNA分子加工成约21-24个核苷酸的较短片段。这些片段，称为小干扰RNA(siRNA)，结合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。在附加处理后，将siRNA转化为单链RNA，所述单链RNA充当引导序列以识别和指导对靶基因转录物的切割。

植物细胞可产生dsRNA。据报道番茄RNA依赖性RNA聚合酶(RDR)已产生在两个末端具有1-nt或2-nt的3′-悬垂的dsRNA。参见Schiebel等人，J.Biol.Chem.263：11858-67(1993)；Rajeswaran等人，Nucleic Acid Res.，40(13)：6241-54(2012)。期望按照可预测和预程序化的模式将dsRNA加工成siRNA，并且最终加工成单链RNA。本申请尤其提供并公开了并入到dsRNA分子中以改善将dsRNA加工成siRNA的可预测性的序列和结构特征，所述siRNA的功能是引导预定靶基因的沉默。因此，本申请提供了在促进基因调控和性状修饰方面具有更高效力的核酸分子。

发明简述

本公开提供了用于调控基因表达的组合物和方法。在一方面，本公开提供用于植物中RNAi介导的沉默的外源性触发分子。

在一方面，本公开提供了双链RNA(dsRNA)分子，所述双链RNA(dsRNA)分子包含：a).第一链，其包含与靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸基本上相同的核苷酸序列；和b).第二链，其在5′至3′方向上包含5′-悬垂，与所述第一链基本互补的核苷酸序列，以及2个核苷酸的3′-悬垂，其中所述5′-悬垂为至少5个核苷酸长。

在另一方面，本公开提供了dsRNA分子，其包含：a).第一链，其在5′至3′方向上包含i).第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列与第一靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸相同；ii).第二核苷酸序列，其包含2个或更多个A；和iii).第三核苷酸序列，其与第二靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸或第一靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸相同；和b).第二链，其在5′至3′方向上包含5个核苷酸的5′-悬垂，与所述第一链互补的核苷酸序列，以及2个核苷酸的3′-悬垂。在一些实施方案中，第一靶核苷酸序列和第二靶核苷酸序列是相同的。

在另一方面，本公开还提供了包含本文公开的dsRNA分子的组合物。在另一方面，本公开提供了包含本文公开的dsRNA分子的植物、植物部分或种子，其中所述dsRNA分子对所述植物、植物部分或种子来说是外源的。

在一方面，本公开提供了一种调控至少一种靶基因的表达的方法，所述方法包括将包含本文所公开的dsRNA分子的组合物施加于植物或植物部分的表面，其中所述dsRNA分子包含第一链，所述第一链包含与靶基因的至少18个连续核苷酸基本上相同的核苷酸序列。

在另一方面，本公开还提供了一种提高dsRNA分子在植物、植物部分或种子中产生所需小RNA方面的效率的方法，所述方法包括向植物、植物部分或种子提供本文所公开的dsRNA分子，其中21-24个核苷酸的小RNA的产生定向偏向dsRNA分子的第二链的3′端。

在一方面，本公开提供了dsRNA分子，其中将dsRNA分子群体加工成一个或多个21-24聚体小RNA(sRNA)优先从具有3′悬垂的末端开始，并且其中由其加工成的可检测到的21-24聚体sRNA的至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％包含与紧邻3′悬垂的至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个核苷酸的第一双链部分的序列相同的序列。

在一方面，本公开提供了dsRNA分子，其中在距3′悬垂的3′末端约21至24个核苷酸的位置处用Dicer样蛋白质第一次切割dsRNA分子，并且其中由所述dsRNA分子群体加工成的可检测到的21-24聚体sRNA的至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％包含与紧邻3′悬垂的至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个核苷酸的第一双链部分的序列相同的序列。

在一方面，本公开提供了dsRNA分子，其中将dsRNA分子群体加工成一个或多个21-24聚体小RNA(sRNA)优先从dsRNA分子的一个末端开始，并且其中由所述dsRNA分子群体加工成的最丰富的可检测到的21-24聚体sRNA包含与紧邻3′悬垂的至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个核苷酸的第一双链部分的序列相同的序列。在另一方面，从如本文所公开的dsRNA分子群体加工成的第二大最丰富的可检测到的21-24聚体sRNA包含与紧邻第一双链部分的序列相同的序列。

在一方面，本公开提供了在dsRNA分子的第一末端包含5′悬垂的dsRNA分子，其中将dsRNA分子加工成一个或多个sRNA优先从dsRNA分子的第二末端开始，并且其中所述第一末端和所述第二末端是dsRNA分子的相对末端。

在一方面，本公开的dsRNA分子或定向触发剂包含：包含3′悬垂的第一末端部分，包含5′悬垂的第二末端部分，以及两个或更多个靶特异性序列，所述两个或更多个靶特异性序列通过一个或多个接头序列邻接。

在一方面，本公开提供了定向触发剂，所述定向触发剂包含当用Dicer样蛋白加工成sRNA时具有优先定向性的外源dsRNA分子。在一方面，本公开的定向触发剂包含3′悬垂。在一些实施方案中，3′悬垂为至少2个核苷酸长。在一些实施方案中，3′悬垂具有序列UA、UU、AA、AU、UG或UC。在另一方面，本公开的定向触发剂包含5′悬垂。在一些实施方案中，5′悬垂具有高GC含量。在一些实施方案中，5′悬垂是2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个核苷酸长。在一些实施方案中，5′悬垂为至少5个核苷酸长。在另一方面，定向触发剂具有在同一链上的3′悬垂和5′悬垂。在另一方面，定向触发剂具有在反义链上的3′悬垂和5′悬垂。在另一方面，定向触发剂具有在有义链上的5′G。

在另一方面，本公开提供了包含本文公开的dsRNA分子的植物、植物部分或种子，其中所述dsRNA分子对所述植物、植物部分或种子来说是外源的。

在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂具有用于产生sRNA的预程序化的加工模式，其中sRNA加工从包含3′悬垂的末端开始，并用约21个核苷酸相以定相方式继续。在另一方面，定向触发剂能够通过优先使一个或多个sRNA双链体的反义链作为引导链来产生具有链选择性的一个或多个sRNA双链体。在一些方面，用如本文所公开的定向触发剂产生的至少一种sRNA双链体在其反义链的5′端包含一个尿嘧啶或尿嘧啶-尿嘧啶二核苷酸。

在一方面，本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂是包含两个或更多个靶特异性序列的嵌合体，当用Dicer样蛋白切割定向触发剂时，所述两个或更多个靶特异性序列产生相同数目的sRNA，其中每一sRNA数目对应一个靶特异性序列。在一方面，两个或更多个靶特异性序列在定向触发剂中彼此紧邻。在一方面，两个或更多个靶特异性序列在定向触发剂中不相邻。在一方面，两个或更多个靶特异性序列在定向触发剂中是不连续的。在一方面，定向触发剂的两个或更多个靶特异性序列来自两种或更多种不同的基因。在另一方面，定向触发剂中的两个或更多个靶特异性序列来源于相同基因但在该基因中不连续。在另一方面，定向触发剂的两个或更多个靶特异性序列具有基本上相同的序列。在另一方面，定向触发剂还包含邻接两个或更多个靶特异性序列的一个或多个富AU的接头序列。

在一方面，由如本文所公开的定向触发剂加工成的sRNA的至少50％来自定向触发剂的反义链的3′端。在另一方面，由如本文所公开的定向触发剂加工成的sRNA的至少50％包含来自定向触发剂的反义链的3′端的序列。

在一方面，如本文所公开的定向触发剂不是来自病毒载体。在另一方面，如本文所公开的定向触发剂不是从天然病毒感染产生的。

在一方面，如本文所公开的定向触发剂是化学合成或酶促产生的。在另一方面，如本文所公开的定向触发剂是经化学修饰的。在一方面，对定向触发剂的化学修饰能够增强分子到植物细胞中的递送或分子在植物细胞中的稳定性。在另一方面，对定向触发剂的化学修饰选自由胆固醇部分和经修饰的核苷酸组成的组。

在一方面，如本文所公开的定向触发剂能够通过选自由以下项组成的组的机制来调控基因表达：RNA切割、翻译或转录衰减以及DNA修饰。

在一方面，如本文所公开的定向触发剂包含来自一种或多种靶基因的一个或多个靶特异性序列，所述靶基因选自由以下项组成的组：内源性植物基因，转基因，植物有害生物或病原体的必需基因，提供除草剂抗性的植物基因，以及涉及非生物或生物胁迫耐受性的植物基因。

在一方面，本公开提供了双链RNA(dsRNA)分子，所述双链RNA分子包含a)编码相同数目的sRNA的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列在单个天然存在的分子中不存在，或在单个天然存在的分子中不连续，b)约45与约75个核苷酸之间的长度，c)一个或多个富含腺嘌呤或尿嘧啶的接头序列，所述接头序列邻接所述两个或多个sRNA触发序列，d)dsRNA分子的反义链中的3′悬垂，e)所述反义链中位置20、21处的尿嘧啶，所述位置20和21分别是相对于3′悬垂的末端的第20个和第21个核苷酸，以及f)3至5个核苷酸的5′悬垂。

在一方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含如本文所公开的定向触发剂，以及促进定向触发剂从植物表面转移到植物细胞中的转移剂。在一方面，如本文所公开的组合物包含转移剂，所述转移剂选自由表面活性剂和盐类组成的组。在一方面，本公开的转移剂包含湿润剂或螯合剂。

在一方面，如本文所公开的组合物包含定向触发剂和有机硅表面活性剂。在另一方面，如本文所公开的组合物包含定向触发剂和硅氧烷聚醚共聚物。在一方面，如本文公开的组合物包含定向触发剂和有机或无机盐类。

在另一方面，本公开提供用包含如本文所公开的定向触发剂和转移剂的组合物处理过的植物或种子。在另一方面，本公开提供了包含如本文所公开的定向触发剂的植物、植物部分或种子。

在另一方面，本公开提供了一种将定向触发剂或由其制成的组合物施加于植物、植物部分或种子以赋予有益性状的方法。

附图说明

图1A-1C：不受任何特定理论的限制，dsRNA分子上的悬垂影响分子的加工和分子促进基因沉默的能力。图1A示出了六种dsRNA触发剂，其中每种dsRNA触发剂包含具有不同长度悬垂的约50个核苷酸的两条链。这些dsRNA触发剂靶向番茄(tomato)(番茄(Solanumlycopersicum)，S1)5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因。触发剂1具有平末端。触发剂2在两个末端上具有2个碱基的3′悬垂。触发剂3至6分别在每一末端上具有2个碱基、5个碱基、10个碱基和15个碱基的5′悬垂。所有触发剂都用P32进行了5′端标记。图1B示出了在小麦胚芽提取物(WGE)中孵育2小时后对触发剂1至6的加工的变性聚丙烯酰胺凝胶分析。5′-悬垂的存在延迟或阻碍了对dsRNA触发分子的加工。箭头表示存在siRNA，而箭号表示全长的触发分子。尺寸梯(size ladder)标记在图像的左侧。图1C示出Taqman定量PCR数据，所述Taqman定量PCR数据说明了用dsRNA触发剂1至6对本氏烟草(Nicotiana benthamiana)原生质体中EPSPS基因的各种下调程度。用在两端上具有5′悬垂的触发分子实现的靶沉默程度随着5′悬垂的长度增加而减小。

图2A-2B：用RNA依赖性RNA聚合酶(RDR，作为实例示出RDR6)合成的dsRNA分子(图2A)与如本文所公开的定向触发剂的一个实施方案(图2B)之间的比较，所述定向触发剂的实施方案在其反义链上包含2-nt的3′悬垂(“3′起始悬垂”)和5′悬垂(“5′封阻区悬垂”)。与当用Dicer蛋白加工时在两端上具有3′悬垂并且缺乏定向性的RDR合成dsRNA分子相比，主要从具有3′起始悬垂的末端开始加工定向触发剂。

图3：定向dsRNA触发剂的合理设计和加工的示意图，优先用Dicer样蛋白质将所述定向dsRNA触发剂以定相方式加工成两种不同的功能性siRNA。设计概念包括但不限于用Dicer样蛋白从具有3′悬垂的一个末端定向起始加工，以及在相反的末端使用5′悬垂封阻用Dicer样蛋白从此末端起始加工。合理设计的定向嵌合dsRNA触发分子主要产生在适当相中的siRNA产物以靶向两个目标基因(GOI1和GOI2)。同时，对定向dsRNA触发剂的加工导致其siRNA产物的仅小部分具有异常相。“异常”定相的siRNA产物最多具有与靶序列的部分互补性，其不能触发靶沉默。

图4：定向dsRNA触发剂(出于说明目的示出52个核苷酸)的示意图，优先用Dicer样蛋白以定相的方式将所述定向dsRNA触发剂加工成至少两种不同的siRNA。如图所示，两种不同的siRNA识别相同或不同靶基因(仅GOI1，或GOI1和GOI2)中的序列。siRNA1和siRNA2都包含在反义链的5′端处的UU二核苷酸和在有义链的5′端处的G。以UU二核苷酸开始的siRNA1和siRNA2的反义链优先加载到Argonaute蛋白(AGO)中并识别靶基因mRNA分子，从而导致靶基因沉默。

图5A-5B：定向dsRNA触发剂的一个实施方案和非定向dsRNA触发剂之间的示意性比较。示意图和以下解释仅出于说明目的提供，并且不限于任何科学理论或机制。在图5A中，定向触发剂的有义链包含来自目标基因(GOI)的靶特异性序列。如图所示的靶特异性序列1和2可以来自相同的GOI或不同的GOI。定向触发剂的反义链包含3′悬垂(例如2-nt)和5′悬垂两者。Dicer样蛋白优先从具有3′悬垂的末端开始，从定向触发剂切割第一21-24聚体(siRNA1)，并且还产生第二21-24聚体(siRNA2)，所述第二21-24聚体紧邻第一21-24聚体(例如，与第一21-24聚体同相)。因此，定向dsRNA触发剂以定相方式产生一组21-24聚体(图中示出了两个21-24聚体)，其中siRNA1和siRNA2为主要物质。siRNA1和siRNA2都包含在反义链的5′端处的UU二核苷酸和在有义链的5′端处的G。起始于UU二核苷酸的siRNA1和siRNA2的反义链优先加载到Argonaute蛋白(AGO)中，并且也被称为引导链，其指导对靶基因mRNA序列的识别并导致靶基因沉默。

非定向dsRNA触发剂可以是嵌合或非嵌合的，平末端的，在两端上具有3′悬垂，或这些特征的组合。示出于图5B，嵌合触发剂具有两个3′悬垂。当用dicer样蛋白质加工时，非定向dsRNA触发剂并未朝向触发剂的任一末端定向偏移。因此，从非定向dsRNA触发剂产生的21-24聚体更为异质。同相21-24聚体(例如siRNA1′和siRNA2′)仅代表21-24聚体的总汇集物的一部分，所述21-24聚体的总汇集物还包含大量异相21-24聚体(例如siRNA3′和siRNA4′)。因此，与定向触发剂相比，非定向dsRNA触发剂产生更稀释的同相21-24聚体。

此外，由非定向dsRNA触发剂产生的21-24聚体在其反义链的5′末端没有UU二核苷酸并且在其有义链的5′末端没有G。因此，反义链和有义链都不优先加载到AGO蛋白中。相反，每个21-24聚体的每条链可以潜在地加载到AGO蛋白中作为引导链。引导链1′和2′与靶序列互补并且能够识别靶分子以引起沉默。因此，与由定向触发剂产生的引导链相比，非定向dsRNA触发剂产生有效引起沉默的更稀释的引导链。

图6A-6D：抗两种拟南芥(Arabidopsis)靶基因的定向触发剂在拟南芥原生质体中产生抗它们的预定靶的两种功能性siRNA。图6A示出了所测试的三种定向嵌合dsRNA触发剂的示意图。这些定向dsRNA触发剂各自包含两个靶序列，这两个靶序列中的每个来自AtEPSPS或AtCUT1(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：58)，或者这两个靶序列都来自AtEPSPS(SEQID NO：8/SEQ ID NO：59)或AtCUT1(SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60)。图6B示出了嵌合触发剂在小麦胚芽提取物(WGE)中在沉默融合靶mRNA AtEPSPS1：Fluc方面的活性。AtEPSPS1：Fluc是全长荧光素酶编码序列与AtEPSPS1编码序列之间的mRNA融合体，所述AtEPSPS1编码序列由触发剂SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59，和SEQ ID NO：10/SEQID NO：61靶向。SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：61是非定向dsRNA触发剂。图6C示出了嵌合触发剂在小麦胚芽提取物(WGE)中在沉默靶mRNA方面的活性。AtCUT1：Fluc是全长荧光素酶编码序列与AtCUT1编码序列之间的mRNA融合体，所述AtCUT1编码序列由触发剂SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60，而不是SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59靶向。y轴反映了针对海肾荧光素酶归一化的相对荧光素酶活性。误差条形图表示标准偏差。对于WGE孵育，融合靶mRNA以3pmol/μl使用，而触发剂以60pmol/μl使用。图6D示出了用来自图5A的定向dsRNA触发剂处理后拟南芥原生质体中AtEPSPS1表达水平(“EPSPS RQ”)的q-PCR结果。含有抗AtEPSPS1的至少一个siRNA序列的定向触发剂(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：58和SEQID NO：8/SEQ ID NO：59)能够特异性下调AtEPSPS1表达，而抗AtCUT1的定向触发剂(SEQ IDNO：9/SEQ ID NO：60)不能沉默AtEPSPS1。与无触发剂对照相比，每种处理中AtEPSPS1下调的百分比示出在图式中。除了触发剂SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59外，所有触发剂以200pmol剂量测试，所述触发剂SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59包含均靶向AtEPSPS1的两种不同siRNA并且以50pmol剂量进行评价。此较低剂量的SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59实现了接近于由较高浓度的SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：58所实现的目标下调，这表明具有来自AtEPSPS1的两个靶特异性序列的SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59相较于SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：58具有更高的效力。

图7A-7E：靶向番茄(番茄，S1)八氢番茄红素脱氢酶(PDS)和EPSPS基因的定向嵌合dsRNA触发剂可有效触发本氏烟草(Nb)原生质体中的沉默。图7A示出了所测试的三种定向触发剂的示意图。SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：63各自包含两个靶序列，一个来自SlPDS，另一个来自SlEPSPS。两个靶序列的排列是在SEQ ID NO：11/SEQID NO：62与SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：63之间相反。图7B示出了嵌合触发剂在小麦胚芽提取物(WGE)中在沉默靶mRNA SlPDS：Fluc方面的活性。SlPDS：Fluc是全长荧光素酶编码序列与SlPDS编码序列之间的mRNA融合体，所述SlPDS编码序列由触发剂SEQ ID NO：11/SEQ IDNO：62和SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：63，而不是SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60靶向。图7C示出了嵌合触发剂在WGE中在沉默靶mRNA SlEPSPS：Fluc方面的活性。SlEPSPS：Fluc是全长荧光素酶编码序列与SlEPSPS编码序列之间的mRNA融合体，所述SlEPSPS编码序列由触发剂SEQID NO：11/SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：63，而不是SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60靶向。y轴反映了针对内部海肾荧光素酶对照报告子归一化的相对荧光素酶活性。误差条形图表示标准偏差。对于WGE孵育，靶mRNA以3pmol/μl使用，而每种触发剂以60pmol/μl使用。图7D示出了RNA印迹分析结果，表现了在本氏烟草原生质体中用触发剂SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：63对NbEPSPS基因的下调，而下方为rRNA对照。图7E列出了通过5′探针或3′探针对在本氏烟草原生质体中用触发剂SEQ ID NO：11/SEQ IDNO：62和SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：63实现的靶基因(目标基因，GOI)下调进行定量分析的结果。KD％是指与无触发剂对照相比，每种触发剂的基因敲低百分比。

图8：定向dsRNA触发剂(靶向AtEPSPS1的SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59，参见图5A)和非定向触发剂SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：61之间的在拟南芥原生质体中靶下调方面的比较显示与非定向触发剂相比，定向dsRNA触发剂具有更高的沉默效力。测试了八种不同的触发剂浓度(250，125，62.5，31.3，15.6，7.8，3.9，以及2.0pmol)。SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：81表示不靶向AtEPSPS1的阴性对照定向dsRNA触发剂。触发剂根据它们的浓度在x轴上列出。例如，x轴上的第一数据点“01 250 SEQ ID NO：10/SEQ IDNO：61”是指使用250pmol的触发剂SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：61的处理No.01。相似地，x轴上的数据点“32 2.0 SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：81”是指使用2.0 pmol的触发剂SEQ IDNO：14/SEQ ID NO：81的处理No.32。AtEPSPS1表达的相对q-PCR定量示出于y轴上。进行学生t检验(Student′s t-test)以显示统计学显著性。相同的定量结果也显示在表2中。定向dsRNA触发剂SEQ IDNO：8/SEQ ID NO：59当分别以125pmol和250pmol使用时分别使AtEPSPS1的表达减少了34％和39％。非定向dsRNA触发剂SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：61在最高剂量(250pmol))能够使AtEPSPS1的表达减少24％，并且表现为当以125pmol或更低的浓度使用时没有沉默活性。当以相同浓度(例如，250pmol)使用时，定向dsRNA触发剂SEQ IDNO：8/SEQ ID NO：59相较于非定向dsRNA触发剂SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：61更有效地减少AtEPSPS1的表达(39％对24％)。

图9A-9C：通过深度测序对由定向嵌合的dsRNA触发剂加工成的siRNA进行的调查证明了定向性。在WGE中加工触发剂SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60(图9A)，并且随后使产物集合经受深度测序。图9B在x轴上示出了SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60在WGE中加工后的RNA产物的尺寸分布，并且在y轴上示出了每种RNA尺寸的读段数。总共2,456,774个测序读数定位至触发剂SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60，其中2,107,001个读段(约85％)来自触发剂SEQ IDNO：9/SEQ ID NO：60的反义链，而349,774个测序读段(约15％)来自触发剂SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60的有义链。图9C示出21-24的尺寸范围(即，21-24聚体)含有473,000个测序读段(约19％)，其中约90％定位至触发剂SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60的反义链的3′端，而仅约0.4％来自于有义链的5′端。对21-24聚体的分析显示反义链的3′端与反义链的5′端相比过表达(约17％对约0.4％)，这支持对嵌合触发剂的优先定向加工从包含2-nt的3′悬垂的末端开始。在表1中显示了将两种另外的触发剂(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59)加工成21-24聚体的模式。

图10：对来自如图7中在WGE中由触发剂SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60加工成的反义链的3′端的21-24聚体的详细分析。针对列出的每个尺寸和序列，示出了测序读读段数(#)及其21-24聚体的总数百分比。

图11：来自48-nt的触发序列(SEQ ID NO：15，顶行)的最丰富的推定主siRNA双链体(例如，完全匹配的双链21-24聚体)的比对。用电脑模拟从21-24聚体测序读段组装推定的siRNA双链体，所述21-24聚体测序读段通过对在WGE中由触发剂BOL5.2加工成的小RNA进行测序产生。这些推定的siRNA双链体基于用它们的绝对频率的总和所估计的它们的相对丰度来评级。将评级最高的推定双链体(仅完美匹配21-24聚体)与48-nt的BOL5.2触发序列进行比对。评级最高的前10个推定siRNA双链体占所有完全匹配读段的约75％。在这10个双链体中，仅3个优先匹配触发剂的3′侧(具有5′悬垂的dsRNA末端)。四个评级最高的双链体(两个21-nt的siRNA和两个24-nt的siRNA)显示出相反的链偏性。两个评级最高的21-nt的siRNA偏向反义链，而两个评级最高的24-nt的siRNA偏向有义链。

图12：使用抗GFP(图A)或抗MgChl(图B)多克隆抗体的蛋白质印迹分析的结果。泳道如下：泳道1是来自用仅GFP触发剂处理过的植物的未沉默的绿色组织(在紫外光下)；泳道2为空的；泳道3是从GFP沉默处理制备的组织(在紫外光下的红点)；泳道4为空的；泳道5来自从用靶向GFP/MgChl的嵌合触发剂处理过的植物制备的组织。

图13：在原生质体细胞中测试的dsRNA多核苷酸的图和Taqman数据。图A示出了所测试的三种dsRNA：靶向PDS和PAT1两者的定向触发剂(SEQ ID NO：68/SEQ ID NO：69)，其具有5′-悬垂和期望组成；在与PDS或PAT1互补的序列中具有突变的dsRNA触发剂(SEQ ID NO：70/SEQ ID NO：71)，以及平末端的dsRNA触发剂(SEQ ID NO：72/SEQ ID NO：73)。图B示出了RNA提取和定量分析后获得的Taqman结果。

发明详述

除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本领域的技术人员将认识到，在本公开的实践中可以使用许多方法。实际上，本公开决不限于所描述的方法和材料。此外，本公开并非旨在受任何特定科学理论的限制。为了本公开的目的，以下术语定义如下。

其中引用的任何参考文献全文以引用方式并入。

如本文所用，单数形式的“一”、“一个”和“该”包括多个指代物，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。

如本文所用，术语“约”表示值包括用于测定值的方法的固有误差变化或实验之间存在的变化。

如本文所用，“dsRNA”分子是指包含通过氢键结合在一起的两条反向平行核糖核苷酸链的分子，其中每条链包含通过磷酸二酯键连接的核糖核苷酸，所述两条链一条在5′-3′方向中行进，另一条在3′-5′方向中行进。dsRNA的两条反向平行链可以彼此完全互补，或包含一个或多个错配直到任何一个附加的错配导致两条反向平行链解离的程度。dsRNA分子可以在整个dsRNA分子上具有完全互补性，或者在dsRNA构型中仅包含整个分子的一部分。dsRNA的两条反向平行链也可来自通过磷酸二酯键连接的连续核糖核苷酸链，例如发夹样结构(通常也称为茎-环结构)。在一些实施方案中，通过两个SEQ ID NO识别dsRNA分子，其中第一个SEQ ID NO表示dsRNA的有义链，而第二个SEQ ID NO表示dsRNA的反义链。在其它实施方案中，通过一个SEQ ID NO识别dsRNA分子，所述SEQ ID NO表示dsRNA的有义链。

如本文所用，在RNA介导的基因沉默的情形中，dsRNA分子的有义链是指包含与靶RNA序列相同或基本上相同的序列的链。dsRNA分子的反义链是指具有与靶RNA序列互补的序列的链。在DNA情形中，术语“反义”是指相对于其正常转录或功能方向反向并且因此表达与宿主细胞内所表达的靶基因mRNA分子互补的RNA转录物(例如，它可以通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对与靶基因、mRNA分子或单链基因组DNA杂交)或与靶DNA分子(诸如宿主细胞中存在的基因组DNA)互补的核苷酸序列。

如本文所用，术语“悬垂”是指在包含双链部分的核酸分子的一端的一个或多个单链核苷酸。“3′悬垂”是指以3′羟基或其修饰形式为末端的一个或多个单链核苷酸。“3′起始悬垂”是指具有可变长度(例如2-nt)的dsRNA分子的3′悬垂，其有利于用Dicer样蛋白质从具有3′悬垂的末端开始dsRNA加工。类似地，“5′悬垂”是指以5′磷酸根或其修饰形式为末端的一个或多个单链核苷酸。5′封阻悬垂”是指dsRNA分子的5′悬垂，其不利于用Dicer样蛋白质从具有5′悬垂的末端开始dsRNA加工。3′或5′悬垂的末端核苷酸(或末端)是指离双链部分最远的悬垂的核苷酸。

翻口末端(frayed end)是指具有显著比例的非互补序列的双链核酸分子末端(例如，平行链上的核苷酸不形成沃森-克里克配对)。

如本文所用，“小RNA(sRNA)”是指约15-30个核苷酸长，优选21-24个核苷酸长的任何RNA分子。“21-24聚体小RNA”或“21-24聚体sRNA”是指21-24个核苷酸的小RNA，其可为双链或单链的。双链21-24聚体sRNA可以在一端或两端包含选自由平末端、3′悬垂和5′悬垂组成的组中的一个或多个结构。用Dicer样蛋白质从dsRNA前体分子加工成的双链21-24聚体sRNA通常在两端包含2-nt的悬垂。

小RNA包括但不限于siRNA(小干扰RNA)、miRNA(微RNA)、ta-siRNA(反式激活siRNA)、激活RNA(RNAa)、nat-siRNA(天然反义siRNA)、hc-siRNA(异染色质siRNA)、顺式作用siRNA、lmiRNA(长miRNA)、lsiRNA(长siRNA)和easiRNA(表观遗传学上激活的siRNA)。本公开的优选sRNA分子是siRNA分子。成熟形式的sRNA可以是双链或单链的，虽然sRNA的生物起源通常涉及sRNA双链体，sRNA双链体为双链形式的sRNA。尽管不受具体理论的限制，但sRNA双链体通常是用蛋白质如Dicer样蛋白质从dsRNA前体(例如，如本文所公开的定向触发剂)加工成的。

如本文所用，术语“siRNA”(本文中也可互换地称为“小干扰RNA”)是一类长度为约18-25个核苷酸的双链RNA分子(例如18聚体、19聚体、20聚体、21聚体、22聚体、23聚体、24聚体或25聚体)。双链siRNA通常具有完全或接近完全的互补性。不受任何理论的限制，siRNA的作用是其参与RNA干扰(RNAi)途径，其中其干扰特定靶基因的表达。

siRNA的一条链称为“引导链”，其加载到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中并引导对互补mRNA分子(靶mRNA分子)的识别，以触发后续沉默。siRNA的另一条链称为“过客链”，其被降解。

如本文所用，术语“功能性siRNA”是指有效沉默预定靶基因的siRNA。

如本文所用，短语“RNA沉默”是指由RNA分子介导的一组调控机制(例如，RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、灭活、共抑制和翻译抑制)，所述调控机制导致对相应靶基因表达的抑制或“沉默”。

如本文所用，短语“紧邻”是指与参考位置或结构直接连接而没有间隙或间隔的位置。当两个核酸序列在单个分子的序列中存在并且刚好彼此相邻，没有任何间隙或间隔时，这两个核酸序列是紧邻或邻接的。

如本文所用，“合成序列”是指缺乏天然存在的相应序列的核酸序列。

如本文所用，“靶特异性序列”是指与触发多核苷酸所针对的基因或基因产物中存在的任意核苷酸序列基本上相同，相同，基本上互补或互补的核酸序列。在本文中，术语“基因”是指基因组序列中对应于遗传单位的可定位区，其包括调控区(诸如启动子、增强子)、5′非翻译区、内含子区、3′非翻译区、转录区以及可以作为天然基因或转基因在植物基因组或病原体基因组中存在的其它功能序列区。如本文所用，术语“病原体”是指病毒、类病毒、细菌、真菌、卵菌纲、原生动物、植原体和寄生植物。根据情况，术语靶序列或靶基因可以指靶向用于抑制的基因或基因产物的全长核苷酸序列或靶向用于抑制的基因或基因产物的一部分的核苷酸序列。在一些实施方案中，靶特异性序列可以来源于信使RNA(mRNA)的序列，所述mRNA在与小RNA分子杂交时导致靶基因表达衰减。在一些实施方案中，靶特异性序列可以来源于以下项的序列：微RNA、小干扰RNA以及与沉默复合物(RISC)或Argonaute蛋白相关的其它小RNA；核糖体或核糖酶的RNA组分；小核仁RNA；以及其它非编码RNA。在一些实施方案中，靶特异性序列可以来源于不可翻译(非编码)序列，诸如但不限于5′非翻译区、启动子、增强子，或其它非编码转录区，3′非翻译区、终止子，以及内含子。在一些实施方案中，靶特异性序列可以来源于编码转录因子的基因，参与目标分子(诸如但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂质，糖类和其它碳水化合物，生物聚合物，以及次级代谢物，所述次级代谢物包括生物碱、萜类化合物、聚酮化合物、非核糖体肽，以及混合生物合成来源的次级代谢物)的生物合成或分解代谢的酶。相反，“非靶特异性序列”是指不是靶特异性序列的任何核酸序列。

如本文所用，术语“触发剂”，“触发多核苷酸”或“多核苷酸触发剂”是指包含与靶基因或从所述靶基因或靶基因片段表达的RNA的多核苷酸序列基本上同源或互补的多核苷酸并且具有抑制靶基因的表达或产生敲低表型的功能的生物活性多核苷酸分子。触发多核苷酸能够抑制或“沉默”靶基因的表达。触发多核苷酸通常关于其“靶序列”来描述。触发多核苷酸可以是单链DNA(ssDNA)、单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、双链DNA(dsDNA)或双链DNA/RNA杂交体。触发多核苷酸可以包含天然存在的核苷酸、经修饰的核苷酸、核苷酸类似物或其任何组合。在一些实施方案中，触发多核苷酸可以结合到较大的多核苷酸内。在一些实施方案中，触发多核苷酸可以被加工成小干扰RNA(siRNA)。如本文所公开的触发剂包括但不限于定向触发剂、定向嵌合触发剂以及链选择性定向嵌合触发剂。

如本文所用，定向触发剂是外源dsRNA分子，其可以引起至少一种靶基因的沉默，并且当用Dicer样蛋白质加工成小RNA时具有优先的定向性。定向触发剂的一个实施方案在同一条链上具有3′悬垂和5′悬垂，其不受任何科学理论或机制的限制，有利于从3′端开始dicer加工并且不利于从5′端开始dicer加工。在一些实施方案中，定向触发剂是嵌合触发剂，其包含两个或更多个靶特异性序列，当用Dicer样蛋白切割定向触发剂时，所述两个或更多个靶特异性序列产生可预测的siRNA，每种可预测的siRNA对应一个靶特异性序列。

如本文所用，链选择性定向嵌合触发剂是能够产生两个或更多个sRNA双链体的定向嵌合触发剂，所述两个或更多个sRNA双链体中的大多数sRNA双链体优先使其反义链作为引导链。

非定向dsRNA触发分子(“非定向触发剂”)是当用dicer样蛋白加工成sRNA时不具有优先定向性的dsRNA分子。非定向触发剂的实施方案包括但不限于缺乏3′起始悬垂、5′封阻悬垂或两者的dsRNA触发分子。

如本文所用，术语“基本上相同”或“基本上互补”意指触发剂(或双链多核苷酸的至少一条链或其部分，或单链多核苷酸的一部分)在生理条件下与靶基因、从靶基因转录成的RNA，或其片段杂交，以实现对靶基因的调控或抑制。例如，在一些实施方案中，触发剂(或双链触发剂的至少一条链)当相较于靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个或更多个连续核苷酸的序列时具有100％的序列同一性或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，触发剂(或双链触发剂的至少一条链)当相较于靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个或更多个连续核苷酸的序列时具有100％的序列互补性或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列互补性。在一些实施方案中，触发剂(或双链触发剂的至少一条链)与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员(基因的编码或非编码序列)具有100％的序列同一性或互补性。在一些实施方案中，触发剂(或双链触发剂的至少一条链)与给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性或互补性。在一些实施方案中，触发剂(或双链触发剂的至少一条链)与给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有100％的序列同一性或互补性。

如本文所用，关于核酸序列、核酸分子或基因，术语“自然的”、“天然存在的”或“天然的”是指相应的序列或分子存在于尚未经基因修饰或人工操控的野生型细胞中。天然靶向一个基因的小RNA分子是指存在于野生型细胞中并且靶向天然存在于所述野生型细胞中的基因的小RNA分子。

如本文所用，当关于核酸使用时，术语“同源性”和“同一性”描述两个或更多个核苷酸序列之间的相似性程度。两个序列之间的“序列同一性”百分比是通过以下方式测定的：在比较窗中比较两个最佳比对的序列，以使得所述序列在比较窗中的部分相较于用于最佳比对所述两个序列的参考序列(其不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(缺口)。通过以下方式计算所述百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分比。与参考序列相比每个位置相同的序列被称为与参考序列同一，反之亦然。两个或更多个序列的比对可以使用任何合适的计算机程序来进行。例如，用于进行序列比对的广泛使用和认可的计算机程序是CLUSTALW v1.6(Thompson等人，Nucl.Acids Res.，22：4673-4680，1994)。

如本文所用，术语“高GC含量”是指给定核苷酸序列的核苷酸组成中至少50％为鸟嘌呤或胞嘧啶。

如本文所用，术语相对于生物体的“外源多核苷酸”和“外源核酸分子”是指在该生物体内非天然存在的异源核酸分子。可以以稳定或瞬时方式将外源核酸分子引入生物体内。外源核酸分子可以包含与生物体的内源核酸序列相同或部分同源的核酸序列。

如本文所用，术语“改善”、“改善的”、“增加”和“增加的”是指由特定处理或设计特征引起的性质或属性的至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％或更大的增加。

如本文所用，试剂(诸如蛋白质或mRNA)水平的“降低”是指相对于缺乏能够减少试剂的dsRNA分子的细胞或生物体，所述水平降低。

如本文所用，术语试剂(诸如蛋白质或mRNA)的水平的“至少部分降低”是指相对于缺乏能够减少所述试剂的dsRNA分子的细胞或生物体，所述水平降低至少25％。

如本文所用，术语试剂(诸如蛋白质或mRNA)的水平的“显著降低”是指相对于缺乏能够减少试剂的dsRNA分子的细胞或生物体，所述水平降低，其中所述试剂的水平降低至少75％。

如本文所用，试剂(诸如蛋白质或mRNA)的“有效消除”是相对于缺乏能够减少试剂的dsRNA分子的细胞或生物体而言，其中试剂水平的降低大于95％。试剂，优选dsRNA分子，优选能够提供至少部分减少，更优选显著减少，或最优选有效消除另一种试剂(诸如蛋白质或mRNA)，其中所述试剂使得第二种试剂的水平保持基本上不受影响，实质上不受影响或部分不受影响。

如本文所用，当提及细胞中核酸分子的表达或活性时，术语“抑制”、“阻遏”、“下调”和“沉默”在本文中同等地使用并且意指核酸分子在应用本公开的方法后在生物体或细胞中的表达水平或活性低于其在应用本公开的方法之前在生物体或细胞中的表达或活性，或者相较于缺乏如本文所公开的核酸分子的对照生物体或细胞更低。

如本文所用，“抑制”、“阻遏”或“下调”试剂(诸如蛋白质、mRNA或RNA)的水平或活性的是指相对于在基本上相同条件下生长、缺乏如本文所公开的核酸分子的基本上相同的植物、植物部分或植物细胞，所述水平或活性降低。如本文所用，“抑制”、“阻遏”或“下调”试剂(诸如由靶基因表达的前体RNA、mRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA)及/或由其编码的蛋白质产物的水平或活性是指相对于缺乏如本文所公开的核酸分子的细胞或生物体，量减少10％或更多，例如20％或更多、优选30％或更多、更优选50％或更多、甚至更优选70％或更多、最优选80％或更多例如90％。

如本文所用的术语“植物”涵盖整株植物，植物的祖先和后代以及植物部分(包括种子、枝条、茎、根(包括块茎))，分离的植物细胞，组织和器官。植物可以是任何形式，包括但不限于悬浮培养物、胚乳、胚茅、分生区域、愈伤组织、叶、配子体、孢子体、花粉和小孢子。应当理解，植物或其种子可以是转基因植物。

如本文所用，短语“植物细胞培养物”是指任何类型的天然(天然存在的)植物细胞、植物细胞系以及经基因修饰的植物细胞，其未组装形成完整植株，使得植物的至少一种生物结构不存在。任选地，本公开的此实施方案的植物细胞培养物可包含特定类型的植物细胞或多种不同类型的植物细胞。应当指出的是，任选地以特定类型的植物细胞为特征的植物培养物可以最初来源于多种不同类型的此种植物细胞。在根据本公开的某些实施方案中，植物细胞是无性繁殖植物细胞。在其它方面，本公开的植物细胞是非光合植物细胞。

如本文所公开的dsRNA分子的加工可以使用在本领域中已知的任何方法或系统来监测。在一方面，在小麦胚芽提取物(例如，Promega目录号L4380)中监测如本文所公开的dsRNA分子的加工。在另一方面，在植物原生质体中监测如本文所公开的dsRNA分子的加工。在另一方面，在选自由以下项组成的组的植物或植物部分中监测如本文所公开的dsRNA分子的加工：悬浮培养物、胚芽、分生区域、愈伤组织、叶、根、嫩枝、花、果实、种子、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

在一方面，本公开提供了双链RNA(dsRNA)分子，所述双链RNA(dsRNA)分子包含：a).第一链，其包含与靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸基本上相同的核苷酸序列；和b).第二链，其在5′至3′方向上包含5′-悬垂，与所述第一链基本上互补的核苷酸序列，以及2个核苷酸的3′-悬垂，其中所述5′-悬垂为至少5个核苷酸长。

在一些实施方案中，第二链的5′-悬垂具有高GC含量。在一些实施方案中，第二链的5′-悬垂的长度为5个核苷酸。在一个实施方案中，5′-悬垂具有序列GCGCG。在一个实施方案中，第二链的2个核苷酸的3′-悬垂具有序列UA。

在一些实施方案中，第一链还包含位于与靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸基本上相同的核苷酸序列的3′的核苷酸GCCAC。在一些实施方案中，第一链还包含5′G。在另一个实施方案中，5′G与靶核苷酸序列不同。

在一些实施方案中，第二链中的2个核苷酸的3′-悬垂包含改善dsRNA分子的稳定性的至少一种修饰。在一些实施方案中，2个核苷酸的3′-悬垂包含选自由以下项组成的组中的至少一种修饰：甲基化、硫代磷酸酯添加、锁核酸(LNA)以及其任何组合。

在一些实施方案中，靶核苷酸序列是mRNA的编码区、5′非翻译区、3′非翻译区、内含子、启动子、增强子、终止子、rRNA、tRNA、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、参与RNA干扰的非编码RNA以及其任何组合。

在一些实施方案中，dsRNA分子的第一链在5′至3′方向上还包含：a).第一序列，其与第一靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸基本上相同；和b).第二序列，其与第二靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸基本上相同。在一些实施方案中，第一靶核苷酸序列和第二靶核苷酸序列来自不同的基因。在其它实施方案中，第一靶核苷酸序列和第二靶核苷酸序列来自相同的基因。在一些实施方案中，第一靶核苷酸序列和第二靶核苷酸序列是相同的。在一些实施方案中，第一靶核苷酸序列和第二靶核苷酸序列是不连续的。在一些实施方案中，第一链包含在所述第一和第二序列之间的一个或多个A。在一个实施方案中，第二序列包含5′G。在另一个实施方案中，第二序列包含5′GUA。在另一个实施方案中，第二序列包含5′GAA。在一个实施方案中，第二序列包含3′AA。

在一些实施方案中，第一链的3′端具有高GC含量。在一些实施方案中，第一链的3′端与靶核苷酸序列不同。

在一方面，加工dsRNA分子以产生21个、22个、23个和/或24个核苷酸的siRNA。在一些实施方案中，第一链中的第一和第二序列为21个核苷酸长。

在一些实施方案中，dsRNA的第一链还包含与第三靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸基本上相同的第三序列。在一些实施方案中，dsRNA的第一链还包含与第四靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸基本上相同的第四序列。在一些实施方案中，dsRNA的第一链还包含与第五靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸基本上相同的第五序列。在一些实施方案中，dsRNA的第一链还包含与第六靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸基本上相同的第六序列。在一些实施方案中，dsRNA的第一链还包含与第七靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸基本上相同的第七序列。在一些实施方案中，dsRNA的第一链还包含与第八靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸基本上相同的第八序列。

在一些实施方案中，dsRNA的第一链包含与多个靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸基本上相同的多个靶特异性序列。在一些实施方案中，多个靶核苷酸序列中的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个来自不同的基因。在一些实施方案中，多个靶核苷酸序列中的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个来自相同的基因。

在另一方面，本公开提供了dsRNA分子，其包含：a).第一链，其在5′至3′方向上包含i).第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列与第一靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸相同；ii).第二核苷酸序列，其包含2个或更多个A；和iii).第三核苷酸序列，其与第二靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸或第一靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸相同；和b).第二链，其在5′至3′方向上包含5个核苷酸的5′-悬垂、与所述第一链互补的核苷酸序列以及2个核苷酸的3′-悬垂。在一些实施方案中，5个核苷酸的5′-悬垂具有高GC含量。在一个实施方案中，5个核苷酸的5′-悬垂具有序列GCGCG。在一个实施方案中，2个核苷酸的3′-悬垂具有序列UC。在一个实施方案中，第一链还包含位于第三核苷酸序列的3′的核苷酸GCCAC。在一些实施方案中，第一和第二靶核苷酸序列选自：mRNA的编码区、5′非翻译区、3′非翻译区、内含子、启动子、增强子、终止子、rRNA、tRNA、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、参与RNA干扰的非编码RNA以及其任何组合。在一些实施方案中，第一靶核苷酸序列和第二靶核苷酸序列来自不同的基因。在一些实施方案中，第一靶核苷酸序列和第二靶核苷酸序列来自相同的基因。在一些实施方案中，第一靶核苷酸序列和第二靶核苷酸序列是相同的。在一些实施方案中，第二链中的2个核苷酸的3′-悬垂包含改善dsRNA分子的稳定性的至少一种修饰。在一些实施方案中，2个核苷酸的3′-悬垂包含选自由以下项组成的组中的至少一种修饰：甲基化、硫代磷酸酯添加、锁核酸(LNA)以及其任何组合。可以将修饰引入至两条链的最5′端核苷酸，并且引入至作为悬垂的组成部分的所有核苷酸。在一个实施方案中，可以修饰代表反义链(5′-GCGCG-3′)的5′端的所有五个核苷酸以增强稳定性。

在一些实施方案中，本公开中的dsRNA分子包含相同触发序列的多联体。在一些实施方案中，dsRNA分子包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个相同的触发序列。

在一方面，加工dsRNA分子以产生21个、22个、23个和/或24个核苷酸的siRNA。在一些实施方案中，第一链中的第一和第三序列为21个核苷酸长。

在另一方面，本公开还提供了包含本文公开的dsRNA分子的组合物。

在一方面，本公开提供了一种调控至少一种靶基因的表达的方法，所述方法包括将包含本文所公开的dsRNA分子的组合物施加于植物或植物部分的表面，其中所述dsRNA分子包含第一链，所述第一链包含与靶基因的至少18个连续核苷酸基本上相同的核苷酸序列。在一方面，dsRNA分子从植物或植物部分的表面转移到植物或植物部分的细胞中。

在一些实施方案中，dsRNA分子的第一链包含与第一靶基因的至少18个连续核苷酸基本上相同的第一核苷酸序列和与第二靶基因的至少18个连续核苷酸基本上相同的第二核苷酸序列。在另一个实施方案中，dsRNA分子的第一链还包含与第三靶基因的至少18个连续核苷酸基本上相同的第三核苷酸序列。在另一个实施方案中，dsRNA分子的第一链还包含与第四靶基因的至少18个连续核苷酸基本上相同的第四核苷酸序列。

在一些实施方案中，dsRNA分子的第一链包含与多个靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸基本上相同的多个靶特异性序列。在一些实施方案中，多个靶核苷酸序列中的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个来自不同的基因。在一些实施方案中，多个靶核苷酸序列中的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个来自相同的基因。

在一些实施方案中，dsRNA分子抑制至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种靶基因的表达。

在另一方面，本公开还提供了一种提高dsRNA分子在植物或植物部分中产生所需小RNA方面的效率的方法，所述方法包括向植物或植物部分提供本文所公开的dsRNA分子，其中21-24个核苷酸的小RNA的产生定向偏向dsRNA分子的第二链的3′端。

在另一方面，本公开提供了包含本文公开的dsRNA分子的植物、植物部分或种子，其中所述dsRNA分子对所述植物、植物部分或种子来说是外源的。在一方面，dsRNA分子抑制植物、植物部分或种子中至少一种、至少两种、至少三种或至少四种靶基因的表达。

本公开提供了定向触发剂，所述定向触发剂包含当用Dicer样蛋白加工成sRNA时具有优先定向性的外源dsRNA分子。在一方面，本公开的定向触发剂包含3′悬垂。在另一方面，本公开的定向触发剂包含5′悬垂。在另一方面，定向触发剂具有在有义链上的3′悬垂和5′悬垂。在另一方面，定向触发剂具有在反义链上的3′悬垂和5′悬垂。

在一方面，如本文所公开的定向触发剂具有用于产生sRNA的预程序化的加工模式，其中sRNA加工从包含3′悬垂的末端开始，并用约21个核苷酸的相以定相方式继续。在另一方面，定向触发剂能够通过优先使一个或多个sRNA双链体的反义链作为引导链来产生具有链选择性的一个或多个sRNA双链体。sRNA双链体的引导链是加载到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中中并引导对互补mRNA分子(例如，靶mRNA分子)的识别以触发后续沉默的链。

在一方面，如本文所公开的定向触发剂包含两个或更多个靶特异性序列，当用Dicer样蛋白切割定向触发剂时，所述两个或更多个靶特异性序列产生相同数目的sRNA，其中每一sRNA数目对应一个靶特异性序列。在一方面，两个或更多个靶特异性序列在定向触发剂中彼此紧邻。在一方面，两个或更多个靶特异性序列在定向触发剂中不相邻。在一方面，两个或更多个靶特异性序列在定向触发剂中是不连续的。在一方面，定向触发剂的两个或更多个靶特异性序列来自两种或更多种不同的基因。在另一方面，定向触发剂中的两个或更多个靶特异性序列来源于相同基因但在该基因中不连续。在另一方面，定向触发剂的两个或更多个靶特异性序列具有基本上相同的序列。在另一方面，定向触发剂还包含邻接两个或更多个靶特异性序列的一个或多个富AU的接头序列。

在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂可以采用茎-环构型，其包含3′起始悬垂但缺乏5′封阻悬垂。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂不是来自病毒载体。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂不是由天然病毒感染产生的。

在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂产生了至少一种、两种、三种、四种或五种siRNA(小干扰RNA)。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂产生了至少一种、两种、三种、四种或五种miRNA(微RNA)。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂产生了至少一种、两种、三种、四种或五种ta-siRNA(反式激活siRNA)。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂产生了至少一种、两种、三种、四种或五种激活RNA(RNAa)。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂产生了至少一种、两种、三种、四种或五种反义siRNA。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂产生了至少一种、两种、三种、四种或五种hc-siRNA(异染色质siRNA)。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂产生了至少一种、两种、三种、四种或五种顺式作用siRNA。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂产生了至少一种、两种、三种、四种或五种lmiRNA(长miRNA)。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂产生了至少一种、两种、三种、四种或五种反义lsiRNA(长siRNA)。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂产生了至少一种、两种、三种、四种或五种easiRNA(表观遗传学上激活的siRNA)。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂产生了至少一种、两种、三种、四种或五种选自由以下项组成的组的sRNA：siRNA、miRNA、ta-siRNA、RNAa、反义siRNA，hc-siRNA、顺式作用siRNA、lmiRNA、lsiRNA、easiRNA以及其任何组合。

本公开的dsRNA分子或定向触发剂可以具有可变长度。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的每条链的长度为从约20至约1000个核苷酸。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的每条链的长度为约25至约1000个核苷酸、约30至约1000个核苷酸、约35至约1000个核苷酸、约40至约1000个核苷酸、约45至约1000个核苷酸、约55至约1000个核苷酸、约60至约100个核苷酸、约65至约1000个核苷酸、约70至约1000个核苷酸、约75至约1000个核苷酸、约80至约1000个核苷酸、约85至约1000个核苷酸、约90至约1000个核苷酸、约95至约1000个核苷酸、约100至约1000个核苷酸、约150至约1000个核苷酸、约200至约1000个核苷酸、约250至约1000个核苷酸、约300至约1000个核苷酸、约350至约1000个核苷酸、约400至约1000个核苷酸、约500至约1000个核苷酸、约600至约1000个核苷酸、约700至约1000个核苷酸、约800至约1000个核苷酸或约900至约1000个核苷酸。

在一个实施方案中，dsRNA分子或定向触发剂的一条链的长度为约20至约200个核苷酸、约25至约200个核苷酸、约30至约200个核苷酸、约35至约200个核苷酸、约40至约200个核苷酸、约45至约200个核苷酸、约50至约200个核苷酸、约55至约200个核苷酸、约60至约200个核苷酸、约65至约200个核苷酸、约70至约200个核苷酸、约75至约200个核苷酸、约80至约200个核苷酸、约85至约200个核苷酸、约90至约200个核苷酸、约95至约200个核苷酸、约100至约200个核苷酸、约105至约200个核苷酸、约110至约200个核苷酸、约120至约200个核苷酸、约130至约200个核苷酸、约140至约200个核苷酸或约150至约200个核苷酸。

在另一个实施方案中，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的一条链的长度为约20至约190个核苷酸、约25至约180个核苷酸、约30至约170个核苷酸、约35至约160个核苷酸、约40至约150个核苷酸、约45至约140个核苷酸、约50至约130个核苷酸、约55至约120个核苷酸、约60至约110个核苷酸、约65至约100个核苷酸、约70至约90个核苷酸或约75至约80个核苷酸。

在一个实施方案中，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的一条链的长度为约40至约100个核苷酸、约45至约100个核苷酸、约50至约100个核苷酸、约55至约100个核苷酸、约60至约100个核苷酸、约65至约100个核苷酸、约70至约100个核苷酸、约75至约100个核苷酸、约80至约100个核苷酸、约85至约100个核苷酸或约90至约100个核苷酸。

在另一个实施方案中，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的一条链的长度为约40至约95个核苷酸、约40至约90个核苷酸、约40至约85个核苷酸、约40至约80个核苷酸、约40至约75个核苷酸、约40至约70个核苷酸、约40至约65个核苷酸、约40至约60个核苷酸、约40至约55个核苷酸或约40至约50个核苷酸。

在另一个实施方案中，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的一条链的长度为约45至约95个核苷酸、约50至约90个核苷酸、约55至约85个核苷酸、约60至约80个核苷酸或约65至约75个核苷酸。

在一个实施方案中，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的一条链的长度为从约45至约75个核苷酸。

在另一个实施方案中，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的一条链的长度为约25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个、140个、145个、150个、155个、160个、165个、170个、175个、180个、185个、190个、195个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个、950个或1000个核苷酸。

在一个实施方案中，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂包含各自编码一个sRNA双链体的2个、3个、4个、5个或6个sRNA触发序列。

在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂可以包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个错配区。错配区可以具有1组、2组、3组、4组、5组、6组、7组、8组、9组、10组、11组、12组、13组、14组、15组、16组、17组、18组、19组、20组或更多组错配核苷酸。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂可包含1个、2个、3个、4个或更多个核苷酸构成的一个或多个凸起。

在一个实施方案中，本公开的dsRNA分子或定向触发剂具有单个靶基因。在另一个实施方案中，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂具有两个或更多个不同的靶基因。在一个实施方案中，由本公开的dsRNA分子或定向触发剂编码的两个或更多个sRNA双链体靶向相同的基因。如本文所公开的定位触发剂编码靶向相同靶基因的两个或更多个不同的sRNA，与包含没有3′起始悬垂和5′封阻悬垂的类似靶特异性序列的非定向触发剂相比，所述定位触发剂可以具有更高的沉默效率。可以通过任何可用的方法来比较两种沉默分子的效率，例如测量观察到设定量(例如，20％)的靶基因表达降低所需的最小分子浓度，或通过施加设定量(例如，250pmol)的沉默分子来测量靶基因表达的降低百分比。本领域的普通技术人员应理解，当评定不同组分子的效率时，靶基因表达降低的设定量和沉默分子的设定量可为不同的。

在另一个实施方案中，由本公开的dsRNA分子或定向触发剂编码的两个或更多个sRNA双链体不靶向相同的基因。在另一个实施方案中，由本公开的dsRNA分子或定向触发剂编码的两个或更多个sRNA双链体中的每一个靶向不同的基因。在另一个实施方案中，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂靶向来自相同基因家族的两个或更多个基因。在另一个实施方案中，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂靶向两个或更多个种内同源基因。在另一个实施方案中，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂靶向在共同代谢途径中的两个或更多个基因，并且因此增加了破坏代谢途径的概率。在另一个实施方案中，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂靶向两个、三个或更多个单独的抗除草剂基因。

在一个实施方案中，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂可以包含一个或多个靶特异性序列，所述一个或多个靶特异性序列与选自由以下项组成的组的序列(其可以是编码序列或非编码序列)基本上相同或相同：植物内源性基因序列、植物病原体基因序列、植物病毒基因序列、植物昆虫基因序列，以及它们的组合。在一个实施方案中，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂可以诱导对植物中内源性基因的系统调控或抑制。

在一个实施方案中，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂具有编码除草剂耐受性蛋白质的一个或多个目标靶基因。提供除草剂耐受性的蛋白质的实例包括例如5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、草甘膦氧化还原酶(GOX)、草甘膦脱羧酶、草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT)、麦草畏单加氧酶、膦丝菌素乙酰转移酶、2，2-二氯丙酸脱卤素酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、卤代芳基腈水解酶、乙酰-辅酶A羧化酶、二氢蝶酸合酶、八氢番茄红素脱氢酶、原卟啉IX加氧酶、羟苯丙酮酸双加氧酶、对氨基苯甲酸合酶、谷氨酰胺合酶、纤维素合酶、β-微管蛋白，以及丝氨酸羟甲基转移酶。编码赋予除草剂耐受性的蛋白质的核酸的实例包括：用于赋予对草甘膦的耐受性的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS；参见例如美国专利No.5,627,061、No.5,633,435RE39,247、No.6,040,497和No.5,094,945，以及PCT国际申请公开WO04074443和WO04009761)、草甘膦氧化还原酶(GOX；美国专利No.5,463,175)、草甘膦脱羧酶(PCT国际申请公开WO05003362、美国专利No.7,405,347以及美国专利申请公开2004/0177399)、草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT；美国专利No.7,714,188)；用于赋予对生长素样除草剂(如麦草畏)的耐受性的麦草畏单加氧酶(美国专利No.7,105,724)；用于赋予对草丁膦(phosphinothricin)或草胺磷(glufosinate)的耐受性的膦丝菌素乙酰转移酶(pat或bar)(美国专利No.5,646,024)；用于赋予对2，2-二氯丙酸(茅草枯(Dalapon))耐受性的2，2-二氯丙酸脱卤素酶(PCT国际申请公开WO9927116)；用于赋予对乙酰乳酸合酶抑制剂(诸如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶基氧苯甲酸酯和苯酞)的耐受性的乙酰羟酸合酶或乙酰乳酸合酶(美国专利No.6,225,105)；用于赋予溴苯腈耐受性的卤代芳基腈水解酶(Bxn)(美国专利No.4,810,648)；用于赋予对环己二酮(稀禾定)和芳氧苯氧丙酸酯类(吡氟氯禾灵)的耐受性的改性的乙酰-辅酶A羧化酶(美国专利No.6,414,222)；用于赋予对磺酰胺类除草剂的耐受性的二氢蝶酸合酶(sul I)(美国专利No.5,719,046)；赋予对三嗪类除草剂的耐受性的32kDa光合体系II多肽(psbA)(Hirschberg等人，1983，Science，222：1346-1349)；用于赋予对5-甲基色氨酸的耐受性的邻氨基苯甲酸酯合酶(美国专利No.4,581,847)；用于赋予对氨乙基半胱氨酸的耐受性的二氢吡啶二羧酸合酶(dap A)(PCT国际申请公开WO8911789)；用于赋予对哒嗪酮类除草剂(诸如达草灭)的耐受性的八氢番茄红素脱氢酶(crtI)(日本专利JP06343473)；用于赋予对环丙基异噁唑类除草剂(诸如异噁唑草酮)的耐受性的羟苯丙酮酸双加氧酶、4-羟基苯乙酸氧化酶和4-羟基苯乙酸1-水解酶(美国专利No.7,304,209)(美国专利No.6,268,549)；用于赋予对原卟啉原氧化酶抑制剂的耐受性的改性的原卟啉原氧化酶I(protox)(美国专利No.5,939,602)；用于赋予对含有芳氧基链烷酸酯部分的除草剂的耐受性的芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-1)(PCT国际申请公开WO05107437)；丝氨酸羟甲基转移酶(美国专利申请公开2008/0155716)、草胺磷耐受性谷氨酰胺合酶(美国专利申请公开2009/0018016)。此类除草剂的实例包括苯氧基生长素(例如2，4-D和二氯丙酸)，吡啶氧基生长素(诸如氟草烟和绿草定)，芳氧苯氧丙酸酯类(AOPP)乙酰-辅酶A羧化酶(ACC酶)抑制剂(诸如吡氟氯禾灵(haloxyfop)、喹禾灵(quizalofop)以及禾草灵(diclofop))，以及5-取代的苯氧基乙酸原卟啉原氧化酶1x抑制剂(诸如霸草灵(pyraflufen)和氟烯草酸(flumiclorac))。所有上述引用的专利和专利申请公开，包括其中所公开的编码除草剂耐受性蛋白质的核酸的序列和所述除草剂耐受性蛋白质的序列，所述引用文献全文以引用方式并入本文中。

在另一个实施方案中，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂具有一个或多个目标靶基因，所述目标靶基因为必需基因。必需基因是维持细胞生命或支持生物体繁殖所必要的基因。示例性的必需基因包括参与DNA或RNA复制、基因转录、RNA介导的基因调控、蛋白质合成、能量产生和细胞分裂的基因。必需基因的纲要的一个实例描述于Zhang等人，(2004)Nucleic Acids Res.，32：D271-D272(列出了拟南芥(Arabidopsis thaliana)的777个必需基因)中。必需基因的其它实例包括翻译起始因子(TIF)和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)。在其它方面，目标靶基因可以是编码转录因子的基因以及编码参与植物中分子的生物合成或分解代谢的酶的基因，所述分子为诸如但不限于氨基酸，脂肪酸和其它脂质，糖类和其它碳水化合物，生物聚合物，以及次级代谢物，所述次级代谢物包括生物碱、萜类化合物、聚酮化合物、非核糖体肽，以及混合生物合成来源的次级代谢物。

在一些实施方案中，包含在如本文所公开的核酸分子中的靶特异性序列当相较于靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个或更多个连续核苷酸的区域时具有100％的序列互补性或至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列互补性。在一些实施方案中，包含在如本文所公开的核酸分子中的靶特异性序列与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员(基因的编码或非编码序列)具有100％的序列互补性。在一些实施方案中，包含在如本文所公开的核酸分子中的靶特异性序列与给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列互补性。在一些实施方案中，包含在核酸分子中的靶特异性序列与给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有100％的序列互补性。

在一些实施方案中，包含在如本文所公开的核酸分子中的靶特异性序列当相较于靶基因或从所述靶基因转录的RNA中的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个或更多个连续核苷酸的区域时具有100％的序列同一性或至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，包含在如本文所公开的核酸分子中的靶特异性序列与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员(基因的编码或非编码序列)具有100％的序列同一性。在一些实施方案中，包含在如本文所公开的核酸分子中的靶特异性序列与给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，包含在核酸中的靶特异性序列与给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有100％的序列同一性。

在一方面，本公开的dsRNA分子或定向触发剂可以不同长度的时段进行对基因表达的调控(例如，抑制)。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂在经处理植物的生命期期间有效达至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周的时段。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂可以施加于种子并随后在种子发芽后的任何阶段调控基因表达。用如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂处理过的种子可以贮藏任何时长的时段，例如2周、4周或6周，或2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月，或2年、3年、4年、5年、6年、7年或更多年，同时保持dsRNA分子或定向触发的效用。

本公开的dsRNA分子或定向触发剂可包含具有可变长度的3′悬垂。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个核苷酸的3′悬垂。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的3′悬垂包含非靶特异性序列。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的3′悬垂包含合成序列。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的3′悬垂包含序列5′-尿嘧啶-腺嘌呤-3′。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的3′悬垂包含序列5′-尿嘧啶-尿嘧啶-3′。不受任何科学理论或机制的束缚，观察到具有3′悬垂的UU二核苷酸的siRNA是最有效触发沉默的。参见Elbashir等人，Functional anatomy of siRNA formediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate，EMBO J，20：6877-6888(2001)；还参见Strapps等人，The siRNA sequence and guide strandoverhangs are determinants of in vivo duration of silencing，Nucleic AcidsResearch，38(14)：4799-97(2010)。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的3′悬垂不包含鸟嘌呤残基。不受任何科学理论或机制的约束，RNA酶可在单链鸟嘌呤残基处切割siRNA。在另一方面，紧挨着如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的3′悬垂的第一非悬垂化核苷酸包含胞嘧啶。在另一方面，如本文所公开的任何核酸分子的3′悬垂末端可以被翻口末端取代或与翻口末端组合。

在一方面，本公开的dsRNA分子或定向触发剂优先在距离3′悬垂的末端约21个核苷酸的距离处由Dicer样蛋白切割而产生第一sRNA双链体，其中在相同取向上以约21个核苷酸的间隔继续切割dsRNA分子或定向触发剂而产生第二sRNA双链体，并且所述第一sRNA双链和所述第二sRNA双链体均为约21个核苷酸长，具有约19个核苷酸的双链区域并且在两端处具有2个核苷酸的3′悬垂。

在一方面，本公开的dsRNA分子或定向触发剂优先在距离具有3′悬垂的末端约21个核苷酸的距离处由Dicer样蛋白切割而产生第一sRNA双链体，其中在相同取向上以约21个核苷酸的间隔继续切割dsRNA分子或定向触发剂而产生一个或多个连续的sRNA双链体，并且其中所述第一sRNA双链体和所述一个或多个连续的sRNA双链体为约21个核苷酸长，具有约19个核苷酸的双链区域并且在两端处具有2个核苷酸的3′悬垂。在一方面，可将本公开的dsRNA分子或定向触发剂切割成至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个连续的sRNA双链体，所述连续的sRNA双链体为约21个核苷酸，具有约19个核苷酸的双链区域并且在两端处具有2个核苷酸的3′-悬垂。

本公开的dsRNA分子或定向触发剂可以在一个末端处包含具有可变长度的5′悬垂，不受任何理论或机制的约束，所述5′悬垂基本上不利于或基本上排除Dicer样蛋白从此末端开始切割。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个核苷酸的5′悬垂。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的5′悬垂包含非靶特异性序列。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的5′-悬垂包含合成序列。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的5′悬垂包含序列5′-鸟嘌呤-鸟嘌呤-鸟嘌呤-3′。在另一方面，如本文所公开的任何核酸分子的5′悬垂末端可以被翻口末端取代或与翻口末端组合。

在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂包含紧邻5′悬垂的双链区，所述双链区具有可变长度的非靶特异性序列。在一方面，与5′悬垂相邻的非靶特异性双链区的长度选自由以下项组成的组：2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个核苷酸。

在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向诱发剂包含一个或多个经修饰的核苷酸。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的5′悬垂包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个脱氧核糖核苷酸。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的5′悬垂仅由脱氧核糖核苷酸构成。

本公开的dsRNA分子或定向触发剂还可以包含可变长度的接头序列，所述接头序列邻接两个相邻的sRNA触发序列。在一方面，如本文所公开的接头序列为约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个核苷酸长。

在一方面，如本文所公开的接头序列包含非靶特异性序列。在另一方面，如本文所公开的接头序列包含合成序列。在另一方面，如本文所公开的接头序列富含腺嘌呤或尿嘧啶。在一方面，本文使用的接头序列的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％包含腺嘌呤(A)或尿嘧啶(U)。在另一方面，如本文所公开的接头序列包含序列5′-AAAAG-3′(SEQID NO：80)。

本公开的dsRNA分子或定向触发剂还可为编码一个或多个sRNA双链体的链选择性触发剂或嵌合体，所述sRNA双链体优先使其反义链作为引导链。在一方面，从本公开的dsRNA分子或定向触发剂产生的至少最丰富的sRNA双链体优先使其反义链作为引导链。在另一方面，从本公开的dsRNA分子或定向触发剂产生的最丰富的和第二大最丰富的sRNA双链体优先使其反义链作为引导链。在另一方面，从本公开的dsRNA分子或定向触发剂产生的最丰富的，第二大最丰富的和第三大最丰富的sRNA双链体优先使其反义链作为引导链。在另一方面，从本公开的dsRNA分子或定向触发剂产生的最丰富的，第二大最丰富的，第三大最丰富的，第四大最丰富的sRNA双链体优先使其反义链作为引导链。sRNA双链体的引导链是加载到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中以引导对互补mRNA分子的识别并触发后续沉默的链。

在一方面，由如本文所公开的链选择性触发剂所编码的至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多sRNA双链体使其反义链作为引导链。在另一方面，由如本文所公开的链选择性触发剂所编码的小于10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的sRNA双链体使其有义链作为引导链。

在一方面，由如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂编码的sRNA双链体在其反义链的5′端处包含尿嘧啶或胞嘧啶。在另一方面，由如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂编码的至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.5％的sRNA双链体在其反义链的5′端包含尿嘧啶或胞嘧啶。

在另一方面，由本公开的dsRNA分子或定向触发剂编码的sRNA双链体在其有义链的5′端包含鸟嘌呤。在另一方面，由本公开的dsRNA分子或定向触发剂编码的sRNA双链体在其反义链的5′端包含尿嘧啶或胞嘧啶，并且在其有义链的5′端包含鸟嘌呤。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂包含在具有2个核苷酸的3′悬垂的相同链上的位置21处的尿嘧啶或胞嘧啶，其中位置21是相对于所述2个核苷酸的3′悬垂的末端的第21个核苷酸。

与非定向触发剂相比，本公开的dsRNA分子或定向触发剂可以被加工成更均一化的sRNA群体。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂产生主要来源于dsRNA分子或定向触发剂的特定区域或链的sRNA。在一方面，由如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂产生的sRNA主要来源于所述dsRNA分子或定向触发剂的反义链的3′端。在另一方面，由如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂产生的总sRNA中的至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.5％主要来源于所述dsRNA分子或定向触发剂的反义链的3′端。在另一方面，由如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂产生的21-24nt的总sRNA中的至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.5％主要来源于所述dsRNA分子或定向触发剂的反义链的3′端。

与包含相似或基本上相同的靶特异性序列的非定向触发剂相比，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂可具有增加的沉默效率。在一方面，当如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂以非定向触发剂的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的浓度施加时，所述dsRNA分子或定向触发剂可以实现与由所述非定向触发剂所实现的类似、基本上相同或相同的靶基因表达降低百分比。

本公开的dsRNA分子或定向触发剂可以实现其靶的所需沉默程度所需的任何浓度施加至植物、植物部分或种子。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂当以选自由以下项组成的组的浓度施加于植物或种子时可导致靶基因表达的至少部分减少，显著减少，有效消除或抑制：小于约100μM、75μM、50μM、40μM、30μM、20μM、10μM、9μM、8μM、7μM、6μM、5μM、4μM、3μM、2μM、1μM、0.5μM、0.2μM、0.1μM、0.05μM，以及0.01μM。

在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂当以选自由以下项组成的组的浓度施加于植物或种子时可导致靶基因表达的至少部分减少，显著减少，有效消除或抑制：在0.1和10μM之间、在0.2和10μM之间、在0.3和10μM之间、在0.4和10μM之间、在0.5和10μM之间、在0.6和10μM之间、在0.7和10μM之间、在0.8和10μM之间、在0.9和10μM之间、在1和10μM之间、在2和10μM之间、在3和10μM之间、在4和10μM之间、在5和10μM之间、在6和10μM之间、在7和10μM之间、在8和10μM之间以及在9和10μM之间。

在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂当以选自由以下项组成的组的浓度施加于植物或种子时可导致靶基因表达的至少部分减少，显著减少，有效消除或抑制：在0.1和10μM之间、在0.2和9μM之间、在0.3和8μM之间、在0.4和7μM之间、在0.5和6μM之间、在0.6和5μM之间、在0.7和4μM之间、在0.8和3μM之间以及在0.9和2μM之间。

在另一个方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂当以选自由以下项组成的组的浓度施加于植物或种子时可导致靶基因表达的至少部分减少，显著减少，有效消除或抑制：在0.1和10μM之间、在0.1和9μM之间、在0.1和8μM之间、在0.1和7μM之间、在0.1和6μM之间、在0.1和5μM之间、在0.1和4μM之间、在0.1和3μM之间、在0.1和2μM之间、在0.1和1μM之间、在0.1和0.9μM之间、在0.1和0.8μM之间、在0.1和0.7μM之间、在0.1和0.6μM之间、在0.1和0.5μM之间、在0.1和0.4μM之间、在0.1和0.3μM之间以及在0.1和0.2μM之间。

在一方面，本公开提供了dsRNA分子，其中将dsRNA分子群体加工成一个或多个21-24聚体sRNA优先从具有3′悬垂的末端开始，并且其中由其加工成的可检测到的21-24聚体sRNA的至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％包含与紧邻3′悬垂的至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个核苷酸的第一双链部分的序列相同的序列。在一方面，dsRNA分子是定向触发剂。在一方面，3′悬垂的长度为1个、2个或3个核苷酸。在另一方面，3′悬垂的长度大于3个核苷酸。在另一方面，dsRNA分子还包含5′悬垂。在另一方面，5′悬垂在具有3′悬垂的同一链上。在另一方面，5′悬垂为3至5个核苷酸长。在另一方面，5′悬垂包含脱氧核糖核苷酸。在另一方面，5′悬垂在末端处包含一个、两个或三个鸟嘌呤。在另一方面，dsRNA分子的长度在约45和约75个核苷酸之间。在另一方面，dsRNA分子还包含编码相同数目的sRNA双链体的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列在单个天然存在的dsRNA分子中不存在。在另一方面，dsRNA分子还包含编码相同数目的sRNA双链体的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列在单个天然存在的分子中不连续。在另一方面，dsRNA分子还包含编码相同数目的sRNA双链体的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列由一个或多个合成接头序列邻接。在一方面，接头序列为约5个核苷酸长。在另一方面，接头序列是富含腺嘌呤或富含尿嘧啶的序列。在一方面，两种或更多种sRNA双链体靶向相同的基因。在另一方面，所述两种或更多种sRNA双链体不靶向相同的基因。在另一方面，两种或更多种sRNA双链体中的每一种靶向不同的基因。在一方面，两个或更多个sRNA双链体中的每一个的引导链来自dsRNA分子的相同链。在另一个方面，两个或更多个sRNA群体的每一个的引导链来自dsRNA分子的反义链。在另一方面，两个或更多个sRNA双链体中的每一个的引导链来自dsRNA分子的相反链。在另一方面，两个或更多个sRNA触发序列中的每一个的长度在约20和约30个核苷酸之间。在一方面，dsRNA分子包含在具有3′悬垂的相同链上的位置21处的尿嘧啶，位置21是相对于3′悬垂的末端的第21个核苷酸。在另一方面，其中dsRNA分子还包含在具有3′悬垂的相同链上的位置20处的尿嘧啶，位置20是相对于3′悬垂的末端的第20个核苷酸。在另一方面，dsRNA分子的3′悬垂末端的5′端核苷酸是鸟嘌呤。

在一方面，本公开提供了dsRNA分子，其中在距3′悬垂的3′末端约21至24个核苷酸的位置处用Dicer样蛋白质第一次切割dsRNA分子，并且其中由所述dsRNA分子群体加工成的可检测到的21-24聚体sRNA的至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％包含与紧邻3′悬垂的至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个核苷酸的第一双链部分的序列相同的序列。在一方面，dsRNA分子是定向触发剂。在一方面，3′悬垂的长度为1个、2个或3个核苷酸。在另一方面，3′悬垂的长度大于3个核苷酸。在另一方面，dsRNA分子还包含5′悬垂。在另一方面，5′-悬垂在具有3′-悬垂的同一链上。在另一方面，5′悬垂为3至5个核苷酸长。在另一方面，5′悬垂包含脱氧核糖核苷酸。在另一方面，5′悬垂在末端处包含一个、两个或三个鸟嘌呤。在另一方面，dsRNA分子的长度在约45和约75个核苷酸之间。在另一方面，dsRNA分子还包含编码相同数目的sRNA双链体的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列在单个天然存在的dsRNA分子中不存在。在另一方面，dsRNA分子还包含编码相同数目的sRNA双链体的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列在单个天然存在的分子中不连续。在另一方面，dsRNA分子还包含编码相同数目的sRNA双链体的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列由一个或多个合成接头序列邻接。在一方面，接头序列为约5个核苷酸长。在另一方面，接头序列是富含腺嘌呤或富含尿嘧啶的序列。在一方面，两种或更多种sRNA双链体靶向相同的基因。在另一方面，所述两种或更多种sRNA双链体不靶向相同的基因。在另一方面，两种或更多种sRNA双链体中的每一种靶向不同的基因。在一方面，两个或更多个sRNA双链体中的每一个的引导链来自dsRNA分子的相同链。在另一个方面，两个或更多个sRNA群体的每一个的引导链来自dsRNA分子的反义链。在另一方面，两个或更多个sRNA双链体中的每一个的引导链来自dsRNA分子的相反链。在另一方面，两个或更多个sRNA触发序列中的每一个的长度在约20和约30个核苷酸之间。在一方面，dsRNA分子包含在具有3′悬垂的相同链上的位置21处的尿嘧啶，位置21是相对于3′悬垂的末端的第21个核苷酸。在另一方面，其中dsRNA分子还包含在具有3′悬垂的相同链上的位置20处的尿嘧啶，位置20是相对于3′悬垂的末端的第20个核苷酸。在另一方面，dsRNA分子的3′悬垂末端的5′端核苷酸是鸟嘌呤。

在一方面，本公开提供了包含5′悬垂的dsRNA分子，其中在距所述dsRNA分子的3′末端约21至24个核苷酸的位置处用Dicer样蛋白质第一次切割dsRNA分子，并且其中由所述dsRNA分子群体加工成的可检测到的21-24聚体sRNA的至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％包含与至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个核苷酸的第一双链部分的序列相同的序列。在一方面，dsRNA分子是定向触发剂。在一方面，3′末端包括长度为1个、2个或3个核苷酸的3′悬垂。在另一方面，3′悬垂的长度大于3个核苷酸。在另一方面，5′悬垂在具有3′悬垂的同一链上。在另一方面，5′悬垂为3至5个核苷酸长。在另一方面，5′悬垂包含脱氧核糖核苷酸。在另一方面，5′悬垂在末端处包含一个、两个或三个鸟嘌呤。在另一方面，dsRNA分子的长度在约45和约75个核苷酸之间。在另一方面，dsRNA分子还包含编码相同数目的sRNA双链体的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列在单个天然存在的dsRNA分子中不存在。在另一方面，dsRNA分子还包含编码相同数目的sRNA双链体的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列在单个天然存在的分子中不连续。在另一方面，dsRNA分子还包含编码相同数目的sRNA双链体的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列由一个或多个合成接头序列邻接。在一方面，接头序列为约5个核苷酸长。在另一方面，接头序列是富含腺嘌呤或富含尿嘧啶的序列。在一方面，两种或更多种sRNA双链体靶向相同的基因。在另一方面，所述两种或更多种sRNA双链体不靶向相同的基因。在另一方面，两种或更多种sRNA双链体中的每一种靶向不同的基因。在一方面，两个或更多个sRNA双链体中的每一个的引导链来自dsRNA分子的相同链。在另一个方面，两个或更多个sRNA群体的每一个的引导链来自dsRNA分子的反义链。在另一方面，两个或更多个sRNA双链体中的每一个的引导链来自dsRNA分子的相反链。在另一方面，两个或更多个sRNA触发序列中的每一个的长度在约20和约30个核苷酸之间。在一方面，dsRNA分子包含在具有5′悬垂的相同链上的位置21处的尿嘧啶，位置21是相对于所述dsRNA分子的3′末端的第21个核苷酸。在另一方面，其中dsRNA分子还包含在具有5′悬垂的相同链上的位置20处的尿嘧啶，位置20是相对于3′端的末端的第20个核苷酸。在另一方面，dsRNA分子的3′悬垂末端的5′端核苷酸是鸟嘌呤。

在一方面，本公开提供了dsRNA分子，其中将dsRNA分子群体加工成一个或多个21-24聚体小RNA(sRNA)优先从dsRNA分子的一个末端开始，并且其中由所述dsRNA分子群体加工成的最丰富的可检测到的21-24聚体sRNA包含与紧邻3′悬垂的至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个核苷酸的第一双链部分的序列相同的序列。在另一方面，从如本文所公开的dsRNA分子群体加工成的第二大最丰富的可检测到的21-24聚体sRNA包含与紧邻第一双链部分的序列相同的序列。在一方面，dsRNA分子是定向触发剂。在一方面，3′悬垂的长度为1个、2个或3个核苷酸。在另一方面，3′悬垂的长度大于3个核苷酸。在另一方面，dsRNA分子还包含5′悬垂。在另一方面，5′悬垂在具有3′悬垂的同一链上。在另一方面，5′悬垂为3至5个核苷酸长。在另一方面，5′悬垂包含脱氧核糖核苷酸。在另一方面，5′悬垂在末端处包含一个、两个或三个鸟嘌呤。在另一方面，dsRNA分子的长度在约45和约75个核苷酸之间。在另一方面，dsRNA分子还包含编码相同数目的sRNA双链体的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列在单个天然存在的dsRNA分子中不存在。在另一方面，dsRNA分子还包含编码相同数目的sRNA双链体的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列在单个天然存在的分子中不连续。在另一方面，dsRNA分子还包含编码相同数目的sRNA双链体的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列由一个或多个合成接头序列邻接。在一方面，接头序列为约5个核苷酸长。在另一方面，接头序列是富含腺嘌呤或富含尿嘧啶的序列。在一方面，两种或更多种sRNA双链体靶向相同的基因。在另一方面，所述两种或更多种sRNA双链体不靶向相同的基因。在另一方面，两种或更多种sRNA双链体中的每一种靶向不同的基因。在一方面，两个或更多个sRNA双链体中的每一个的引导链来自dsRNA分子的相同链。在另一个方面，两个或更多个sRNA群体的每一个的引导链来自dsRNA分子的反义链。在另一方面，两个或更多个sRNA双链体中的每一个的引导链来自dsRNA分子的相反链。在另一方面，两个或更多个sRNA触发序列中的每一个的长度在约20和约30个核苷酸之间。在一方面，dsRNA分子包含在具有3′悬垂的相同链上的位置21处的尿嘧啶，位置21是相对于3′悬垂的末端的第21个核苷酸。在另一方面，其中dsRNA分子还包含在具有3′悬垂的相同链上的位置20处的尿嘧啶，位置20是相对于3′悬垂的末端的第20个核苷酸。在另一方面，dsRNA分子的3′悬垂末端的5′端核苷酸是鸟嘌呤。

在一方面，本公开提供了在dsRNA分子的第一末端包含5′悬垂的dsRNA分子，其中将dsRNA分子加工成一个或多个sRNA优先从dsRNA分子的第二末端开始，并且其中所述第一末端和所述第二末端是dsRNA分子的相对末端。在一方面，dsRNA分子是定向触发剂。在一方面，第二末端包含3′悬垂。在一方面，3′悬垂的长度为1个、2个或3个核苷酸。在另一方面，3′悬垂的长度大于3个核苷酸。在另一方面，dsRNA分子还包含5′悬垂。在另一方面，5′悬垂在具有3′悬垂的同一链上。在另一方面，5′悬垂为3至5个核苷酸长。在另一方面，5′-悬垂包含脱氧核糖核苷酸。在另一方面，5′悬垂在末端处包含一个、两个或三个鸟嘌呤。在另一方面，dsRNA分子的长度在约45和约75个核苷酸之间。在另一方面，dsRNA分子还包含编码相同数目的sRNA双链体的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列在单个天然存在的dsRNA分子中不存在。在另一方面，dsRNA分子还包含编码相同数目的sRNA双链体的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列在单个天然存在的分子中不连续。在另一方面，dsRNA分子还包含编码相同数目的sRNA双链体的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列由一个或多个合成接头序列邻接。在一方面，接头序列为约5个核苷酸长。在另一方面，接头序列是富含腺嘌呤或富含尿嘧啶的序列。在一方面，两种或更多种sRNA双链体靶向相同的基因。在另一方面，所述两种或更多种sRNA双链体不靶向相同的基因。在另一方面，两种或更多种sRNA双链体中的每一种靶向不同的基因。在一方面，两个或更多个sRNA双链体中的每一个的引导链来自dsRNA分子的相同链。在另一个方面，两个或更多个sRNA群体的每一个的引导链来自dsRNA分子的反义链。在另一方面，两个或更多个sRNA双链体中的每一个的引导链来自dsRNA分子的相反链。在另一方面，两个或更多个sRNA触发序列中的每一个的长度在约20和约30个核苷酸之间。在一方面，dsRNA分子包含在具有3′悬垂的相同链上的位置21处的尿嘧啶，位置21是相对于3′悬垂的末端的第21个核苷酸。在另一方面，其中dsRNA分子还包含在具有3′悬垂的相同链上的位置20处的尿嘧啶，位置20是相对于3′悬垂的末端的第20个核苷酸。在另一方面，dsRNA分子的3′悬垂末端的5′端核苷酸是鸟嘌呤。

在一方面，本公开提供了dsRNA分子，所述dsRNA分子包含编码相同数量的sRNA的两个或更多个sRNA触发序列，以及邻接所述两个或更多个sRNA触发序列的一个或多个富含腺嘌呤或尿嘧啶的接头序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列在单个天然存在的分子中不存在。在另一方面，dsRNA分子的长度在约45和约75个核苷酸之间。在一方面，接头序列为约5个核苷酸长。在一方面，接头序列是合成序列。在一方面，两种或更多种sRNA双链体靶向相同的基因。在另一方面，所述两种或更多种sRNA双链体不靶向相同的基因。在另一方面，两种或更多种sRNA双链体中的每一种靶向不同的基因。在一方面，两个或更多个sRNA双链体中的每一个的引导链来自dsRNA分子的相同链。在另一个方面，两个或更多个sRNA群体的每一个的引导链来自dsRNA分子的反义链。在另一方面，两个或更多个sRNA双链体中的每一个的引导链来自dsRNA分子的相反链。在另一方面，两个或更多个sRNA触发序列中的每一个的长度在约20和约30个核苷酸之间。

在一方面，本公开提供了dsRNA分子，所述dsRNA分子包含编码相同数量的sRNA的两个或更多个sRNA触发序列，以及邻接所述两个或更多个sRNA触发序列的一个或多个富含腺嘌呤或尿嘧啶的接头序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列在单个天然存在的分子中不连续。在另一方面，dsRNA分子的长度在约45和约75个核苷酸之间。在一方面，接头序列是合成序列。在一方面，接头序列为约5个核苷酸长。在另一方面，接头序列是富含腺嘌呤或富含尿嘧啶的序列。在一方面，两种或更多种sRNA双链体靶向相同的基因。在另一方面，所述两种或更多种sRNA双链体不靶向相同的基因。在另一方面，两种或更多种sRNA双链体中的每一种靶向不同的基因。在一方面，两个或更多个sRNA双链体中的每一个的引导链来自dsRNA分子的相同链。在另一个方面，两个或更多个sRNA群体的每一个的引导链来自dsRNA分子的反义链。在另一方面，两个或更多个sRNA双链体中的每一个的引导链来自dsRNA分子的相反链。在另一方面，两个或更多个sRNA触发序列中的每一个的长度在约20和约30个核苷酸之间。

在一方面，本公开提供了dsRNA分子，所述dsRNA分子包含3′悬垂和5′悬垂，并且还包含编码相同数量的sRNA的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列在单个天然存在的分子中不存在。在另一方面，dsRNA分子的长度在约45和约75个核苷酸之间。在一方面，dsRNA分子是定向触发剂。在另一方面，dsRNA分子是定向嵌合触发剂。在另一方面，dsRNA分子是链选择性嵌合触发剂。在一方面，3′悬垂的长度为1个、2个或3个核苷酸。在另一方面，3′悬垂的长度大于3个核苷酸。在另一方面，5′悬垂在具有3′悬垂的同一链上。在另一方面，5′悬垂为3至5个核苷酸长。在另一方面，5′悬垂包含脱氧核糖核苷酸。在另一方面，5′悬垂在末端处包含一个、两个或三个鸟嘌呤。在另一方面，dsRNA分子还包含一个或多个合成接头序列，所述一个或多个合成接头序列邻接两个或多个sRNA触发序列。在一方面，所述合成接头序列为约5个核苷酸长。在另一方面，所述合成接头序列是富含腺嘌呤或富含尿嘧啶的序列。在一方面，两种或更多种sRNA双链体靶向相同的基因。在另一方面，所述两种或更多种sRNA双链体不靶向相同的基因。在另一方面，两种或更多种sRNA双链体中的每一种靶向不同的基因。在一方面，两个或更多个sRNA双链体中的每一个的引导链来自dsRNA分子的相同链。在另一个方面，两个或更多个sRNA群体的每一个的引导链来自dsRNA分子的反义链。在另一方面，两个或更多个sRNA双链体中的每一个的引导链来自dsRNA分子的相反链。在另一方面，两个或更多个sRNA触发序列中的每一个的长度在约20和约30个核苷酸之间。在一方面，dsRNA分子包含在具有3′悬垂的相同链上的位置21处的尿嘧啶，位置21是相对于3′悬垂的末端的第21个核苷酸。在另一方面，其中dsRNA分子还包含在具有3′悬垂的相同链上的位置20处的尿嘧啶，位置20是相对于3′悬垂的末端的第20个核苷酸。在另一方面，dsRNA分子的3′悬垂末端的5′端核苷酸是鸟嘌呤。

在一方面，本公开提供了dsRNA分子，所述dsRNA分子包含3′悬垂和5′悬垂，并且还包含编码相同数量的sRNA的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列在单个天然存在的分子中不连续。在另一方面，dsRNA分子的长度在约45和约75个核苷酸之间。在一方面，dsRNA分子是定向触发剂。在另一方面，dsRNA分子是定向嵌合触发剂。在另一方面，dsRNA分子是链选择性嵌合触发剂。在一方面，3′-悬垂的长度为1个、2个或3个核苷酸。在另一方面，3′悬垂的长度大于3个核苷酸。在另一方面，5′悬垂在具有3′悬垂的同一链上。在另一方面，5′悬垂为3至5个核苷酸长。在另一方面，5′悬垂包含脱氧核糖核苷酸。在另一方面，5′悬垂在末端处包含一个、两个或三个鸟嘌呤。在另一方面，dsRNA分子还包含一个或多个合成接头序列，所述一个或多个合成接头序列邻接两个或多个sRNA触发序列。在一方面，所述合成接头序列为约5个核苷酸长。在另一方面，所述合成接头序列是富含腺嘌呤或富含尿嘧啶的序列。在一方面，两种或更多种sRNA双链体靶向相同的基因。在另一方面，所述两种或更多种sRNA双链体不靶向相同的基因。在另一方面，两种或更多种sRNA双链体中的每一种靶向不同的基因。在一方面，两个或更多个sRNA双链体中的每一个的引导链来自dsRNA分子的相同链。在另一个方面，两个或更多个sRNA群体的每一个的引导链来自dsRNA分子的反义链。在另一方面，两个或更多个sRNA双链体中的每一个的引导链来自dsRNA分子的相反链。在另一方面，两个或更多个sRNA触发序列中的每一个的长度在约20和约30个核苷酸之间。在一方面，dsRNA分子包含在具有3′悬垂的相同链上的位置21处的尿嘧啶，位置21是相对于3′悬垂的末端的第21个核苷酸。在另一方面，其中dsRNA分子还包含在具有3′悬垂的相同链上的位置20处的尿嘧啶，位置20是相对于3′悬垂的末端的第20个核苷酸。在另一方面，dsRNA分子的3′悬垂末端的5′端核苷酸是鸟嘌呤。

在一方面，本公开的dsRNA分子或定向触发剂包含选自由以下项组成的组的一个、两个、三个、四个、五个或更多个特征：(a)各自编码一种sRNA的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列在单个天然存在的分子中不存在，或在单个天然存在的分子中不连续，(b)长度在约45和约75个核苷酸之间，(c)包含一个或多个富含腺嘌呤或尿嘧啶的接头序列，所述接头序列邻接所述两个或多个sRNA触发序列，(d)包含在反义链中的3′悬垂，(e)包含在所述反义链中相对于3′悬垂的末端的位置20和21处的尿嘧啶，(f)3至5个核苷酸的5′悬垂，以及(g)它们的组合。

在一方面，本公开的dsRNA分子或定向触发剂包含：包含3′悬垂的第一末端部分，包含5′悬垂的第二末端部分，以及两个或更多个靶特异性序列，所述两个或更多个靶特异性序列通过一个或多个接头序列邻接。在另一方面，dsRNA分子的长度在约45和约75个核苷酸之间。在一方面，3′悬垂的长度为1个、2个或3个核苷酸。在另一方面，3′悬垂的长度大于3个核苷酸。在另一方面，5′悬垂在具有3′悬垂的同一链上。在另一方面，5′悬垂为3至5个核苷酸长。在另一方面，5′悬垂包含脱氧核糖核苷酸。在另一方面，5′悬垂在末端处包含一个、两个或三个鸟嘌呤。在另一方面，所述一个或多个接头序列是合成序列。在一方面，所述合成接头序列为约5个核苷酸长。在另一方面，所述合成接头序列是富含腺嘌呤或富含尿嘧啶的序列。在一方面，所述两个或更多个靶特异性序列可以在天然存在的分子中存在，但在所述分子中不连续。在另一方面，所述两个或更多个靶特异性序列来自不同的基因。在另一方面，所述两个或更多个靶特异性序列来自两个不同的天然存在的分子。在一方面，所述两个或更多个靶特异性序列中的至少一个的长度在约20和约30个核苷酸之间。在另一方面，所述两个或更多个靶特异性序列中的每一个的长度在约20和约30个核苷酸之间。在一方面，dsRNA分子包含在具有3′悬垂的相同链上的位置21处的尿嘧啶，位置21是相对于3′悬垂的末端的第21个核苷酸。在另一方面，其中dsRNA分子还包含在具有3′悬垂的相同链上的位置20处的尿嘧啶，位置20是相对于3′悬垂的末端的第20个核苷酸。在另一方面，dsRNA分子的3′悬垂末端的5′端核苷酸是鸟嘌呤。

在一方面，由如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂产生的sRNA可以通过任何RNA沉默机制来调控靶基因的表达。示例性机制包括RNA切割，翻译或转录衰减，DNA或染色质修饰。

本公开的核酸分子可以通过在本领域中已知的任何合成方法合成，诸如酶促合成或固相合成。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂是化学合成的。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂是酶促产生的。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂是在体外酶促产生的。多核苷酸的实际合成完全在本领域的技术人员的能力范围内，并且可以通过如在例如“Molecular Cloning：A Laboratory Manual，”Sambrook等人，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology，”第I-III卷，Ausubel，R.M.编辑(1994)；Ausubel等人，“Current Protocols in Molecular Biology，”John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide toMolecular Cloning，”John Wiley&Sons，New York(1988)和“OligonucleotideSynthesis，”Gait，M.J.编辑(1984)中描述的已确立方法利用固相化学品(例如氰乙基亚磷酰胺)完成，然后通过例如自动化加三苯甲基(trityl-on)方法或HPLC进行去保护、脱盐和纯化。用于进行固相合成的设备和试剂可从例如Applied Biosystems公司商购获得。也可以使用用于此类合成的任何其它手段，例如，购自Ambion公司的试剂盒，所述试剂盒具有连接在5′端上、编码细菌T7聚合酶启动子的DNA，所述细菌T7聚合酶启动子使得产生能够组装成dsRNA的RNA链。或者，dsRNA分子可以由表达盒在具有经过调控或不足的RNA酶III酶活性的细菌细胞中产生。在一方面，设计参数如雷诺兹评分(Reynolds score)和塔斯尔规则(Tuschl rules)在本领域中是已知的并且用于选择在基因沉默方面有效的多核苷酸序列。在另一方面，使用对多核苷酸序列的随机设计或经验选择来选择在基因沉默方面有效的多核苷酸序列。在另一方面，筛选抗预期植物基因组DNA的多核苷酸序列，以最小化其它基因的非有意沉默。

合成后，可任选地纯化本公开的核酸分子。例如，可以通过用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、色谱法或它们的组合来从混合物中纯化出多核苷酸。或者，多核苷酸可以不经纯化或在最少纯化的情况下使用，以避免由于样品处理造成损失。多核苷酸可以干燥贮藏或溶解在水溶液中。所述溶液可以含有缓冲液和盐类以促进双链体链的退火和/或稳定化。

本公开提供了重组构建体，所述重组构建体包含植物可表达的启动子，所述启动子有效连接至编码如本文所述的定向触发剂的核苷酸序列。在一个实施方案中，本文所用的启动子选自由以下项组成的组：组成型启动子，组织特异性启动子，以及诱导型启动子。在一个实施方案中，组成型启动子是CaMV 35S启动子。在另一个实施方案中，启动子是非生物胁迫诱导型启动子。

本公开还提供了转基因植物，所述转基因植物从上述重组构建体表达定向触发剂。在一个实施方案中，定向触发剂在转基因植物中稳定地表达。在另一个实施方案中，定向触发剂在转基因植物中瞬时表达。

本公开的dsRNA分子或定向触发剂可以包含各种化学修饰，包括但不限于经修饰的碱基，经修饰的糖主链以及经修饰的核苷间键。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂是经化学修饰的，所述修饰能够增强dsRNA分子或定向触发剂到植物细胞中的递送，改善其在植物细胞中的稳定性，或两者。在另一方面，dsRNA分子或定向触发剂包含胆固醇部分。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合，例如主要由核糖核苷酸构成但具有一个或多个末端脱氧核糖核苷酸的合成多核苷酸。

在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂在所述定向触发剂的任何部分中，优先在5′或3′悬垂中，包含任何种类的一个或多个经修饰的核苷酸。示例性的经修饰RNA核苷酸可见于Limbach等人，Summary：the modified nucleosides of RNA.NucleicAcids Res.1994，22(12)：2183-96；和Abeydeera等人，2008，Modified Nucleosides inRNA.Wiley Encyclopedia of Chemical Biology.1-14，这两个参考文献全文以引用方式并入。其它示例性经修饰的核苷酸可以包括经修饰的碱基，包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤素(特别是5-溴)、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂包括非规范核苷酸，诸如肌苷、硫尿苷或假尿苷。

在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂包含经修饰的多核苷酸主链，包括但不限于硫代磷酸根、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫羰烷基磷酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯。

在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂是除草组合物、杀昆虫组合物或杀虫组合物的一种活性成分。本公开的dsRNA分子或定向触发剂可以是组合物的组成部分，所述组合物还包含各种分子或试剂。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂是与已知与核酸分子缔合的抗衡离子或其它分子一起配制的，所述抗衡离子或其它分子为例如四烷基铵离子、三烷基铵离子、锍离子、锂离子以及多胺(诸如精胺、亚精胺或腐胺)。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂是与非多核苷酸除草剂(例如，草甘膦、2，4-二氯丙酸、溴苯腈、磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶基氧苯甲酸酯、苯酞、双丙氨磷、草丁膦、草胺膦、莠去津、麦草畏、环己二酮(稀禾定)和芳氧苯氧丙酸酯类(吡氟氯禾灵))一起配制的。在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂构成了液体除草组合物的活性成分。

在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂是与转移剂或渗透性增强剂一起配制的，所述转移剂或渗透性增强剂调节植物组织(例如，种子、叶、茎、根、花或果实)的表面，以使dsRNA分子或定向触发剂渗透到植物细胞中。可以通过向植物组织预先或同时施加转移剂来促进如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂向植物细胞内的转移。转移剂实现了用于使dsRNA穿过角质层蜡质屏障、气孔和/或细胞壁或膜屏障并进入植物细胞中的路径。

用于促进dsRNA分子或定向触发剂到植物细胞内的转移的合适试剂包括增加植物外部的渗透性或增加植物细胞对寡核苷酸或多核苷酸的渗透性的试剂。此类试剂包括但不限于化学试剂、物理试剂，或它们的组合。用于调节的化学试剂包括但不限于(a)表面活性剂，(b)有机溶剂或水溶液或有机溶剂的水性混合物，(c)氧化剂，(d)酸，(e)碱，(f)油，(g)酶，或它们的组合。本文设想的转移剂还可包括湿润剂或螯合剂。

用于调节植物渗透性的示例性试剂或处理包括但不限于乳液、反相乳液、脂质体，以及其它胶束样组合物。其它示例性试剂或处理包括已知与核酸分子缔合的抗衡离子或其它分子，所述抗衡离子或其它分子为例如无机铵离子、烷基铵离子、锂离子、多胺(诸如精胺、亚精胺或腐胺)，以及其它阳离子。用于调节植物的多核苷酸渗透性的有机溶剂包括DMSO、DMF、吡啶、N-吡咯烷、六甲基磷酰胺、乙腈、二噁烷、聚丙二醇、与水可混溶的或将在非水体系中溶解磷酸核苷酸的其它溶剂(诸如用于合成反应中)。可以使用含有或不含有表面活性剂或乳化剂的天然来源的或合成的油，例如植物来源的油、作物油、石蜡油、多元醇-脂肪酸酯，以及具有用酰胺或多胺(诸如聚乙烯亚胺)或N-吡咯烷改性的短链分子的油。包含如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的组合物还可包含有机或无机盐。在一方面，所述盐是铵盐，例如硫酸铵。

促进dsRNA到植物细胞内的摄取的示例性表面活性剂包括脂肪酸钠盐或锂盐(例如牛脂或牛脂胺或磷脂)和有机硅氧烷表面活性剂。其它示例性表面活性剂包括有机硅氧烷表面活性剂，包括非离子有机硅氧烷表面活性剂，例如三硅氧烷乙氧基化物表面活性剂或硅氧烷聚醚共聚物，诸如聚环氧烷改性的七甲基三硅氧烷和烯丙氧基聚丙二醇甲基醚的共聚物(可作为Silwet L-77表面活性剂商购获得)。当Silwet L-77表面活性剂用于处理植物种子、叶或其它表面时，在约0.015至约2重量％(wt％)的范围内(例如，约0.01重量％、0.015重量％、0.02重量％、0.025重量％、0.03重量％、0.035重量％、0.04重量％、0.045重量％、0.05重量％、0.055重量％、0.06重量％、0.065重量％、0.07重量％、0.075重量％、0.08重量％、0.085重量％、0.09重量％、0.095重量％、0.1重量％、0.2重量％、0.3重量％、0.4重量％、0.5重量％、0.6重量％、0.7重量％、0.8重量％、0.9重量％、1.0重量％、1.1重量％、1.2重量％、1.3重量％、1.4重量％、1.5重量％、1.6重量％、1.7重量％、1.8重量％、1.9重量％、2.0重量％、2.1重量％、2.2重量％、2.3重量％、2.4重量％、2.5重量％)的浓度可有效制备种子、叶或其它植物表面，从而将dsRNA分子或定向触发剂转移到植物细胞内。

促进dsRNA到植物细胞内的摄取的示例性物理试剂包括但不限于(a)研磨剂，诸如金刚砂、刚玉、沙、方解石、浮石、石榴石等，(b)纳米颗粒，诸如碳纳米管，或(c)物理力。碳纳米管由Kam等人，(2004)J.Am.Chem.Soc.，126(22)：6850-6851，Liu等人，(2009)NanoLett.，9(3)：1007-1010以及Khodakovskaya等人，(2009)ACS Nano，3(10)：3221-3227公开。物理力试剂可包括加热、冷却、施加正压力或超声处理。

在另一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂可以与细胞穿透肽在功能上相关，所述细胞穿透肽是包含短(约12-30个残基)氨基酸序列或功能基序的肽，所述短氨基酸序列或功能基序赋予与可透过膜的复合物跨细胞的细胞质和/或核膜的转运相关的非能量依赖性(例如，非内吞的)转位性质。在本公开的可透过膜的复合物中使用的细胞穿透肽优选包含至少一个非功能性半胱氨酸残基，其是游离的或经衍生以与已经为形成二硫键连接而经修饰的dsRNA形成此类二硫键连接。赋予此类性质的代表性氨基酸基序在美国专利No.6,348,185中列出，该专利的内容以引用方式明确地并入本文。本公开的细胞穿透肽优选包括但不限于穿膜肽、转运素(transportan)、pIs1、TAT(48-60)、pVEC、MTS和MAP。

可以通过在本领域中已知的任何方法将dsRNA分子或定向触发剂或包含本公开的dsRNA分子或定向触发剂的组合物施加于植物或植物部分，所述方法为例如喷涂、浸润(浸润)、浸泡，或用粉末、乳液、悬浮液或溶液涂覆。在一方面，如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂是对植物细胞外源的。

本公开还提供了用如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂处理过的植物和植物部分。本公开还提供了包含如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的植物和植物部分。

在一方面，用本公开的dsRNA分子处理过的植物和植物部分包含dsRNA分子的至少1种、2种或3种靶基因的减少表达。在另一方面，用本公开的dsRNA分子处理过的植物和植物部分包含dsRNA分子的至少1种、2种或3种靶基因的部分减少表达。在另一方面，用本公开的dsRNA分子处理过的植物和植物部分包含dsRNA分子的至少1种、2种或3种靶基因的显著减少表达。在另一方面，用本公开的dsRNA分子处理过的植物和植物部分包含对dsRNA分子的至少1种、2种或3种靶基因的表达的有效消除。

在一方面，包含本公开的dsRNA分子的植物和植物部分包含dsRNA分子的至少1种、2种或3种靶基因的减少表达。在另一方面，包含本公开的dsRNA分子的植物和植物部分包含dsRNA分子的至少1种、2种或3种靶基因的部分减少表达。在另一方面，包含本公开的dsRNA分子的植物和植物部分包含dsRNA分子的至少1种、2种或3种靶基因的显著减少表达。在另一方面，包含本公开的dsRNA分子的植物和植物部分包含对dsRNA分子的至少1种、2种或3种靶基因的表达的有效消除。

根据本公开的一些实施方案可设想任何商业上或科学上有价值的植物。在本公开的方法中特别有用的植物包括属于超家族绿色植物界(Viridiplantae)的所有植物，特别是选自包括以下项的列表的单子叶和双子叶植物(包括豆科饲料或草料植物)、观赏植物、食用作物、树或灌木：金合欢属某些种(Acacia spp.)、槭属某些种(Acer spp.)、猕猴桃属某些种(Actinidia spp.)、七叶树属某些种(Aesculus spp.)、贝壳杉(Agathisaustralis)、阿马拉合欢(Albizia amara)、三色桫椤(Alsophila tricolor)、须芒草属某些种(Andropogon spp.)、落花生属某些种(Arachis spp.)、槟榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、鹰嘴紫云英(Astragalus cicer)、多小叶红苏木(Baikiaeaplurijuga)、桦属某些种(Betula spp.)、芸苔属某些种(Brassica spp.)、木榄(Bruguieragymnorrhiza)、红紫丁香(Burkea africana)、紫铆(Butea frondosa)、粉质胚乳白花菜(Cadaba farinosa)、朱缨花属某些种(Calliandra spp.)、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒属某些种(Capsicum spp.)、决明属某些种(Cassia spp.)、距瓣豆(Centroema pubescens)、木瓜属某些种(Chacoomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、可乐豆(Colophospermum mopane)、绣球小冠花(Coronilliavaria)、沙枸子(Cotoneaster serotina)、山楂属某些种(Crataegus spp.)、甜瓜属某些种(Cucumis spp.)、柏木属某些种(Cupressus spp.)、银蕨(Cyathea dealbata)、榅桲(Cydonia oblonga)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅属某些种(Cymbopogonspp.)、银背番桫椤(Cynthea dealbata)、榅桲(Cydonia oblonga)、货贝黄檀(Dalbergiamonetaria)、大叶骨碎补(Davallia divaricata)、山蚂蝗属某些种(Desmodium spp.)、粗糙蚌壳蕨(Dicksonia squarosa)、拢双黄茅(Dibeteropogon amplectens)、迪奥豆属某些种(Dioclea spp.)、镰扁豆属某些种(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、锥形稗(Echinochloa pyramidalis)、拉菲草属某些种(Ehraffia spp.)、穇子(Eleusinecoracana)、画眉草属某些种(Eragrestis spp.)、刺桐属某些种(Erythrina spp.)、桉属某些种(Eucalyptus spp.)、希氏假乌木(Euclea schimperi)、绒毛状金茅(Eulaliavillosa)、荞麦属某些种(Pagopyrum spp.)、费约果(Feijoa sellowlana)、草莓属某些种(Fragaria spp.)、千斤拔属某些种(Flemingia spp.)、河岸藤露兜树(Freycinetiabanksli)、东亚老鹳草(Geranium thunbergii)、银杏(GinAgo biloba)、野大豆(Glycinejavanica)、墨西哥丁香属某些种(Gliricidia spp.)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、银桦属某些种(Grevillea spp.)、鞘籽古夷布提木(Guibourtia coleosperma)、岩黄芪属某些种(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemaffhia altissima)、黄茅(Heteropogon contoffus)、大麦(Hordeum vulgare)、红苞茅(Hyparrhenia rufa)、小连翘(Hypericum erectum)、Hypeffhelia dissolute、异花木蓝(Indigo incamata)、鸢尾属某些种(Iris spp.)、雨伞草(Leptarrhena pyrolifolia)、胡枝子属某些种(Lespediza spp.)、莴苣属某些种(Lettuca spp.)、银合欢(Leucaena leucocephala)、单罗得草(Loudetia simplex)、Lotonus bainesli、百脉根属某些种(Lotus spp.)、阿切尔结豆(Macrotyloma axillare)、苹果属某些种(Malus spp.)、木薯(Manihot esculenta)、紫苜蓿(Medicago saliva)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、香蕉(Musa sapientum)、烟草属某些种(Nicotianumspp.)、驴食豆属某些种(Onobrychis spp.)、鸟足豆属某些种(Ornithopus spp.)、稻属某些种(Oryza spp.)、非洲双翼豆(Peltophorum africanum)、狼尾草属某些种(Pennisetumspp.)、酪梨(Persea gratissima)、碧冬茄属某些种(Petunia spp.)、菜豆属某些种(Phaseolus spp.)、槟榔竹(Phoenix canariensis)、新西兰剑麻(Phormium cookianum)、石楠属某些种(Photinia spp.)、白云杉(Picea glauca)、松属某些种(Pinus spp.)、豌豆(Pisum sativam)、新西兰罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、礼普格纳西亚草(Pogonaffhria squarrosa)、杨属某些种(Populus spp.)、瓜叶牧豆(Prosopiscineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、星状老虎刺(Pterolobium stellatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属某些种(Quercus spp.)、厚叶石斑木(Rhaphiolepsisumbellata)、美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、纳塔尔漆树(Rhus natalensis)、欧洲醋栗(Ribes grossularia)、茶蔗子属某些种(Ribes spp.)、刺槐(Robiniapseudoacacia)、蔷薇属某些种(Rosa spp.)、悬钩子属某些种(Rubus spp.)、柳属某些种(Salix spp.)、红裂稃草(Schyzachyrium sanguineum)、金松(Sciadopitysvefficillata)、北美红杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、两色高粱(Sorghum bicolor)、菠菜属某些种(Spinacia spp.)、流苏状鼠尾粟(Sporobolusfimbriatus)、Stiburus alopecuroides、矮柱花草(Stylosanthos humilis)、葫芦茶属某些种(Tadehagi spp.)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黄背草(Themedatriandra)、三叶草属某些种(Trifolium spp.)、小麦属某些种(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsuga heterophylla)、越桔属某些种(Vaccinium spp.)、蚕豆属某些种(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、锥穗沃森花(Watsonia pyramidata)、马蹄莲(Zantedeschiaaethiopica)、玉蜀黍(Zea mays)、苋属植物、朝鲜蓟、天门冬属植物、球花甘蓝、抱子甘蓝、卷心菜、油菜(canola)、胡萝卜、花椰菜、芹菜、散叶甘蓝(collard greens)、亚麻、羽衣甘蓝、兵豆、油籽油菜(oilseed rape)、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、苞谷、大麦、燕麦、花生、豌豆、小扁豆和紫花苜蓿、棉花、油菜籽、芥籽、胡椒、向日葵、烟草、茄子、桉树、树、观赏植物、多年生草和饲料作物。或者，藻类及其它非绿色植物可用于本发明的方法中。

根据本公开的一些实施方案，通过本公开的方法使用的植物是作物植物，包括但不限于棉花、芸苔属蔬菜、油籽油菜、芝麻、橄榄树、棕榈油、香蕉、小麦、玉米或玉蜀黍、大麦、苜蓿、花生、向日葵、水稻、燕麦、糖蔗、大豆、草皮草、大麦、黑麦、高粱、甘蔗、菊苣、莴苣、番茄、西葫芦、灯笼椒、茄子、黄瓜、甜瓜、西瓜、豆角、木槿、秋葵、苹果、玫瑰、草莓、辣椒、蒜、豌豆、兵豆、油菜(canola)、菊花(mums)、拟南芥属植物、球花甘蓝、卷心菜、甜菜、藜麦、菠菜、南瓜、洋葱、韭葱、烟草、马铃薯、糖用甜菜、木瓜、菠萝、芒果、拟南芥，以及用于园艺学、花卉栽培或林业的植物(诸如但不限于杨树、枞树、桉树、松树)、观赏植物、多年生草和饲料作物、针叶植物、苔藓、藻类、以及在互联网上在如nationmaster.com/encyclopedia/Plantae处可获得的其它植物。

根据一个具体实施方案，所述植物选自玉米、水稻、小麦、番茄、棉花和高粱。在某些实施方案中，所述植物是玉米植物。在某些实施方案中，所述植物是水稻植物。在某些实施方案中，所述植物是小麦植物。在某些实施方案中，所述植物是棉花植物。在某些实施方案中，所述植物是高粱植物。

可使用常规递送方法将本公开的组合物引入植物(与种子相对)的任何器官/细胞中，所述常规递送方法为诸如颗粒轰击、嫁接(grafting)、浸泡等。

在一方面，本公开还提供了用包含如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的组合物处理过的植物种子。在另一个方面，本公开还提供了包含如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂的组合物的植物种子。

在一方面，如本文所公开的包含定向触发剂的植物或种子包含一种或多种增强性状。如本文所用，“增强的性状”是指转基因植物的特征，所述特征包括但不限于以增强的植物形态、生理机能、生长和发育、产量、营养强化，抗病性或抗虫性，或环境或化学耐受性为特征的增强农学性状。在本公开的更具体方面，增强的性状选自由以下项组成的组：增强的水利用效率，增强的耐寒性，增加的产量，增加的氮利用效率，增加的籽粒蛋白和增加的籽粒油。在本公开的一个重要方面，所述增强的性状是增强的产量，包括在非胁迫条件下增加的产量和在环境胁迫条件下增加的产量。胁迫条件可以包括例如干旱、阴暗、真菌疾病、病毒疾病、细菌性疾病、昆虫侵染、线虫侵染、低温暴露、热暴露、渗透胁迫、降低的氮营养物利用度，降低的磷营养物利用度和高植物密度。“产量”可受许多性质影响，包括但不限于植物高度、荚果数、荚果在植物上的位置、节间数、荚果落粒的发生率、谷粒尺寸、结瘤和固氮效率、营养吸收的效率、对生物和非生物胁迫的抗性，碳吸收、植物构造、抗倒伏性、种子萌发百分比、幼苗活力，以及幼体性状。产量也可受萌发效率(包括胁迫条件下的萌发)、生长速率(包括胁迫条件下的生长速率)、成穗数、每穗籽数、籽粒尺寸、籽粒组成(淀粉、油、蛋白质)以及种子饱满的特征影响。

可以以多种方式测量本公开的转基因或非转基因植物的增加产量，所述方式包括测试重量，每株植物的籽粒数，籽粒重量，每单位面积的籽粒数(即每英亩的籽粒或籽粒重量)，每英亩的蒲式耳数，每英亩的吨数，或每公顷的公斤数。例如，玉米产量可以测量为每单位生产面积的带壳玉米谷粒的产量，例如以蒲式耳/英亩或公吨/公顷为单位，所述产量往往在水分调整的基础上报告，例如在15.5％的水分下。增加的产量可以由关键的生物化学化合物(诸如氮、磷和碳水化合物)的改善利用或对环境胁迫(例如冷、热、干旱、盐，以及害虫或病原体的侵袭)的改善响应引起。作为改进植物生长调节素的表达或改进细胞周期或光合作用途径的结果，如本文所公开的核酸分子还可用于提供具有改善的生长和发育，并且最终增加的产量的植物。还关注的是产生在籽粒组成方面表现出增加的产量的转基因或非转基因植物，所述籽粒组成方面的产量可能对应或可能不对应总植物产量；此类性质包括籽粒油、籽粒分子如蛋白质和淀粉、油组分的增加，如可以通过籽粒组分比率的改变显示的。

本公开还提供了用于用如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂处理过的植物种子的容器。本公开的经处理的种子的容器可以含有任何数量、重量或体积的种子。例如，容器可以含有至少或大于100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、2000个、2500个、3000个、3500个、4000或更多个种子。或者，容器可以含有至少或大于1盎司、5盎司、10盎司、1磅、2磅、3磅、4磅、5磅或更多的种子种子的容器可以是本领域中可用的任何容器。作为非限制性实例，容器可以是盒、袋、包、小袋、带卷或管。

本公开提供了一种通过将如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂引入植物细胞中来同时调控两个或更多个目标基因的表达的方法。还提供了一种通过将如本文所公开的靶向代谢途径中的两种或更多种目标基因的dsRNA分子或定向触发剂引入植物细胞中来破坏代谢途径的方法。还提供了一种同时调控选自由以下项组成的组的两种或更多种目标基因的表达的方法：植物内源基因序列，植物病原体基因序列，植物病毒基因序列，植物昆虫基因序列，以及它们的组合，其中所述方法包括将如本文所公开的dsRNA分子或定向触发剂引入植物细胞中。

本公开还提供了一种增加用Dicer样蛋白从dsRNA分子加工成的sRNA群体的同质性或均一性的方法，其中所述方法包括向dsRNA分子中引入选自由以下项组成的组的一个、两个、三个、四个、五个或更多个特征：(a)长度在约45和约75个核苷酸之间，(b)包含一个或多个富含腺嘌呤或尿嘧啶的接头序列，所述接头序列邻接各自编码一种sRNA双链体的两个或多个sRNA触发序列，(c)包含在反义链中的3′悬垂，(d)包含在反义链中相对于3′悬垂的末端的位置20和21处的尿嘧啶，(e)3至5个核苷酸长的5′-悬垂，以及(f)它们的组合。

本公开还提供了一种富集从触发分子加工成的功能性sRNA的方法，包括将选自由以下项组成的组的一个、两个、三个、四个、五个或更多个特征引入触发分子中：(a)各自编码一种sRNA的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列在单个天然存在的分子中不存在，或在单个天然存在的分子中不连续，(b)长度在约45和约75个核苷酸之间，(c)包含一个或多个富含腺嘌呤或尿嘧啶的接头序列，所述接头序列邻接所述两个或多个sRNA触发序列，(d)包含在反义链中的3′悬垂，(e)包含在所述反义链中相对于3′悬垂的末端的位置20和21处的尿嘧啶，(f)3至5个核苷酸的5′悬垂，以及(g)它们的组合。

本公开还提供了一种用预定加工模式产生触发分子的方法，包括将选自由以下项组成的组的一个、两个、三个、四个、五个或更多个特征引入触发分子中：(a)各自编码一种sRNA的两个或更多个sRNA触发序列，其中所述两个或更多个sRNA触发序列在单个天然存在的分子中不存在，或在单个天然存在的分子中不连续，(b)长度在约45和约75个核苷酸之间，(c)包含一个或多个富含腺嘌呤或尿嘧啶的接头序列，所述接头序列邻接所述两个或多个sRNA触发序列，(d)包含在反义链中的3′悬垂，(e)包含在所述反义链中相对于3′悬垂的末端的位置20和21处的尿嘧啶，(f)3至5个核苷酸的5′悬垂，以及(g)它们的组合。

应当理解，本公开的某些特征为清楚起见而在各单独方面的上下文中进行阐述，但也可以组合形式提供在单个方面中。相反地，本公开的某些特征为了简洁起见而在单个方面的上下文中描述，但也可以单独地或以任何合适的子组合提供或者以在本公开的任何其它描述的方面中适当的方式提供。在各个方面的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些方面的必要特征，除非在没有那些要素的情况下该方面无效。如上所述和如以下权利要求部分中所要求保护的本公开的各个方面在以下实施例中得到了实验支持。

以下实施例出于说明目的提供并且不应被理解为限制。

具体实施方式

实施例1：评价dsRNA悬垂对dsRNA加工的影响及其诱导沉默的能力。

将六种dsRNA触发分子(SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：2/SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：3/SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：/4SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：57以及SEQ ID NO：6/SEQ ID NO：57)在小麦胚芽提取物中孵育以测试悬垂长度对dsRNA加工的影响，其中每种dsRNA触发分子包含具有不同长度的悬垂的约50个核苷酸的两条链。这些dsRNA触发分子包含来自番茄(番茄，S1)5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的靶特异性序列。所有触发分子都用P32进行了5′-端标记(图1A)。触发剂1(SEQ ID NO：1/SEQID NO：57)具有平末端。触发剂2(SEQ ID NO：2/SEQ ID NO：57)在两端上具有2个碱基的3′-悬垂。触发剂3-6(SEQ ID NO：3/SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：/4SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：57以及SEQ ID NO：6/SEQ ID NO：57)分别在每个末端上具有2个碱基、5个碱基、10个碱基和15个碱基的5′悬垂。

具体地，将1μl的经5′P32末端标记的dsRNA触发分子(50,000cpm)在含有30μl小麦胚芽提取物(Promega公司)和8μl 5x Dicer反应缓冲液(0.5M NaCl、100μM GTP、500μMATP、10mM磷酸肌酸、10μg/ml肌酸磷酸激酶、5mM DTT以及0.1U/μl RNA酶抑制剂)(Promega公司)的40μl反应物中于25℃下孵育3小时。通过加入2x蛋白酶K缓冲液(pH7.5的200mMTris-HCl、25mM EDTA、300mM NaCl、2％(w/v)十二烷基硫酸钠)终止反应，随后在65℃下用2mg/ml蛋白酶K去蛋白15分钟。将加工的RNA产物用3体积的冷乙醇沉淀，并通过在15％聚丙烯酰胺测序凝胶中电泳来进行分析。触发剂1和2都被加工成20至21个核苷酸的小RNA，而几乎未观察到从触发剂3至6加工成的小RNA，这支持5′悬垂延迟或阻止对dsRNA分子的加工(图1B)。

在本氏烟草原生质体中进一步测试了触发剂1至6沉默EPSPS基因的能力。具体地，将各3μg触发剂1至6加入本氏烟草原生质体中。使用Taqman定量PCR定量靶EPSPS基因的表达。观察触发剂1至6的各种EPSPS下调程度(图1C)。用在两端上具有5′悬垂的触发剂实现的EPSPS沉默程度随着5′悬垂的长度增加而减小。

实施例2：定向触发剂的合理设计.

为了提高dsRNA分子的沉默效率，将各种序列或结构特征并入dsRNA分子中以形成定向触发剂。这些序列或结构特征有利于按照更可预测的模式加工dsRNA，从而允许更专注地产生具有沉默预定靶基因功能的小RNA(图2至图5)。结构特征包括但不限于用Dicer样蛋白从具有3′悬垂的一个末端定向起始加工，以及在相反的末端使用5′悬垂封阻用Dicer样蛋白从此末端起始加工。

用RNA依赖性RNA聚合酶(RDR)(图2A，示出RDR6作为实例)合成的dsRNA分子包含在两端上的3′悬垂，因此由Dicer样蛋白质以类似频率从任一端开始加工。相比之下，示例性定向触发剂包含在其反义链上的2-nt核苷酸的3′悬垂(“3′端起始悬垂”)和5′悬垂(“5′封阻悬垂”)，不受任何科学理论或机制的约束，所述3′悬垂和5′悬垂分别利于和不利于从此末端起始dicer加工(图2B)。因此，合理设计的定向触发剂主要产生处于预程序化相和可预测相(例如，从具有3′悬垂的dsRNA末端开始间隔约21个核苷酸的相)中的siRNA产物。

预程序化加工模式和可预测加工模式还允许dsRNA分子产生在适当相中的多种不同siRNA，使得每种siRNA具有促进其预定靶的沉默的功能。例如，示例性定向嵌合dsRNA触发剂主要产生在适当相中的siRNA产物以靶向两个目标基因(GOI1和GOI2)(图3)。同时，对定向dsRNA触发剂的加工导致其siRNA产物的仅小部分具有异常相(图3)。异常定相的siRNA产物最多具有与靶序列的部分互补性，因此其不能促进靶沉默(例如，图3中的非功能性siRNA)。

还将另外的特征并入定向触发剂中，例如两个靶特异性序列之间的富AU接头(图4和图5)。可将示例性定向触发剂(图4)加工成两种不同的siRNA，所述两种不同的siRNA识别相同或不同靶基因(仅GOI1，或GOI1和GOI2)中的序列。siRNA1和siRNA2都包含在反义链的5′端处的UU二核苷酸和在有义链的5′端处的G。以UU二核苷酸开始的siRNA1和siRNA2的反义链优先加载到Argonaute蛋白(AGO)中并识别靶基因mRNA分子，从而导致靶基因沉默。靶特异性序列是与靶基因序列基本上相同、相同或者基本互补或互补的序列。非特异性序列是与靶基因无关的序列并且可以在长度和组成方面与图4中所示的那些不同。

示例性定向dsRNA触发剂和非定向dsRNA触发剂之间的进一步示意性比较示于图5中。示例性定向dsRNA触发剂包含在其有义链上的来自目标基因(GOI)的靶特异性序列。示例性定向dsRNA触发剂的反义链包含3′-悬垂(例如2-nt)和5′-悬垂(3-5个核苷酸或更长)。Dicer样蛋白优先从具有3′悬垂的末端开始，从定向dsRNA触发剂切割第一21-24聚体(siRNA1)，并且继续产生第二21-24聚体(siRNA2)，所述第二21-24聚体紧邻第一21-24聚体(例如，与第一21-24聚体同相)。因此，示例性定向dsRNA触发剂以定相方式产生一组21-24聚体(图中示出了两个21-24聚体)，其中siRNA1和siRNA2为主要物质。此外，siRNA1和siRNA2都包含在其反义链的5′端处的UU二核苷酸和在其有义链的5′端处的G。将起始于UU二核苷酸的siRNA1和siRNA2的反义链优先加载到Argonaute蛋白(AGO)中，并且也被称为引导链，其指导对靶基因mRNA序列的识别并导致靶基因沉默。

然而，当用dicer样蛋白质加工时，非定向dsRNA触发剂并未朝向触发剂的任一末端定向偏移。因此，从非定向dsRNA触发剂产生的21-24聚体更为异质。同相21-24聚体(例如siRNA1′和siRNA2′)仅代表21-24聚体的总汇集物的一部分，所述21-24聚体的总汇集物还包含大量异相21-24聚体(例如siRNA3′和siRNA4′)。因此，与定向触发剂相比，非定向dsRNA触发剂产生更稀释的同相21-24聚体。非定向dsRNA触发剂可以是嵌合或非嵌合的，平末端的，在两端上具有3′-悬垂，或这些特征的组合。具有两个3′悬垂的嵌合触发剂示出于图5B中。

此外，由非定向dsRNA触发剂产生的21-24聚体在其反义链的5′末端没有UU二核苷酸并且在其有义链的5′末端没有G。因此，反义链和有义链都不优先加载到AGO蛋白中。相反，每个21-24聚体的每条链可以潜在地加载到AGO蛋白中作为引导链。然而，仅引导链1′和2′与靶序列互补并且能够识别靶分子以引起沉默。因此，与由定向dsRNA触发剂产生的引导链相比，非定向dsRNA触发剂产生有效引起沉默的更稀释的引导链。

实施例3：使用荧光素酶报告子体系在小麦胚芽提取物中评价定向dsRNA触发剂的沉默效率。

在小麦胚茅提取物中测试示例性定向dsRNA触发剂的沉默荧光素酶报告子的能力。使用三种定向dsRNA触发剂(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60，图6A)。每种定向dsRNA触发剂包含两条靶特异性序列。SEQ IDNO：7/SEQ ID NO：58包含来自AtEPSPS的一条靶特异性序列以及来自AtCUT1的另一条靶特异性序列。SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59中的两个靶特异性序列均来自AtEPSPS，而SEQ IDNO：9/SEQ ID NO：60中的两个靶特异性序列均来自AtCUT1。还包括特异性靶向AtEPSPS的非定向dsRNA触发剂(SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：61)作为对照。

为了在小麦胚芽提取物中评价沉默活性，使用50μl反应体系，所述反应体系包含25μl小麦胚芽提取物、4μl氨基酸混合物、触发剂(60皮摩尔)以及包含触发剂的靶和萤火虫荧光素酶的融合mRNA(3皮摩尔)。将反应物在25℃下孵育2小时，然后根据制造商的说明书使用双荧光素酶体系(Promega公司)读取荧光素酶活性。

相对荧光素酶活性显示在小麦胚芽提取物中SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：58和SEQID NO：8/SEQ ID NO：59成功地沉默了融合靶mRNA AtEPSPS1：Fluc(图6B)。AtEPSPS1：Fluc是全长荧光素酶编码序列与AtEPSPS1编码序列之间的mRNA融合体，所述AtEPSPS1编码序列由定向触发剂SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59和非定向触发剂SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：61靶向。相对荧光素酶活性还显示在小麦胚芽提取物中SEQ IDNO：7/SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60沉默了融合靶mRNA AtCUT1：Fluc，而SEQID NO：8/SEQ ID NO：59则没有(图6C)。AtCUT1：Fluc是全长荧光素酶编码序列与AtCUT1编码序列之间的mRNA融合体，所述AtCUT1编码序列由SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：58和SEQ IDNO：9/SEQ ID NO：60，而不是SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59靶向。

实施例4：用定向dsRNA触发剂在拟南芥原生质体中沉默内源性AtEPSPS1基因.

还在拟南芥原生质体中测试了示例性定向dsRNA触发剂(SEQ ID NO：7/SEQ IDNO：58、SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60，图6A)的沉默内源性AtEPSPS1基因的能力。还包括非定向dsRNA触发剂(SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：61)作为对照。拟南芥原生质体的制备和转化及随后的RNA提取描述于下文的实施例5中。SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：61均以200pmol的剂量测试，而含有均靶向AtEPSPS1的两种不同siRNA的SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59是以50pmol的剂量评价的。通过q-PCR定量分析AtEPSPS1的表达。

含有来源于AtEPSPS1的至少一条靶特异性序列的定向dsRNA触发剂(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59)能够特异性下调AtEPSPS1表达，而仅包含来自AtCUT1的靶特异性序列的定向dsRNA触发剂(SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60)则不能(图6D)。用于SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59的较低剂量(50pmol)实现了与由较高剂量的触发剂SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：58(200pmol)所实现的相当的靶下调水平，这显示通过具有来自AtEPSPS1的两条靶序列，触发剂SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59相较于触发剂SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：58(具有仅一条来自AtEPSPS1的靶序列)更有效地促进沉默。AtCUT1(At1g68530)和AtEPSPS1(At1g48860)基因都在拟南芥叶中表达，所述拟南芥叶是原生质体制剂的来源。

实施例5：拟南芥原生质体的分离和PEG介导的转化以及随后的RNA提取.

根据标准方案进行拟南芥原生质体的分离和PEG介导的转化。简言之，从抽苔之前约3周龄的植物收集深绿色、健康的拟南芥叶。然后将叶在一块石蜡膜上切成大致约1mm的条，所述条从叶端开始并在距离叶的叶柄末端约2至3mm处终止。然后将切片叶置于皮氏培养皿(每皮氏培养皿约50片叶)中的消化溶液中，使近轴叶面朝上。通过施加真空随后在室温下于黑暗中过夜孵育来用消化溶液浸润叶条。在以40RPM轻微振荡皮氏培养皿2-3分钟后，使原生质体从叶释放到消化溶液中。随后，将消化混合物透过两层60微米尼龙网过滤到50ml锥形管中。将皮氏培养皿和叶条用10ml W5溶液冲洗，随后过滤并收集。在将原生质体与W5冲洗溶液温和且彻底混合后，将原生质体在具有甩平转子(swinging bucket rotor)的Harrier台式离心机中以100xg离心沉降2分钟。将原生质体沉淀重悬于10ml W5溶液中。然后将从多个皮氏培养皿收集的原生质体与使用血细胞计数器估计的原生质体浓度(40片叶通常产生约4-6×10⁶个原生质体)汇集。在转化前将制备的原生质体在冰上置于W5溶液中至少1小时。

为了分析dsRNA分子对报告基因的沉默，每次转化使用0.8至1×10⁵个拟南芥原生质体。对于每次转化，使用10μg的每种报告子构建体连同1.3μg FLuc(pMON8796)a(pMON63934)作为内部对照。对于每种构建体，以随机化转化顺序使用一式三份样品。首先通过温和地上下吹打来混合DNA构建体与150μl原生质体。随后，将150μl PEG溶液加入原生质体中，接着通过倒置试管约1分钟来混合原生质体和PEG溶液。在室温下孵育4分钟后，将所述PEG-原生质体转化混合物与300μl W5溶液混合，接着孵育5-10分钟。然后原生质体通过以90xg离心1分钟来离心沉降，随后重悬于1ml WI溶液中。将转化的原生质体在黑暗中于室温下孵育4-6小时，然后进行RNA提取以及Taqman或转录表达谱分析。

对于RNA提取，将约1×10⁶个拟南芥原生质体以300xg离心沉降2分钟。将原生质体沉淀再悬浮并在250μl缓冲液RLT(Qiagen RNeasy小试剂盒(Qiagen RNeasy Mini Kit)或Qiagen#79216)中裂解，所述缓冲液RLT含有1％β-巯基乙醇(BME)。将用缓冲液RLT裂解的原生质体贮藏在-80℃的冰箱中或根据在Qiagen的RNeasy小试剂盒中找到的标准植物/真菌提取方法立即处理以进行RNA分离。

实施例6：定向dsRNA触发剂对番茄或烟草靶基因的沉默。

在小麦胚芽提取物中测试具有番茄靶基因的示例性定向dsRNA触发剂沉默荧光素酶报告子的能力。测试了两种定向dsRNA触发剂(SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：63，图7A)。SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：63各自包含两条靶序列，一条来自(番茄，Sl)八氢番茄红素脱氢酶(SlPDS)，另一条来自SlEPSPS。两条靶序列的排列是在SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：62与SEQ ID NO：12/SEQ IDNO：63之间相反。还包括SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60作为对照，SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60包含来自AtCUT1的两个靶特异性序列。基本上如实施例3所述地进行在小麦胚芽提取物中对dsRNA分子的加工以及对荧光素酶报告子活性的监测。

相对荧光素酶活性显示在小麦胚芽提取物中SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：62和SEQID NO：12/SEQ ID NO：63成功地沉默了融合靶mRNA SlPDS：Fluc(图7B)。SlPDS：Fluc是全长荧光素酶编码序列与SlPDS编码序列之间的mRNA融合体，所述SlPDS编码序列由SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：63，而不是SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60靶向。相对荧光素酶活性还显示在小麦胚芽提取物中SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：62和SEQ IDNO：12/SEQ ID NO：63沉默了融合靶mRNA SlEPSPS：Fluc，而SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60则没有(图7C)。SlEPSPS：Fluc是全长荧光素酶编码序列与SlEPSPS编码序列之间的mRNA融合体，所述SlEPSPS编码序列由触发剂SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：12/SEQ IDNO：63，而不是SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60靶向。

在本氏烟草(Nb)原生质体中进一步测试了定向dsRNA触发剂SEQ ID NO：11/SEQID NO：62和SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：63沉默内源性NbEPSPS1基因的能力。在用SEQ IDNO：11/SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：63处理本氏烟草原生质体后，通过RNA印迹分析评价NbEPSPS1表达(图7D)。经由5′探针或3′探针对NbEPSPS1表达的定量指示SEQ IDNO：11/SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：63都能够在本氏烟草原生质体中沉默NbEPSPS1(图7E)。

实施例7：定向dsRNA触发剂和非定向触发剂之间的比较

定向dsRNA触发剂(靶向AtEPSPS1的SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59，参见图6A)和非定向触发剂(靶向AtEPSPS1的SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：61)都在拟南芥原生质体中测试以比较其在促进内源性AtEPSPS1基因的沉默方面的效率。拟南芥原生质体制备和转化是基本上如在实施例4和5中描述的那样进行的。测试了八种不同的dsRNA剂量(250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9和2.0pmol)。还包括不靶向AtEPSPS1的定向触发剂SEQ ID NO：14/SEQID NO：64和SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：81作为阴性对照。

使用q-PCR定量AtEPSPS1表达，并通过学生t检验评价统计学显著性。AtEPSPS1表达数据显示定向dsRNA触发剂SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59相较于非定向触发剂SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：61具有更高的沉默效率(图8和表1)。SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59当分别以125和250pmol使用时分别使AtEPSPS1表达减少了34％和39％。然而，SEQ ID NO：10/SEQ IDNO：61在最高剂量(250pmol)下能够使AtEPSPS1表达减少24％，并且表现为当以125pmol或更低的浓度使用时没有沉默活性。当以相同浓度(例如，250pmol)使用时，定向dsRNA触发剂SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59相较于非定向触发剂SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：61更有效地减少AtEPSPS1表达(39％对比24％)。在使用阴性对照触发剂SEQ ID NO：1 4/SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：81的情况下没有观察到AtEPSPS1沉默，这表明所观察到的AtEPSPS1沉默是序列特异性的并且依赖于抗AtEPSPS1的触发剂分子的存在。

表1：在用各种剂量的dsRNA触发剂处理后通过q-PCR进行的拟南芥原生质体中AtEPSPS1表达的定量结果。

表1显示了在图8中使用的相同数据集。每个实验在处理栏中显示为“处理编号”_“触发剂剂量”_“触发剂名称”。例如，“01_250_SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：61”是指处理编号01，其使用250pmol的触发剂SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：61。平均SRC是指归一化为设定为100的无触发剂对照的AtEPSPS1表达水平的平均读出。最右列是指归一化为无触发剂对照(在最底行中显示为“基线”)的AtEPSPS1的表达变化百分比。

实施例8：通过深度测序分析从定向dsRNA触发剂加工的小RNA.

为了确认定向dsRNA触发剂的合理设计确实以更可预测的方式促进dsRNA加工并且富集了具有沉默预定靶的功能的小RNA，进行小RNA深度测序以分析定向dsRNA触发剂SEQID NO：7/SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60的加工产物(参见图6A)。首先在小麦胚芽提取物中加工定向dsRNA触发剂，其中收集经加工的RNA产物，然后使其经受深度测序。深度测序结果汇总在表2中。测序结果表明将SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60加工成21-24个核苷酸的小RNA(21-24聚体)定向偏向其反义链(AS链)的3′端。具体地，21-24聚体的49％、51％和69％分别定位至SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：8/SEQ ID NO：59和SEQ IDNO：9/SEQ ID NO：60的反义链的3′末端。

对来自定向dsRNA触发剂SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60的深度测序结果的更精细分析进一步说明了SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60加工的定向性和功能为沉默SEQ ID NO：9/SEQID NO：60的预定靶AtCUT1的21-24聚体的富集(图9和图10)。图9B示出了在小麦胚芽提取物中加工后来自SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60的RNA产物的尺寸分布和相关丰度。总之，将2,456,774个测序读段定位至触发剂SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60，其中2,107,001个读段(约85％)来自触发剂SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60的反义链，而349,774个测序读段(约15％)来自触发剂SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60的有义链。图9C示出21-24个核苷酸的尺寸范围(即，21-24聚体)含有473,000个测序读段(总序列读段的约19％)，其中将约90％定位至触发剂SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60的反义链的3′端，而仅约0.4％来自于有义链的5′端。相较于反义链5′端偏向反义链的3′端(约17％对比约0.4％)支持对SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：60的优先定向加工从包含2-nt的3′-悬垂的末端开始。

还进行了另外的深度测序实验来分析将定向触发剂加工成siRNA的模式。还在小麦胚芽提取物中加工了48-nt的定向触发剂(SEQ ID NO：15，图11中的最顶行)，收集小RNA产物，然后使其经受深度测序。分析21-24聚体的深度测序结果，并用电脑模拟组装以识别推定的主要siRNA双链体(例如，完全匹配的双链21-24聚体)。这些推定的siRNA双链体基于用它们的绝对频率的总和所估计的它们的相对丰度来评级。将评级最高的推定双链体(仅完美匹配21-24聚体)与BOL5.2 48-nt触发序列进行比对(图11)。评级最高的前10个推定siRNA双链体占所有完全匹配读段的约75％。在这10个双链体中，仅3个优先匹配触发剂的3′侧(具有5′悬垂的dsRNA末端)。四个评级最高的双链体(两个21-nt和两个24-nt的siRNA)显示出相反的链偏向。两个评级最高的21-nt的siRNA偏向反义链，而两个评级最高的24-ntsiRNA偏向有义链。

实施例9：定向嵌合触发剂的植物内(In planta)加工

总共20μl的dsRNA触发剂(单独的GFP靶向触发剂-SEQ ID NO：65/SEQ ID NO：82或嵌合GFP/MgChl-SEQ ID NO：66/SEQ ID NO：67)的4μg/μl原液施加至本氏烟草16C转基因植物(2-3周龄幼苗)的叶的近轴侧并引入植物细胞中。最终溶液由dsRNA触发剂和水组成。使该溶液在叶表面上干燥约一个小时，之后将砂纸在叶上辗动以将dsRNA递送到植物细胞中。

转染后四天时评估植物组织的可视表型。与此同时，收获组织以进行蛋白质印迹分析。对于每次处理，将两个5mm叶圆片置于冷冻的1.5mL微管中。用冷冻的塑料微杵研磨组织，直到形成细粉。向每个样品中加入约20μl缓冲溶液，然后涡旋30秒。所述缓冲溶液由pH7.4的50mM Tris-HCl；2.5mM MgCl2、100mM KCl；0.1％Nonidet P-40和一片完全蛋白酶抑制剂片剂(Roche公司)组成。然后将提取物在微型离心机中于4℃下以最大速度离心10分钟。将上清液转移到干净的试管中并在4℃下再离心5分钟。使用BCA测定(Pierce公司)定量总蛋白。对于免疫印迹分析，使用标准蛋白质印迹程序来分析6μg总蛋白。分别使用多克隆抗GFP(Santa Cruz Biotechnologies公司)或多克隆抗MgChl(自制生产)兔抗体的1∶5000稀释液使GFP和MgChl显色，如图12所示。此处理之后使用HRP缀合物(山羊抗兔IgG-HRP；Santa Cruz Biotechnologies)。通过使用SuperSignal West Pico化学发光底物(Pierce)进行对GFP或MgChl特异性条带的检测。

在处理后4天时对植物的目测检查显示了在两种处理中对GFP抑制，所述两种处理为用仅GFP触发剂处理过的那些或用针对GFP和MgChl的嵌合触发剂处理过的那些。然而，只有用靶向GFP和MgChl两者的嵌合触发剂处理过的叶显示出了以在明亮光下可见的黄色/萎黄病病灶(yellow/chlorotic foci)的存在为特征的MgChl抑制表型。通过在蛋白质印迹后测量条带强度，使用Image J软件来定量两种靶的百分比减少。结果呈现于表3中。靶蛋白减少了至少60％。由于用于蛋白质提取的组织由绿色部分和黄色部分组成，因此针对MgChl建立的敲低百分比可能被低估了。

表3.相应蛋白质靶的百分比减少。值是基于未处理和用触发剂处理的样品之间的条带强度比较计算的。

	GFP％减少	MgChl％减少
			未处理	0	0
仅GFP触发剂(T41817)	100	0
			嵌合触发剂(T52255)	95	60

实施例10.定向触发剂序列的中心部分的突变和平末端(在触发剂的末端处)导致了有效加工的损失.

通过在dsRNA触发剂SEQ ID NO：68/SEQ ID NO：69的互补部分中引入突变(SEQ IDNO：70/SEQ ID NO：71；参见图13中的图A)进行了对加工功效的评价，由此推测当突变引入拟南芥原生质体时抑制对多核苷酸的有效加工或切割。另外，还测试了平末端dsRNA触发剂(SEQ ID NO：72/SEQ ID NO：73；参见图13中的图A)。

使用如实施例5中所述的标准程序，用各100pmol的每种dsRNA触发剂来转染拟南芥属原生质体，所述dsRNA触发剂包括作为阴性对照的非特异性触发剂(SEQ ID NO：74/SEQID NO：75)、仅靶向拟南芥八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的定向触发剂(SEQ ID NO：76/SEQ IDNO：77)、仅靶向拟南芥磷酸核糖基邻氨基苯甲酸转移酶1(PAT1)的定向触发剂(SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：79)、靶向PDS和PAT1两者的定向触发剂(SEQ ID NO：68/SEQ ID NO：69)、突变的定向触发剂(SEQ ID NO：70/SEQ ID NO：71)以及平末端触发剂(SEQ ID NO：72/SEQ IDNO：73)。转染后约16-20小时提取RNA，并通过Taqman进行分析。此分析的结果在图13中的图B中呈现。

在对PDS转录物进行的分析(图13中的图B，左侧)中，在用仅靶向PDS的dsRNA(SEQID NO：76/SEQ ID NO：77)处理过的细胞中或在用嵌合的PDS/PAT1 dsRNA触发剂(SEQ IDNO：68/SEQ ID NO：69)处理过的细胞可见到明显的信使水平(message level)下降，而在用突变触发剂(SEQ ID NO：70/SEQ ID NO：71)或具有平末端的触发剂(SEQ ID NO：72/SEQ IDNO：73)处理过的细胞中则未见到。同样，当进行Taqman分析以测定PAT1mRNA水平(图13中的图B，右侧)时，仅在用靶向PAT1的dsRNA多核苷酸(SEQ ID N0：78/SEQ ID NO：79)或嵌合的PDS/PAT1 dsRNA(SEQ ID NO：68/SEQ ID NO：69)处理过的细胞中观察到了信使减少，而在用突变触发剂(SEQ ID NO：70/SEQ ID NO：71)或具有平末端的触发剂(SEQ ID NO：72/SEQID NO：73)处理过的细胞中则未观察到。所述结果进一步验证了定向触发剂的活性，指示在siRNA的正确加工中靶特异性序列中互补性百分比的重要性以及悬垂长度和取向的重要性。

Claims (46)

1.一种双链RNA(dsRNA)分子，其包含：

a.第一链，其在5'至3'方向上包含：

i.第一序列，其与第一靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸相同；和

ii.第二序列，其与第二靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸相同；和

b.第二链，其在5'至3'方向上包含5'-悬垂，与所述第一链互补的核苷酸序列，以及2个核苷酸的3'-悬垂，其中所述5'-悬垂为至少5个核苷酸长。

2.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述5'-悬垂具有高GC含量。

3.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述5'-悬垂为5个核苷酸长。

4.根据权利要求3所述的dsRNA分子，其中所述5个核苷酸的5'-悬垂具有序列GCGCG。

5.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述2个核苷酸的3'-悬垂具有序列UA。

6.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述第一链还包含位于与所述第一或第二靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸相同的所述核苷酸序列的3'的核苷酸GCCAC。

7.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述第一或第二靶核苷酸序列是mRNA的编码区、5'非翻译区、3'非翻译区、内含子、启动子、增强子、终止子、rRNA、tRNA、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、参与RNA干扰的非编码RNA以及其任何组合。

8.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述2个核苷酸的3'-悬垂包含改善所述dsRNA分子的稳定性的至少一种修饰。

9.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述2个核苷酸的3'-悬垂包含选自由以下项组成的组中的至少一种修饰：甲基化、硫代磷酸酯添加、锁核酸(LNA)以及其任何组合。

10.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述第一链还包含5'G。

11.根据权利要求10所述的dsRNA分子，其中所述5'G与所述靶核苷酸序列不同。

12.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述第一靶核苷酸序列和第二靶核苷酸序列来自不同的基因。

13.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述第一靶核苷酸序列和第二靶核苷酸序列来自相同的基因。

14.根据权利要求13所述的dsRNA分子，其中所述第一靶核苷酸序列和第二靶核苷酸序列是不连续的。

15.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述第一链包含在所述第一和第二序列之间的一个或多个A。

16.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述第二序列包含5'G。

17.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述第二序列包含5'GUA。

18.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述第二序列包含5'GAA。

19.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述第二序列包含3'AA。

20.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述第一链的3'端具有高GC含量。

21.根据权利要求19所述的dsRNA分子，其中所述第一链的3'端与所述靶核苷酸序列不同。

22.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述第一序列和第二序列为21个核苷酸长。

23.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中加工所述dsRNA分子以产生21个、22个、23个和/或24个核苷酸的siRNA。

24.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述第一链还包含与第三靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸相同的第三序列。

25.根据权利要求24所述的dsRNA分子，其中第一链还包含与第四靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸相同的第四序列。

26.一种双链RNA(dsRNA)分子，其包含：

a.第一链，其在5'至3'方向上包含：

i.第一核苷酸序列，其与第一靶-核苷酸序列的至少18个连续核苷酸相同；

ii.第二核苷酸序列，其包含2个或更多个A；和

iii.第三核苷酸序列，其与第二靶向核苷酸序列的至少18个连续核苷酸或所述第一靶核苷酸序列的至少18个连续核苷酸相同；和

b.第二链，其在5'至3'方向上包含5个核苷酸的5'-悬垂，与所述第一链互补的核苷酸序列，以及2个核苷酸的3'-悬垂。

27.根据权利要求26所述的dsRNA分子，其中所述5个核苷酸的5'-悬垂具有高GC含量。

28.根据权利要求26所述的dsRNA分子，其中所述5个核苷酸的5'-悬垂具有序列GCGCG。

29.根据权利要求26所述的dsRNA分子，其中所述2个核苷酸的3'-悬垂具有序列UC。

30.根据权利要求26所述的dsRNA分子，其中所述第一链还包含位于所述第三核苷酸序列的3'端的核苷酸GCCAC。

31.根据权利要求26所述的dsRNA分子，其中所述第一和所述第二靶核苷酸序列选自：mRNA的编码区、5'非翻译区、3'非翻译区、内含子、启动子、增强子、终止子、rRNA、tRNA、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、参与RNA干扰的非编码RNA以及其任何组合。

32.根据权利要求26所述的dsRNA分子，其中所述第一靶核苷酸序列和所述第二靶核苷酸序列来自不同的基因。

33.根据权利要求26所述的dsRNA分子，其中所述第一靶核苷酸序列和所述第二靶核苷酸序列来自相同的基因。

34.根据权利要求26所述的dsRNA分子，其中所述2个核苷酸的3'-悬垂包含改善所述dsRNA分子的稳定性的至少一种修饰。

35.根据权利要求34所述的dsRNA分子，其中所述2个核苷酸的3'-悬垂包含选自由以下项组成的组中的至少一种修饰：甲基化、硫代磷酸酯添加、锁核酸(LNA)以及其任何组合。

36.根据权利要求26所述的dsRNA分子，其中加工所述dsRNA分子以产生21个、22个、23个和/或24个核苷酸的siRNA。

37.根据权利要求26所述的dsRNA分子，其中所述第一链中的所述第一和所述第三核苷酸序列为21个核苷酸长。

38.一种组合物，其包含根据权利要求1至37中任一项所述的dsRNA分子。

39.一种调控至少一种靶基因的表达的方法，所述方法包括将根据权利要求38所述的组合物施加于植物或植物部分的表面上，其中所述dsRNA分子包含第一链，所述第一链包含与所述靶基因的至少18个连续核苷酸相同的核苷酸序列。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述dsRNA分子的第一链包含与第一靶基因的至少18个连续核苷酸相同的第一核苷酸序列和与第二靶基因的至少18个连续核苷酸相同的第二核苷酸序列。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述dsRNA分子的第一链还包含与第三靶基因的至少18个连续核苷酸相同的第三核苷酸序列。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述dsRNA分子的第一链还包含与第四靶基因的至少18个连续核苷酸相同的第四核苷酸序列。

43.根据权利要求39所述的方法，其中所述dsRNA分子从所述植物或植物部分的表面转移到所述植物或植物部分的细胞中。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述dsRNA分子抑制至少一种靶基因的表达。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述dsRNA分子抑制至少两种、至少三种或至少四种靶基因的表达。

46.一种提高dsRNA分子在植物或植物部分中产生所需小RNA方面的效率的方法，所述方法包括向所述植物或植物部分提供根据权利要求1至37中任一项所述的dsRNA分子，其中所述21-24个核苷酸的小RNA的产生定向偏向所述dsRNA分子的第二链的3'端。

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