JP2017500877A - 新規トウモロコシユビキチンプロモーター - Google Patents

Abstract

トウモロコシ（Zea mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ユビキチン−１（トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１）プロモーターは、植物において高レベルの構成的導入遺伝子発現を推進する。多遺伝子構築物で同じトウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１プロモーターを繰り返し使用すると、遺伝子サイレンシングをもたらすこともあり、それによりトランスジェニック産物の有効性が低くなる。異なるトウモロコシ（Zea）種であるＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１のＵｂｉ−１プロモーター由来の遺伝子調節エレメントを使用して、植物細胞および／または植物組織において導入遺伝子を発現させるための遺伝子調節プロモーターエレメント、構築物、および方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１２月３１日出願の米国特許仮出願第６１／９２２５２９号の３５ ＵＳＣ§１１９（ｅ）の下での利益を主張し、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。

電子的に提出される配列表への言及
配列表の公式謄本は、ファイル名「７５６６５＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、２０１４年１２月３０日作成、サイズ１３．３キロバイトのＡＳＣＩＩフォーマット配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子的に提出し、本明細書と同時に提出される。本ＡＳＣＩＩフォーマット文書に含まれる配列表は本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は一般的には植物分子生物学の分野に関し、さらに詳細には植物における導入遺伝子の発現の分野に関する。

多くの植物種が導入遺伝子で形質転換されて農学的に望ましい形質または特徴を導入することができる。植物種は特定の望ましい形質を有するように開発されるおよび／または改変される。一般的には、望ましい形質には、例えば、栄養価品質を改善する、収率を増加させる、害虫もしくは病害への抵抗性を与える、耐乾燥性およびストレス耐性を増加させる、園芸品質（例えば、色素沈着および成長）を改善する、除草剤抵抗性を分け与える、植物由来の工業的に有用な化合物および／もしくは材料の生産を可能にする、ならびに／または医薬品の生産を可能にすることが含まれる。

単一のゲノム遺伝子座にスタックされている複数の導入遺伝子を含むトランスジェニック植物種は植物形質転換技術により生産される。植物形質転換技術により、導入遺伝子の植物細胞への導入、植物ゲノムに導入遺伝子の安定的に組み込まれたコピーを含有する稔性導入遺伝子植物の回収がもたらされ、植物ゲノムの転写および翻訳によるその後の導入遺伝子の発現により望ましい形質および表現型を有するトランスジェニック植物が生じる。しかし、形質スタックとして工学的に作製された複数の導入遺伝子を高度に発現するトランスジェニック植物種の生産を可能にするメカニズムが望ましい。

同様に、植物の特定の組織または器官内での導入遺伝子の発現を可能にするメカニズムが望ましい。例えば、土壌伝播性病原体による感染に対する植物の抵抗性の増加は、病原体抵抗性タンパク質が植物の根内で強く発現されるように、病原体抵抗性遺伝子で植物ゲノムを形質転換することにより実現し得る。代わりに、例えば、細胞分裂または伸長などの特定の成長または発生期にある植物組織において導入遺伝子を発現させることが望ましい場合がある。

プロモーター、上流プロモーター、５’−ＵＴＲ、およびイントロンを含むジーラグジュリアンス（Zea luxurians）Ｕｂｉ−１プロモーター調節エレメントが本明細書では説明される。遺伝子調節エレメントを利用する構築物および方法がさらに説明される。

植物細胞および／または植物組織において導入遺伝子を発現させるためのプロモーター、構築物、および方法が本明細書で開示される。一実施形態では、導入遺伝子の発現はプロモーターの使用を含む。一実施形態では、プロモーターはポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、プロモーターポリヌクレオチド配列は上流プロモーター、５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）またはリーダー配列、およびイントロンを含む。一実施形態では、プロモーターポリヌクレオチド配列はユビキチン−１遺伝子（Ｕｂｉ−１）を含む。一実施形態では、プロモーターポリヌクレオチド配列はジーラグジュリアンス（Zea luxurians、Z. luxurians）のＵｂｉ−１遺伝子を含む。

一実施形態では、構築物はＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）のＵｂｉ−１遺伝子から得られたプロモーターポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態では、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）由来のＵｂｉ−１プロモーターポリヌクレオチド配列は、上流プロモーター領域、５’−ＵＴＲまたはリーダー配列、およびイントロンを含む。一実施形態では、構築物は、フィアリジウム種（Phialidium species）由来黄色蛍光タンパク質（ＰｈｉＹＦＰ）をコードする遺伝子由来のイントロンに融合されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）Ｕｂｉ−１遺伝子から得られたプロモーターポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態では、構築物は、フィアリジウム種（Phialidium species）由来黄色蛍光タンパク質（ＰｈｉＹＦＰ）をコードする遺伝子由来のイントロンに融合されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）遺伝子から得られたプロモーターポリヌクレオチド配列、それに続くトウモロコシ（Z. mays）のペルオキシダーゼ５遺伝子（ＺｍＰｅｒ５）由来の３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）を含む遺伝子発現カセットを含む。こうして得られたポリヌクレオチド配列は新規のプロモーター遺伝子調節エレメントを含む。

一実施形態では、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子または異種コード配列に作動可能に連結された遺伝子プロモーター調節エレメントを含む。一実施形態では、遺伝子発現カセットは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くの導入遺伝子を含む。

新規の遺伝子プロモーター調節エレメント（例えば、上流プロモーター、５’−ＵＴＲ、およびイントロン）を使用して導入遺伝子を発現する植物を生育する方法が本明細書で開示されている。新規の遺伝子プロモーター調節エレメントを使用して導入遺伝子を発現する植物組織および細胞を培養する方法も本明細書で開示されている。一実施形態では、本明細書に開示されている方法は、植物葉、根、カルス、および花粉における構成的遺伝子発現を含む。新規の遺伝子プロモーター調節エレメントを含むポリヌクレオチド配列を精製する方法も本明細書で開示される。

トウモロコシ（Zea mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１遺伝子を含む模式的な新規プロモーターを示す図である。プロモーターは、上流エレメント、５’−ＵＴＲまたはリーダー配列、およびイントロンから構成される。上流エレメントは転写開始部位（ＴＳＳ）の５’上流に位置し、長い矢で示している。上流エレメントはＴＡＴＡボックスなどの調節エレメントから構成され、短い矢で示され、熱ショックエレメントは星印で示されている。 Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１遺伝子のＰＣＲ増幅プロモーター配列を含むベクターｐＤＡＢ１０５７１０のプラスミドマップを示す図である。 トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１制御プロモーターのポリヌクレオチド配列（配列番号１）を示す図であり、上流プロモーター領域には下線を付し、５’−ＵＴＲ／リーダー配列には網掛けし、イントロン領域を小文字で示す。 Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーターのポリヌクレオチド配列（配列番号２）を示す図であり、上流プロモーター領域には下線が付され、５’−ＵＴＲ／リーダー配列には網掛けし、イントロン領域を小文字で示す。 トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３制御上流プロモーター配列（配列番号３）と比較したＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１の上流プロモーター領域（配列番号４）のポリヌクレオチド配列アライメントを示す図である。 トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３制御上流プロモーター配列（配列番号３）と比較したＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１の上流プロモーター領域（配列番号４）のポリヌクレオチド配列アライメントを示す図である。 トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３制御５’−ＵＴＲ／リーダー配列（配列番号５）と比較したＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１の５’−ＵＴＲ／リーダー領域（配列番号６）のポリヌクレオチド配列アライメントを示す図である。 トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３制御イントロン配列（配列番号７）と比較したＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１のイントロン領域（配列番号８）のポリヌクレオチド配列アライメントを示す図である。 トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３制御イントロン配列（配列番号７）と比較したＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１のイントロン領域（配列番号８）のポリヌクレオチド配列アライメントを示す図である。 制御エントリーベクター、ｐＤＡＢ１０５７４２（トウモロコシ（Z．mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３）を含み、デスティネーションベクター、ｐＤＡＢ１０１９７に挿入されたバイナリー発現構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８のベクターマップを示す図である。 エントリーベクター、ｐＤＡＢ１０５７３７（Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１）を含み、デスティネーションベクター、ｐＤＡＢ１０１９７に挿入されたバイナリー発現構築物、ｐＤＡＢ１０５７４３のベクターマップを示す図である。 バイナリー発現構築物ｐＤＡＢ１０５７４８（トウモロコシ（Z．mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３）およびｐＤＡＢ１０５７４３（Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１）についてのＴ_０植物カルスにおけるＰｈｉＹＦＰ遺伝子発現を示す図である。 バイナリー発現構築物ｐＤＡＢ１０５７４８（トウモロコシ（Z．mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３）、ｐＤＡＢ１０５７４３（Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１）、および陰性対照についてのＴ_１植物花粉におけるＰｈｉＹＦＰ遺伝子発現を示す図である。 ＺｍＵｂｉ−１プロモーターｖ２により推進されるＰｈｉＹＦＰレポーター遺伝子およびＺｍＰｅｒ５ ３’−ＵＴＲならびにＺ．ｌｕｘｕｒｉａｎｓ ｖ１により推進されるＡＡＤ−１ ｖ３遺伝子およびＺｍＬｉｐ ３’−ＵＴＲ ｖ１を含むバイナリー発現構築物ｐＤＡＢ１１２８５３のベクターマップを示す図である。

定義
本明細書で使用されるように、冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他の方法で明瞭かつ明確に指示していなければ、複数の対象を含む。

本明細書で使用されるように、用語「戻し交配」とは、栽培者が雑種子孫をその親の１つに戻し交雑させる、例えば、第１世代の交雑Ｆ１をＦ１交雑の親遺伝子型の１つと交雑させるプロセスを指す。

本明細書で使用されるように、用語「イントロン」とは、遺伝子（または対象の発現されたヌクレオチド配列）に含まれ、転写されるが翻訳はされない任意の核酸配列を指す。イントロンには、ＤＮＡの発現される配列内の非翻訳核酸配列、および、そこから転写されるＲＮＡ分子内の対応する配列が含まれる。

本明細書に記載される構築物は、イントロンなどの翻訳および／またはｍＲＮＡ安定性を増強する配列を含有していてもよい。１つのこのようなイントロンの例は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のヒストンＨ３バリアントの遺伝子ＩＩの第１イントロンまたは他の一般に知られている任意のイントロン配列である。イントロンはプロモーター配列と組み合わせて使用すれば、翻訳および／またはｍＲＮＡ安定性を増強することができる。

本明細書で使用されるように、用語「５’−非翻訳領域」または「５’−ＵＴＲ」とは、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの５’末端にある非翻訳セグメントを指す。例えば、成熟ｍＲＮＡ上では、５’−ＵＴＲは典型的にはその５’末端に７−メチルグアノシンキャップを保有し、スプライシング、ポリアデニル化、細胞質へのｍＲＮＡ核外輸送、翻訳機構によるｍＲＮＡの５’末端の確認、および分解に対するｍＲＮＡの保護などの多くのプロセスに関与している。

本明細書で使用されるように、用語「３’−非翻訳領域」または「３’−ＵＴＲ」とは、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの３’末端にある非翻訳セグメントを指す。例えば、成熟ｍＲＮＡ上では、この領域はポリ（Ａ）尾部を保有し、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始、およびｍＲＮＡ輸送に多くの役割を有することが知られている。

本明細書で使用されるように、用語「ポリアデニル化シグナル」とは、ｍＲＮＡ転写物中に存在し、ポリ（Ａ）ポリメラーゼが存在している場合には、例えば、ポリ（Ａ）シグナルの１０〜３０塩基下流に位置するポリアデニル化部位で転写物をポリアデニル化することが可能な核酸配列を指す。多くのポリアデニル化シグナルが当技術分野では既知であり、本発明に有用である。例となる配列には、Loke J., et al., (2005) Plant Physiology 138(3); 1457-1468に記載されているＡＡＵＡＡＡおよびそのバリアントが含まれる。

本明細書で使用されるように、用語「単離された」とは、生物学的成分（核酸またはタンパク質を含む）であって、成分が天然に存在する生物の細胞中の他の生物学的成分（すなわち、他の染色体ＤＮＡおよび染色体外ＤＮＡ）から分離されている成分を指す。

本明細書で使用されるように、核酸分子に関して、用語「精製された」は至純（例えば、均質な調製物）である必要はない。代わりに、「精製された」は、配列がその天然の細胞環境にあるよりも比較的純度が高いという指示を表す。例えば、「精製された」レベルの核酸は、その天然のレベルと比べた場合、濃度または遺伝子発現レベルの点で少なくとも２〜５倍であるはずである。

特許請求しているＤＮＡ分子は、全ＤＮＡからまたは全ＲＮＡから直接得ることができる。さらに、ｃＤＮＡクローンは天然には存在していないが、むしろ部分的に精製された天然に存在する物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作により得るのが好ましい。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築は、合成物質（ｃＤＮＡ）の作製を含む。個別のｃＤＮＡクローンは、ｃＤＮＡライブラリーを有する細胞のクローン選択により合成ライブラリーから精製することができる。したがって、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築および異なるｃＤＮＡクローンの精製を含むプロセスにより、天然のメッセージのおよそ１０^６倍の精製がもたらされる。同様に、プロモーターＤＮＡ配列はプラスミドにクローニングすることができる。このようなクローンは天然には存在していないが、むしろ、ゲノムＤＮＡライブラリーなどの、部分的に精製された天然に存在する物質の操作により得るのが好ましい。したがって、少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、さらに好ましくは４または５桁の精製がこれらの技法においては好都合である。

同様に、精製は、成分ＤＮＡ配列の化学的または機能的変化が起きたという指示を表す。「精製された」核酸分子およびタンパク質には、標準精製法により精製される核酸分子およびタンパク質が含まれる。用語「精製された」には、宿主細胞（例えば、植物細胞）において組換えＤＮＡ法により調製される核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成される核酸分子、タンパク質、およびペプチドも包含される。

用語「組換えの」とは、遺伝子組換えが起きた細胞または生物を意味する。前記用語は、ヒトの介入により人工的にまたは合成的に（すなわち、非天然に）改変された分子（例えば、ベクター、プラスミド、核酸、ポリペプチド、または小分子ＲＮＡ）も含まれる。改変はその天然環境もしくは状態内の分子でも、またはそこから取り除いた分子でも実施することができる。

本明細書で使用されるように、用語「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡ（小分子ＲＮＡ分子を含む）に転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡ（「転写物」とも呼ばれる）がその後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスのことである。遺伝子発現は外部シグナル、例えば、遺伝子発現を増加させるまたは減少させる薬剤への細胞、組織、または生物の曝露により影響されることがある。遺伝子の発現は、ＤＮＡからＲＮＡさらにタンパク質へ向かう経路のいずれの地点で調節することもできる。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセッシング、ｍＲＮＡなどの媒介分子の分解に作用する制御を通じて、または作製された後の特定のタンパク質分子の活性化、不活化、区画化、もしくは分解を通じて、またはその組合せにより起こる。遺伝子発現は、限定なしで、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、もしくはｉｎ ｖｉｖｏタンパク質活性アッセイ（複数可）を含む、当技術分野で既知のいかなる方法によっても、ＲＮＡレベルでまたはタンパク質レベルで測定することができる。

本明細書で使用されるように、用語「相同性ベースの遺伝子サイレンシング」または「ＨＢＧＳ」は、転写遺伝子サイレンシングと転写後遺伝子サイレンシングの両方を含む一般名称である。非連結サイレンシング遺伝子座による標的遺伝子座のサイレンシングは、それぞれプロモーターまたは転写される配列に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生のために、転写阻害（例えば、転写遺伝子サイレンシング；ＴＧＳ）またはｍＲＮＡ分解（例えば、転写後遺伝子サイレンシング；ＰＴＧＳ）から生じることがある。それぞれのプロセスに異なる細胞成分が関与していることから、ｄｓＲＮＡ誘導ＴＧＳおよびＰＴＧＳがおそらく古くからの共通のメカニズムの多様化から生じることが示唆される。しかし、ＴＧＳとＰＴＧＳの厳密な比較を達成するのは困難であった。なぜならば、前記比較は一般的に異なるサイレンシング遺伝子座の分析に頼っているからである。単一の導入遺伝子の遺伝子座は、異なる標的遺伝子のプロモーターと転写される配列に対応するｄｓＲＮＡの産生のために、ＴＧＳおよびＰＴＧＳの両方を始動させると説明することができる。

本明細書で使用されるように、用語「核酸分子」、「核酸」または「ポリヌクレオチド」（３つの用語全てが互いに同義である）とは、ポリマー型のヌクレオチドを指し、これにはＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成型、ならびにその混合ポリマーが含まれ得る。「ヌクレオチド」はリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはどちらかの種類のヌクレオチドの改変型を指し得る。核酸分子は、他の方法で明記されなければ、通常少なくとも１０塩基長である。前記用語は未定の長さのＲＮＡまたはＤＮＡの分子を指し得る。前記用語は一本鎖および二本鎖型のＤＮＡを含む。核酸分子は、天然に存在するおよび／または天然には存在しないヌクレオチド連結により互いに連結された天然に存在するヌクレオチドおよび改変されたヌクレオチドのいずれかまたは両方を含んでいてもよい。

当業者であれば容易に認識するように、核酸分子は化学的にもしくは生化学的に修飾されていてもよく、または非天然のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい。このような修飾には、例えば、標識、メチル化、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数の類似体での置換、ヌクレオチド間の修飾（例えば、メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホロアミド酸、カルバミン酸などの非電荷連結；ホスホロチオエート、ジチオリン酸などの電荷連結；ペプチドなどのペンデント部分；アクリジン、ソラレンなどの介入物；キレート剤；アルキル化剤；およびアルファアノマー核酸などの修飾連鎖）が含まれる。用語「核酸分子」には、一本鎖、二本鎖、部分的二重鎖、三重鎖、ヘアピン状、環状、およびパドロック立体構造を含む、いかなるトポロジー立体構造も含まれる。

転写はＤＮＡ鎖に沿って５’から３’への様式で進行する。これは、ＲＮＡは、ピロリン酸の必要な脱離を伴い、伸長する鎖の３’末端へのリボヌクレオチド−５’−三リン酸の逐次付加により作製されることを意味する。線形核酸分子でも環状核酸分子でも、別々のエレメント（例えば、特定のヌクレオチド配列）は、他のエレメントから５’方向にある同じ核酸に結合しているまたは結合していると考えられる場合、そのエレメントに対して「上流」にあると称することができる。同様に、別々のエレメントは、他のエレメントから３’方向にある同じ核酸に結合しているまたは結合していると考えられる場合、そのエレメントに対して「下流」にあると称することができる。

本明細書で使用されるように、用語「塩基位」とは指定された核酸内での所与の塩基またはヌクレオチド残基の位置を指す。指定された核酸は、参照核酸とのアライメントによって定義することができる。

本明細書で使用されるように、用語「ハイブリダイゼーション」とは、オリゴヌクレオチドおよびその類似物が、相補的塩基間でのワトソンクリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン水素結合を含む水素結合によりハイブリダイズするプロセスを指す。一般には、核酸分子は、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、およびチミン（Ｔ）などのピリミジン、またはアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）などのプリンのいずれかである窒素含有塩基からなる。窒素含有塩基はピリミジンとプリンの間で水素結合を形成し、ピリミジンのプリンへの結合は「塩基対合」と呼ばれる。さらに具体的には、ＡはＴまたはＵと特異的な水素結合を形成し、ＧはＣと特異的に結合する。「相補的」とは、２つの異なる核酸配列または同じ核酸配列の２つの異なる領域の間で生じる塩基対合のことである。

本明細書で使用されるように、用語「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」とは、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的の間に安定で特異的な結合が生じるのに十分な程度の相補性を指す。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズするのに標的配列に対して１００％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子に結合すると標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能が妨げられ、特異的な結合が望ましい条件下、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたは系の場合には生理的条件下で、オリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合には特異的にハイブリダイズ可能である。このような結合は特異的ハイブリダイゼーションと称される。特定程度の厳密性をもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択されるハイブリダイゼーション法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変動することになる。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（特に、Ｎａ^＋および／またはＭｇ^２＋濃度）はハイブリダイゼーションの厳密性に寄与することになるが、洗浄回数も厳密性に影響を及ぼす。特定程度の厳密性を達成するのに必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算はSambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989において論じられている。

本明細書で使用されるように、用語「厳密な条件」は、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的の間にあるミスマッチが５０％未満の場合にのみハイブリダイゼーションが起きる条件を包含する。「厳密な条件」はさらに特定レベルの厳密性を含む。したがって、本明細書で使用されるように、「中程度の厳密性」条件とは、５０％を超える配列ミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「高厳密性」の条件とは、２０％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件であり、「超高厳密性」の条件とは、１０％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。特定の実施形態では、厳密な条件は、６５℃でのハイブリダイゼーションとそれに続く６５℃での、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳによる、４０分間の洗浄を含むことが可能である。以下は代表的な、非限定的ハイブリダイゼーション条件である。
・超高厳密性：５×ＳＳＣバッファー中、６５℃で、１６時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣバッファー中、室温で、それぞれ１５分間の２度の洗浄；および０．５×ＳＳＣバッファー中、６５℃で、それぞれ２０分間の２度の洗浄
・高厳密性：５〜６×ＳＳＣバッファー中、６５〜７０℃で、１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣバッファー中、室温で、それぞれ５〜２０分間の２度の洗浄；および１×ＳＳＣバッファー中、５５〜７０℃で、それぞれ３０分間の２度の洗浄
・中程度の厳密性：６×ＳＳＣバッファー中、室温〜５５℃で、１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２〜３×ＳＳＣバッファー中、室温〜５５℃で、それぞれ２０〜３０分間の少なくとも２度の洗浄
一実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は超高厳密性ハイブリダイゼーション条件下で結合したままであってよい。一実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は高厳密性ハイブリダイゼーション条件下で結合したままであってよい。一実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は中程度の厳密性ハイブリダイゼーション条件下で結合したままであってよい。

本明細書で使用されるように、用語「オリゴヌクレオチド」とは短い核酸ポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、長い核酸セグメントの切断により、または個々のヌクレオチド前駆体を重合化することにより形成することができる。自動合成装置により、数百塩基対長までのオリゴヌクレオチドの合成が可能である。オリゴヌクレオチドは相補的ヌクレオチド配列に結合することができるので、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのプローブとして使用することができる。ＤＮＡから構成されているオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）は、小ＤＮＡ配列の増幅のための技法である、ポリメラーゼ連鎖反応で使用することができる。ポリメラーゼ連鎖反応では、オリゴヌクレオチドは典型的には「プライマー」と呼ばれ、これのおかげでＤＮＡポリメラーゼはオリゴヌクレオチドを伸長させて相補鎖を複製することが可能になる。

本明細書で使用されるように、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されているように、微少量の核酸、ＲＮＡ、および／またはＤＮＡを増幅させる手順または技法を指す。一般には、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができるように、対象の領域の末端またはその後ろからの配列情報が入手可能である必要がある。ＰＣＲプライマーは、増幅される核酸鋳型の反対の鎖と配列が同一であるまたは類似していることになる。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは増幅される材料の末端と一致していてもよい。ＰＣＲを使用して全ゲノムＤＮＡおよび全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ由来の特定のＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列、バクテリオファージ、もしくはプラスミド配列などを増幅させることができる。一般には、Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989) を参照されたい。

本明細書で使用されるように、用語「プライマー」とは、条件がプライマー伸長産物の合成に適している場合に、相補鎖に沿って合成の開始点として働くことができるオリゴヌクレオチドを指す。合成条件には、４種の異なるデオキシリボヌクレオチド三リン酸（すなわち、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）および逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼなどの少なくとも１つの重合化誘導剤または酵素の存在が含まれる。これらの試薬は、典型的には、コファクターである成分または種々の適切な温度で、ｐＨなどの条件に影響を与える成分を含んでいてもよい適切なバッファー中に存在する。プライマーは、増幅効率が最適化されるように一本鎖配列であることが好ましいが、二本鎖配列を利用してもよい。

本明細書で使用されるように、用語「プローブ」とは、標的配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を指す。ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＴａｑＭａｎ（登録商標）スタイルアッセイ法では、プローブは２つのプライマーのアニーリング部位の間に位置する標的の一部にハイブリダイズする。プローブは、約８ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、または約５０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プローブは約８ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチドを含む。

サザンブロットアッセイ法では、プローブは膜に結合しているＤＮＡ断片にハイブリダイズする。プローブは、約１０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド、約２，５００ヌクレオチド、または約５，０００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プローブは約５００ヌクレオチド〜約２，５００ヌクレオチドを含む。

プローブは、放射性標識、ビオチン化標識、フルオロフォア（例えば、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ（登録商標）、フルオレセインイソチオシアネートなど）などの検出可能な標識をさらに含むことができる。検出可能な標識は、プローブの５’末端または３’末端に位置するようにプローブオリゴヌクレオチドに直接共有結合することができる。フルオロフォアを含むプローブは、クエンチャー色素（例えば、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）など）をさらに含むこともできる。

本明細書で使用されるように、用語「配列同一性」または「同一性」とは、互換的に使用することができ、特定の比較窓にわたって最大一致するように整列された場合に同一である２つの配列における核酸残基を指す。

本明細書で使用されるように、用語「配列同一性のパーセンテージ」または「配列相同性のパーセンテージ」とは、比較窓にわたり２つの最適に整列された配列（例えば、核酸配列またはアミノ酸配列）を比較することにより決定される値を指し、比較窓の配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントを得るために参照配列と比べた場合、付加、置換、ミスマッチ、および／または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことがある。パーセンテージは、両方の配列に同一の核酸またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、マッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較窓における全位置数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。比較のために配列を整列させるための方法は周知である。種々のバイオインフォマティックスまたはコンピュータプログラムならびにＣｌｕｓｔａｌＷおよびＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒなどのアライメントアルゴリズムも当技術分野では周知でありおよび／または、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881−90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155−65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50に記載されている。

国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）；Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10）は、いくつかの配列分析プログラムに関連して使用するために、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの供給源からおよびインターネット上で利用することが可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、インターネット上のＢＬＡＳＴ（商標）の「ｈｅｌｐ」セクション下で入手可能である。核酸配列の比較では、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」機能を、デフォルトパラメータを使用して用いることができる。参照配列に対してはるかに大きな類似性を有する核酸配列は、この方法によって評価した場合、パーセンテージ同一性の増加を示すことになる。

本明細書で使用されるように、用語「作動可能に連結された」とは、核酸が別の核酸と機能的な関係に置かれていることを指す。一般に、「作動可能に連結された」は、連結された核酸が近接していることを意味することがある。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションにより達成され得る。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを核酸にライゲートさせるまたはアニールさせ、これを使用して近接するポリヌクレオチド断片を連結させる。しかし、エレメントは、作動可能に連結されるために近接している必要はない。

本明細書で使用されるように、用語「プロモーター」とは、ＤＮＡのうち、一般に遺伝子の上流に位置しており（すなわち、遺伝子の５’末端方向）、遺伝子の転写を開始させ推進するのに必要な領域を指す。プロモーターは、それが制御している遺伝子の適切な活性化または抑制を可能にすることができる。プロモーターは転写因子により認識される特異的な配列を含有し得る。これらの因子はプロモーターＤＮＡ配列に結合することができ、これにより、遺伝子のコード領域からＲＮＡを合成する酵素であるＲＮＡポリメラーゼが動員される。プロモーターとは一般には、５’−ＵＴＲ、イントロン、およびリーダー配列を含む、遺伝子の上流に位置するあらゆる遺伝子調節エレメントを指す。

本明細書で使用されるように、用語「上流プロモーター」とは、転写の開始を指示するのに十分である近接ポリヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用されるように、上流プロモーターは、ＴＡＴＡボックス、イニシエーター（Ｉｎｔｒ）配列、ＴＦＩＩＢ認識エレメント（ＢＲＥ）、および他のプロモーターモチーフを含むいくつかの配列モチーフを有する転写開始部位を包含する（Jennifer, E.F. et al, (2002) Genes & Dev., 16: 2583-2592）。上流プロモーターは、ＴＦＩＩＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＨのような基本的または一般的転写因子を有する多サブユニット酵素であるＲＮＡポリメラーゼＩＩに作用部位を提供する。これらの因子は会合して転写開始前複合体（ＰＩＣ）となり、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を触媒する。

上流プロモーターの活性化は、調節ＤＮＡ配列エレメントの付加により遂行され、このエレメントに種々のタンパク質が結合し引き続いて転写開始複合体と相互作用して遺伝子発現を活性化する。これらの遺伝子調節エレメント配列は特定のＤＮＡ結合因子と相互作用する。これらの配列モチーフはｃｉｓ−エレメントと称されることもある。このようなｃｉｓ−エレメントは、組織特異的または発生特異的転写因子が結合するが、独立してまたは組み合わせて、プロモーターの時空間的発現パターンを転写レベルで決定することができる。これらのｃｉｓ−エレメントは、それが作動可能に連結された遺伝子に及ぼす制御の種類が広く異なる。いくつかのエレメントは環境応答（例えば、温度、湿度、および傷）に呼応して作動可能に連結された遺伝子の転写を増加するように作用する。他のｃｉｓ−エレメントは、発生上の合図（例えば、発芽、種子成熟、および開花）にまたは空間情報（例えば、組織特異性）に応答することができる。例えば、Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23を参照されたい。これらのｃｉｓ−エレメントは転写開始点から様々な距離に位置している。いくつかのｃｉｓ−エレメント（近位エレメントと称される）は最小コアプロモーター領域に隣接しており、他のエレメントはプロモーターの数キロ塩基５’上流にまたは３’下流に位置していることがある（エンハンサー）。

本明細書で使用されるように、用語「形質転換」は核酸分子を細胞内に導入することができるあらゆる技法を包含する。例には、ウイルスベクターを用いるトランスフェクション、プラスミドベクターを用いる形質転換、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション（Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介導入、直接ＤＮＡ取込み、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介形質転換、および微粒子銃が含まれるがこれらに限定されない。これらの技法は、植物細胞の安定な形質転換と一過性形質転換の両方のために使用することができる。「安定な形質転換」とは、遺伝子的に安定した遺伝をもたらす宿主生物のゲノム内への核酸断片の導入を指す。安定的に形質転換されると、核酸断片は宿主生物およびそれに続くいかなる世代のゲノムにも安定的に組み込まれる。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は「トランスジェニック」生物と称される。「一過性形質転換」とは、遺伝子的に安定した遺伝のない遺伝子発現をもたらす、宿主生物の核またはＤＮＡ含有オルガネラ内への核酸断片の導入を指す。

本明細書で使用されるように、用語「形質導入する」とは、ウイルスが核酸を細胞内に移入させるプロセスである。

本明細書で使用されるように、用語「導入遺伝子」とは、外来性核酸配列を指す。一例では、導入遺伝子は遺伝子配列（例えば、除草剤抵抗性遺伝子）、産業的にまたは薬剤的に有用な化合物をコードする遺伝子、または望ましい農業上の形質をコードする遺伝子である。さらに別の例では、導入遺伝子はアンチセンス核酸配列であり、アンチセンス核酸配列の発現により標的核酸配列の発現が阻害される。導入遺伝子は、導入遺伝子に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーター、イントロン、５’−ＵＴＲ、または３’−ＵＴＲ）を含有することができる。いくつかの実施形態では、対象の核酸は導入遺伝子である。しかし、他の実施形態では、対象の核酸は、その追加のゲノムコピーが望まれる内在性核酸、または宿主生物における標的核酸の配列に関してアンチセンス方向である核酸である。

本明細書で使用されるように、用語「ベクター」とは、細胞内に導入され、それによって形質転換細胞を生成する核酸分子を指す。ベクターは、宿主細胞においてベクターが複製するのを可能にする、複製起点などの核酸配列を含むことができる。例には、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、または外来性ＤＮＡを細胞内に運搬するウイルスが含まれるがこれらに限定されない。ベクターは、１つまたは複数の遺伝子、アンチセンス分子、選択可能なマーカー遺伝子、および当技術分野で既知の他の遺伝子エレメントも含むことができる。ベクターは細胞を形質導入し、形質転換し、または細胞に感染し、それによってベクターにコードされている核酸分子および／またはタンパク質を細胞に発現させる。ベクターは、核酸分子の細胞内への進入を達成するのを支援する材料（例えば、リポソーム）を場合によって含んでいてもよい。

本明細書で使用されるように、用語「カセット」、「発現カセット」、および「遺伝子発現カセット」とは、特異的な制限部位でまたは相同組換えにより核酸またはポリヌクレオチドに挿入することができるＤＮＡのセグメントを指す。ＤＮＡのセグメントは、対象の小分子ＲＮＡまたはポリペプチドをコードする対象の遺伝子を含有するポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳のための適切なリーディングフレームへのカセットの挿入を確実にするように設計される。一実施形態では、発現カセットは対象の小分子ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができ、ポリヌクレオチドに加えて特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有することができる。一実施形態では、遺伝子発現カセットは、宿主細胞での対象のポリペプチドをコードする小分子ＲＮＡまたはポリヌクレオチドの増強された発現を可能にするエレメントも含むことができる。これらのエレメントには、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、イントロン、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、終結配列、ポリアデニル化配列などを含むことができるが、これらに限定されない。

本明細書で使用されるように、用語「異種コード配列」は、正常には宿主生物には存在せず、適切な条件下で宿主細胞において発現させることができるペプチドまたはタンパク質またはその等価なアミノ酸配列、例えば、酵素をコードする、または最終的にコードする任意のポリヌクレオチドを示すのに使用される。したがって、「異種コード配列」は、細胞が、正常にはその細胞に存在しないコード配列の追加のコピーを発現するように、正常には宿主細胞に存在しないコード配列の１つまたは追加のコピーを含むことができる。異種コード配列は、ＲＮＡもしくはその任意の種類（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡもしくはその任意の種類（例えば、ｃＤＮＡ）、またはハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡであってよい。コード配列の例には、コード配列、イントロン、プロモーター領域、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、およびエンハンサー領域などの特長を含む完全長転写単位が含まれるがこれに限定されない。

「異種コード配列」は、ペプチドもしくは酵素のコード部分（すなわち、ｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡ配列）、完全長転写単位のコード部分（すなわち、イントロンとエキソンを含む遺伝子）、「コドン最適化」配列、切断型配列または酵素をコードするもしくは、等価なアミノ酸配列が機能的なタンパク質を生じる限り、その等価なアミノ酸配列をコードする他の形の改変された配列も含む。このような等価なアミノ酸配列は、１つまたは複数のアミノ酸の欠失を有してもよく、欠失はＮ末端、Ｃ末端、または内部である。切断型は、それが本明細書に示される触媒能力を有する限り、企図されている。

本明細書で使用されるように、用語「対照」とは、比較目的で分析手順において使用される試料を指す。対照は「陽性」でも「陰性」でも可能である。例えば、分析手順の目的が細胞または組織において差次的に発現される転写物またはポリペプチドを検出することである場合、一般には、所望の発現を示す既知の植物由来の試料などの陽性対照、および所望の発現を欠く既知の植物由来の試料などの陰性対照を含むことが好ましい。

本明細書で使用されるように、用語「植物」は、植物ならびに、植物細胞および葉、カルス、茎、根、花、花粉と種子などの植物組織を含むがこれらに限定されない植物部分を含む。本発明で使用することができる植物の種類は、一般に、被子植物、裸子植物、シダ類、および多細胞の藻類を含む、変異原性を受け入れられる高等および下等植物の種類と同じだけ広い。したがって、「植物」は双子葉植物および単子葉植物を含む。双子葉植物の例には、タバコ、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、ダイズ、トマト、パパイヤ、キャノーラ、ヒマワリ、ワタ、アルファルファ、ジャガイモ、ブドウ、キマメ、エンドウマメ、アブラナ属（Brassica）、ヒヨコマメ、サトウダイコン、ナタネ、スイカ、メロン、コショウ、ピーナッツ、カボチャ（pumpkin）、ダイコン、ホウレンソウ、カボチャ（squash）、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、キュウリ、ナス、およびレタスが含まれる。単子葉植物の例には、トウモロコシ、イネ、コムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、モロコシ、ラン、タケ、バナナ、ガマ、ユリ、カラスムギ、タマネギ、アワ、およびライコムギが含まれる。

本明細書で使用されるように、用語「植物原料」とは、葉、カルス、茎、根、花もしくは花部、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、切り枝、細胞もしくは組織培養物、または植物の他の任意の部分もしくは産物を指す。一実施形態では、植物原料には子葉および葉が含まれる。一実施形態では、植物原料には根組織および地下に位置する他の植物組織が含まれる。

本明細書で使用されるように、用語「選択可能なマーカー遺伝子」とは、例えば、植物細胞を選択剤から保護するためにまたは選択剤に対する抵抗性／耐性を与えるために、場合により植物形質転換において使用される遺伝子を指す。さらに、「選択可能なマーカー遺伝子」はレポーター遺伝子を包含することを意味する。機能的選択可能マーカーを受け入れる細胞または植物のみが、選択剤を有する条件下で分裂するまたは成長することができる。選択剤の例には、例えば、スペクチノマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン、およびハイグロマイシンを含む抗生物質を含むことができる。これらの選択可能マーカーには、抗生物質カナマイシンに対する耐性を与える酵素を発現するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ ＩＩ）、関連抗生物質であるネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン、およびＧ４１８の遺伝子、またはハイグロマイシンに対する耐性を与える酵素を発現するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）の遺伝子が含まれる。他の選択可能マーカー遺伝子は、ｂａｒまたはｐａｔ（グルホシネートアンモニウムまたはホスフィノトリシンに対する抵抗性）、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ、スルホニル尿素（ＳＵ）、イミダゾリノン（ＩＭＩ）、トリアゾロピリミジン（ＴＰ）、ピリミジニルオキシベンゾエート（ＰＯＢ）、および分岐鎖アミノ酸の合成の第１段階を妨げるスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンなどの阻害剤に対する抵抗性）、グリホサート、２，４−Ｄ、および金属抵抗性または感受性を含む除草剤抵抗性をコードする遺伝子を含むことができる。選択可能マーカー遺伝子として使用することができる「レポーター遺伝子」の例には、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするタンパク質、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼなどの発現されたレポーター遺伝子タンパク質の目視観察が含まれる。語句「マーカー陽性」とは、選択可能マーカー遺伝子を含むように形質転換された植物を指す。

本明細書で使用されるように、用語「検出可能なマーカー」とは、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート、または酵素などの検出可能な標識を指す。検出可能なマーカーの例には以下のもの、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、検出可能なマーカーには、潜在的な立体障害を減らす種々の長さのスペーサーアームが結合することができる。

本明細書で使用されるように、用語「検出する」は、特定の分子の定性的および定量的測定の両方、例えば、特定のポリペプチドの測定を含むもっとも広い意味で使用される。

他の方法で明確に説明されなければ、本明細書で使用される専門用語および科学用語全てが、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。分子生物学における共通語の定義は、例えば、Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994; and Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995に見出すことができる。

遺伝子発現調節エレメントとしてのプロモーター
基礎研究またはバイオテクノロジー応用のために使用される植物プロモーターは一般に一方向性であり、その３’末端（下流）に融合された導入遺伝子の構成的発現を指示する。多くの場合、代謝工学および形質スタッキングのために植物内で導入遺伝子を強く発現させる必要がある。さらに、複数の遺伝子の発現を推進するためには、トランスジェニック作物中に複数の新規プロモーターが典型的には必要である。３’末端で融合された導入遺伝子の発現を指示することが可能な構成的プロモーターが本明細書では開示されている。

トランスジェニック産物の開発はますます複雑になっており、これは導入遺伝子を強く発現させ、単一遺伝子座に複数の導入遺伝子をスタックすることを必要とする。従来では、それぞれの導入遺伝子は発現のための独自のプロモーターを必要とし、１つの遺伝子スタック内で異なる導入遺伝子を発現させるには複数のプロモーターが必要である。遺伝子スタックのサイズが増えるに従って、この方法では、単一の多遺伝子形質の発現のために異なる導入遺伝子の類似するレベルの発現パターンを得るのに同一プロモーターを繰り返し使用する場合が多くなる。

同一プロモーターにより推進される多遺伝子構築物は、遺伝子サイレンシングを引き起こし、圃場でのトランスジェニック産物の効果が低くなることで知られている。プロモーター繰り返しに起因する過剰な転写因子（ＴＦ）結合部位のために、内在性ＴＦが枯渇し転写不活化をもたらし得る。導入遺伝子のサイレンシングは、導入遺伝子を発現する生産されたトランスジェニック植物の性能に望ましくない影響を及ぼす可能性がある。導入遺伝子内の反復配列のために、遺伝子遺伝子座内相同組換えをもたらして、ポリヌクレオチド再編成が生じることがある。

構成的プロモーターに加えて、組織特異的、または器官特異的プロモーターは、植物のカーネル、根、葉、カルス、花粉、またはタペータムなどのある種の組織における遺伝子発現を推進する。組織および発生段階特異的プロモーターは、特定の組織でまたは植物発生中の特定の時期に発現される遺伝子の発現を推進する。組織特異的プロモーターはトランスジェニック植物産業におけるある種の適用に必要であり、組織におけるおよび／または選択された発生段階における異種遺伝子の特異的発現を可能にし、種々の器官、組織、および／または異なる時間での異種遺伝子の発現を差次的に示すが他では示さないので望ましい。

例えば、土壌伝播性病原菌による感染に対する植物の抵抗性の増加は、病原菌抵抗性タンパク質が植物内で強く発現されるように、植物ゲノムを病原菌抵抗性遺伝子で形質転換することにより達成し得る。代わりに、例えば、細胞分裂または伸長などの特定の増殖または発生期にある植物組織において導入遺伝子を発現させるのが望ましい場合がある。別の応用では、プロモーターが農学的形質をコードする導入遺伝子の発現を発生中の植物部分（すなわち、根、葉、カルス、または花粉）に限局するように、組織特異的プロモーターを使用することが望ましい。

本明細書に記載されるプロモーターは、複数の遺伝子を含有する商業的導入遺伝子構築物を作製するための有望なツールである。これらのプロモーターは、導入遺伝子サイレンシングを減少させるなどの、細菌宿主における構造的安定性および植物細胞における機能的安定性も与えて、導入遺伝子発現を可能にする。発現範囲が変化するプロモーターも、本明細書に記載される方法を用いることにより得ることができる。単一のプロモーターを複数回使用する導入遺伝子構築物と比べて、本出願に記載される多様化したプロモーター構築物は、トランスジェニック事象の下流分子分析により適合性がある。本明細書に記載される多様化したプロモーターを使用すれば、亜鉛フィンガー技術を用いたターゲティング中のトランスジェニック多遺伝子座の再編成も軽減することができる（SHUKLA et al. 2009）。

トウモロコシ（Zea mays）およびジーラグジュリアンス（Zea luxurians）ユビキチン−１プロモーター
トウモロコシ（Zea mays）Ｕｂｉ−１プロモーターはバイオテクノロジー産業標準であり、主にトウモロコシにおける安定した高トランスジェニック発現のために使用されている（CHRISTENSEN and QUAIL 1996; CHRISTENSEN et al. 1992; TOKI et al. 1992）。それぞれの導入遺伝子は通常、十分な発現のために特異的なプロモーターを必要とする。１つの遺伝子スタック内で異なる導入遺伝子を発現させるためには典型的には複数のプロモーターが必要である。このパラダイムは、多くの場合、その所望の高レベルなタンパク質発現および構成的発現パターンにより、トウモロコシ（Z. mays）Ｕｂｉ−１プロモーターを繰り返し使用する。

しかし、トランスジェニック遺伝子座に反復配列を計画的に導入すると、導入遺伝子発現および安定性に対して望ましくない負の効果をもたらすこともある（FLADUNG and KUMAR 2002; KUMAR and FLADUNG 2000a; KUMAR and FLADUNG 2000b; KUMAR and FLADUNG 2001a; KUMAR and FLADUNG 2001b; KUMAR and FLADUNG 2002; METTE et al. 1999; MOURRAIN et al. 2007）。複数の協調的導入遺伝子発現という難問は、プロモーター多様性アプローチを使用して取り組むことができ、異なるプロモーターを使用して同じ発現プロファイルを有する異なる導入遺伝子を推進する（PEREMARTI et al. 2010）。本出願は、異なるトウモロコシ（Zea）種から新規のプロモーターを同定し精製することにより得られた多様化したＵｂｉ−１プロモーター配列を記載している。

植物遺伝子における遺伝子発現の転写開始および調節は、プロモーターと称されるより大きな配列において集合的に配置された種々のＤＮＡ配列エレメントにより指示される。真核生物プロモーターは典型的には最小コアプロモーターおよび上流調節配列からなる。コアプロモーターは、転写の正確な開始を指示するのに十分である最小ストレッチの近接ＤＮＡ配列である。植物のコアプロモーターは、一般に、ＣＡＡＴおよびＴＡＴＡボックスなどの転写開始と関連のあるカノニカル領域（コンセンサス配列ＴＡＴＡＷＡＷ）を含む。ＴＡＴＡボックスエレメントは通常、転写開始部位（ＴＳＳ）のおよそ２０〜３５塩基対（ｂｐ）上流に位置している。コアプロモーターの活性化は上流調節配列により達成され、その配列に種々のタンパク質が結合し、引き続いて転写開始複合体と相互作用して遺伝子発現を活性化する。これらの調節エレメントは、プロモーターの時空間的発現パターンを決定するＤＮＡ配列を含む。

図１を参照すると、トウモロコシ（Z. mays）Ｕｂｉ−１遺伝子プロモーターはトウモロコシ（Z. mays）自殖細胞株Ｂ７３由来である。トウモロコシ（Z. mays）Ｕｂｉ−１プロモーターは、ＴＳＳの５’上流に位置するおよそ８９５ｂｐのＤＮＡ配列（すなわち、上流エレメント）から構成される。さらに、トウモロコシ（Z. mays）Ｕｂｉ−１プロモーターは、ＴＳＳの３’下流に位置する約１０９３ｂｐのＤＮＡ配列から構成される（米国特許第５，５１０，４７４号参照）。したがって、トウモロコシ（Z. mays）Ｕｂｉ−１プロモーターは、およそ２キロ塩基対（ｋｂ）の全ＤＮＡ配列から構成される。

トウモロコシ（Z. mays）Ｕｂｉ−１プロモーターの上流エレメントは、ＴＳＳのおよそ３０ｂｐ ５’上流に位置するＴＡＴＡボックスを含む（図１および図３）。さらに、上流エレメントはＴＳＳの直ぐ５’上流に位置する２つの重複している熱ショックコンセンサスエレメントを含む。８２ｂｐ ５’−ＵＴＲまたはリーダー配列はＴＳＳの直ぐ３’下流に位置しており、続いてイントロンが塩基８３〜１０９３まで伸びている（図１および図３）。

以前の研究では、トウモロコシ（Z. mays）Ｕｂｉ−１プロモーターにより調節される遺伝子および／または導入遺伝子の遺伝子発現の増加が記載された。例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子をトウモロコシ（Z. mays）Ｕｂｉ−１プロモーターに転写融合させると、トウモロコシプロトプラストにおいて、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターにより推進される発現の１０倍を超えるレベルのＣＡＴ活性が得られた（CHRISTENSEN and QUAIL 1996; CHRISTENSEN et al. 1992）。

制御トウモロコシ（Z．mays）Ｕｂｉ−１プロモーターに加えて、本出願は新規のトウモロコシＵｂｉ−１プロモーターを説明する。トウモロコシ（Z. mays）遺伝子型ｃ．ｖ．Ｂ７３に由来する対照Ｕｂｉ−１プロモーターとは違って、新規のＵｂｉ−１プロモーターは異なるトウモロコシ（Zea）種であるジーラグジュリアンス（Zea luxurians）に由来していた。本明細書で使用されるＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）Ｕｂｉ−１プロモーターはバージョン１（ｖ１）遺伝子型を有していた。ポリヌクレオチド配列を含むトウモロコシ（Z．mays）またはＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）Ｕｂｉ−１プロモーターを使用する構築物および方法が提供される。一実施形態では、プロモーターは、以下のトウモロコシ（Z．mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１遺伝子由来のポリヌクレオチド配列を含むことができる。

別の実施形態では、プロモーターは、以下のＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１遺伝子由来のポリヌクレオチド配列を含むことができる。

本明細書に記載されるプロモーターは、プロモーターの特異的領域（すなわち、上流プロモーター、５’−ＵＴＲ、およびイントロン領域）を同定するためのクローニングおよびそれに続くＤＮＡ配列相同分析により特徴付けられた。植物において導入遺伝子を発現させるための上流プロモーター領域、５’−ＵＴＲまたはリーダー領域、およびイントロンのポリヌクレオチド配列を含む構成的トウモロコシ（Z．mays）またはＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）Ｕｂｉ−１プロモーターを使用する構築物および方法が提供される。一実施形態では、プロモーターは以下のトウモロコシ（Z．mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１遺伝子由来の上流プロモーターポリヌクレオチド配列を含むことができる。

別の実施形態では、プロモーターは以下のＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１遺伝子由来の上流プロモーターポリヌクレオチド配列を含むことができる。

追加の遺伝子調節エレメント
導入遺伝子発現は、上流プロモーター配列の３’下流に位置する５’−ＵＴＲおよび／またはイントロン領域によっても調節することができる。５’−ＵＴＲおよび／またはイントロンに作動可能に連結された上流プロモーター領域を含むプロモーターは導入遺伝子発現を調節することが可能である。上流プロモーターは転写を推進するのに必要であるが、５’−ＵＴＲおよび／またはイントロンが存在すれば発現レベルを増加させ、翻訳およびタンパク質合成のためのｍＲＮＡ転写物をより多く産生することが可能である。上流プロモーターポリヌクレオチド配列に５’−ＵＴＲおよび／またはイントロンを付加させると、導入遺伝子の安定した発現を助けることが可能である。

さらに、植物における導入遺伝子の発現を助けるため、上流プロモーターポリヌクレオチド配列を含む構成的プロモーターに５’−ＵＴＲまたはリーダー領域が続いてもよい。一実施形態では、プロモーターは以下のトウモロコシ（Z．mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１遺伝子由来の５’−ＵＴＲまたはリーダーポリヌクレオチド配列を含むことができる。

別の実施形態では、プロモーターは以下のＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１遺伝子由来の５’−ＵＴＲまたはリーダーポリヌクレオチド配列を含むことができる。

さらに、植物における導入遺伝子の発現を助けるため、上流プロモーターポリヌクレオチド配列に続いて５’−ＵＴＲまたはリーダー領域を含む構成的プロモーターにイントロンが続いてもよい。一実施形態では、プロモーターは以下のトウモロコシ（Z．mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１遺伝子由来のイントロンポリヌクレオチド配列を含むことができる。

別の実施形態では、プロモーターは以下のＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１遺伝子由来のイントロンポリヌクレオチド配列を含むことができる。

導入遺伝子およびレポーター遺伝子発現カセット
導入遺伝子発現は遺伝子発現カセットによっても調節することができる。一実施形態では、遺伝子発現カセットはプロモーターを含む。一実施形態では、遺伝子発現カセットはＵｂｉ−１プロモーターを含む。一実施形態では、遺伝子発現カセットは植物由来のＵｂｉ−１プロモーターを含む。一実施形態では、遺伝子発現カセットは、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１由来のＵｂｉ−１プロモーターを含む。

一実施形態では、遺伝子発現カセットは、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーターであって、配列番号２に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、または１００％同一であるプロモーターを含む。一実施形態では、遺伝子発現カセットは、レポーター遺伝子または導入遺伝子に作動可能に連結されている、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーターなどの構成的プロモーターを含む。一実施形態では、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されている構成的プロモーターを含み、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択可能マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せであってよい。一実施形態では、構成的プロモーターを含む遺伝子発現カセットは１つまたは複数の導入遺伝子またはレポーター遺伝子の発現を推進することができる。一実施形態では、構成的プロモーターを含む遺伝子発現カセットは２つ以上の導入遺伝子またはレポーター遺伝子の発現を推進することができる。

一実施形態では、遺伝子発現カセットは、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーターであって、その上流プロモーター配列が配列番号４に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、または１００％同一であるプロモーターを含む。一実施形態では、遺伝子発現カセットは、レポーター遺伝子または導入遺伝子に作動可能に連結されている、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１上流プロモーターなどの構成的プロモーターを含む。一実施形態では、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されている構成的上流プロモーターを含み、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択可能マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せであってよい。一実施形態では、構成的上流プロモーターを含む遺伝子発現カセットは１つまたは複数の導入遺伝子またはレポーター遺伝子の発現を推進することができる。一実施形態では、構成的上流プロモーターを含む遺伝子発現カセットは２つ以上の導入遺伝子またはレポーター遺伝子の発現を推進することができる。追加の実施形態では、上流プロモーターはイントロンを含むことができる。一実施形態では、上流プロモーターは、レポーター遺伝子または導入遺伝子に作動可能に連結されているイントロン配列を含むことができる。別の実施形態では、上流プロモーターは５’−ＵＴＲまたはリーダー配列を含むことができる。一実施形態では、上流プロモーターは、レポーター遺伝子または導入遺伝子に作動可能に連結されている５’−ＵＴＲまたはリーダー配列を含むことができる。さらに別の実施形態では、上流プロモーターは５’−ＵＴＲまたはリーダー配列およびイントロン配列を含むことができる。一実施形態では、上流プロモーターは、レポーター遺伝子または導入遺伝子に作動可能に連結されている５’−ＵＴＲまたはリーダー配列およびイントロン配列を含むことができる。

一実施形態では、遺伝子発現カセットは、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーターであって、その５’−ＵＴＲまたはリーダー配列が配列番号６に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、または１００％同一であるプロモーターを含む。一実施形態では、遺伝子発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結されているユビキチン−１タンパク質をコードするトウモロコシ遺伝子由来の５’−ＵＴＲまたはリーダーを含み、プロモーターは、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーター、または植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）またはジーラグジュリアンス（Zea luxurians）ユビキチン−１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）、もしくは細菌（例えば、アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）デルタｍａｓ）を起源とするプロモーターである。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されているユビキチンタンパク質をコードするトウモロコシ遺伝子由来のＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ ５’−ＵＴＲまたはリーダー配列を含み、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択可能マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せであってよい。

一実施形態では、遺伝子発現カセットは、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーターであって、そのイントロン配列が配列番号８に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、または１００％同一であるプロモーターを含む。一実施形態では、遺伝子発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結されているユビキチン−１タンパク質をコードするトウモロコシ遺伝子由来のイントロンを含み、プロモーターは、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーター、または植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）またはジーラグジュリアンス（Zea luxurians）ユビキチン−１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）、もしくは細菌（例えば、アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）デルタｍａｓ）を起源とするプロモーターである。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されているユビキチンタンパク質をコードするトウモロコシ遺伝子由来のイントロンを含み、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択可能マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せであってよい。

一実施形態では、ベクターは本明細書に記載される遺伝子発現カセットを含むことができる。一実施形態では、ベクターは、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージ、ウイルス、またはドナーＤＮＡなどの、直接形質転換もしくは遺伝子ターゲティングにおいて本発明者らのために切除されたポリヌクレオチド断片でもよい。

一実施形態では、細胞または植物は本明細書に記載される遺伝子発現カセットを含む。一実施形態では、細胞または植物は、本出願において開示される遺伝子発現カセットを含むベクターを含む。一実施形態では、ベクターは、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージ、またはウイルスでもよい。それにより、遺伝子発現カセットを含む細胞または植物は、それぞれトランスジェニック細胞またはトランスジェニック植物である。

一実施形態では、トランスジェニック植物は単子葉植物でも双子葉植物でもよい。トランスジェニック単子葉植物の一実施形態は、トウモロコシ、コムギ、イネ、モロコシ、カラスムギ、ライムギ、バナナ、サトウキビ、およびアワでもよいがこれらに限定されない。トランスジェニック双子葉植物の一実施形態は、ダイズ、ワタ、ヒマワリ、またはキャノーラでもよいがこれらに限定されない。本明細書に記載されるように、一実施形態にはトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子も含まれる。

選択可能マーカー
種々の選択可能マーカーは、レポーター遺伝子とも言われるが、形質転換された植物（「形質転換体」）の同定および選択を可能にするために、選択された発現ベクター内に組み込むことができる。例えば、ＤＮＡシークエンシングとポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、サザンブロッティング、ＲＮＡブロッティング、ホスフィノトリシン抵抗性を媒介する沈殿タンパク質などのベクターから発現されたタンパク質の検出のための免疫学的方法、またはβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼなどをコードするレポーター遺伝子などの他のタンパク質の目視観察を含む、形質転換された植物における選択可能マーカーの発現を確かめるための多くの方法が利用可能である（Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001参照。その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

選択可能マーカー遺伝子は形質転換された細胞または組織の選択のために利用される。選択可能マーカー遺伝子には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子などの抗生物質抵抗性をコードする遺伝子ならびに除草剤化合物に対する抵抗性を与える遺伝子が含まれる。除草剤抵抗性遺伝子は一般に、除草剤に非感受性の改変された標的タンパク質を、または除草剤が作用できる前に植物内において除草剤を分解するまたは解毒する酵素をコードしている。例えば、グリホサートに対する抵抗性は、変異標的酵素、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子を使用することにより得られてきた。ＥＰＳＰＳの遺伝子および変異体は周知であり、下でさらに説明される。グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、および２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）に対する抵抗性は、それぞれの除草剤を解毒する、ｐａｔをコードする細菌遺伝子またはＤＳＭ−２、ニトリラーゼ、ａａｄ−１またはａａｄ−１２遺伝子を使用することにより得られてきた。

一実施形態では、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素、ならびにアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）およびアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の抵抗性／耐性の遺伝子を含む、除草剤は成長点または分裂組織を阻害することができる。グリホサート抵抗性遺伝子は、組換え核酸の導入ならびに／またはそれぞれ天然のＥＰＳＰ遺伝子、ａｒｏＡ遺伝子、およびグリホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子の種々の形態のｉｎ ｖｉｖｏ変異誘発による、変異５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）およびｄｇｔ−２８遺伝子を含む。他のホスホノ化合物の抵抗性遺伝子には、ストレプトミセスハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトミセスビリドクロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes）を含む、ストレプトミセス種由来のＢＡＲ遺伝子、ならびにピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン（ＡＣＣアーゼ阻害剤コード遺伝子）が含まれる。シクロヘキサンジオンおよび／またはアリールオキシフェノキシプロパン酸（Ｈａｌｏｘｙｆｏｐ、Ｄｉｃｌｏｆｏｐ、Ｆｅｎｏｘｙｐｒｏｐ、Ｆｌｕａｚｉｆｏｐ、Ｑｕｉｚａｌｏｆｏｐを含む）に対する抵抗性を与える例となる遺伝子には、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）−Ａｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡｃｃ１−Ｓ３の遺伝子が含まれる。一実施形態では、トリアジン（ｐｓｂＡおよび１ｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）を含む、除草剤は光合成を阻害することが可能である。

一実施形態では、選択可能マーカー遺伝子には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ、シアナミドヒドラターゼ、アスパラギン酸キナーゼ、ジヒドロジピコリネートシンターゼ、トリプトファンデカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリネートシンターゼおよび脱感作アスパラギン酸キナーゼ、ｂａｒ遺伝子、トリプトファンデカルボキシラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴまたはＨＹＧ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、５−エノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼ（ａｒｏＡ）、ハロアリ−ルニトリラーゼ、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ｓｕｌ Ｉ）、ならびに３２ｋＤ光化学系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ）をコードする遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。

一実施形態には、クロラムフェニコール、メトトレキサート、ハイグロマイシン、スペクチノマイシン、ブロモキシニル、グリホサート、およびホスフィノトリシンに対する抵抗性をコードする遺伝子も含まれる。

選択可能マーカー遺伝子の上記リストは限定的であることを意図してはいない。本発明にはいかなるレポーターまたは選択可能マーカー遺伝子でも包含される。

選択可能マーカー遺伝子は植物における最適発現のために合成される。例えば、一実施形態では、遺伝子のコード配列は、植物における発現を増強するためにコドン最適化により改変されている。選択可能マーカー遺伝子は特定の植物種における発現のために最適化することができる、または代わりに双子葉植物または単子葉植物における最適発現のために改変することができる。植物の好ましいコドンは、対象の特定の植物種においてもっとも大量に発現されるタンパク質におけるもっとも高い出現頻度のコドンから決定することができる。一実施形態では、選択可能マーカー遺伝子は、植物においてより高いレベルで発現されて、より高い形質転換効率を生じるように設計される。遺伝子の植物最適化のための方法は周知である。合成ポリヌクレオチド配列の最適化および製造に関する手引きは、例えば、ＷＯ２０１３／０１６５４６、ＷＯ２０１１／１４６５２４、ＷＯ１９９７／０１３４０２、米国特許第６，１６６，３０２号、および米国特許第５，３８０，８３１号に見出すことができ、これら特許文献は参照により本明細書に組み込まれる。

導入遺伝子
開示された方法および組成物は、植物ゲノム内のポリヌクレオチド遺伝子配列を発現させるのに使用することができる。したがって、除草剤耐性、昆虫抵抗性、栄養分、抗生物質、または治療分子をコードする遺伝子を新規プロモーターにより発現させることができる。

一実施形態では、主題の開示の構成的プロモーター調節エレメントは、グリホサート、２，４−Ｄグルホシネート、または別の除草剤に対する抵抗性または耐性を与え、選択した昆虫もしくは病害に対する抵抗性および／または滋養強壮作用、改良された農学的特徴、タンパク質、または餌、食物に有用な他の産物、産業上の、医薬上のもしくは他の使用を提供するポリヌクレオチド配列をコードする１つまたは複数の遺伝子と組み合わされるまたは作動可能に連結される。導入遺伝子は、植物ゲノム内で２つ以上の対象の核酸配列と一緒に「スタックする」ことができる。スタッキングは、例えば、２つ以上の事象を使用する従来の植物育種、対象の配列を含有する構築物を用いた植物の形質転換、トランスジェニック植物の再形質転換、または相同組換えによる標的を狙った組込みを通じた新しい形質の追加により達成することができる。

対象のこのようなポリヌクレオチド配列には、下に提供される例が含まれるがこれらに限定されない。

１．有害生物または病害に対する抵抗性を与える遺伝子またはコード配列（例えば、ｉＲＮＡ）
（Ａ）植物耐病性遺伝子。植物防御は多くの場合、植物中の耐病性遺伝子の産物（Ｒ）と病原体中の対応する非病原性（Ａｖｒ）遺伝子の産物の間の特異的な相互作用により活性化される。植物品種はクローン化された抵抗性遺伝子で形質転換して、特異的な病原体株に対して抵抗性である植物を工学的に作製することができる。このような遺伝子の例には、クラドスポリウムフルバム（Cladosporium fulvum）に対する抵抗性のトマトＣｆ−９遺伝子（Jones et al., 1994 Science 266:789）、シュードモナスシンリンゲｐｖ．トマトに対する抵抗性の、タンパク質キナーゼをコードするトマトＰｔｏ遺伝子（Martin et al., 1993 Science 262:1432）、およびシュードモナスシンリンゲ（Pseudomonas syringae）に対する抵抗性のシロイヌナズナＲＳＳＰ２遺伝子（Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089）が含まれる。
（Ｂ）バチルスチューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質、その誘導体またはそれをモデルとする合成ポリペプチド、例えば、Ｂｔδエンドトキシン遺伝子（Geiser et al., 1986 Gene 48:109）および植物殺虫性（ＶＩＰ）遺伝子（例えば、Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94参照）のヌクレオチド配列。さらに、δエンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号４００９８、６７１３６、３１９９５および３１９９８の下、アメリカ合衆国培養細胞系保存機関（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）から購入することが可能である。
（Ｃ）レクチン、例えば、いくつかのクリビアミニアタ（Clivia miniata）マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列（Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825）。
（Ｄ）ビタミン結合タンパク質、例えば、害虫に対する幼虫駆除剤として有用であるアビジンおよびアビジン相同体。米国特許第５，６５９，０２６号参照。
（Ｅ）酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤。このような遺伝子の例には、イネシステインプロテイナーゼ阻害剤（Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793）、タバコプロテイナーゼ阻害剤Ｉ（Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985）、およびαアミラーゼ阻害剤（Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243）が含まれる。
（Ｆ）昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン、例えば、エクジステロイド、および幼若ホルモン、その変異体、それに基づく模倣体、またはそのアンタゴニストもしくはアゴニスト、例えば、幼若ホルモンの失活剤であるクローン化された幼若ホルモンエステラーゼのバキュロウイルス発現、（Hammock et al., 1990 Nature 344:458）。
（Ｇ）発現すると冒された害虫の生理機能を破壊する昆虫特異的ペプチドまたは神経ペプチド（J. Biol. Chem. 269:9）。このような遺伝子の例には、昆虫利尿ホルモン受容体（Regan, 1994）、ジプロプテラパンクタタ（Diploptera punctata）において同定されたアロスタチン（Pratt, 1989）、および昆虫特異的麻痺性神経毒（米国特許第５，２６６，３６１号）が含まれる。
（Ｈ）サソリ昆虫障害性ペプチドなどの、ヘビ、スズメバチなどにより天然において産生される昆虫特異的毒液（Pang, 1992 Gene 116:165）。
（Ｉ）モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性のある別の非タンパク質分子の高度集積の原因となる酵素。
（Ｊ）生物活性分子の翻訳後修飾を含む、修飾に関与する酵素、例えば、天然であれ合成であれ、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、アミノ基転移酵素、エステラーゼ、加水分解酵素、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ、およびグルカナーゼ。このような遺伝子の例には、オランダカイウ（calla）遺伝子（ＰＣＴ公開出願ＷＯ９３／０２１９７）、キチナーゼコード配列（例えば、受託番号３９９９６３７および６７１５２の下、ＡＴＣＣから入手可能である）、タバコ鉤虫キチナーゼ（Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691）、およびパセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子（Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673）が含まれる。
（Ｋ）シグナル伝達を刺激する分子。このような分子の例には、リョクトウカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757）、およびトウモロコシカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467）が含まれる。
（Ｌ）疎水性モメントペプチド。米国特許第５，６５９，０２６号および米国特許第５，６０７，９１４号参照。後者は耐病性を与える合成抗菌ペプチドを教示している。
（Ｍ）トランスジェニックタバコ植物をシュードモナスソラナセアラム（Pseudomonas solanacearum1）に対して抵抗性にするセクロピン−β溶菌性ペプチド類似体（Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89:43）などの、膜パーミアーゼ、チャネルフォーマー（channel former）またはチャネルブロッカー。
（Ｎ）ウイルス侵入性タンパク質またはそれに由来する複合毒素。例えば、形質転換された植物細胞内にウイルスコートタンパク質が蓄積すると、ウイルス感染および／またはコートタンパク質遺伝子が由来するウイルスにより、ならびに関連するウイルスによりもたらされる病害の発症に対する抵抗性が与えられる。アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑病ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチ病ウイルス、タバコラットルウイルスおよびタバコモザイクウイルスに対するコートタンパク質媒介抵抗性が形質転換された植物に与えられてきた。例えば、Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451参照。
（Ｏ）昆虫特異的抗体またはそれに由来する免疫毒素。したがって、昆虫腸における極めて重要な代謝機能を標的にした抗体であれば冒された酵素を不活化し、昆虫を死滅させることになる。例えば、Taylor et al. (1994) Abstract #497, Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactionsは、一本鎖抗体断片を産生することによるトランスジェニックタバコにおける酵素不活化を明らかにしている。
（Ｐ）ウイルス特異的抗体。例えば、組換え抗体遺伝子を発現しているトランスジェニック植物がウイルス攻撃から保護されていることを明らかにするTavladoraki et al. (1993) Nature 266:469を参照されたい。
（Ｑ）病原体または寄生虫により天然に産生される発育遅延タンパク質。したがって、真菌エンドα−１，４−Ｄポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼを可溶化することにより真菌定着および植物養分放出を促進する（Lamb et al., 1992）Bio/Technology 10:1436。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特徴付けはToubart et al. (1992 Plant J. 2:367) に記載されている。
（Ｒ）真菌病に対する増加した抵抗性を与えるオオムギリボソーム不活化遺伝子などの、植物により天然に産生される発育遅延タンパク質(Longemann et al., 1992). Bio/Technology 10:3305。
（Ｓ）ＲＮＡ分子を使用して標的遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ干渉。一例でのＲＮＡ分子は部分的にまたは完全に二本鎖であり、これがサイレンシング応答を始動させ、ｄｓＲＮＡを小分子干渉ＲＮＡに切断して、その後この小分子干渉ＲＮＡはターゲティング複合体に組み込まれて、相同ｍＲＮＡを破壊する。例えば、Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，５０６，５５９号；Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ，米国特許第６，５７３，０９９号を参照されたい。

２．除草剤に対する抵抗性を与える遺伝子
（Ａ）イミダゾリノン、スルホンアニリドまたはスルホニル尿素除草剤などの、成長点または分裂組織を阻害する除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。この範疇での例となる遺伝子は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）酵素（Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449）としても知られる変異アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）（Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241）をコードする。
（Ｂ）変異ＥＰＳＰシンターゼおよびａｒｏＡ遺伝子により、またはＤＧＴ−２８、２ｍＥＰＳＰＳ、ＧＡＴ（グリホサートアセチルトランスフェラーゼ）もしくはＧＯＸ（グリホサートオキシダーゼ）などの遺伝子ならびにグルホシネート（ｐａｔ、ｂａｒおよびｄｓｍ−２遺伝子）およびアリールオキシフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサンジオン（ＡＣＣアーゼ阻害剤コード遺伝子）などの他のホスホノ化合物による代謝不活化を通して与えられるグリホサートに対する抵抗性もしくは耐性をコードする１つもしくは複数の追加の遺伝子。例えば、グリホサート抵抗性を与えることができるＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列を開示する、米国特許第４，９４０，８３５号を参照されたい。変異ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号３９２５６の下で入手可能であり、変異遺伝子のヌクレオチド配列は米国特許第４，７６９，０６１号に開示されている。欧州特許出願第０３３３０３３号および米国特許第４，９７５，３７４号は、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を与えるグルタミンシンセターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示している。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は欧州特許出願第０２４２２４６号に提供されている。De Greef et al. (1989) Bio/Technology 7:61は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性をコードするキメラｂａｒ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の生成を記載している。セトキシジムおよびハロキシホップなどの、アリールオキシフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサンジオンに対する抵抗性を与える遺伝子の例は、Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435により記載されているＡｃｃｌ−Ｓ１、Ａｃｃｌ−Ｓ２およびＡｃｃｌ−Ｓ３遺伝子である。
（Ｃ）トリアジン（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）およびベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）などの、光合成を阻害する除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3:169はクラミドモナス（Chlamydomonas）を形質転換するための変異ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドの使用を記載している。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は米国特許第４，８１０，６４８号に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子はＡＴＣＣ受託番号５３４３５、６７４４１および６７４４２下で入手可能である。グルタチオンＳトランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現はHayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173により記載されている。
（Ｄ）パラヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）がホモゲンチジン酸に変換される反応を触媒する酵素である、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）に結合する除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。これには、イソキサゾール（ＥＰ４１８１７５、ＥＰ４７０８５６、ＥＰ４８７３５２、ＥＰ５２７０３６、ＥＰ５６０４８２、ＥＰ６８２６５９、米国特許第５，４２４，２７６号）、特にトウモロコシの選択性除草剤であるイソキサフルトール、ジケトニトリル（ＥＰ４９６６３０、ＥＰ４９６６３１）、特に２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３Ｃｌ２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、トリケトン（ＥＰ６２５５０５、ＥＰ６２５５０８、米国特許第５，５０６，１９５号）、特にスルコトリオンおよびピラゾリネートなどの除草剤が含まれる。例えば、米国特許第６，２６８，５４９号および米国特許第６，２４５，９６８号ならびに米国特許出願公開第２００３／００６６１０２号に記載される遺伝子を含む、植物において過剰なＨＰＰＤを産生する遺伝子は、このような除草剤に対する耐性または抵抗性を与えることが可能である。
（Ｅ）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）などのフェノキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性をコードし、アリールオキシフェノキシプロピオン酸（ＡＯＰＰ）除草剤に対する抵抗性または耐性も与えることができる遺伝子。このような遺伝子の例には、米国特許第７，８３８，７３３号に記載されている、α−ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ酵素（ａａｄ−１）遺伝子が含まれる。
（Ｆ）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）などのフェノキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性をコードし、フルロキシピルまたはトリクロピルなどのピリジルオキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性も与えることができる遺伝子。このような遺伝子の例には、ＷＯ２００７／０５３４８２ Ａ２に記載されている、αケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ酵素遺伝子（ａａｄ−１２）が含まれる。
（Ｇ）ジカンバに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子（例えば、米国特許出願公開第２００３０１３５８７９号参照）。
（Ｈ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）を阻害する除草剤に対する抵抗性または耐性を与える遺伝子（米国特許第５，７６７，３７３号参照）。
（Ｉ）光化学系ＩＩ反応中心（ＰＳＩＩ）のコアタンパク質に結合するトリアジン系除草剤（アトラジンなど）および尿素誘導体（ジウロンなど）除草剤に対する抵抗性または耐性を与える遺伝子（Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245参照）。

３．付加価値形質を与えるまたはこれに寄与する遺伝子
（Ａ）植物のステアリン酸含有量を増加させるために、例えば、トウモロコシまたはアブラナ属（Brassica）をアンチセンス遺伝子またはステアロイルＡＣＰデサチュラーゼで形質転換することによる改変された脂肪酸代謝 (Knultzon et al., 1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624。
（Ｂ）減少したフィターゼ含有量
（１）クロコウジカビ（Aspergillus niger）フィターゼ遺伝子（Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87）などのフィターゼコード遺伝子を導入すると、フィチン酸の分解が増強され、形質転換された植物にさらに多くの遊離リン酸を加える。
（２）フィチン酸含有量を減少させる遺伝子を導入することが可能であった。トウモロコシでは、これは、例えば、低レベルのフィチン酸を特徴とするトウモロコシ変異体の原因である単一の対立遺伝子と関連のあるＤＮＡをクローニングし次に再導入することにより達成することが可能であった（Raboy et al., 1990 Maydica 35:383）。
（Ｃ）例えば、デンプンの分枝パターンを変化させる酵素をコードする遺伝子で植物を形質転換することによりもたらされる改変された炭水化物組成。このような酵素の例には、ストレプトコッカス（Streptococcus）粘液フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子（(Shiroza et al., 1988) J. Bacteriol. 170:810）、枯草菌（Bacillus subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子（Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220）、バチルスリケニフォルミス（Bacillus licheniformis）αアミラーゼ（Pen et al., 1992 Bio/Technology 10:292）、トマトインベルターゼ遺伝子（Elliot et al., 1993）、オオムギアミラーゼ遺伝子（Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480）、およびトウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素ＩＩ（Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450）が含まれる。

形質転換
植物の形質転換に適した方法には、ＤＮＡを細胞内に導入することができるいかなる方法でも、例えばおよび限定なしで、エレクトロポレーション（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号参照）、微粒子銃（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号、米国特許第５，５５０，３１８号、米国特許第５，５３８，８８０号、米国特許第６，１６０，２０８号、米国特許第６，３９９，８６１号、および米国特許第６，４０３，８６５号参照）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換（例えば、米国特許第５，６３５，０５５号、米国特許第５，８２４，８７７号、米国特許第５，５９１，６１６号、米国特許第５，９８１，８４０号、および米国特許第６，３８４，３０１号参照）、およびプロトプラスト形質転換（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号参照）が含まれる。これらの方法を使用すれば、植物を安定的に形質転換することも一過性に形質転換することもできる。

ＤＮＡ構築物は炭化珪素繊維を用いた撹拌などの技法を使用して植物細胞のゲノムＤＮＡ内に直接導入することができる（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号および米国特許第５，４６４，７６５号参照）。ＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ粒子銃などの微粒子銃法を使用して植物組織に直接導入することができる（例えば、Klein et al., (1987) Nature 327:70-73参照）。代わりに、ＤＮＡ構築物は、ナノ粒子形質転換により植物細胞に導入することができる（例えば、米国特許出願公開第２００９／０１０４７００号参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

さらに、遺伝子導入は、根粒菌種（Rhizobium sp.）ＮＧＲ２３４、アルファルファ根粒菌（Sinorhizoboium meliloti）、ミヤコグサ根粒菌（Mesorhizobium loti）、ジャガイモウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルス、キャッサバ葉脈モザイクウイルス、および／またはタバコモザイクウイルスなどの非アグロバクテリウム（Agrobacterium）細菌またはウイルスを使用して達成することができる（例えば、Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4参照）。

形質転換技法の適用を通じて、ほぼどんな植物種の細胞でも安定的に形質転換することができ、これらの細胞は周知の技法によりトランスジェニック植物に成長させることができる。例えば、ワタ形質転換という文脈で特に有用である可能性がある技法は、米国特許第５，８４６，７９７号、米国特許第５，１５９，１３５号、米国特許第５，００４，８６３号、および米国特許第６，６２４，３４４号に記載されており、特にアブラナ属（Brassica）植物を形質転換するための技法は、例えば、米国特許第５，７５０，８７１号に記載されており、ダイズを形質転換するための技法は、例えば、米国特許第６，３８４，３０１号に記載されており、ならびにトウモロコシを形質転換するための技法は、例えば、米国特許第７，０６０，８７６号および米国特許第５，５９１，６１６号、ならびに国際ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０６７２２に記載されている。

レシピエント細胞への外来性核酸の送達をもたらした後、形質転換された細胞は一般には、さらなる培養および植物体再生のために同定される。形質転換体を同定する能力を改善するために、形質転換体を生成するのに使用される形質転換ベクターと一緒に選択可能マーカー遺伝子を用いるのが望ましいことがある。例示的な一実施形態では、形質転換された細胞集団は、細胞を選択剤（単数または複数）に曝露することによりアッセイすることができる、または所望のマーカー遺伝子形質について細胞をスクリーニングすることができる。

選択剤への曝露を生き延びる細胞、またはスクリーニングアッセイにおいてプラスのスコアーを得た細胞は、植物の再生を支持する培地において培養することができる。一実施形態では、いかなる適切な植物組織培養培地でも、成長調節物質などの追加の物質を含むことにより改変することができる。植物組織は、植物体再生の試みを開始するのに十分な組織が入手可能になるまで成長調節物質のある基本培地上で維持することができる。代わりに、組織の形態が再生に適するまで（例えば、少なくとも２週間）の手作業での選別の繰り返しラウンドに続いて、その後組織は苗条形成に役立つ培地に移すことができる。培養物は十分な苗条形成が起こるまで定期的に移される。苗条が形成された後は、根形成に役立つ培地に移される。十分な根が形成された後、植物はさらなる成長と成熟のために土壌に移すことができる。

再生中の植物に与えられた構築物を含む所望の核酸の存在を確かめるために、種々のアッセイを実施することができる。このようなアッセイには、サザンおよびノーザンブロッティングならびにＰＣＲなどの分子生物学的アッセイ；ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよび／もしくはＬＣ−ＭＳ ＭＳ分光光度法などの免疫学的手段により、または葉、カルス、もしくは花粉アッセイなどの植物部分アッセイによりなどの酵素機能によるタンパク質産物の存在を検出することなどの生化学的アッセイ；ならびに／あるいは全再生植物の表現型の分析が含まれ得る。

トランスジェニック事象は、例えば、対象の核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲ増幅によりスクリーニングすることができる。ＰＣＲ遺伝子型判定は、ゲノムに組み込まれた対象の核酸分子を含有すると予想される単離されたおよび／または精製された宿主植物組織由来のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅、続いて標準クローニング、ならびにＰＣＲ増幅産物の配列分析を含むがこれらに限定されないと理解されている。ＰＣＲ遺伝子型判定の方法は十分に説明されており（例えば、Rios et al. (2002) Plant J. 32:243-53参照）、細胞培養物を含む任意の植物種または組織型由来のゲノムＤＮＡに適用することができる。

標的配列と導入配列の両方に結合するオリゴヌクレオチドプライマーの組合せは、ＰＣＲ増幅反応において順次使用することも多重化する（multiplex）こともできる。標的部位、導入核酸配列、および／または２種類の核酸配列の組合せにアニールするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを生成することができる。したがって、ＰＣＲ遺伝子型判定戦略は、例えばおよび限定なしで、植物ゲノム中の特異的な配列の増幅、植物ゲノム中の複数の特異的な配列の増幅、植物ゲノム中の非特異的な配列の増幅、および前述のいずれかの組合せを含むことができる。当業者であれば、ゲノムを調べるためにプライマーおよび増幅反応の追加の組合せを工夫することができる。例えば、一組のフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーを設計して、導入された核酸配列の境界の外側の標的に特異的な核酸配列（複数可）にアニールさせることができる。

フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーを設計して、例えば、そこに含まれる対象のヌクレオチド配列内のコード領域に一致する配列で、導入された核酸分子、または核酸分子の他の部分に特異的にアニールさせることができる。プライマーは本明細書に記載されるプライマーと併せて使用することができる。オリゴヌクレオチドプライマーは所望の配列に従って合成してもよく、市販されている（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡより）。増幅後にクローニングおよびシークエンシング、または増幅産物の直接配列分析が続いてもよい。一実施形態では、遺伝子標的に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーはＰＣＲ増幅において用いる。

導入遺伝子を発現させる方法
一実施形態では、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーター（配列番号２）を含む植物を生育することを含む。一実施形態では、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーター（配列番号２）を含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。

一実施形態では、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーター（配列番号２）を含む遺伝子発現カセットを含む植物を生育することを含む。別の実施形態では、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーター（配列番号２）を含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。

一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は導入遺伝子に作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーター（配列番号２）を含む遺伝子発現カセットを含む。その中で、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーター（配列番号２）は、上流プロモーター（配列番号４）、５’−ＵＴＲ（配列番号６）、およびイントロン（配列番号８）から構成される。一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１上流プロモーター（配列番号４）、５’−ＵＴＲ（配列番号６）、およびイントロン（配列番号８）を含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１遺伝子のＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１上流プロモーター（配列番号４）、５’−ＵＴＲ（配列番号６）、およびイントロン（配列番号８）を含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１遺伝子のＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１上流プロモーター（配列番号４）、５’−ＵＴＲ（配列番号６）、およびイントロン（配列番号８）を含む遺伝子発現カセットを含む。

一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞はＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーターを含む。一実施形態では、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーターは配列番号２であってよい。一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、配列番号２に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、または１００％同一であるプロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的な一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含み、導入遺伝子は殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択可能マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せであってよい。

一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞はＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１上流プロモーターを含む。一実施形態では、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１上流プロモーターは配列番号４であってよい。一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、配列番号４に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、または１００％同一である上流プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１上流プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的な一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１上流プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含み、導入遺伝子は殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択可能マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せであってよい。

一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞はＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１ ５’−ＵＴＲまたはリーダー配列を含む。一実施形態では、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１ ５’−ＵＴＲまたはリーダー配列は配列番号６のポリヌクレオチドであってよい。一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、配列番号６に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、または１００％同一である５’−ＵＴＲまたはリーダー配列を含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態では、遺伝子発現カセットはプロモーターに作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１ ５’−ＵＴＲまたはリーダーを含み、プロモーターは、ユビキチンプロモーター、または植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）またはジーラグジュリアンス（Zea luxurians）ユビキチン−１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）、もしくは細菌（例えば、アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）デルタｍａｓ）を起源とするプロモーターである。一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１ ５’−ＵＴＲまたはリーダーを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的な一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１ ５’−ＵＴＲまたはリーダーを含む遺伝子発現カセットを含み、導入遺伝子は殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択可能マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せであってよい。

一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞はＵｂｉ−１イントロンを含む。一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞はＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１イントロンを含む。一実施形態では、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１イントロンは配列番号８のポリヌクレオチドであってよい。一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、配列番号８に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、または１００％同一であるイントロンを含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態では、遺伝子発現カセットはプロモーターに作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１イントロンを含み、プロモーターは、ユビキチンプロモーター、または植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）またはジーラグジュリアンス（Zea luxurians）ユビキチン−１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）、または細菌（例えば、アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）デルタｍａｓ）を起源とするプロモーターである。一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１イントロンを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的な一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されていＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１イントロンを含む遺伝子発現カセットを含み、導入遺伝子は殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択可能マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せであってよい。

一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１上流プロモーター、Ｕｂｉ−１イントロン、およびＵｂｉ−１ ５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。遺伝子発現カセットが２つ以上の導入遺伝子を含む場合、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーター、Ｕｂｉ−１イントロン、およびＵｂｉ−１ ５’−ＵＴＲを遺伝子発現カセット内の異なる導入遺伝子に作動可能に連結させることが可能である。例示的な一実施形態では、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーターを含み、導入遺伝子は殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択可能マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せであってよい。例示的な一実施形態では、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１イントロンを含み、導入遺伝子は殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択可能マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せであってよい。一実施形態では、遺伝子発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１イントロンを含み、プロモーターは、ユビキチンプロモーター、または植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）またはジーラグジュリアンス（Zea luxurians）ユビキチン−１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）、または細菌（例えば、アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）デルタｍａｓ）を起源とするプロモーターである。例示的な一実施形態では、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されているＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１ ５’−ＵＴＲを含み、導入遺伝子は殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択可能マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せであってよい。

一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、本明細書に開示されている構成的遺伝子プロモーター調節エレメントを含むベクターを含む。一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されている、本明細書に開示されている構成的遺伝子プロモーター調節エレメントを含むベクターを含む。一実施形態では、本明細書に開示されているように、植物、植物組織、または植物細胞は遺伝子発現カセットを含むベクターを含む。一実施形態では、ベクターはプラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージ、またはウイルス断片であってもよい。

一実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、本明細書に開示された方法に従えば、単子葉であってよい。単子葉植物、植物組織、または植物細胞は、トウモロコシ、イネ、コムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、モロコシ、ラン、タケ、バナナ、ガマ、ユリ、カラスムギ、タマネギ、アワ、およびライコムギであってよいがこれらに限定されない。別の実施形態では、植物、植物組織、または植物細胞は、本明細書に開示された方法に従えば、双子葉であってよい。双子葉植物、植物組織、または植物細胞は、ナタネ、キャノーラ、カラシナ、エチオピアマスタード、ダイズ、ヒマワリ、およびワタであってよいがこれらに限定されない。

遺伝子改変された植物の生産に関して、植物を遺伝子工学的に作製するための方法は当技術分野では周知である。例えば、双子葉植物および単子葉植物のための生物学的および物理学的形質転換プロトコルを含む、植物形質転換のための数多くの方法が開発されてきた（例えば、Goto−Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67−88 (1993)）。さらに、植物細胞または組織形質転換のためのベクターおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ培養法ならびに植物の再生は、例えば、Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)において入手可能である。

当業者であれば、外来性配列は、トランスジェニック植物に安定的に組み込まれており作動可能であることが確認された後、性的交雑により他の植物に導入することができることは認識するであろう。交雑させる種に応じて、いくつかの標準育種法のいずれでも使用することができる。

形質転換された植物細胞、根、葉、カルス、花粉、組織、または植物は、トランスフォーミングＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子によりコードされている形質について工学的に作製された植物材料を選択するまたはスクリーニングすることにより同定し単離することができる。例えば、選択は、トランスフォーミング遺伝子構築物が抵抗性を与える対象となる阻害量の抗生物質または除草剤を含有する培地で工学的に作製された植物材料を生育することにより実施することができる。さらに、形質転換された細胞は、組換え核酸構築物上に存在する可能性があるいかなる可視マーカー遺伝子（例えば、ＹＦＰ、ＧＦＰ、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＢまたはＣ１遺伝子）の活性についてスクリーニングすることにより同定することもできる。このような選択およびスクリーニング法は当業者には周知である。

物理的および生化学的方法を使用して、挿入された遺伝子構築物を含有する植物または植物細胞形質転換体を同定することもできる。これらの方法は、これらに限定されないが、１）組換えＤＮＡインサートを検出しその構造を決定するためのサザン分析もしくはＰＣＲ増幅；２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写物を検出し調べるためのノーザンブロット、Ｓ１ ＲＮａｓｅ保護、プライマー伸長、もしくは逆転写酵素−ＰＣＲ増幅；３）酵素もしくはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイであり、ここではこのような遺伝子産物は遺伝子構築物によりコードされている；４）次世代シークエンシング（ＮＧＳ）分析；または５）タンパク質ゲル電気泳動法、ウェスタンブロット法、免疫沈降、もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含み、ここで、遺伝子構築物産物はタンパク質である。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色などの追加の技法を使用して、特定の植物器官および組織において組換え構築物の存在または発現を検出することもできる。これらのアッセイの全てを実行するための方法は当業者には周知である。

本明細書で開示される方法を使用する遺伝子操作の効果は、例えば、対象の組織から単離されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のノーザンブロットにより観察することができる。典型的には、ｍＲＮＡが存在しているまたはｍＲＮＡの量が増加している場合には、対応する導入遺伝子が発現されていると想定することができる。遺伝子および／またはコードされているポリペプチド活性を測定する他の方法を使用することができる。使用する基質および反応産物または副産物の増加または減少を検出する方法に応じて、異なる種類の酵素アッセイを使用することができる。さらに、発現されるポリペプチドのレベルは、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、および、電気泳動検出アッセイ（染色またはウェスタンブロッティングを用いて）など、当業者には周知の他の抗体ベースのアッセイを用いることにより免疫化学的に測定することができる。１つの非限定的例として、ＥＬＩＳＡアッセイを使用するＡＡＤ−１（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；ＷＯ ２００５／１０７４３７参照）およびＰＡＴ（ホスフィノトリシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ）タンパク質の検出は、米国特許出願公開第２００９００９３３６６号に記載されており、前記特許文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。導入遺伝子は、植物のいくつかの細胞型もしくは組織でまたはいくつかの発生段階で選択的に発現させることもできる。導入遺伝子は、全ての植物組織においておよびその全生活環に沿ってかなり発現させることもできる。しかし、いかなる組合せの発現様式でも適用可能である。

本開示は、上記のトランスジェニック植物の種子であって、レポーター遺伝子、導入遺伝子、または遺伝子発現カセットを含む種子も包含する。本開示は、上記のトランスジェニック植物の子孫、クローン、細胞株、または細胞であって、レポーター遺伝子、導入遺伝子、または遺伝子構築物を含む子孫、クローン、細胞株、または細胞をさらに包含する。

本発明は特定の方法および実施形態に関連して説明してきたが、本明細書に記載される本発明から逸脱することなく種々の改変および変更を加えることができることを認識するべきである。
［実施例］

新規プロモーターの同定および単離
Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１のＵｂｉ−１遺伝子由来の新規プロモーター配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅させた。新規のプロモーター、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１を増幅するように設計したオリゴヌクレオチド（表１）は、対照としての働きをするトウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１プロモーター配列の保存領域に由来した。ＰＣＲ産物はＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１から得られ、特徴付けた。

新規のプロモーターを含むＰＣＲ産物は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲクローニングキットを製造業者の使用説明書に従って使用してＴｏｐｏ（商標）ベクター内にクローニングした。新規プロモーターＰＣＲ産物を含むクローン化されたプラスミドを示すベクターマップを提供する。プラスミドｐＤＡＢ１０５７１０はＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１（図２）に対応する。

クローニング後、ＰＣＲ産物を含有するプロモーターインサートは当業者に既知の方法を使用して塩基配列決定した。Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１のプロモーターポリヌクレオチド配列（図４）はコンピュータ処理的に整列させ、続いてトウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１対照配列（図３）に対する配列相同性について分析した。当業者には既知である、ＣｌｕｓｔａｌＷまたはＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒなどの生物情報学的方法および／またはソフトウェアプログラムを使用して、配列相同性分析を実施した。

新規プロモーター特徴付け
トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１対照配列（配列番号１：図３）との配列アライメントおよび比較を含む、配列相同性分析（図３〜７）により、さらに特徴付けするための新規のＵｂｉ−１プロモーターが明らかにされた。Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１（配列番号２；図４）から得られた新しいＵｂｉ−１プロモーター配列は、３つの異なる領域；１）上流プロモーター領域（配列番号４）、２）５’ＵＴＲ（配列番号６）、および３）イントロン（配列番号８）のポリヌクレオチド配列を含んでいることも観察された。Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１由来のプロモーター領域および特異的なプロモーターエレメントは、トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１対照配列に対する配列相同性について分析した（図５〜７）。さらに具体的には、配列アライメントを実施して、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１プロモーターの上流プロモーター、５’−ＵＴＲ、およびイントロン領域、ならびにＴＡＴＡボックスおよび熱ショックエレメント（ＨＳＥ）調節エレメントを、トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１対照配列の対応する領域と個別に比較した（図５〜７、表２）。

図５は、トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１対照プロモーター配列の上流プロモーター領域と比較したＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１プロモーターの上流プロモーター領域の配列アライメントを示している。図６は、トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１対照プロモーター配列の５’ＵＴＲまたはリーダー配列と比較したＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１プロモーターの５’ＵＴＲまたはリーダー配列の配列アライメントを示している。図７は、トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１対照プロモーター配列のイントロン配列と比較したＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーターのイントロン領域の配列アライメントを示している。

Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１から得られるプロモーターエレメントは、トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１配列に対して９０．４％の全体配列同一性（表２）を示した。Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１由来の新規プロモーター配列の特徴付けにより、機能的プロモーターに典型的に見出されるプロモーター調節エレメント（すなわち、ＴＡＴＡボックスまたは熱ショックエレメント）の大半がＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１遺伝子のコアプロモーター領域内に高度に保存されていることも確かめられた（表２）。例えば、図５は、新規のＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーターの上流プロモーター領域において同定されＴＳＳのおよそ５０ｂｐ ５’上流に位置することが見出された高度に保存されたＴＡＴＡボックス（下線が付されている塩基対８６９〜８７６）を示している。トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１対照配列（図６）と９８．８％の配列相同性を有する新規のＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーター（図４）の５’−ＵＴＲまたはリーダー配列にはわずかなレベルの変動しか観察されなかったが、上流プロモーター領域（図５）およびイントロン領域（図７）におけるさらに低い配列保存の領域も同定された。

Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーターの上流プロモーター領域は、トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１上流プロモーターからの変動を示しており、配列相同性はわずか８７．８％であった（表２）。Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１上流プロモーター領域において同定された差異の大多数がヌクレオチド欠失、置換、および／またはミスマッチを含んでいた（図５）。特に、ＴＡＴＡボックスプロモーターエレメントの１００ｂｐ ５’上流内に位置する１２〜１３ｂｐ欠失がＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーターで見つかった（囲みで示されている塩基対７７３〜７８４）。同様に、図５は、本研究で分析した新規のＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーターには保存されていなかった２つの重複している熱ショックエレメント（ＨＳＥ）配列（丸で囲まれて示される、それぞれ、塩基対４５７〜４８１および４８２〜５００）を示している。

さらに、ＴＳＳの１００〜２００ｂｐ ５’上流に伸長しているＵｂｉ−１上流プロモーター領域には追加の調節モチーフが存在している。これらのモチーフは、転写開始複合体と相互作用しその構築を促進する転写因子に結合する、その安定性を改善する、または転写機構が始動した後はプロモーターエスケープの効率を増加させる（PEREMARTI et al. 2010）。したがって、この調節領域内の欠失、置換、およびミスマッチは、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーター（図５）において観察された場合には、プロモーター強度と特異性の両方に潜在的に影響するおそれがある。

Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーターのイントロン領域では配列変動も同定された。新規のＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーターはトウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１対照プロモーター配列と比較的保存されたレベルの配列同一性（すなわち、９１．７％）を共有していたが（表２）、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１イントロンプロモーター配列は、対照配列では同定されなかったそれぞれおよそ１７ｂｐおよび８ｂｐの２つの著しい欠失（図７）も含有していた。１７ｂｐの欠失はＴＳＳのおよそ１９５ｂｐ ３’下流に位置し（囲みで示されている塩基対１２０〜１３６）、８ｂｐの欠失はＴＳＳのおよそ７１０ｂｐ ３’下流に位置していた（下線を付して示される塩基対６２６〜６３３）。

遺伝子発現のための新しいプロモーターを使用するベクター構築物
他の方法で示されていなければ、ここに記載される分子生物学的および生化学的操作ならびにそれに続く実施例は、例えば、Ausubel et al. (1995), およびSambrook et al. (1989)およびその更新版に開示されている標準法により実施した。実験で使用した構築物は下でさらに詳細に説明される（表３）。

上流プロモーター、５’ＵＴＲ、およびイントロン領域を含むＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）プロモーターは、前述のように、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）種のＵｂｉ−１遺伝子から抽出し、ＰＣＲアンプリコンはＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してゲル精製した。次に、プロモーターポリヌクレオチド配列は、当技術分野で既知の標準クローニング技法を使用してＧａｔｅｗａｙ Ｅｎｔｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１のＵｂｉ−１プロモーター配列を含む得られたＧａｔｅｗａｙ Ｅｎｔｒｙ Ｖｅｃｔｏｒ（登録商標）は、制限消化およびシークエンシングにより確かめた。トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１プロモーター配列を含む対照エントリーベクターも当技術分野の標準クローニング技法を使用してｇａｔｅｗａｙ ｅｎｔｒｙ ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。

Ｕｂｉ−１プロモーター配列に加えて、エントリーベクターは、コザラクラゲ（Phialidium）種由来の黄色蛍光タンパク質レポーター遺伝子（PhiYFP; Shagin, D. A., (2004) Mol Biol Evol. 21;841-50）も、前記配列に組み込まれたＳＴ−ＬＳ１イントロン（Vancanneyt, G., (1990) Mol Gen Genet. 220;245-50）およびトウモロコシ（Zea mays）パーオキシダーゼ５遺伝子の３’−ＵＴＲ領域（ZmPer5、米国特許第６，６９９，９８４号）と一緒に含んでいた。プロモーター配列のそれぞれを含むクローン化されたエントリーベクターを示すベクターマップを提供する。構築物ｐＤＡＢ１０５７４２はトウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１プロモーター配列を含む対照エントリーベクターに対応している。構築物ｐＤＡＢ１０５７３７はＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１プロモーター配列を含むエントリーベクターに対応している。このようにして、トウモロコシ（Zea）種であるＵｂｉ−１プロモーター、ＰｈｉＹＦＰ遺伝子、およびＺｍＰｅｒ５ ３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含むエントリーベクターを確立した。

表３に記載されているように、新しいプロモーター配列により推進されＺｍＰｅｒ５ ３’−ＵＴＲにより終結されるＰｈｉＹＦＰレポーター遺伝子を含むバイナリー発現ベクター構築物を構築した。アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介トウモロコシ胚形質転換のための形質転換または発現ベクターは、上記の通りに、標準クローニング法ならびに標準デスティネーションバイナリーベクター、ｐＤＡＢ１０１９１７および遺伝子発現カセットを含むエントリーベクターを用いるＧａｔｅｗａｙ（登録商標）組換え反応の使用を通じて構築した。

バイナリーデスティネーションベクター、ｐＤＡＢ１０１９１７は、除草剤耐性遺伝子、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（PAT; Wehrmann et al., 1996, Nature Biotechnology 14:1274-1278）を含んでいた。ｐＤＡＢ１０１９１７ベクターでは、ＰＡＴ遺伝子発現はトウモロコシ（Z. mays）Ｕｂｉ−１プロモーター、５’−ＵＴＲ、およびイントロンの制御下にあった。ｐＤＡＢ１０１９１７ベクターはトウモロコシ（Z. mays）リパーゼ遺伝子由来の３’−ＵＴＲ領域（ＺｍＬｉｐ；米国特許第７，１７９，９０２号）も含んでいた。ＺｍＬｉｐ ３’−ＵＴＲを使用して、ＰＡＴ ｍＲＮＡの転写を終結させた。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）組換え反応により、遺伝子発現カセット（すなわち、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１またはトウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１プロモーター、ＰｈｉＹＦＰ遺伝子、およびＺｍＰｅｒ５ ３’−ＵＴＲ）を含むそれぞれのエントリーベクターのｐＤＡＢ１０１９１７デスティネーションバイナリーベクター内への挿入が可能になった。エントリーベクターは、ｐＤＡＢ１０１９１７デスティネーションベクター内のＴ−ＤＮＡボーダーＡとＢの間およびＰＡＴ発現カセットの上流に挿入された。

バイナリー発現構築物、ｐＤＡＢ１０１９１７を、組み込まれているトウモロコシ（Z. mays）またはＺ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）Ｕｂｉ−１プロモーター、ＰｈｉＹＦＰ遺伝子、およびＺｍＰｅｒ５ ３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットと一緒に示すベクターマップが提供される。対照構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８は、トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ Ｕｂｉ−１プロモーターを含む遺伝子発現カセットに対応する（図８）。さらに、構築物、ｐＤＡＢ１０５７４３は、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１ Ｕｂｉ−１プロモーター配列を含む遺伝子発現カセットに対応する（図９）。

植物形質転換
バイナリーベクター構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８（トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３）およびｐＤＡＢ１０５７４３（Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１）はそれぞれ、当技術分野で既知の標準形質転換技法を使用して、アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株、ＥＨＡ１０１に形質転換した。細菌コロニーを単離し、バイナリープラスミドＤＮＡを抽出し、精製し、制限酵素消化により確認した。

トウモロコシ植物の形質転換は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換および選択可能な植物マーカーとしてホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（PAT; Wehrmann et al., 1996, Nature Biotechnology 14:1274-1278）を用いるVega et al., 2008, Plant Cell Rep 27:297-305に記載されているプロトコルに従って実施した。バイナリーベクター構築物（上記）を含むアグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）培養物を使用して、トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｈｉ−ＩＩ植物を形質転換し第１ラウンドＴ_０トランスジェニックトウモロコシ事象を生成した（表４）。未成熟接合体胚を生成し、調製し、形質転換の２．５か月後に収穫した。

個々の遺伝子発現構築物についての形質転換結果は表４にさらに説明されている。生成した胚の総数、カルス段階でおよび全植物において観察されるトランスジェニック事象の総数、ならびに全体形質転換効率のパーセンテージを開示している。バイナリー発現構築物の全体形質転換効率は、多くの実験における胚の生育量が不十分だったために以前に報告された（Vega et al., 2008）よりも低い。

導入遺伝子コピー数分析
トランスジェニックトウモロコシ（Z. mays）植物のゲノム内でのＰｈｉＹＦＰ導入遺伝子の安定的組込みは、加水分解プローブアッセイにより確かめた。カルスから発生した安定的に形質転換したトランスジェニクトウモロコシ（Z. mays）小植物が得られ、分析して、低コピー数（すなわち、１〜２コピー）の完全長Ｔ鎖インサートを含有する事象を同定した。

Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（商標）システムを使用して、製造業者の使用説明書に従って導入遺伝子コピー数を決定した。前記方法は、１回のアッセイで、ＰｈｉＹＦＰ遺伝子におよび内在性参照遺伝子、トウモロコシ（Z. mays）インベルターゼ（ＺｍＩｎｖ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ１６１２３．１）に特異的なオリゴヌクレオチドを用いるバイプレックスＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ反応を利用した。コピー数および接合状態は、既知のコピー数標準物質と比べた場合の、ＺｍＩｎｖ特異的蛍光に対するＰｈｉＹＦＰ特異的蛍光の強度を測定することにより決定した。

ＰｈｉＹＦＰ遺伝子特異的ＤＮＡ断片を、ＦＡＭ（商標）蛍光色素で標識されたプローブを含有する１つのＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いて増幅し、ＺｍＩｎｖを、ＨＥＸ（商標）蛍光で標識されたプローブを含有する別のＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いて増幅した（表５）。コピー数分析のためのプライマーおよびプローブはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）により商業的に合成された。ＦＡＭ（商標）蛍光部分は光学密度４６５／５１０ｎｍで励起され、ＨＥＸ（商標）蛍光部分は光学密度５３３／５８０ｎｍで励起された。

ＰＣＲ反応は表６に記載される試薬を使用して最終１０μｌの反応体積で調製した。遺伝子特異的ＤＮＡ断片は表７に記載される熱サイクリング条件に従って増幅した。試料のコピー数および接合状態は、既知のコピー数標準物質と比べた場合の、参照遺伝子ＺｍＩｎｖに特異的な蛍光に対するレポーター遺伝子ＰｈｉＹＦＰに特異的な蛍光の相対強度を測定することにより決定した。

コピー数標準物質は、ベクターｐＤＡＢ１０８７０６をトウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ１０４ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に希釈し、ｐＤＡＢ１０８７０６：ｇＤＮＡが既知の比である標準物質を得ることにより作製した。例えば、１コピーのトウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ１０４ ｇＤＮＡあたり１、２、および４コピーのベクターＤＮＡを有する試料を調製した。トウモロコシ（Z. mays）ｃ．ｖ．Ｂ１０４ ｇＤＮＡ標準物質と混ぜ合わせたｐＤＡＢ１０８７０６の１および２コピー希釈液は、ヘミ接合性であることが分かっている対照トウモロコシ（Z. mays）事象およびホモ接合性であることが分かっている対照トウモロコシ（Z. mays）事象（すなわち、トウモロコシ（Z. mays）事象２７８；ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ２０１１／０２２４６９ Ａ２号参照）に対して確証された。

ＰＡＴ遺伝子および内在性ＺｍＩｎｖ参照遺伝子それぞれに特異的なオリゴヌクレオチドを利用するＴａｑＭａｎ（登録商標）バイプレックスＰＣＲ増幅アッセイを実施した。１つのＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマーセットおよびＦＡＭ（商標）蛍光色素で標識されたプローブを用いてＰＡＴの遺伝子特異的ＤＮＡ断片を検出するＰＣＲ増幅を用いた（表５）。別のプライマーセットおよびＨＥＸ（商標）蛍光色素で標識されたプローブも使用してＺｍＩｎｖ内在性参照／対照遺伝子を増幅し検出した（表５）。ＰＡＴ ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応混合物を表６に記載される通りに調製し、特異的断片は表７に記載される条件に従って増幅させた。

異なるプロモーター構築物を用いた形質転換により得られたトランスジェニック植物の導入遺伝子コピー数分析からの結果を表８に示している。１〜２コピーのＰｈｉＹＦＰ導入遺伝子を有する植物のみを温室に移し、さらなる発現分析のために生育した。

ＰｈｉＹＦＰおよびＰＡＴタンパク質のＥＬＩＳＡ定量化
植物は葉ＥＬＩＳＡアッセイを使用して発生のＶ４〜５段階で試料採取した。試料は９６ウェル収集チューブプレートに収集し、４葉ディスク（紙穴パンチサイズ）を試料ごとに採取した。２つの４．５ｍｍのＢＢ（Ｄａｉｓｙ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｏｇｅｒ、ＡＲ）および２００μＬの抽出バッファー［０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０および０．０５％のＢＳＡを補充された１×ＰＢＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（登録商標）、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）］をそれぞれのチューブに添加した。追加の２００μＬの抽出バッファーをそれぞれのチューブに添加し、続いて反転させて混合した。プレートは３０００ｒｐｍで５分間回転させた。上澄みは氷上に保存したディープウェル９６の対応するウェルに移した。ＥＬＩＳＡ用には、Ｎｕｎｃ（登録商標）９６ウェルＭａｘｉ−Ｓｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用した。プレートはマウスモノクローナル抗ＹＦＰ捕捉抗体（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で被覆した。抗体はＰＢＳ（１μｇ／ｍＬ）に希釈し、ウェルあたり１５０μＬの希釈ＰＢＳを添加した。プレートは４℃で一晩インキュベートした。一晩プレートは室温に２０〜３０分間保持し、その後３５０μＬの洗浄バッファー［０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０を補充された１×ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）］で４×洗浄した。プレートは、ウェルあたり２００μＬのブロッキングバッファー［０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０プラス０．５％のＢＳＡを補充された１×ＰＢＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（登録商標））］で＋３７℃で最低でも１時間ブロックし、続いて３５０μＬの洗浄バッファー（Ｔｏｍｔｅｃ ＱｕａｄｒａＷａｓｈ（商標）２、Ｔｏｍｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｈａｍｄｅｎ、ＣＴ）で４×洗浄した。

ＹＦＰ ＥＬＩＳＡでは、Ｅｖｒｏｇｅｎ組換えＰｈｉ−ＹＦＰ １ｍｇ／ｍＬ（Ａｘｘｏｒａ ＬＬＣ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）を標準物質として使用した。５パラメータフィット標準曲線（１ｎｇ／ｍｌと０．１２５ｎｇ／ｍｌ標準の間）を使用して、曲線の直線部分で全てのデータフォールを確実にした。１００μＬの標準物質または試料をウェルに添加した。アッセイバッファー中最低でも１対４希釈の試料を使用した。プレートは、プレート振盪機（２５０ｒｐｍ；Ｔｉｔｅｒ Ｐｌａｔｅ ｓｈａｋｅｒ）上、室温で１時間インキュベートし、続いて３５０μＬの洗浄バッファー（Ｔｏｍｔｅｃ ＱｕａｄｒａＷａｓｈ（商標）２）で４×洗浄した。約１００μＬの１μｇ／ｍＬ Ｅｖｒｏｇｅｎウサギポリクローナル抗ＰｈｉＹＦＰ一次抗体（Ａｘｘｏｒａ）をそれぞれのウェルに添加した。プレートは、２５０ｒｐｍのプレート振盪機上、室温で１時間インキュベートし、続いて３５０μＬの洗浄バッファー（Ｔｏｍｔｅｃ ＱｕａｄｒａＷａｓｈ（商標）２）で４×洗浄した。次に、１００μＬの抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をブロッキング／アッセイバッファー中で１対５０００に希釈し、このＰＡＴタンパク質をＥｎｖｉｒｏｌｏｇｉｘ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）製のキットを使用して定量化した。ＥＬＩＳＡは、植物抽出物の複数の希釈液ならびに基本的に供給業者により提供される試薬および説明書を使用して実施した。

新規プロモーターに作動可能に連結されている導入遺伝子の安定的植物発現
トランスジェニック植物組織においてタンパク質発現が観測された。例えば、ＰｈｉＹＦＰ発現は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）との共培養により安定的に形質転換されたＴ_０植物のカルスにおいて観察された。トランスジェニック植物は、新規のプロモーターｐＤＡＢ１０５７４３（Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１、図９）および対照プロモーターｐＤＡＢ１０５７４８（トウモロコシ（Z．mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３、図８）を含むバイナリーベクター構築物を使用して形質転換されたトウモロコシ（Z．mays）胚から生育された。植物カルスは、ＹＦＰフィルターおよび５００ｎｍ光源を使用して実体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）下で観察された。対照ｐＤＡＢ１０５７４８と比べた場合のｐＤＡＢ１０５７４３を含むトランスジェニックＴ_０トウモロコシ植物のカルス組織において観察されたＰｈｉＹＦＰの安定的発現の代表例を図１０に示す。データによれば、ｐＤＡＢ１０５７４３（Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１）を含む新規のプロモーターは、本明細書に記載される通りに、Ｔ_０トランスジェニック植物のカルス組織においてＰｈｉＹＦＰ遺伝子の強い発現を推進できることが確認されている。

表８に記載されるように、低コピー数（すなわち、１〜２コピー）のＰｈｉＹＦＰ導入遺伝子を含有する全植物は温室で生育させた。一般に、構築物あたり約５〜約１０事象および事象あたり約５の植物がＴ_１発現分析のために使用された。ＥＬＩＳＡデータから、対照構築物ｐＤＡＢ１０５７４８（トウモロコシ（Z．mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３）と比べた場合の新規のプロモーターｐＤＡＢ１０５７４３（Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１）を含むベクター構築物を使用するＴ_１トウモロコシ植物の葉においてＰｈｉＹＦＰタンパク質の一貫した発現が明らかになった。

対照構築物ｐＤＡＢ１０５７４８（トウモロコシ（Z．mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３、図８）を含む対照植物により産生されるおよそ２８５．３ｎｇ／ｍｇ（＋／−２２．７ｎｇ／ｍｇ）のＰｈｉＹＦＰタンパク質と比べた場合、新規のプロモーター構築物ｐＤＡＢ１０５７４３（Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１、図９）を含むＴ_１植物について約１４２．５ｎｇ／ｍｇ（＋／−３５．９ｎｇ／ｍｇ）のＰｈｉＹＦＰの平均ＰｈｉＹＦＰタンパク質発現が観察された。これらの結果により、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１由来の新規のプロモーターは、本明細書に記載されるように、高レベルのタンパク質産生でトランスジェニック形質を作り出すのに有用であったことが確証される。

さらに、トウモロコシ（Z．mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３プロモーター由来のｐＤＡＢ１０５７４８を含む対照植物により産生されるおよそ１０５．８ｎｇ／ｍｇ（＋／−７．４ｎｇ／ｍｇ）のＰＡＴタンパク質と比べた場合、ｐＤＡＢ１０５７４３（Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１）を含む全てのＴ_１植物について平均ＰＡＴ発現はおよそ５９．０ｎｇ／ｍｇ（＋／−１１．６ｎｇ／ｍｇ）であった。全体的に見て、全てのトウモロコシ植物についてのＰＡＴタンパク質の発現は、トウモロコシ植物においてＰｈｉＹＦＰ遺伝子について観察される発現よりも有意に低かった。

ＰｈｉＹＦＰタンパク質発現は、本明細書に記載されるそれぞれの新規のプロモーター構築物を表す選択されたＴ_１トランスジェニック植物の尾房由来の花粉においても測定した。図１１に示されるように、トランスジェニック花粉の画像分析から、ｐＤＡＢ１０５７４３（Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１）を含む新規のプロモーターは、本出願において記載されるように、花粉においてＰｈｉＹＦＰタンパク質の高度な発現を推進することが確証される。

ベクター構築
バイナリー発現ベクター構築物ｐＤＡＢ１１２８５３は図１２に示している。ｐＤＡＢ１１２８５３構築物は、ＺｍＵｂｉ−１プロモーターｖ２により推進されるＰｈｉＹＦＰレポーター遺伝子およびＺｍＰｅｒ５ ３’−ＵＴＲを含んでいた。ｐＤＡＢ１１２８５３構築物は、Ｚ．ラグジュリアンス（Z. luxurians）ｖ１により推進されるＡＡＤ−１ ｖ３遺伝子およびＺｍＬｉｐ ３’−ＵＴＲ ｖ１も含んでいた。

ｐＤＡＢ１１２８５３構築物は、例えば、Ausubel et al. (1995)、Sambrook et al. (1989)およびその更新版に開示されている標準法を使用して作製した。アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介トウモロコシ胚形質転換のための形質転換または発現ベクターは、上記の通りに、標準クローニング法ならびに標準デスティネーションバイナリーベクター、および遺伝子発現カセットを含むエントリーベクターを用いるＧａｔｅｗａｙ（登録商標）組換え反応の使用を通じて構築した。

新規のプロモーターに作動可能に連結されている導入遺伝子の安定的植物発現
低コピー数（すなわち、１〜２コピー）のＰｈｉＹＦＰ導入遺伝子を含有する全植物を温室で生育させた。表９（下）に示されるＴ_０発現分析には１９の事象を使用した。分析したすべての事象からは強いＡＡＤ１タンパク質発現が得られた（表９参照）。

Ｔ_０単一導入遺伝子コピー植物を野生型Ｂ１０４トウモロコシ植物に戻し交配し、Ｔ_１種子を得た。ヘミ接合性Ｔ_１植物を分析に使用した。Ｒ３葉発現では、構築物あたり３つの事象および事象あたり５つの植物を分析した。他の組織型発現では事象あたり３つの事象を使用した。

新規のプロモーター構築物を含むＴ_１トランスジェニック植物の葉組織から得られたＡＡＤ１タンパク質の定量測定値を表１０（下）に示している。表１０のデータから、Ｔ_０葉発現結果（表９参照）が確かめられ、本明細書に記載される新規のプロモーターを含有する植物から得られるＲ３葉および他の組織におけるＡＡＤ１タンパク質の一貫して高度な発現がさらに示された。

Claims (50)

1. 導入遺伝子に作動可能に連結されているプロモーターを含む遺伝子発現カセットであって、前記プロモーターが、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、遺伝子発現カセット。
2. 前記プロモーターが、配列番号２の相補体に対する少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブに厳密な条件下でハイブリダイズする、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
3. 前記作動可能に連結された導入遺伝子がポリペプチドまたは小分子ＲＮＡをコードする、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
4. 前記導入遺伝子が、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、および選択可能マーカー導入遺伝子からなる群から選択される、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
5. ３’−非翻訳領域をさらに含む、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
6. 請求項１に記載の遺伝子発現カセットを含む組換えベクター。
7. プラスミド、コスミド、細菌人工染色体、ウイルス、およびバクテリオファージからなる群から選択される、請求項６に記載の組換えベクター。
8. 請求項１に記載の遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック細胞。
9. トランスジェニック植物細胞である、請求項８に記載のトランスジェニック細胞。
10. 請求項９に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
11. 単子葉または双子葉植物である、請求項１０に記載のトランスジェニック植物。
12. 前記単子葉植物が、トウモロコシ植物、イネ植物、およびコムギ植物からなる群から選択される、請求項１１に記載のトランスジェニック植物。
13. 請求項１０に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
14. 配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する合成ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞。
15. 前記合成ポリヌクレオチドが、配列番号２の相補体に対する少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブに厳密な条件下でハイブリダイズする、請求項１４に記載のトランスジェニック細胞。
16. トランスジェニック植物細胞である、請求項１４に記載のトランスジェニック細胞。
17. 前記トランスジェニック植物細胞が植物形質転換法により生産される、請求項１６に記載のトランスジェニック細胞。
18. 前記植物形質転換法が、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換法、微粒子銃形質転換法、炭化珪素形質転換法、プロトプラスト形質転換法、およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される、請求項１７に記載のトランスジェニック細胞。
19. 請求項１４に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
20. 単子葉植物である、請求項１９に記載のトランスジェニック植物。
21. 前記単子葉植物が、トウモロコシ植物、イネ植物、およびコムギ植物からなる群から選択される、請求項２０に記載のトランスジェニック植物。
22. 請求項２１に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
23. 請求項１４に記載の遺伝子発現カセットを含む組換えベクター。
24. プラスミド、コスミド、細菌人工染色体、ウイルス、およびバクテリオファージからなる群から選択される、請求項２３に記載の組換えベクター。
25. トランスジェニック植物において異種コード配列を発現させるための方法であって、
    ａ）３’−非翻訳領域に作動可能に連結されている、前記異種コード配列に作動可能に連結されている配列番号２を含むポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットで植物細胞を形質転換すること、
    ｂ）前記遺伝子発現カセットを含む前記形質転換された植物細胞を単離すること、
    ｃ）前記形質転換された植物細胞をトランスジェニック植物に再生させること、および
    ｄ）配列番号２を含む前記ポリヌクレオチド配列を含む前記遺伝子発現カセットを含む前記トランスジェニック植物を得ること
    を含む方法。
26. 前記異種コード配列が、殺虫剤抵抗性コード配列、除草剤耐性コード配列、窒素利用効率コード配列、水利用効率コード配列、栄養品質コード配列、ＤＮＡ結合コード配列、および選択可能マーカーコード配列からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
27. 植物細胞を形質転換することが植物形質転換法である、請求項２５に記載の方法。
28. 前記植物形質転換法が、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換法、微粒子銃形質転換法、炭化珪素形質転換法、プロトプラスト形質転換法、およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
29. 前記トランスジェニック植物が単子葉または双子葉トランスジェニック植物である、請求項２５に記載の方法。
30. 前記単子葉トランスジェニック植物が、トウモロコシ植物、コムギ植物、およびイネ植物からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
31. 請求項２５に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
32. 前記異種コード配列がトランスジェニック植物組織において発現される、請求項２５に記載の方法。
33. 前記トランスジェニック植物組織が、トランスジェニック植物根、苗条、茎、または花粉組織である、請求項２５に記載の方法。
34. 配列番号２に対する少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を単離するための方法であって、
    ａ）配列番号に対する少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を同定すること、
    ｂ）配列番号に対する少なくとも９０％の配列同一性を含む前記ポリヌクレオチド配列に結合する複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列を作製すること、
    ｃ）前記複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、ＤＮＡ試料から配列番号に対する少なくとも９０％の配列同一性を含む前記ポリヌクレオチド配列を増幅させること、および
    ｄ）配列番号に対する少なくとも９０％の配列同一性を含む前記ポリヌクレオチド配列を単離すること
    を含む方法。
35. 配列番号２に対する少なくとも９０％の配列同一性を含む前記単離されたポリヌクレオチド配列が導入遺伝子に作動可能に連結されている、請求項３４に記載の方法。
36. 前記作動可能に連結された導入遺伝子がポリペプチドまたは小分子ＲＮＡをコードする、請求項３５に記載の方法。
37. 導入遺伝子の発現を促進する、配列番号２に対する少なくとも９０％の配列同一性を含む精製されたポリヌクレオチド配列。
38. 配列番号２の相補体に対する少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブ配列が、請求項３７に記載の精製されたポリヌクレオチド配列に厳密な条件下でハイブリダイズする、請求項３７に記載の精製されたポリヌクレオチド配列。
39. 導入遺伝子に作動可能に連結されている、請求項３７に記載の精製されたポリヌクレオチド配列。
40. ポリペプチドをコードする、請求項３９に記載の作動可能に連結されている導入遺伝子。
41. ３’−非翻訳領域に作動可能に連結されている、請求項３７に記載の導入遺伝子に作動可能に連結されている精製されたポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセット。
42. 前記導入遺伝子が、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養品質導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、および選択可能マーカー導入遺伝子からなる群から選択される、請求項４１に記載の遺伝子発現カセット。
43. 請求項４１に記載の遺伝子発現カセットを含む組換えベクター。
44. プラスミドベクター、コスミドベクター、およびＢＡＣベクターからなる群から選択される、請求項４３に記載の組換えベクター。
45. 請求項３７に記載の精製されたポリヌクレオチド配列を含むトランスジェニック細胞。
46. トランスジェニック植物細胞である、請求項４５に記載のトランスジェニック細胞。
47. 請求項４６に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
48. 単子葉植物である、請求項４７に記載のトランスジェニック植物。
49. 前記単子葉植物が、トウモロコシ植物、コムギ植物、およびイネ植物からなる群から選択される、請求項４８に記載のトランスジェニック植物。
50. 請求項４９に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。