CN103534267B - 植物调控元件及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可用于调节植物和植物细胞中的基因表达的新的DNA分子和构建体，包括它们的核苷酸序列。本发明还提供了包含可操作地与异源可转录多核苷酸连接的DNA分子的转基因植物、植物细胞、植物部分、种子和商品，以及它们的使用方法。

Description

植物调控元件及其用途
相关申请参考
本申请要求2011年3月25日提交的美国临时申请No.61/467,875的权益，通过引用将其全部并入本文中作为参考。
序列表的引入
通过电子提交在此一起提交了序列表，其包含在2012年3月21日生成的347kb(如在Microsoft 中测量的)的文件名为“MONS282WO_seq.txt”的文件中，并通过引用将其并入本文中。
发明领域
本发明涉及植物分子生物学和植物遗传工程的领域，并且涉及可用于调节植物中的基因表达的DNA分子。
背景技术
调控元件是通过调节可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录来调控基因活性的遗传元件。这样的元件包括启动子、前导序列、内含子和3’非翻译区域，并且可用于植物分子生物学和植物遗传工程领域中。
发明概述
本发明提供了用于植物中的新基因调控元件。本发明还提供了包含所述调控元件的DNA构建体。本发明还提供了包含所述调控元件的转基因植物细胞、植物和种子。可以提供可操作地与可转录多核苷酸分子连接的序列。在一个实施方案中，可转录多核苷酸分子相对于本文中提供的调控序列可以是异源的。因此，在特定的实施方案中，本发明提供的调控元件序列可以限定为可操作地与异源可转录多核苷酸分子连接。本发明还提供了制备和使用该调控元件、包含该调控元件的DNA构建体以及包含可操作地与可转录多核苷酸分子连接的调控元件的转基因植物细胞、植物和种子的方法。
因此，在一个方面中，本发明提供了一种包含DNA序列的DNA分子，所述DNA序列选自：a)与SEQ ID NO：1-158和180-183中任一个具有至少约85％序列同一性的序列；b)包含SEQ ID NO：1-158和180-183中任一个的序列；和c)SEQ ID NO：1-158和180-183中任一个的片段，其中该片段具有基因调控活性；其中该序列可操作地与异源可转录多核苷酸分子连接。在特定的实施方案中，DNA分子包括与SEQ ID NO：1-158和180-183中任一个的DNA序列至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％的同一性。在DNA分子的某些实施方案中，所述DNA序列包括调控元件。在一些实施方案中，所述调控元件包含启动子。在特定的实施方案中，所述异源可转录多核苷酸分子包含具有农艺学意义的基因，如能够在植物中提供除草剂抗性的基因，或能够在植物中提供植物抗虫性的基因。
本发明还提供了包含本发明提供的异源DNA构建体的转基因植物细胞，所述DNA构建体包括SEQ ID NO：1-158和180-183中任一个的序列或其片段或变体，其中所述序列可操作地与异源可转录多核苷酸分子连接。在某些实施方案中，转基因植物细胞是单子叶植物细胞。在其他实施方案中，转基因植物细胞是双子叶植物细胞。
本发明进一步提供了包含本文中提供的DNA分子的转基因植物或其部分，所述DNA分子包括选自以下的DNA序列：a)与SEQ ID NO：1-158和180-183中任一个具有至少85％序列同一性的序列；b)包含SEQ ID NO：1-158和180-183中任一个的序列；和c)SEQ ID NO：1-158和180-183中任一个的片段，其中该片段具有基因调控活性；其中所述序列可操作地与异源可转录多核苷酸分子连接。在特定的实施方案中，转基因植物可以是，相对于包含所述DNA分子的起始转基因植物，包含所述DNA分子的任一代的后代植物。再进一步提供了包含根据本发明的DNA分子的转基因种子。
在另一个方面中，本发明提供了生产商品的方法，其包括获得根据本发明的转基因植物或其部分并从其生产商品。在一个实施方案中，本发明的商品是蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、籽粒、淀粉、种子、粗粉(meal)、面粉(flour)、生物质或种子油。在另一个方面中，本发明提供了使用上述方法生产的商品。例如，在一个实施方案中，本发明提供了包含本文中提供的DNA分子的商品，所述DNA分子包括选自以下的DNA序列：a)与SEQ ID NO：1-158和180-183中任一个具有至少85％序列同一性的序列；b)包含SEQ ID NO：1-158和180-183中任一个的序列；和c)SEQ ID NO：1-158和180-183中任一个的片段，其中该片段具有基因调控活性；其中所述序列可操作地与异源可转录多核苷酸分子连接。
还是在另一个方面中，本发明提供了一种表达可转录多核苷酸分子的方法，其包括获得根据本发明的转基因植物，如包含本文中所述的DNA分子的植物，并且栽培植物，其中DNA分子中的可转录多核苷酸被表达。
在整个说明书和权利要求中，除非上下文另外要求，词语“包含(comprise)”及其变变型，如“包括(comprises)”和“包含着(comprising)”，将理解为意味着包括所陈述的组合物、步骤和/或值，或其组，但并不排除任何其他组合物、步骤和/或值，或其组。
附图简述
图1a-1h描绘了对应于分离自草类物种须芒草(Andropogon gerardii)的启动子元件的启动子大小变异体的比对。特别地，图1a-1h显示了在转录调控表达元件组EXP-ANDge.Ubp1：1：9(SEQ ID NO：1)中发现的2603bp启动子序列P-ANDge.Ubp1-1：1：11(SEQ IDNO：2)与通过P-ANDge.Ubp1-1：1：11的删除分析得到的启动子序列的比对。例如，P-ANDge.Ubp1-1：1：11的5’端删除产生了启动子P-ANDge.Ubp1-1：1：9(SEQ ID NO：6)，其是在EXP-ANDge.Ubp1：1：7(SEQ ID NO：5)内发现的2114bp序列。图1中的其他启动子序列包括P-ANDge.Ubp1-1：1：10(SEQ ID NO：9)，包含在EXP-ANDge.Ubp1：1：8(SEQ ID NO：8)内的1644bp序列；P-ANDge.Ubp1-1：1：12(SEQ ID NO：11)，包含在EXP-ANDge.Ubp1：1：10(SEQ IDNO：10)内的1472bp序列；P-ANDge.Ubp1-1：1：8(SEQ ID NO：13)，包含在EXP-ANDge.Ubp1：1：6(SEQ ID NO：12)内的1114bp序列；P-ANDge.Ubp1-1：1：13(SEQ ID NO：15)，包含在EXP-ANDge.Ubp1：1：11(SEQ ID NO：14)内的771bp序列；和P-ANDge.Ubp1-1：1：14(SEQ ID NO：17)，包含在EXP-ANDge.Ubp1：1：12(SEQ ID NO：16)内的482bp序列。
图2a-2g描绘了分离自草类沙生蔗茅(Saccharum ravennae(Erianthusravennae))的启动子变体的比对。特别地，图2a-2g显示了2536bp启动子序列P-ERIra.Ubq1-1：1：10(SEQ ID NO：19)(例如，在转录调控表达元件组EXP-ERIra.Ubq1(SEQID NO：18)中发现的)与源自P-ERIra.Ubq1-1：1：10的删除分析的启动子序列的比对：2014bp启动子序列P-ERIra.Ubq1-1：1：9(SEQ ID NO：23)；1525bp启动子序列P-ERIra.Ubq1-1：1：11(SEQ ID NO：26)；1044bp启动子序列P-ERIra.Ubq1-1：1：8(SEQ ID NO：28)；769bp序列P-ERIra.Ubq1-1：1：12(SEQ ID NO：30)和511bp序列P-ERIra.Ubq1-1：1：13(SEQ ID NO：32)。
图3a-3c描绘了对应于分离自草类物种狗尾草(Setaria viridis)的启动子元件的启动子大小变体的比对。特别地，图3a-3c显示了1493bp启动子序列P-Sv.Ubq1-1：1：1(SEQ ID NO：34)与源自P-Sv.Ubq1-1：1：1的5’端的删除分析的启动子的比对：1035bp大小的启动子P-Sv.Ubq1-1：1：2(SEQ ID NO：38)和681bp启动子序列P-Sv.Ubq1-1：1：3(SEQ IDNO：40)。
图4a-4e描绘了源自草类墨西哥玉米(Zea mays subsp.mexicana)的转录调控表达元件组变体的比对。特别地，图4a-4e比较了称为EXP-Zm.UbqM1：1：2(SEQ ID NO：49)的2005bp转录调控表达元件组与等位基因变体EXP-Zm.UbqM1：1：5(SEQ ID NO：53)，以及与大小变体EXP-Zm.UbqM1：1：1(SEQ ID NO：41)(其是1922bp长)和EXP-Zm.UbqM1：1：4(SEQ IDNO：45)(其是1971bp长)。
图5a-5b描绘了分离自草类高粱(Sorghum bicolor)的启动子大小变体的比对。特别地，图5a-5b显示了包含在转录调控表达元件组EXP-Sb.Ubq6(SEQ ID NO：59)内的791bp大小的启动子元件P-Sb.Ubq6-1：1：2(SEQ ID NO：60)与包含在EXP-Sb.UbqM6：1：1(SEQ IDNO：63)内的855bp启动子元件P-Sb.Ubq6-1：1：1(SEQ ID NO：64)的比对。
图6a-6c描绘了对应于分离自草类小米(Setaria italica)的启动子元件的启动子大小变体的比对。特别地，图6a-6c显示了1492bp启动子变体P-SETit.Ubq1-1：1：1(SEQID NO：70)与1492bp启动子变体P-SETit.Ubq1-1：1：4(SEQ ID NO：74)、1034bp启动子元件P-SETit.Ubq1-1：1：2(SEQ ID NO：76)和680bp启动子元件P-SETit.Ubq1-1：1：3(SEQ IDNO：78)的比对。
图7a-7b描绘了启动子大小变体和对应于分离自草类物种薏苡(Coix lachryma-jobi)的启动子元件的增强子元件的比对。特别地，图7a和7b显示了在转录调控表达元件组EXP-Cl.Ubq1：1：1(SEQ ID NO：79)内发现的837bp启动子变体P-Cl.Ubq1-1：1：1(SEQ IDNO：80)与798bp长的源自P-Cl.Ubq1-1：1：1的增强子片段(称为E-Cl.Ubq1：1：1)( SEQ IDNO：89)以及与P-Cl.Ubq1-1：1：1的三个5’端删除变体的比对，所述三个5’端删除变体为：742bp元件P-Cl.Ubq1-1：1：4(SEQ ID NO：84)；401bp元件P-Cl.Ubq1-1：1：3(SEQ ID NO：86)和54bp最小启动子元件P-Cl.Ubq1-1：1：5(SEQ ID NO：88)。
图8描绘了本发明的转基因盒构造。
序列简述
SEQ ID NO：1、5、8、10、12、14、16、18、22、25、27、29、31、33、37、39、41、45、49、53、55、59、63、65、69、73、75、77、79、83、85、87、90、93、95、97、98、99、100、102、104、106、108、110、112、114、115、116、117、119、121、123、124、125、126、128、130、132、133、134、136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、180、181和183是转录调控表达元件组的序列或包含可操作地5’连接于前导序列的启动子序列的EXP序列，所述前导序列可操作地5’连接于内含子序列。
SEQ ID NO：2、6、9、11、13、15、17、19、23、26、28、30、32、34、38、40、42、46、50、56、60、64、66、70、74、76、78、80、84、86、88、91、96和135是启动子序列。
SEQ ID NO：3、20、35、43、47、51、57、61、67、71和81是前导序列。
SEQ ID NO：4、7、21、24、36、44、48、52、54、58、62、68、72、82、92、94、101、103、105、107、109、111、113、118、120、122、127、129、131、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158和182是内含子序列。
SEQ ID NO：89是增强子的序列。
发明详述
本文所公开的本发明提供了来自植物物种的具有有益基因调控活性的多核苷酸分子。本发明提供了这些多核苷酸分子的设计、构建和用途。在SEQ ID NO：1-158和180-183中提供了这些多核苷酸分子的核苷酸序列。这些多核苷酸分子例如能够影响植物组织中可操作连接的可转录多核苷酸分子的表达，并且因此选择性地调节转基因植物中的基因表达或所编码的基因产物的活性。本发明还提供了修饰、产生和使用这些多核苷酸分子的方法。本发明还提供了含有该启动子和/或其他公开的核苷酸序列的组合物、转化的宿主细胞、转基因植物和种子，以及用于制备和使用这些的方法。
提供了以下的定义和方法来更好地限定本发明以及在本发明的实施中指导本领域普通技术人员。除非另外指出，术语根据相关领域的普通技术人员的常规使用方式来理解。
DNA分子
如本文中所用的，术语“DNA”或“DNA分子”指的是基因组或合成来源的双链DNA分子，即，脱氧核糖核苷酸碱基的聚合物或多核苷酸分子，从5’(上游)端至3’(下游)端阅读。如本文中所用的，术语“DNA序列“指的是DNA分子的核苷酸序列。本文中所用的命名法对应于United States Code of Federal Regulations§1.882的标题37，并且列于WIPOStandard ST.25(1998)，附录2、表1和3的表格中的命名。
如本文中所用的，术语“分离的DNA分子”指的是至少部分地与在天然或自然状态中通常与其相关联的其他分子分离的DNA分子。在一个实施方案中，术语“分离的”指的是至少部分地与在其天然或自然状态中通常侧邻所述DNA分子的一些核酸分离的DNA分子。因此，例如，作为重组技术的结果而与通常不相关的调控或编码序列融合的DNA分子在本文中被认为是分离的。当整合至宿主细胞的染色体中或存在于含有其他DNA分子的核酸溶液中时，认为这样的分子是分离的，因为它们未处于其自然状态中。
本领域技术人员公知的多种方法可以用来分离和操纵本发明中公开的DNA分子或其片段。例如，PCR(聚合酶链式反应)技术可以用于扩增特定的起始DNA分子和/或用于产生原始分子的变体。DNA分子或其片段也可以通过其他技术获得，如通过化学方法直接合成该片段，如通常通过使用自动化寡核苷酸合成仪来实施的。
如本文中所用的，术语“序列同一性”指的是两个最佳比对的多核苷酸序列或两个最佳比对的多肽序列相同的程度。通过人工比对两个序列(例如，参比序列和另一序列)来形成最佳序列比对以最大化带有合适的内部核苷酸插入、删除或空隙的序列比对中核苷酸匹配的数目。如本文中所用的，术语“参比序列”指的是SEQ ID NO：1-158和180-183的多核苷酸序列所提供的序列。
如本文中所用的，术语“百分序列同一性”或“百分同一性”或“％同一性”是同一性分数乘以100。对于与参比序列最佳比对的序列，“同一性分数”是最佳比对中核苷酸匹配的数目除以参比序列中的核苷酸总数，例如，整个参比序列的全长中的核苷酸总数。因此，本发明的一个实施方案是包含与参比序列(本文中以SEQ ID NO：1-158和180-183提供)最佳比对时具有与参比序列的至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性或至少约99％同一性的序列的DNA分子。在特定的实施方案中，这样的序列可以定义为具有基因调控活性。
调控元件
调控元件是具有基因调控活性的DNA分子，即，具有影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译的能力的DNA分子。因此，术语“基因调控活性”指的是通过影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译来影响该可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达模式的能力。如本文中所用的，转录调控表达元件组或“EXP”序列可以由可操作地连接的表达元件组成，如增强子、启动子、前导序列和内含子。因此，例如，转录调控表达元件组可以由可操作5’连接于前导序列(其随后可操作地5’连接于内含子序列)的启动子组成。内含子序列可以由在天然序列的第一内含子/外显子剪接接合点开始的序列组成，并且可以进一步由小的前导序列片段组成，所述片段包含第二内含子/外显子剪接接合以便提供正确的内含子/外显子加工，以促进所得到的转录产物的转录和正确加工。前导序列和内含子可能正向地影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录以及所得到的转录的RNA的翻译。加工前的RNA分子包含前导序列和内含子，其可以影响转录的RNA的转录后加工和/或转录的RNA分子从细胞核至细胞质中的输出。在转录的RNA分子的转录后加工后，前导序列可以保留作为最终信使RNA的部分，并且可以正向地影响信使RNA分子的翻译。
调控元件，如启动子、前导序列、内含子和转录终止区(或3’UTR)是具有基因调控活性的DNA分子并且是活细胞的基因整体表达的有机部分。术语“调控元件”指的是具有基因调控活性的DNA分子，即具有影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译的能力的DNA分子。因此，在植物中起作用的分离的调控序列，如启动子和前导序列，可用于通过遗传工程的方法来改变植物表型。
可以通过其表达模式效应(定性地和/或定量地)，例如，正或负效应和/或组成型的或其他的效应，如，通过其时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应表达模式及其任意组合，以及通过定量或定性指标，来表征调控元件。启动子可用作用于调控可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达的调控元件。
如本文中所用的，“基因表达模式”是可操作地连接的DNA分子转录成转录的RNA分子的任何模式。转录的RNA分子可以翻译以产生蛋白质分子或可以提供反义或其他调控RNA分子，如dsRNA、tRNA、rRNA、miRNA等。
如本文中所用的，术语“蛋白质表达”是转录的RNA分子翻译成蛋白质分子的任何翻译模式。蛋白质表达可以通过其时间、空间、发育或形态学性质以及通过定量或定性指标来表征。
如本文中所用的，术语“启动子”通常指的是参与RNA聚合酶II和其他蛋白质(反式作用转录因子)的识别和结合以启动转录的DNA分子。启动子最初可以从基因的基因组拷贝的5’非翻译区(5’UTR)分离。或者，启动子可以是合成地产生或操纵的DNA分子。启动子还可以是嵌合的，即通过两个或更多个异源DNA分子的融合产生的启动子。本发明实施中有用的启动子包括SEQ ID NO：2、6、9、11、13、15、17、19、23、26、28、30、32、34、38、40、42、46、50、56、60、64、66、70、74、76、78、80、84、86、88、91、96和135，或其片段或变体。在本发明的特定实施方案中，本文中描述的这些分子及其任何变体或衍生物进一步定义为包含启动子活性，即，能够在宿主细胞(如，在转基因植物中)中作为启动子发挥作用。在更进一步的特定实施方案中，可以将片段定义为呈现出其所来源的起始启动子具有的启动子活性，或片段可以包含“最小启动子”(其提供基础转录水平，并且由TATA盒或用于RNA聚合酶II复合物的识别和结合以实现转录启动的等同序列组成)。
在一个实施方案中，提供了本文中公开的启动子序列的片段。启动子片段可以包含如上所述的启动子活性，并且可以单独地使用或结合其他启动子和启动子片段一起使用，如在构建的嵌合启动子中。在特定的实施方案中，提供了包含具有本文中公开的启动子活性的多核苷酸分子的至少约50、95、150、250、500、750或至少约1000个连续核苷酸或更长的启动子片段。
可以使用本领域已知的方法来生产源自如SEQ ID NO：2、6、9、11、13、15、17、19、23、26、28、30、32、34、38、40、42、46、50、56、60、64、66、70、74、76、78、80、84、86、88、91、96和135中呈现的任一个启动子的组合物，如内部或5’删除，以提高或改变表达，包括通过去除对表达具有正或负效应的元件；使对表达具有正或负效应的元件重复；和/或使对表达具有组织或细胞特异性效应的元件重复或去除。可以使用源自SEQ ID NO：2、6、9、11、13、15、17、19、23、26、28、30、32、34、38、40、42、46、50、56、60、64、66、70、74、76、78、80、84、86、88、91、96和135中呈现的任一个启动子的包含3’删除的组合物以例如制备增强子元件，其中去除了TATA盒元件或其等同序列及下游序列。可以进行进一步的删除以除去对表达具有正或负效应、组织特异性效应、细胞特异性效应或时间特异性效应(如，但不限于，昼夜节律)的任何元件。SEQ ID NO：2、6、9、11、13、15、17、19、23、26、28、30、32、34、38、40、42、46、50、56、60、64、66、70、74、76、78、80、84、86、88、91、96和135中呈现的任一启动子以及源自其的片段或增强子可以用来制备嵌合转录调控元件组合物，其由可操作地与其他增强子和启动子连接的SEQ ID NO：2、6、9、11、13、15、17、19、23、26、28、30、32、34、38、40、42、46、50、56、60、64、66、70、74、76、78、80、84、86、88、91、96和135中呈现的任一启动子以及源自其的片段或增强组成。可以在稳定的和瞬时的植物分析中，如本文中的工作实施例中所述的那些，经验地测试本文中所述的修饰、重复或删除对特定转基因的所需表达方面的效力，以验证结果(其可能随所进行的改变和起始分子中改变的目标而不同)。
如本文中所用的，术语“前导序列”指的是从基因的基因组拷贝的5’非翻译区(5'UTR)分离的并且通常限定为转录起始位点(TSS)和蛋白编码序列起始位点之间的核苷酸片段的DNA分子。或者，前导序列可以是合成产生或操纵的DNA元件。前导序列可以用作5’调控元件，其用于调节可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达。前导序列分子可以与异源启动子或与其天然启动子一起使用。因此，本发明的启动子分子可以可操作地与其天然的前导序列连接或可以可操作地与异源前导序列连接。实施本发明中有用的前导序列包括SEQ ID NO：3、20、35、43、47、51、57、61、67、71和81或者其片段或变体。在特定的实施方案中，可以提供这样的序列，其限定为能够宿主细胞中作为前导序列发挥作用，所述宿主细胞包括，例如，转基因植物细胞。在一个实施方案中，将这样的序列译解为包含前导序列活性。
作为SEQ ID NO：3、20、35、43、47、51、57、61、67、71和81呈现的前导序列(5'UTR)可以由调控元件组成或可以采取对转基因的转录或翻译具有作用的二级结构。根据本发明可以使用作为SEQ ID NO：3、20、35、43、47、51、57、61、67、71和81呈现的前导序列，以形成影响转基因的转录或翻译的嵌合调控元件。此外，作为SEQ ID NO：3、20、35、43、47、51、57、61、67、71和81呈现的前导序列可以用于形成影响转基因的转录或翻译的嵌合前导序列。
将外源基因引入新的植物宿主中不总是导致引入基因的高表达。此外，如果是处理复杂的性状，有时需要调节几个在空间或时间上具有不同表达模式的基因。内含子可以主要地提供这样的调节。然而，已经表明相同内含子在一个植物中的多重应用呈现出缺陷。在那些情况中，需要具有用于构建合适的重组DNA元件的基础控制元件的集合。由于本领域已知的具有表达增强特性的可用内含子集合是有限的，因此需要替换方案。
源自于以SEQ ID NO：4、7、21、24、36、44、48、52、54、58、62、68、72、82、92、94、101、103、105、107、109、111、113、118、120、122、127、129、131、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158和182呈现的任一个内含子的组合物由顺式调控元件的内部缺失或重复构成；和/或当可操作地与启动子+前导序列或嵌合启动子+前导序列和编码序列连接时，包含内含子/外显子剪接点的5’和3’序列的改变可以用于提高表达或表达的特异性。还可以形成包含内含子/外显子剪接点的5’和3’区的改变以降低引入假起始和终止密码子的可能，所述假起始和终止密码子是在信使RNA的加工和剪接后所得到的转录产物中产生的。可以按照工作实施例中所述的，经验地测试内含子以确定内含子对转基因表达的作用。
根据本发明，可以分析启动子或启动子片段中已知启动子元件的存在，即DNA序列特征，如TATA-盒和其他已知转录因子结合位点基序。本领域技术人员可以利用这些已知启动子元件的确认以设计具有与原始启动子相似的表达模式的启动子变体。
如本文中所用的，术语“增强子”或“增强子元件”指的是顺式作用的转录调控元件，也称为顺式-元件，其赋予可操作连接的多核苷酸序列的整体表达模式的一个方面，但通常单独不足以启动转录。与启动子不同，增强子元件通常不包括转录起始位点(TSS)或TATA盒或等同序列。启动子可以天然地包含一个或多个影响可操作地连接的多核苷酸序列的转录的增强子元件。分离的增强子元件也可以与启动子融合以产生嵌合启动子顺式-元件，其赋予基因表达的整体调节的一个方面。启动子或启动子片段可以包含一个或多个影响可操作地连接的基因的转录的增强子元件。据认为许多启动子增强子元件结合DNA-结合蛋白和/或影响DNA拓扑结构，从而产生选择性地允许或限制RNA聚合酶访问DNA模板或促进双螺旋在转录启始位点选择性打开的局部构象。增强子元件可以起到结合调节转录的转录因子的作用。一些增强子元件结合超过一个转录因子，并且转录因子可以以不同的亲和性与超过一个的增强子结构域相互作用。可以通过多种技术鉴定增强子元件，所述技术包括删除分析，即从启动子的5’端或内部删除一个或多个核苷酸；使用DNase I足迹法、甲基化干涉、电泳迁移率-变动试验、通过连接介导的PCR的体内基因组足迹法和其他常规试验的DNA结合蛋白质分析；或通过使用常规DNA序列比较方法，如BLAST，利用已知的顺式-元件基序或增强子元件作为目标序列或目标基序的DNA序列相似性分析。可以通过一个或多个核苷酸的诱变(或取代)或通过其他常规方法来进一步研究增强子结构域的精细结构。可以通过化学合成或通过从包括这些元件的调控元件分离来获得增强子元件，并且可以用含有有用的限制酶位点的其他侧翼核苷酸来合成以利于后续操作。因此，本发明包括根据本文中公开的方法的增强子元件的设计、构建和使用，以用于调节可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达。
在植物中，在基因构建体中包含一些内含子导致相对于缺少内含子的构建体提高的mRNA和蛋白积聚。
该效应已经被称为基因表达的“内含子介导的增强”(IME)(Mascarenhas等，(1990)PlantMol.Biol.15：913-920)。在玉米基因(例如，tubA1、Adh1、Sh1、Ubi1(Jeon等(2000)Plant Physiol.123：1005-1014；Callis等，(1987)Genes Dev.1：1183-1200；Vasil等(1989)Plant Physiol.91：1575-1579；Christiansen等(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)和水稻基因(例如，盐，tpi：McElroy等，Plant Cell2：163-171(1990)；Xu等，PlantPhysiol.106：459-467(1994))中已经鉴定已知在植物中刺激表达的内含子。相似地，已经发现来自双子叶植物基因的内含子，如来自矮牵牛(例如，rbcS)、马铃薯(例如，st-ls1)和来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)(例如，ubq3和pat1)的那些，其升高基因表达率(Dean等，(1989)Plant Cell1：201-208；Leon等(1991)Plant Physiol.95：968-972；Norris等(1993)Plant Mol Biol21：895-906；Rose和Last(1997)Plant J.11：455-464)。已经表明了内含子的剪接位点内的缺失或突变降低了基因表达，表明剪接对于IME可能是需要的(Mascarenhas等(1990)Plant Mol Biol.15：913-920；Clancy和Hannah(2002)PlantPhysiol.130：918-929)。然而，通过来自拟南芥的pat1基因的剪接位点内的点突变表明对于双子叶植物中的特定IME，剪接本身是不需要的(Rose和Beliakoff(2000)PlantPhysiol.122：535-542)。
通过内含子增强基因表达不是普遍现象，因为一些内含子插入重组表达盒中不能增强表达(例如，来自双子叶植物基因的内含子(来自豌豆的rbcS基因、来自豆类的菜豆蛋白基因和来自马铃薯(Solanum tuberosum)的stls-1基因)和来自玉米基因的内含子(adh1基因第九个内含子，hsp81基因第一个内含子))(Chee等(1986)Gene41：47-57；Kuhlemeier等(1988)Mol Gen Genet212：405-411；Mascarenhas等(1990)Plant Mol.Biol.15：913-920；Sinibaldi和Mettler(1992)WE Cohn，K Moldave编辑，Progress in Nucleic AcidResearch and Molecular Biology，Vol.42.Academic Press，New York，pp229-257；Vancanneyt等，1990Mol.Gen.Genet.220：245-250)。因此，为了操纵转基因植物中非内源性基因或内源性基因的基因表达水平，不是每一种内含子都可以使用。为了增强给定基因的表达率哪个特征或特定的序列特征必须存在于内含子序列中是现有技术中未知的，并且因此从现有技术不可能预测给定的植物内含子在异源性地使用时是否将引起DNA水平或转录产物水平的表达增强(IME)。
如本文中所用的，术语“嵌合的”指的是通过将第一DNA分子与第二DNA分子融合产生的单一DNA分子，其中第一或第二DNA分子通常都不是以该构造存在，即与另一个融合。因此，嵌合DNA分子是通常在自然界未发现的新分子。如本文中所用的，术语“嵌合启动子”指的是通过这样的DNA分子操作产生的启动子。嵌合启动子可以组合两个或更多个DNA片段；一个实例是启动子与增强子元件的融合。因此，本发明包括根据本文中公开的方法的嵌合启动子的设计、构建和使用，以用于调节可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达。
如本文中所用的，术语“变体”指的是在组成上与第一DNA分子相似但不相同的第二DNA分子，并且第二DNA分子仍然保持第一DNA分子的总体功能性，即相同或相似的表达模式。变体可以是第一DNA分子的较短或截断的形式和/或第一DNA分子的序列的改变形式，如具有不同限制酶位点和/或内部缺失、取代和/或插入的变体。“变体”还可以包括调控元件，所述调控元件的核苷酸序列包含参考序列的一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或插入，其中衍生的调控元件与相应的亲本调控分子相比具有更多或更少或等同的转录或翻译活性。调控元件“变体”还包括从细菌和植物细胞转化中天然发生的突变产生的变体。在本发明中，作为SEQ ID NO：1-158和180-183提供的多核苷酸序列可以用于形成组成上与原始调控元件的多核苷酸序列相似但不相同的变体，其同时仍然保持原始调控元件的总体功能性，即相同或相似表达模式。根据本公开的内容，本发明的这些变体的产生在本领域普通技术人员的能力范围内，并且包括在本发明的范围内。嵌合调控元件“变体”包含与参考序列相同的组成元件，但包含嵌合调控元件的组成元件可以通过本领域已知的各种方法来可操作地连接，所述方法如限制酶消化和连接、连接无关性克隆、扩增过程中PCR产物的模块组装或调控元件的直接化学合成以及本领域已知的其他方法。所得到的嵌合调控元件“变体”可以由参考序列的相同组成元件或相同组成元件的变体组成，但在包含一个或多个连接序列的一个或多个序列方面不同，所述一个或多个连接序列使得组成部分可以可操作地连接。在本发明中，作为SEQ ID NO：1-158和180-183提供的多核苷酸序列提供了参考序列，其中包含参考序列的组成部分可以通过本领域已知的方法连结，并且可以包含一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或插入或在细菌和植物细胞转化中天然发生的突变。
构建体
如本文中所用的，术语“构建体”意思是源自任何来源的能够基因组整合或自主复制的任何重组多核苷酸分子，如质粒、粘粒、病毒、自主复制的多核苷酸分子、噬菌体或者线状或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子，包括其中一个或多个多核苷酸分子已经以功能操作的方式连接(即，可操作地连接)的多核苷酸分子。如本文中所用的，术语“载体”意思是可以用于转化(即，将异源DNA引入宿主细胞中)目的的任何重组多核苷酸构建体。该术语包括从上述任何分子分离的表达盒。
如本文中所用的，术语“可操作地连接”指的是第一分子接合第二分子，其中分子排列以使得第一分子影响第二分子的功能。两个分子可以是或不是单一连续分子的部分，并且可以是或不是邻接的。例如，如果启动子在细胞中调节目标可转录多核苷酸分子的转录，则启动子可操作地连接该可转录多核苷酸分子。例如，当前导序列能够作为用于编码序列所编码的多肽的前导序列时，前导序列可操作地连接该编码序列。
在一个实施方案中，可以作为双Ti质粒边界DNA构建体提供本发明的构建体，所述构建体具有从根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)分离的Ti质粒的右边界(RB或AGRtu.RB)和左边界(LB或AGRtu.LB)区，连同根癌农杆菌细胞提供的转移分子，允许T-DNA整合至植物细胞的基因组中(参见，例如，US专利6,603,061)。构建体还可以含有质粒骨架DNA片段，其提供在细菌细胞中的复制功能和抗生素选择，例如，大肠杆菌复制起点(如ori322)、广宿主范围的复制起点(如oriV或oriRi)以及用于选择标记的编码区，如编码赋予对壮观霉素或链霉素抗性的Tn7氨基糖苷腺苷酰转移酶(aadA)的Spec/Strp，或庆大霉素(Gm，Gent)选择标记基因。对于植物转化，宿主细菌菌株常常是根癌农杆菌ABI、C58或LBA4404；然而，植物转化领域中的技术人员已知的其他菌株可以用于本发明中。
以使可转录多核苷酸分子转录成功能性mRNA分子的方式装配构建体并将其引入细胞中的方法是本领域已知的，所述mRNA分子翻译并表达为蛋白质产物。对于本发明的实施，用于制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法是本领域技术人员公知的，参见，例如，Molecular Cloning.·A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第3版，Vol.1、2和3(2000)J.Sambrook，D.W.Russell和N.Irwin，Cold Spring Harbor LaboratoryPress。用于制备特别适于植物转化的重组载体的方法包括但不限于U.S.专利No.4,971,908；4,940,835；4,769,061和4,757,011全文中描述的那些。这些类型的载体在科学文献中已经有综述(参见，例如，Rodriguez等，Vectors.·A Survey of Molecular CloningVectors and Their Uses(载体：分子克隆载体及其使用概述)，Butterworths，Boston(1988)和Glick等，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology(植物分子生物学和生物技术中的方法)，CRC Press，Boca Raton FL.(1993))。用于在高等植物中的核酸表达的典型载体是本领域公知的，并且包括源自根癌农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体(Rogers等，Methods in Enzymology153：253-277(1987))。可用于植物转化的其他重组载体，包括pCaMVCN转移控制载体，也已经在科学文献中有描述(参见，例如，Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：5824-5828(1985))。
可以在构建体中包括各种调控元件，包括本文中提供的那些中的任何一个。任何这样的调控元件可以结合其他调控元件来提供。可以设计或修改这样的组合以产生所需的调控特征。在一个实施方案中，本发明的构建体包含至少一个可操作地连接可转录多核苷酸分子的调控元件，所述可转录多核苷酸分子可操作地连接3'UTR。
本发明的构建体可以包括本文中提供的或本领域已知的任何启动子或前导序列。例如，本发明的启动子可以可操作地连接异源非翻译5’前导序列，如源自热休克蛋白基因的前导序列(参见，例如，U.S.专利No.5,659,122和5,362,865)。或者，本发明的前导序列可以可操作地连接异源启动子，如花椰菜花叶病毒35S转录启动子(参见，U.S.专利No.5,352,605)。
如本文中所用的，术语“内含子”指的是可以从基因的基因组拷贝中分离或鉴定的DNA分子，并且通常限定为在翻译之前的mRNA加工过程中剪接出来的区域。或者，内含子可以是合成产生的或操作的DNA元件。内含子可以含有影响可操作连接的基因的转录的增强子元件。内含子可以用作调控元件以用于调节可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达。DNA构建体可以包含内含子，并且内含子相对于可转录多核苷酸分子序列可以是或不是异源的。本领域中的内含子实例包括水稻肌动蛋白内含子(U.S.专利No.5,641,876)和玉米HSP70内含子(U.S.专利No.5,859,347)。本发明实施中有用的内含子包括SEQ ID NO：4、7、21、24、36、44、48、52、54、58、62、68、72、82、92、94、101、103、105、107、109、111、113、118、120、122、127、129、131、138、140、142、144、146、148、150、152、154、158和182。此外，当修饰内含子/外显子边界序列时，可能优选的是，避免紧接在剪接位点(GT)的5’端前使用核苷酸序列AT或核苷酸A，和分别避免紧接在剪接位点(AG)的3’端后使用核苷酸G或核苷酸序列TG，以消除在信使RNA加工成最终转录产物的过程中形成不需要的起始密码子的可能。因此可以以这种方式修饰内含子的5’或3’端剪接位点周围的序列。
如本文中所用的，术语“3’转录终止分子”或“3'UTR”指的是在转录过程中为产生mRNA分子的3’非翻译区(3'UTR)使用的DNA分子。可以通过特定的切割和3’多腺苷酸化(也称为，多A尾)来产生mRNA分子的3’非翻译区。3'UTR可以可操作地连接可转录多核苷酸分子并且位于可转录多核苷酸分子的下游，并且可以包括提供多腺苷酸化信号的多核苷酸和能够影响转录、mRNA加工或基因表达的其他调控信号的多核苷酸。据认为多A尾在mRNA稳定性和翻译启动中起作用。本领域中3’转录终止分子的实例是胭脂碱合成酶3’区域(参见，Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：4803-4807(1983))、小麦hsp173’区域、豌豆rubisco小亚基3’区域、棉花E63’区(U.S.专利No.6,096,950)；WO0011200A2中公开的3’区域和coixin3'UTR(U.S.专利No.6,635,806)。
通常发现3'UTR对于特定基因的重组表达具有有益用途。在动物系统中，3’UTR的机制已经非常明确(例如，Zhao等，Microbiol Mol Biol Rev63：405-445(1999)；Proudfoot，Nature322：562-565(1986)；Kim等，Biotechnology Progress19：1620-1622(2003)；Yonaha和Proudfoot，EMBO J.19：3770-3777(2000)；Cramer等，FEBSLetters498：179-182(2001)；Kuerstem和Goodwin，Nature Reviews Genetics4：626-637(2003))。需要RNA转录的有效终止以防止不需要的性状不相关(下游)序列的转录，其可能干扰性状性能。与独立的插入相比，多个基因表达盒彼此位置接近的排列(例如，在一个T-DNA中)会引起所述构建体中一个或多个基因的基因表达的抑制(Padidam和Cao，BioTechniques31：328-334(2001))。这可能干扰获得足够水平的表达，例如，在需要来自所有表达盒的强基因表达的情况中。
在植物中，清楚限定的多腺苷酸化信号序列是未知的。Hasegawa等，Plant J.33：1063-1072，(2003)未能在林烟草(Nicotiana sylvestris)的体外和体内系统中鉴定出保守的多腺苷酸化信号序列，也未能确定初始(非-多腺苷酸化的)转录产物的实际长度。弱的3'UTR具有产生连读(read-through)的可能，其可能影响位于邻近表达盒中的基因的表达(Padidam和Cao，BioTechniques31：328-334(2001))。转录终止的适当控制可以防止连读到位于下游的序列(例如，其他表达盒)中并且可以进一步允许RNA聚合酶有效再循环，以提高基因表达。转录的有效终止(从DNA释放RNA聚合酶II)是转录重新启动必需的，并且因此直接影响整体的转录产物水平。转录终止后，成熟的mRNA从合成位点和模板释放至细胞质中。真核mRNA作为多(A)形式在体内累积，使得难以通过常规方法来检测转录终止位点。然而，通过生物信息学方法预测功能性和有效的3'UTR是困难的，因为不存在允许容易地预测有效3'UTR的保守序列。
从实践观点看，在转基因盒中使用的3'UTR具有以下特征通常是有益的。3'UTR应当能够有效地和高效地终止转基因的转录并且防止转录产物连读到任何邻近的DNA序列(如在一个T-DNA中存在多个盒的情况中，所述的邻近DNA序列可以由另一个转基因盒组成)中或T-DNA已经插入的邻近染色体DNA中。3'UTR不应当引起由用于驱动转基因表达的启动子、前导序列和内含子导致的转录活性的降低。在植物生物技术中，3'UTR常常用于引发从转化的植物提取的反转录RNA的扩增反应，并且用于(1)评价一旦整合至植物染色体中的转基因盒的转录活性或表达；(2)评价植物DNA内插入的拷贝数；和(3)评价育种后得到的种子的接合性。3’UTR还用于从转化的植物提取的DNA的扩增反应中，以表征插入盒的完整性。
可以基于从种子、花和其他组织分离的信使RNA制得的cDNA文库中表达的序列标记(EST)的表达来鉴定用于提供转基因在植物中的表达的3’UTR，所述种子、花和其他组织源自大须芒草(Andropogon gerardii)、沙生蔗茅(Saccharum ravennae(Erianthusravennae))、狗尾草(Setaria viridis)、墨西哥玉米(Zea mays subsp.mexicana)、小米(Setaria italica)或薏苡(Coix lacryma-jobi)。使用本领域技术人员已知的方法，从选定植物物种的花组织、种子、叶和根分离的组织制得cDNA文库。使用本领域已知的各种测序方法将所得到的cDNA测序。使用生物信息学软件，如clc_ref_assemble_complete版本2.01.37139(CLC bio USA，Cambridge，Massachusetts02142)，将所得到的EST装配成簇。通过计数各个簇的cDNA读数的数目来确定各个簇的转录产物丰度。鉴定的3’UTR可以由源自cDNA序列的序列以及源自基因组DNA的序列组成。将cDNA序列用于设计引物，其然后用于按照制造商的方案构建的GenomeWalkerTM(Clontech Laboratories，Inc，Mountain View，CA)文库以克隆相应基因组DNA序列的3’区域，来提供较长的终止序列。通过对各个组织文库所观察到的序列读数的直接计数或标准化计数对相关转录产物丰度的分析可以用于推断关于表达模式的特性。例如，相对于叶子可以在根组织中以较高丰度看到的转录产物中发现一些3’UTR。这表明了转录产物在根中是高度表达的，并且根表达的特性可以归因于启动子、前导序列、内含子或3’UTR的转录调控。通过在特定器官、组织或细胞类型内的表达特性鉴定的3’UTR的经验测试可以导致增强那些特定器官、组织或细胞类型内的表达的3’UTR的鉴定。
构建体和载体也可以包括表达连接的肽的转运肽编码序列，所述连接肽用于靶向蛋白产物于特别是叶绿体、白色体或其他质体细胞器；线粒体；过氧化物酶体；液泡或细胞外位置。对于使用叶绿体转运肽的描述参见U.S.专利No.5,188,642和U.S.专利No.5,728,925。许多叶绿体定位的蛋白质作为前体由核基因表达，并且通过叶绿体转运肽(CTP)靶向于叶绿体。这样的分离的叶绿体蛋白质的实例包括，但不限于，与核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亚基(SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、光捕获复合蛋白I和蛋白II、硫氧还蛋白F、烯醇式丙酮酰莽草酸磷酸合成酶(EPSPS)以及U.S.专利No.7,193,133中所描述的转运肽相关的那些。已经在体内和体外证明了非叶绿体蛋白质可以通过使用与异源CTP的蛋白质融合来靶向于叶绿体并且CTP足以将蛋白靶向于叶绿体。已经表明了整合合适的叶绿体转运肽，如拟南芥EPSPS CTP(CTP2)(参见，Klee等，Mol.Gen.Genet.210：437-442(1987))或矮牵牛EPSPS CTP(CTP4)(参见，della-Cioppa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：6873-6877(1986))，将异源EPSPS蛋白序列靶向于转基因植物中的叶绿体(参见，U.S.专利No.5,627,061；5,633,435和5,312,910以及EP0218571；EP189707；EP508909和EP924299)。
可转录多核苷酸分子
如本文中所用的，术语“可转录多核苷酸分子”指的是能够转录成RNA分子的任何DNA分子，包括，但不限于，具有蛋白质编码序列的那些和产生具有可用于基因抑制的序列的RNA分子的那些。“转基因”指的是至少相对于其在基因组中的位置对于宿主细胞异源的可转录多核苷酸分子和/或人工引入目前或任何之前代的细胞的宿主细胞基因组中的可转录多核苷酸分子。
本发明的启动子可以可操作地连接对于启动子分子是异源的可转录多核苷酸分子。如本文中所用的，术语“异源的”指的是两个或多个多核苷酸分子的组合正常情况下未在自然界中发现的这种组合。例如，两个分子可以源自不同的物种和/或两个分子可以源自不同的基因，例如，来自相同物种的不同基因或来自不同物种的相同基因。因此，如果这样的组合正常情况下未在自然界中发现，那么启动子对于可操作地连接的可转录多核苷酸分子是异源的，即，该可转录多核苷酸分子在组合中不是自然发生地可操作连接该启动子分子。
可转录多核苷酸分子通常可以是对于需要其RNA转录产物表达的任何DNA分子。这样的RNA转录产物的表达可以导致所得到的mRNA分子的翻译，并且因此导致蛋白质表达。或者，例如，可以将可转录多核苷酸分子设计成最终引起降低的特定基因和蛋白质的表达。在一个实施方案中，这可以通过使用以反义方向定向的可转录多核苷酸分子来实现。本领域普通技术人员熟知这样的反义技术的使用。简而言之，随着反义可转录多核苷酸分子被转录，RNA产物在细胞内与互补RNA分子杂交并将其隔离。这种双链RNA分子不能通过细胞的翻译机制翻译成蛋白质，并且在细胞中降解。可以以这种方式负调节任何基因。
因此，本发明的一个实施方案是可操作地连接可转录多核苷酸分子的本发明的调控元件，如SEQ ID NO：1-158和180-183中提供的那些，以使得当构建体整合至植物细胞的基因组中时，以所需水平或以所需模式调节可转录多核苷酸分子的转录。在一个实施方案中，可转录多核苷酸分子包含基因的蛋白质编码区，并且启动子影响翻译和表达为蛋白质产物的RNA分子的转录。在另一个实施方案中，可转录多核苷酸分子包含基因的反义区域，并且启动子影响反义RNA分子、双链RNA或其他类似抑制性RNA分子的转录，以抑制特定的目标RNA分子在目标宿主细胞中的表达。
具有农艺学意义的基因
可转录多核苷酸分子可以是具有农艺学意义的基因。如本文中所用的，术语“具有农艺学意义的基因”指的是当在特定的植物组织、细胞或细胞类型中表达时赋予所需特征的可转录多核苷酸分子，所述特征例如与植物形态学、生理学、生长、发育、产量、产物、营养特征、抗病性或抗虫性和/或环境或化学耐受性相关。具有农艺学意义的基因包括，但不限于，编码产品蛋白质、抗应激蛋白、发育控制蛋白、组织分化蛋白、分生组织蛋白、环境反应性蛋白、衰老蛋白、激素反应性蛋白、脱落蛋白(abscission protein)、源蛋白、储器蛋白(sink protein)、花控制蛋白、种子蛋白、除草剂抗性蛋白、疾病抗性蛋白、脂肪酸生物合成酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、杀虫蛋白或任何其他物质(如，靶向特定基因用于抑制的反义或RNAi分子)的那些。具有农艺学意义的基因的产物可以在植物内起作用以引起对植物生理学或代谢的效应，或可以作为施加于植物上的昆虫膳食中的杀虫剂。
在本发明的一个实施方案中，本发明的启动子结合至构建体中，以使得启动子可操作地连接作为具有农艺学意义基因的可转录多核苷酸分子。为了赋予农艺学上有益的性状，具有农艺学意义的基因的表达是合乎需要的。有益的农艺学性状可以是，例如，但不限于，除草剂耐受性、昆虫控制、改变的产量、真菌疾病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌疾病抗性、植物生长和发育、淀粉生产、改变的油生产、高油产量、改变的脂肪含量、高蛋白质产量、果实成熟、增强的动物和人营养、生物聚合物、环境应激抗性、药物肽和可分泌肽、改善的加工性状、提高的可消化性、酶产生、风味、氮固定、杂种种子产生、纤维产生和生物燃料产生。本领域已知的具有农艺学意义的基因的实例包括用于除草剂抗性(U.S.专利No.6,803,501；6,448,476；6,248,876；6,225,114；6,107,549；5,866,775；5,804,425；5,633,435和5,463,175)、提高的产量(U.S.专利No.USRE38,446；6,716,474；6,663,906；6,476,295；6,441,277；6,423,828；6,399,330；6,372,211；6,235,971；6,222,098和5,716,837)、昆虫控制(U.S.专利No.6,809,078；6,713,063；6,686,452；6,657,046；6,645,497；6,642,030；6,639,054；6,620,988；6,593,293；6,555,655；6,538,109；6,537,756；6,521,442；6,501,009；6,468,523；6,326,351；6,313,378；6,284,949；6,281,016；6,248,536；6,242,241；6,221,649；6,177,615；6,156,573；6,153,814；6,110,464；6,093,695；6,063,756；6,063,597；6,023,013；5,959,091；5,942,664；5,942,658,5,880,275；5,763,245和5,763,241)、真菌疾病抗性(U.S.专利No.6,653,280；6,573,361；6,506,962；6,316,407；6,215,048；5,516,671；5,773,696；6,121,436；6,316,407和6,506,962)、病毒抗性(U.S.专利No.6,617,496；6,608,241；6,015,940；6,013,864；5,850,023和5,304,730)、线虫抗性(U.S.专利No.6,228,992)、细菌疾病抗性(U.S.专利No.5,516,671)、植物生长和发育(U.S.专利No.6,723,897和6,518,488)、淀粉产量(U.S.专利No.6,538,181；6,538,179；6,538,178；5,750,876；6,476,295)、改变的油产生(U.S.专利No.6,444,876；6,426,447和6,380,462)、高油产量(U.S.专利No.6,495,739；5,608,149；6,483,008和6,476,295)、改变的脂肪酸含量(U.S.专利No.6,828,475；6,822,141；6,770,465；6,706,950；6,660,849；6,596,538；6,589,767；6,537,750；6,489,461和6,459,018)、高蛋白产生(U.S.专利No.6,380,466)、果实成熟(U.S.专利No.5,512,466)、增强的动物和人营养(U.S.专利No.6,723,837；6,653,530；6,5412,59；5,985,605和6,171,640)、生物聚合物(U.S.专利No.USRE37,543；6,228,623和5,958,745及6,946,588)、环境应激抗性(U.S.专利No.6,072,103)、药物肽和可分泌肽(U.S.专利No.6,812,379；6,774,283；6,140,075和6,080,560)、改善的加工性状(U.S.专利No.6,476,295)、提高的可消化性(U.S.专利No.6,531,648)、低蜜三糖(U.S.专利No.6,166,292)、工业酶产生(U.S.专利No.5,543,114)、改善的风味(U.S.专利No.6,011,199)、氮固定(U.S.专利No.5,229,114)、杂种种子产生(U.S.专利No.5,689,041)、纤维产生(U.S.专利No.6,576,818；6,271,443；5,981,834和5,869,720)和生物燃料产生(U.S.专利No.5,998,700)的那些。
或者，具有农艺学意义的基因可以通过编码引起内源基因基因表达的靶向调节的RNA分子来影响上述植物特征或表型，例如，通过反义(参见，例如，US专利5,107,065)、抑制性RNA(“RNAi”，包括通过miRNA-、siRNA-、反式作用siRNA-和定相sRNA-介导的机制来调节基因表达，例如，如公开的申请US2006/0200878和US2008/0066206以及US专利申请11/974,469中所述的)或共抑制介导的机制。RNA还可以是经工程化来切割所需内源性mRNA产物的催化性RNA分子(例如，核酶或核糖开关；参见，例如US2006/0200878)。因此，编码影响农艺学上重要的目标表型或形态学变化的转录RNA分子的任何可转录多核苷酸分子可以用于本发明的实施中。以将可转录多核苷酸分子转录成能够引起基因抑制的分子的方式构建构建体并将其引入细胞中的方法是本领域已知的。例如，使用含有反义定向的可转录多核苷酸分子的构建体来调节植物细胞中的基因表达的转录后基因抑制公开于U.S.专利No.5,107,065和5,759,829中，以及使用含有正义定向的可转录多核苷酸分子的构建体来调节植物中的基因表达的转录后基因抑制公开于U.S.专利No.5,283,184和5,231,020中。可转录多核苷酸在植物细胞中的表达还可以用于抑制以植物细胞为食的植物害虫，例如，从鞘翅目害虫分离的组合物(U.S.专利公开No.US20070124836)和从线虫害虫分离的组合物(U.S.专利公开No.US20070250947)。植物害虫包括，但不限于，节足害虫、线虫害虫和真菌或微生物害虫。用于结合至本发明的构建体中的示例性可转录多核苷酸包括，例如，来自目标物种以外的物种的DNA分子或基因或源于或存在于相同物种中但通过传统繁殖或育种技术以外的遗传工程方法整合至受体细胞中的基因。多核苷酸分子的类型可以包括，但不限于，已经存在于植物细胞中的多核苷酸分子、来自另一植物的多核苷酸分子、来自不同生物体的多核苷酸分子或外部产生的多核苷酸分子，如含有基因的反义信息的多核苷酸分子，或编码人工的、合成的或转基因的其他修饰形式的多核苷酸分子。
选择标记
如本文中所用的，术语“标记”指的是可以以一定的方式筛选或评价其表达或缺失的任何可转录多核苷酸分子。用于本发明实施中的标记基因包括，但不限于，编码β-葡糖苷酸酶(U.S.专利No.5,599,670中所述的GUS)、绿色荧光蛋白及其变体(U.S.专利No.5,491,084和6,146,826中所述的GFP)、赋予抗生素抗性的蛋白质或赋予除草剂耐受性的蛋白的可转录多核苷酸分子。有用的抗生素抗性标记，包括编码赋予卡那霉素(nptII)、潮霉素B(aphIV)、链霉素或壮观霉素(aad，spec/strep)和庆大霉素(aac3和aacC4)抗性的那些，是本领域已知的。对其已经证明了转基因植物耐受性并且可以对其使用本发明的方法的除草剂包括，但不限于：氨基-甲基-膦酸、草甘膦、草铵膦、磺脲、咪唑啉酮、溴苯腈、茅草枯、麦草畏、烯己二酮、原卟啉原氧化酶抑制剂和异噁氟草除草剂。编码涉及除草剂耐受性的蛋白质的可转录多核苷酸分子是本领域已知的，并且包括，但不限于，编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(U.S.专利No.5,627,061；5,633,435；6,040,497和5,094,945中所述的草甘膦耐受性的EPSPS)的可转录多核苷酸分子；编码草甘膦氧化还原酶和草甘膦-N-乙酰转移酶(U.S.专利No.5,463,175中所述的GOX；U.S.专利公开No.20030083480中所述的GAT和U.S.专利公开No.20030135879中的麦草畏单加氧酶)的可转录多核苷酸分子；编码溴苯腈腈水解酶(U.S.专利No.4,810,648中所述的用于溴苯腈耐受性的Bxn)的可转录多核苷酸分子；编码Misawa等，Plant Journal4：833-840(1993)和Misawa等，Plant Journal6：481-489(1994)中所述的用于氟草敏耐受性的八氢番茄红素去饱和酶(crtI)的可转录多核苷酸分子；编码Sathasiivan等，Nucl.Acid.Res.18：2188-2193(1990)中所述的用于磺脲除草剂耐受性的乙酰羟酸合成酶(AHAS，也称为ALS)的可转录多核苷酸分子；和DeBlock等，EMBOJournal6：2513-2519(1987)中所述的用于草铵膦和双丙氨磷耐受性的bar基因。本发明的启动子分子可以表达连接的可转录多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码草丁膦乙酰转移酶、草甘膦抗性EPSPS、氨基糖苷磷酸转移酶、羟苯基丙酮酸脱氢酶、潮霉素磷酸转移酶、新霉素磷酸转移酶、茅草枯脱卤素酶、溴苯腈抗性腈水解酶、邻氨基苯甲酸合成酶、芳氧基链烷酸酯双加氧酶、乙酰CoA羧化酶、草甘膦氧化还原酶和草甘膦-N-乙酰转移酶。
包括在术语“选择标记”内的还有编码其分泌可以检测以作为鉴定或选择转化细胞的一种方式的选择标记的基因。实例包括编码可以通过抗体相互作用鉴定的可分泌抗原或甚至可以催化性地检测的可分泌酶的标记。可选择的分泌标记蛋白落入多种类别中，包括可检测的小的、扩散性蛋白(例如，通过ELISA)、在细胞外溶液中可检测的小的活性酶(例如，α-淀粉酶、β-内酰胺酶、草丁膦转移酶)，或插入或封闭在细胞壁中的蛋白质(如，包括前导序列的蛋白，如在延伸的表达单元或烟草病理相关蛋白(也称为烟草PR-S)中发现的那些)。其他可能的选择标记基因是本领域技术人员清楚的并且包括在本发明中。
细胞转化
本发明还涉及生产包含可操作连接到可转录多核苷酸分子上的启动子的转化细胞和植物的方法。
术语“转化”指的是将核酸引入受体宿主中。如本文中所用的，术语“宿主”指的是细菌、真菌或植物，包括细菌、真菌或植物的任何细胞、组织、器官或后代。特别感兴趣的植物组织和细胞包括原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶、幼苗、胚芽和花粉。
如本文中所用的，术语“转化的”指的是其中已经引入了外源多核苷酸分子(如，构建体)的细胞、组织、器官或生物体。引入的多核苷酸分子可以整合至受体细胞、组织、器官或生物体的基因组DNA中，以使得引入的多核苷酸分子被遗传到随后的世代。“转基因”或“转化的”细胞或生物体还包括细胞或生物体的后代以及从使用这样的转基因生物体作为杂交亲本的育种程序产生的并且由于外源多核苷酸分子的存在呈现出改变表型的后代。术语“转基因的”指的是含有一个或多个异源多核酸分子的细菌、真菌或植物。
存在许多方法将多核酸分子引入植物细胞中。该方法通常包括如下步骤：选择合适的宿主细胞、用重组载体转化宿主细胞和获得转化的宿主细胞。合适的方法包括细菌感染(例如，农杆菌)、二元细菌人工染色体载体、DNA的直接传递(例如，通过PEG介导的转化、干燥/抑制-介导的DNA摄取、电穿孔、用碳化硅纤维搅拌和DNA覆盖颗粒的加速等(综述于Potrykus等，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.42：205(1991))中)。
用于将DNA分子引入细胞中的技术是本领域技术人员公知的。在本发明的实施中通过将植物DNA构建体引入植物基因组中来转化植物细胞的方法和材料可以包括公知的和证明的方法中的任何一种。任何转化方法可以用于使用本发明的一个或多个启动子和/或构建体转化宿主细胞。宿主细胞可以是任何细胞或生物体，如植物细胞、藻类细胞、藻类、真菌细胞、真菌、细菌细胞或昆虫细胞。优选的宿主和转化的细胞包括来自以下的细胞：植物、曲霉属(Aspergillus)、酵母、昆虫、细菌和藻类。
再生的转基因植物可以自花授粉以提供纯合的转基因植物。或者，可以将获自再生的转基因植物的花粉与非转基因植物(优选是农艺学上重要物种的近交系)杂交。通常用于不同性状和作物的育种方法的描述可以在几本参考书之一中找到，参见，例如，Allard，Principles of Plant Breeding(育种原理)，John Wiley&Sons，NY，U.ofCA，Davis，CA，50-98(1960)；Simmonds；Principles of crop improvement(作物改进原理)，Longman，Inc.，NY，369-399(1979)，Sneep和Hendriksen，Plant breeding perspectives(植物育种概览)，Wageningen(编辑)，Center for Agricultural Publishing and Documentation(1979)；Fehr，Soybeans.·Improvement,Production and Uses(大豆：提高、生产和使用)，第2版，Monograph，16：249(1987)；Fehr，Principles of variety development，Theory andTechnique(品种发育原理，理论和技术)，(Vol.1)和Crop Species Soybean(作物品种大豆)(Vol2)，Iowa State Univ.，Macmillan Pub.Co.，NY,360-376(1987)。相反地，来自非转基因植物的花粉可以用于对再生的转基因植物授粉。
可以分析转化植物的目标基因的存在以及通过本发明的调控元件赋予的表达水平和/或特征。本领域技术人员知道可用于转化植物分析的多种方法。例如，用于植物分析的方法包括，但不限于，Southern印迹或northern印迹、基于PCR的方法、生物化学分析、表型筛选方法、田间评价和免疫诊断试验。可以使用(Applied Biosystems，Foster City，CA)试剂和方法如制造商描述的来测量可转录多核苷酸分子的表达，并且使用Testing Matrix确定PCR循环时间。或者，如制造商所述的(ThirdWave Technologies，Madison，WI)试剂和方法可以用于转基因表达。
可以从可育的转基因植物收集本发明的植物的种子，并且用于生长本发明的转化植物的后代世代，包括包含本发明的构建体并表达具有农艺学意义基因的杂种植物系。
本发明还提供了本发明的植物的部分。植物部分，非限制地，包括叶、茎、根、块茎、种子、胚乳、胚珠和花粉。本发明还包括和提供了包含本发明核酸分子的转化植物细胞。
转基因植物可以将转基因多核苷酸分子传递给其后代。后代包括包含源自其祖先植物的转基因的任何可再生植物部分或种子。转基因植物优选对转化的多核苷酸分子是纯合的并且作为有性繁殖的结果将该序列传递给所有后代。可以从转基因植物产生的种子种植后代。然后将这些另外的植物自花授粉以产生植物的纯育种系。评价来自这些植物的后代，其中特别是评价基因表达。可以通过几种常用的方法，如westem印迹、northern印迹、免疫沉淀和ELISA，来检测基因表达。
商品
本发明提供了包含根据本发明的DNA分子的商品。如本文中所用的，“商品”指的是由源自包含本发明DNA分子的植物、种子、植物细胞或植物部分的材料组成的任何组合物或产品。商品可以销售给消费者，并且可以是可生存的或不可生存的。不可生存的商品包括但不限于不可生存的种子和籽粒；加工过的种子、种子部分和植物部分；脱水的植物组织、冷冻的植物组织和加工过的植物组织；加工用于陆地和/或水生动物食用的动物饲料的种子和植物部分，油、粗粉、面粉、薄片、麸皮、纤维、奶、干酪、纸张、奶油、酒和用于人消耗的任何其他食品；以及生物质和燃料产品。可生存的商品包括但不限于种子和植物细胞。因此包含根据本发明的DNA分子的植物可以用于制造任何通常从植物或其部分获得的商品。
现在已经概括地描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易理解本发明，所述实施例是以说明的方式提供的并且不是用来限制本发明，除非具体说明。本领域技术人员应当理解以下实施例中公开的技术代表了发明人发现很好地实施本发明的技术。然而，根据本发明的公开内容，本领域技术人员应当认识到在所公开的特定实施方案中可以进行许多变化并且仍然获得类似或相似的结果而没有脱离本发明的精神和范围，因此附图中所列或所示的所有事物解释为说明性的而不是限制意义的。
实施例
实施例1：调控元件的鉴定和克隆
从单子叶物种大须芒草(Andropogon gerardii)、沙生蔗茅(Saccharum ravennae(Erianthus ravennae))、狗尾草(Setaria viridis)、墨西哥玉米(Zea mayssubsp.mexicana)、小米(Setaria italica)和薏苡(Coix lacryma-jobi)的基因组DNA鉴别和分离出新的泛素转录调控元件或转录调控表达元件组(EXP)序列。
从以上的各个物种中确定泛素1转录产物序列。将各个泛素1转录产物的5’非翻译区(5'UTR)用于设计引物以扩增用于确认的泛素基因的相应转录调控元件，其包含启动子、前导序列(5’UTR)和可操作地连接的第一内含子。引物用于按照制造商的方案构建的GenomeWalkerTM(Clontech Laboratories，Inc，Mountain View，CA)文库以克隆相应的基因组DNA序列的5’区。使用与玉米(Zea mays)的泛素4、6和7基因同源的公共序列，也从单子叶植物高粱(Sorghum bicolor)分离泛素转录调控元件。
使用鉴定的序列，进行了生物信息学分析来鉴定扩增的DNA中的调控元件。使用该分析的结果，在DNA序列内限定调控元件并且设计引物来扩增调控元件。使用标准聚合酶链式反应条件，用含有独特限制酶位点和从大须芒草(A.gerardii)、沙生蔗茅(S.ravennae)、狗尾草(S.viridis)、墨西哥玉米(Z. mays subsp.mexicana)、小米(S.italica)、薏苡(C.lacryma-jobi)和高粱(S.bicolor)分离的基因组DNA的引物来扩增用于各个调控元件的相应DNA分子。将所得到的DNA片段连接至基础植物表达载体中并且测序。然后使用转化的植物原生质体进行调控元件TSS和内含子/外显子剪接点的分析。简而言之，用包含可操作地连接异源可转录多核苷酸分子的克隆DNA片段的植物表达载体转化原生质体，并通过分析由此产生的mRNA转录产物的序列，将用于cDNA端快速扩增的5’RACE系统，版本2.0(Invitrogen，Carlsbad，California92008)用于证实调控元件TSS和内含子/外显子剪接点。
鉴定的转录调控表达元件组(“EXP”)的序列本文中作为SEQ ID NO：1，5，8，10，12，14，16，18，22，25，27，29，31，33，37，39，41，45，49，53，55，59，63，65，69，73，75，77，79，83，85，87，90，93，95，97，98，99，100，102，104，106，108，110，112，114，115，116，117，119，121，123，124，125，126，128，130，132，133，134，136，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，180，181和183提供，如以下表1中所示。启动子序列本文中作为SEQ ID NO：2，6，9，11，13，15，17，19，23，26，28，30，32，34，38，40，42，46，50，56，60，64，66，70，74，76，78，80，84，86，88，91，96和135提供。前导序列本文中作为SEQ ID NO：3，20，35，43，47，51，57，61，67，71和81提供。内含子序列本文中作为SEQ ID NO：4，7，21，24，36，44，48，52，54，58，62，68，72，82，92，94，101，103，105，107，109，111，113，118，120，122，127，129，131，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158和182提供。增强子序列作为SEQ ID NO：89提供。
如表1中所示，例如，命名为EXP-ANDge.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：1)的转录调控EXP序列(其含有从大须芒草分离的成分)包含启动子元件P-ANDge.Ubq1-1：1：11(SEQ ID NO：2)，可操作地5’连接于前导序列元件L-ANDge.Ubq1-1：1：2(SEQ ID NO：3)，可操作地5’连接于内含子元件I-ANDge.Ubq1-1：1：3(SEQ ID NO：4)。其他EXP相似地连接，如表1中所概述的。
如表1、序列表和图1-7中所示，将来自物种大须芒草、沙生蔗茅、墨西哥玉米、高粱、薏苡、小米和狗尾草的启动子序列的变体工程化，其包含例如，P-ANDge.Ubq1-1：1：11(SEQ ID NO：2)、P-ERIra.Ubq1-1：1：10(SEQ ID NO：19)或来自其他物种的其他相应启动子的较短启动子片段，并且例如得到P-ANDge.Ubq1-1：1：9(SEQ ID NO：6)、P-ERIra.Ubq1-1：1：9(SEQ ID NO：23)、P-Cl.Ubq1-1：1：10(SEQ ID NO：96)、P-SETit.Ubq1-1：1：2(SEQ IDNO：76)和P-Sv.Ubq1-1：1：2(SEQ ID NO：38)，以及其他启动子片段。P-SETit.Ubq1-1：1：4(SEQ ID NO：74)相对于P-SETit.Ubq1-1：1：1(SEQ ID NO：70)包含单核苷酸变化。同样，P-Sv.Ubq1-1：1：3(SEQ ID NO：40)相对于P-Sv.Ubq1-1：1：4(SEQ ID NO：135)包含单核苷酸变化。
在一些情况中，通过改变3’内含子剪接点的序列5’-AG-3’之后的各相应内含子的最后3’核苷酸来形成特定内含子的变体。这些内含子变体显示于以下的表2中。
表2.内含子变体的3’端序列
表1中还列出了使用为来自墨西哥玉米的基因组DNA的扩增而设计的相同引物组分离的三个等位基因变体。EXP序列的等位基因变体由在其他序列的各个区域内共有一定同一性的序列组成，但在各个EXP序列的各启动子、前导序列和/或内含子内的插入、缺失和核苷酸错配也是明显的。命名为EXP-Zm.UbqM1：1：1(SEQ ID NO：41)的EXP序列表示墨西哥玉米Ubq1基因转录调控表达元件组的第一等位基因(等位基因-1)。命名为EXP-Zm.UbqM1：1：6(SEQ ID NO：137)和EXP-Zm.UbqM1：1：10(SEQ ID NO：139)的EXP序列表示第一等位基因(等位基因-1)，两个EXP之间仅有的差异出现在3’内含子剪接点的序列5’-AG-3’之后的各相应内含子的最后3’核苷酸中。命名为EXP-Zm.UbqM1：1：4(SEQ ID NO：45)的EXP序列表示墨西哥玉米Ubq1基因转录调控表达元件组的第二等位基因(等位基因-2)。命名为EXP-Zm.UbqM1：1：7(SEQ ID NO：141)和EXP-Zm.UbqM1：1：12(SEQ ID NO：143)的EXP序列表示第二等位基因(等位基因-2)，两个EXP之间仅有的差异出现在3’内含子剪接点的序列5’-AG-3’后的各相应内含子的最后3’核苷酸中。EXP序列EXP-Zm.UbqM1：1：2(SEQ ID NO：49)和EXP-Zm.UbqM1：1：5(SEQ ID NO：53)表示墨西哥玉米Ubq1基因转录调控表达元件组的第三等位基因(等位基因-3)，并且在其各自的内含子内的位置1034处包含单核苷酸差异(I-Zm.UbqM1-1：1：11(SEQ ID NO：52)为G和I-Zm.UbqM1-1：1：12(SEQ ID NO：54)为T)。命名为EXP-Zm.UbqM1：1：8(SEQ ID NO：145)、EXP-Zm.UbqM1：1：9(SEQ ID NO：147)、EXP-Zm.UbqM1：1：11(SEQ ID NO：149)和EXP-Zm.UbqM1：1：13(SEQ ID NO：181)的EXP序列也表示第三等位基因(等位基因-3)。EXP-Zm.UbqM1：1：9的内含子，I-Zm.UbqM1-1：1：16(SEQ ID NO：148)，在位置1034处包含胸腺嘧啶残基，而EXP-Zm.UbqM1：1：8、EXP-Zm.UbqM1：1：11和EXP-Zm.UbcM1：1：13的内含子(I-Zm.UbqM1-1：1：15，SEQ ID NO：146；I-Zm.UbqM1-1：1：18，SEQID NO：11和I-Zm.UbqM1-1：1：20，SEQ ID NO：182)各自在位置1034处包含鸟嘌呤残基。此外，EXP-Zm.UbqM1：1：8(SEQ ID NO：145)和EXP-Zm.UbqM1：1：9(SEQ ID NO：147)的最后3个3’端核苷酸不同于EXP-Zm.UbqM1：1：11(SEQ ID NO：149)和EXP-Zm.UbqM1：1：13(SEQ IDNO：181)的那些。
实施例2：玉米原生质体中驱动GUS的调控元件的分析
用含有驱动β-葡糖苷酸酶(GUS)转基因表达的EXP序列的植物表达载体转化玉米叶原生质体，并与其中通过已知组成型启动子驱动GUS表达的叶原生质体中的GUS表达相比较。
将通过EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)、EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)、EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)或EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)驱动的转基因的表达与来自已知组成型启动子的表达相比较。将上述的EXP序列克隆至以下表3中所示的植物表达载体中，以产生其中EXP序列可操作地5’连接β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因的载体，其包含源自马铃薯光诱导型组织特异性ST-LS1基因(GenBank登录号：X04753)的可加工内含子(称为GUS-2，SEQ ID NO：160)或连续的GUS编码序列(GUS-1，SEQ ID NO：159)(其可操作地5’连接源自根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因(T-AGRtu.nos-1：1：13，SEQ ID NO：161)或小麦Hsp17基因(T-Ta.Hsp17-1：1：1，SEQ ID NO：162)的3’UTR)。
表3.用于玉米叶原生质体转化的GUS植物表达质粒构建体和相应的EXP序列、GUS编码序列和3’UTR。“SEQ ID NO：”指的是给定的EXP序列。
用于比较的对照质粒(pMON19469、pMON65328、pMON25455和pMON122605)按照以上所述构建并且分别含有可操作地5’连接GUS编码序列和3’UTR的已知EXP序列：EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)、EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：163)、EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)或EXP-Os.TubA-3：1：1(SEQ ID NO：165)。提供三个另外的对照以评价背景GUS和荧光素酶表达：无DNA对照、不是为转基因表达设计的空载体和用于表达绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体。
还使用本领域已知的方法构建了两个质粒用于共转化和数据的标准化。各个质粒含有通过组成型EXP序列驱动的特定荧光素酶编码序列。植物载体pMON19437包含含有可操作地5’连接内含子的组成型启动子的转基因盒，(EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1，SEQ IDNO：170)，其可操作地5’连接萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶编码序列(LUCIFERASE：1：3，SEQ ID NO：166)，可操作地5’连接来自根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的3’UTR(T-AGRtu.nos-1：1：13，SEQ ID NO：161)。植物载体pMON63934包含含有组成型EXP序列的转基因盒(EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1，SEQ ID NO：168)，其可操作地5’连接海肾(Renillareniformis)荧光素酶编码序列(CR-Ren.hRenilla Lucife-0：0：1，SEQ ID NO：167)，可操作地5’连接来自根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的3’UTR(T-AGRtu.nos-1：1：13，SEQ ID NO：161)。
如本领域公知的，使用基于PEG的转化方法来转化玉米叶原生质体。用pMON19437质粒DNA、pMON63934质粒DNA和等摩尔量的表3中呈现的质粒之一转化原生质体细胞，并在完全黑暗下孵育过夜。通过将如上转化的细胞的溶解制备物的等份试样放入两个不同的小孔托盘中来进行GUS和荧光素酶两者的测量。一个托盘用于GUS测量，而第二个托盘用于进行双重荧光素酶试验，其使用双重荧光素酶报告基因分析系统(Promega Corp.，Madison，WI；参见，例如，Promega Notes Magazine，No：57，1996，p.02)。对于每个EXP序列进行一次或两次转化，并且从来自各个转化实验的几个样品测定各个EXP序列的平均表达值。使用每个EXP序列构建体转化的四次重复，或可选地，两个转化实验中的每一个实验对于各个EXP序列构建体的三次重复，来进行样品测量。表4中提供了平均GUS和荧光素酶表达水平。在该表中，在标为“FLuc”的一栏中提供了萤火虫荧光素酶值(例如，来自pMON19437的表达)，在标为“RLuc”的一栏中提供了海肾荧光素酶值。
表4.转化的玉米叶原生质体细胞中的平均GUS和荧光素酶活性。
为了比较各个EXP序列的相对活性，将GUS值表示为GUS与荧光素酶活性的比值，并且相对于对EXP序列EXP-Os.TubA-3：1：1(SEQ ID NO：165)观察到的表达水平进行标准化。以下的表5显示了相对于玉米原生质体中的EXP-Os.TubA-3：1：1表达标准化的GUS/RLuc表达比率。
如表5中看到的，通过EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)、EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)、EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)或EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ IDNO：27)驱动的GUS表达比通过EXP-Os.TubA-3：1：1(SEQ ID NO：165)驱动的GUS表达高4.51至9.42倍。通过EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)、EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)、EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)或EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)驱动的GUS表达也高于EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)、EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：163)或EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)驱动的表达。
表5.玉米叶原生质体细胞中相对于EXP-Os.TubA-3：1：1表达的GUS/RLuc倍数表达
以下的表6显示了玉米原生质体中相对于EXP-Os.TubA-3：1：1表达标准化的GUS/FLuc表达比率。
表6.玉米叶原生质体细胞中相对于EXP-Os.TubA-3：1：1表达的GUS/FLuc倍数表达
如表6中看到的，通过EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)、EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)、EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)或EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ IDNO：27)驱动的GUS表达证明了作为GUS/FLuc比率表示并且相对于EXP-Os.TubA-3：1：1(SEQID NO：165)标准化时相同的总趋势。表达比由EXP-Os.TubA-3：1：1(SEQ ID NO：165)驱动的GUS表达高12.69至32.86倍。通过EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)，EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)，EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)或EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ IDNO：27)驱动的GUS表达在特定的比较中也高于EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ IDNO：170)、EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：163)或EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)驱动的表达。
实施例3：使用GUS转基因盒扩增子分析玉米原生质体中驱动GUS的调控元件。
用源自含有驱动β-葡糖苷酸酶(GUS)转基因表达的EXP序列的植物表达载体的DNA扩增子转化玉米叶原生质体，并且与其中通过以下一系列实验中呈现的由已知组成型启动子驱动的GUS表达的叶原生质体相比较。
在第一组实验中，按照以上所述，用从包含GUS转基因盒的植物表达载体的扩增产生的扩增子转化源自叶组织的玉米原生质体细胞，以将通过EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ IDNO：5)，EXP-ANDge.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：10)，EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)，EXP-ANDge.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：14)，EXP-ANDge.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：16)，EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)，EXP-ERIra.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：25)，EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)，EXP-ERIra.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：29)，EXP-ERIra.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：31)，EXP-SETit.Ubq1：1：5(SEQ ID NO：117)，EXP-SETit.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：123)，EXP-SETit.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：124)，EXP-Sv.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：128)，EXP-Sv.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：132)，EXP-Sv.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：134)，EXP-Zm.UbqM1：1：6(SEQ ID NO：137)，EXP-Zm.UbqM1：1：7(SEQ ID NO：141)，EXP-Sb.Ubq4：1：2(SEQ ID NO：151)，EXP-Sb.Ubq6：1：2(SEQ ID NO：153)和EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)之一驱动的转基因(GUS)的表达与已知组成型启动子驱动的表达相比较。使用本领域已知的方法，将包含从其产生转基因盒扩增子的扩增模板的各个EXP序列克隆至以下表7中标题“扩增子模板”下所示的植物表达载体中。所得到的植物表达载体包含由EXP序列组成的转基因盒，所述EXP序列可操作地5’连接含有可加工的内含子(如以上实施例2中讨论的“GUS-2”)或连续GUS编码序列(如上讨论的“GUS-1”)的β-葡糖苷酸酶(GUS)编码序列，其可操作地5’连接也是如上所述的3′UTRT-AGRtu.nos-1：1：13或T-Ta.Hsp17-1：1：1。使用以下表7中呈现的质粒构建体模板，使用本领域技术人员已知的方法来产生扩增子。简而言之，设计5’寡核苷酸引物以使其与启动子序列退火，并且将在3’UTR的3’端退火的3’寡核苷酸引物用于各个转基因盒的扩增。通过使用设计成在包含各个扩增子模板的启动子序列内的不同位置退火的不同寡核苷酸引物，将连续的5’删除引入包含转基因盒的启动子序列中，以产生不同的EXP序列。
表7.用于玉米叶原生质体转化的GUS植物表达扩增子和相应的质粒构建体扩增子模板、EXP序列、GUS编码序列和3’UTR。
表7中列为扩增子模板的质粒构建体用作用于包含表7中所列EXP序列的转基因表达盒的扩增中的模板。按照之前所述的，用实施例2中所述的已知组成型EXP序列来构建用于产生用于比较的GUS转基因扩增子的对照质粒。还使用了用于测定GUS和荧光酶背景的阴性对照、无DNA对照和其中在转化中连同不表达编码序列的质粒DNA使用两个荧光素酶质粒的对照样品。还使用了如实施例2中讨论的质粒pMON19437和pMON63934以用于共转化和数据的标准化。
按照以上实施例2中所述的，使用基于PEG的转化方法来转化玉米叶原生质体。以下的表8显示了对于各个转基因盒测定的平均GUS和荧光素酶表达值。
表8.转化的玉米叶原生质体细胞中的平均GUS和荧光素酶活性。
为了比较各个EXP序列的相对活性，将GUS值表示为GUS与荧光素酶活性的比率，并且相对于对EXP-Os.Act1：1：1和EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1观察到的表达水平进行标准化。以下的表9显示了玉米原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：1和EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1驱动的表达标准化的GUS/RLuc表达比率。以下的表10显示了玉米原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：1和EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1驱动的表达标准化的GUS/FLuc表达比率。
表9.玉米原生质体中相对于EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1(SEQ IDNO：163)标准化的GUS/RLuc和GUS/FLuc表达比率。
表10.玉米原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)标准化的GUS/RLuc和GUS/FLuc表达比率。
如在表9和10中看到的，几乎所有EXP序列能够驱动玉米细胞中的GUS转基因表达。与通过EXP-Os.Act1：1：1或EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1驱动的GUS表达相比，EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)、EXP-ANDge.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：10)、EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)、EXP-ANDge.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：14)、EXP-ANDge.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：16)、EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)、EXP-ERIra.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：25)、EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)、EXP-ERIra.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：29)、EXP-ERIra.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：31)、EXP-SETit.Ubq1：1：5(SEQ ID NO：117)、EXP-SETit.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：123)、EXP-SETit.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：124)、EXP-Sv.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：128)、EXP-Sv.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：132)、EXP-Sv.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：134)、EXP-Zm.UbqM1：1：6(SEQ ID NO：137)、EXP-Zm.UbqM1：1：7(SEQ ID NO：141)、EXP-Sb.Ubq4：1：2(SEQ ID NO：151)、EXP-Sb.Ubq6：1：2(SEQ ID NO：153)和EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)的平均GUS表达较高。
在第二组实验中，将包含EXP序列EXP-Zm.UbqM1：1：8(SEQ ID NO：145)的GUS盒扩增子与对照扩增子PCR0145942(EXP-Os.Act1：1：9，SEQ ID NO：179)和PCR0145944(EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1，SEQ ID NO：170)进行关于GUS表达的比较。通过EXP序列EXP-Zm.UbqM1：1：8驱动的GUS表达比两个对照的表达高。以下的表11显示了对于每个扩增子测定的平均GUS和荧光素酶值。以下的表12显示了玉米原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：9和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1驱动的表达标准化的GUS/RLuc和GUS/FLuc表达比率。
表11.转化的玉米叶原生质体细胞中的平均GUS和荧光素酶活性。
表12.玉米叶原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)标准化的GUS/RLuc和GUS/FLuc表达比率。
在第三组实验中，扩增子GUS转基因盒按照以上所述的制备，并且分析通过EXP序列EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)、EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)、EXP-Cl.Ubq1：1：13(SEQ ID NO：114)、EXP-Cl.Ubq1：1：14(SEQ ID NO：115)和EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ IDNO：116)驱动的表达。扩增子由可操作地连接GUS-1编码序列的EXP序列组成，所述GUS-1编码序列可操作地连接T-AGRtu.nos-1：1：133′UTR。将表达与对照EXP-Os.Act1：1：9(SEQ IDNO：179)和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)进行比较。以下的表13显示了对于各个扩增子测定的平均GUS和荧光素酶值。以下的表14显示了玉米原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：9和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1驱动的表达标准化的GUS/RLuc表达比率。
表13.转化的玉米叶原生质体细胞中的平均GUS和荧光素酶活性。
表14.玉米叶原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)标准化的GUS/RLuc和GUS/FLuc表达比率。
如在以上的表14中看到的，EXP序列EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)、EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)、EXP-Cl.Ubq1：1：13(SEQ ID NO：114)、EXP-Cl.Ubq1：1：14(SEQ ID NO：115)和EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ ID NO：116)能够驱动转基因表达。通过EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)、EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)、EXP-Cl.Ubq1：1：13(SEQ ID NO：114)和EXP-Cl.Ubq1：1：14(SEQ ID NO：115)驱动的表达比两个对照都高。通过EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ ID NO：116)驱动的表达低于EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQID NO：170)，但高于对照EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)。
在第四组实验中，按照以上所述的制备扩增子GUS转基因盒，并且分析通过EXP序列EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)、EXP-Cl.Ubq1：1：16(SEQ ID NO：93)和EXP-Cl.Ubq1：1：17(SEQ ID NO：97)驱动的表达。将表达与对照EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)相比。以下的表15显示了对各个扩增子测定的平均GUS和荧光素酶值。以下的表16显示了玉米原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：9和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1驱动的表达标准化的GUS/RLuc和GUS/FLuc表达比。
表15.转化的玉米叶原生质体细胞中的平均GUS和荧光素酶活性。
表16：玉米叶原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)标准化的GUS/RLuc和GUS/FLuc表达比率。
如表16中看到的，EXP序列EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)、EXP-Cl.Ubq1：1：16(SEQ ID NO：93)和EXP-Cl.Ubq1：1：17(SEQ ID NO：97)能够驱动转基因表达。通过各个EXP序列驱动的表达高于两个对照的表达。
在第五组实验中，按照以上所述的制备扩增子GUS转基因盒，并分析通过EXP序列EXP-Zm.UbqM1：1：11(SEQ ID NO：149)和EXP-Cl.Ubq1：1：23(SEQ ID NO：108)驱动的表达。将表达与对照EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)和EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：163)相比。以下的表17显示了对于各个扩增子测定的平均GUS和荧光素酶活性。以下的表18显示了玉米原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：9和EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1驱动的表达标准化的GUS/RLuc表达比率。
表17.转化的玉米叶原生质体细胞中的平均GUS和荧光素酶活性。
表18.玉米叶原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)和EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：163)标准化的GUS/RLuc表达比率。
如以上的表18中看到的，EXP序列EXP-Zm.UbqM1：1：11(SEQ ID NO：149)和EXP-Cl.Ubq1：1：23(SEQ ID NO：108)能够驱动玉米叶原生质体中的GUS表达。表达与对照EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)相似，但低于EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：163)。
可以在甘蔗叶原生质体中相似地研究调控元件驱动来自扩增子的GUS表达的功效。例如，可以用源自含有EXP序列(驱动β-葡糖苷酸酶(GUS)转基因的表达)的植物表达载体的DNA扩增子转化甘蔗原生质体，并与其中GUS的表达通过已知组成型启动子驱动的叶原生质体相比较。同样，可以在玉米或小麦原生质体中相似地研究驱动来自扩增子的CP4表达的调控元件。
实施例4：使用GUS转基因盒扩增子分析小麦原生质体中驱动GUS的调控元件。
用源自含有EXP序列(驱动β-葡糖苷酸酶(GUS)转基因的表达)的植物表达载体的DNA扩增子转化小麦叶原生质体，并与其中GUS的表达通过已知组成型启动子驱动的叶原生质体相比较。
使用本领域已知的方法，用从包含植物GUS转基因盒的表达载体的扩增产生的扩增子转化源自叶组织的小麦原生质体细胞，以使用之前的实施例(实施例3)中所述的方法，利用用于以上实施例3中的玉米的分析的相同GUS盒扩增子，将通过表10-11中列出的EXP序列驱动的转基因(GUS)表达与已知组成型启动子驱动的表达进行比较。用于小麦原生质体转化的对照GUS盒扩增子和荧光素酶质粒也与之前的实施例中给出的以及以上实施例3中的表7提供的那些相同。同样，如上所述，将阴性对照用于GUS和荧光素酶背景的测定。按照以上实施例3中所述的，使用基于PEG的转化方法来转化小麦叶原生质体。表19列出了在转化的小麦叶原生质体细胞中看到的平均GUS和LUC活性，而表20显示了小麦原生质体中标准化的GUS/RLuc表达比率。
表19.转化的小麦叶原生质体细胞中的平均GUS和荧光素酶活性。
表20.小麦叶原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)和EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：163)标准化的GUS/RLuc表达比率。
如以上表20中看到的，几乎所有EXP序列能够驱动小麦细胞中的GUS转基因表达。通过EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)、EXP-ANDge.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：10)，EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)，EXP-ANDge.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：14)，EXP-ANDge.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：16)，EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)，EXP-ERIra.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：25)，EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)，EXP-ERIra.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：29)，EXP-ERIra.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：31)，EXP-SETit.Ubq1：1：5(SEQ ID NO：117)，EXP-SETit.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：123)，EXP-SETit.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：124)，EXP-Sv.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：128)，EXP-Sv.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：132)，EXP-Sv.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：134)，EXP-Zm.UbqM1：1：6(SEQ ID NO：137)，EXP-Zm.UbqM1：1：7(SEQ ID NO：141)，EXP-Sb.Ubq4：1：2(SEQ ID NO：151)，EXP-Sb.Ubq6：1：2(SEQ ID NO：153)和EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)驱动的GUS转基因表达比EXP-Os.Act1：1：9驱动的GUS表达高得多。小麦叶原生质体细胞中扩增子相对于EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1的GUS表达与玉米原生质体细胞中观察到的表达略有不同。EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)，EXP-ANDge.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：10)，EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)，EXP-ANDge.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：14)，EXP-ANDge.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：16)，EXP-ERIra.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：25)，EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)，EXP-ERIra.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：31)，EXP-SETit.Ubq1：1：5(SEQ ID NO：117)，EXP-SETit.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：123)，EXP-SETit.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：124)，EXP-Sv.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：128)，EXP-Sv.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：132)，EXP-Sv.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：134)，EXP-Zm.UbqM1：1：6(SEQ ID NO：137)，EXP-Zm.UbqM1：1：7(SEQ ID NO：141)和EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)中每一个都显示了相对于EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1的较高的GUS表达水平。EXP序列EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)，EXP-ERIra.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：29)，EXP-Sb.Ubq4：1：2(SEQ ID NO：151)和EXP-Sb.Ubq6：1：2(SEQ ID NO：153)显示了相对于EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1的较低的GUS表达水平。
在第二组实验中，按照以上所述的制备扩增子GUS转基因盒，并且分析通过EXP序列EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)，EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：13(SEQ ID NO：114)，EXP-Cl.Ubq1：1：14(SEQ ID NO：115)和EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ IDNO：116)驱动的表达。扩增子由可操作地连接GUS-1编码序列的EXP序列组成，所述GUS-1编码序列可操作地连接T-AGRtu.nos-1：1：133′UTR。将表达与对照EXP-Os.Act1：1：9(SEQ IDNO：179)和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)进行比较。以下的表21显示了对于各个扩增子测定的平均GUS和荧光素酶值。以下的表22显示了小麦原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：9和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1驱动的表达标准化的GUS/RLuc表达比率。
表21.转化的小麦叶原生质体细胞中的平均GUS和荧光素酶活性。
表22.小麦叶原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)标准化的GUS/RLuc和GUS/FLuc表达比率。
如从以上表22中所看到的，EXP序列EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)，EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：13(SEQ ID NO：114)，EXP-Cl.Ubq1：1：14(SEQ ID NO：115)和EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ ID NO：116)能够驱动转基因表达。通过EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)，EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：13(SEQ ID NO：114)和EXP-Cl.Ubq1：1：14(SEQ ID NO：115)驱动的表达高于两个对照驱动的表达。通过EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ ID NO：116)驱动的表达低于EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)，但高于对照EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)。
在第三组实验中，按照以上所述的制备扩增子GUS转基因盒以分析通过EXP序列EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：16(SEQ ID NO：93)和EXP-Cl.Ubq1：1：17(SEQ ID NO：97)驱动的表达。将表达与对照EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)进行比较。以下的表23显示了对于各个扩增子测定的平均GUS和荧光素酶值。以下的表24显示了小麦原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：9和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1驱动的表达标准化的GUS/RLuc和GUS/FLuc表达比率。
表23.转化的小麦叶原生质体细胞中的平均GUS和荧光素酶活性
表24.小麦叶原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)标准化的GUS/RLuc和GUS/FLuc表达比率。
在以上的表24中可以看到，EXP序列EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：16(SEQ ID NO：93)和EXP-Cl.Ubq1：1：17(SEQ ID NO：97)能够驱动转基因表达。通过各个EXP序列驱动的表达高于两个对照驱动的表达。
在第四组实验中，按照以上所述的制备扩增子GUS转基因盒以分析通过EXP序列EXP-Zm.UbqM1：1：11(SEQ ID NO：149)和EXP-Cl.Ubq1：1：23(SEQ ID NO：108)驱动的表达。将表达与对照EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)和EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：163)进行比较。以下的表25显示了对于各个扩增子测定的平均GUS和荧光素酶值。以下的表26显示了小麦原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：9和EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1驱动的表达标准化的GUS/RLuc表达比率。
表25.转化的小麦叶原生质体细胞中的平均GUS和荧光素酶活性。
表26.小麦叶原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)和EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：163)标准化的GUS/RLuc表达比率。
在从以上的表26中可以看到的，EXP序列EXP-Zm.UbqM1：1：11(SEQ ID NO：149)和EXP-Cl.Ubq1：1：23(SEQ ID NO：108)能够驱动小麦叶原生质体中的GUS表达。表达与对照EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)驱动的表达相似，但低于EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：163)驱动的表达。
实施例5：使用GUS转基因盒扩增子分析甘蔗原生质体中驱动GUS的调控元件。
用源自含有EXP序列(驱动β-葡糖苷酸酶(GUS)转基因的表达)的植物表达载体的DNA扩增子转化甘蔗叶原生质体，并与其中GUS的表达通过已知组成型启动子驱动的叶原生质体相比较。
如以上实施例3中所述的，使用基于PEG的方法，用由包含GUS转基因盒的植物表达载体的扩增所产生的扩增子转化源自叶组织的甘蔗原生质体细胞，以将通过EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)，EXP-ANDge.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：10)，EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)，EXP-ANDge.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：14)，EXP-ANDge.Ubq1：1：12(SEQID NO：16)，EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)，EXP-ERIra.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：25)，EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)，EXP-ERIra.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：29)，EXP-ERIra.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：31)，EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：13(SEQ ID NO：114)，EXP-Cl.Ubq1：1：14(SEQ ID NO：115)和EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ ID NO：116)之一以及以下表27中呈现的EXP序列驱动的转基因(GUS)的表达与已知组成型启动子驱动的表达进行比较。
表27.GUS植物表达扩增子及相应的质粒构建体扩增子模板和EXP序列。
用于甘蔗原生质体转化的对照GUS盒扩增子和荧光素酶质粒也与实施例2至4中呈现的以及以上实施例3的表7中提供的那些相同。同样，如上所述，将阴性对照用于测定GUS和荧光素酶背景。表28列出了转化的甘蔗叶原生质体细胞中看到的平均GUS和Luc活性，而表29显示了甘蔗叶原生质体中标准化的GUS/RLuc表达比率。
表28.转化的甘蔗叶原生质体细胞中的平均GUS和荧光素酶活性。
表29.甘蔗叶原生质体中相对于EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)和EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)标准化的GUS/RLuc和GUS/FLuc表达比率。
在以上的表29中可以看到，EXP序列EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)，EXP-ANDge.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：10)，EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)，EXP-ANDge.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：14)，EXP-ANDge.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：16)，EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)，EXP-ERIra.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：25)，EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)，EXP-ERIra.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：29)，EXP-ERIra.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：31)，EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：13(SEQ ID NO：114)，EXP-Cl.Ubq1：1：14(SEQ ID NO：115)和EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ ID NO：116)全部能够驱动甘蔗叶原生质体中的转基因表达。在这个实验中，EXP序列EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)，EXP-ANDge.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：10)，EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)，EXP-ANDge.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：14)，EXP-ANDge.Ubq1：1：12(SEQID NO：16)，EXP-ERIra.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：25)，EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)，EXP-ERIra.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：31)，EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：13(SEQ ID NO：114)和EXP-Cl.Ubq1：1：14(SEQ ID NO：115)表达的GUS高于EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)。
实施例6：玉米原生质体中驱动CP4的调控元件的分析。
该实施例证明了EXP-Sv.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：128)，EXP-Sv.Ubq1：1：8(SEQ IDNO：132)，EXP-Sv.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：133)，EXP-Zm.UbqM1：1：6(SEQ ID NO：137)，EXP-Zm.UbqM1：1：8(SEQ ID NO：145)，EXP-Zm.UbqM1：1：7(SEQ ID NO：141)，EXP-SETit.Ubq1：1：5(SEQ ID NO：117)，EXP-SETit.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：123)，EXP-SETit.Ubq1：1：6(SEQ IDNO：124)，EXP-Sb.Ubq4：1：2(SEQ ID NO：151)和EXP-Sb.Ubq6：1：2(SEQ ID NO：153)在玉米原生质体中驱动草甘膦耐受性基因CP4表达的能力。使用本领域已知的方法，将这些EXP序列克隆至植物二元转化质粒构建体中。所得到的植物表达载体含有来自根癌农杆菌的右边界区、可操作地5’连接质体靶向的草甘膦耐受性EPSPS编码序列(CP4，US RE39247)(其可操作地5’连接T-AGRtu.nos-1：1：133'UTR)的泛素EXP序列和来自根癌农杆菌的左边界区(B-AGRtu.左边界)。使用本领域已知的方法，将所得到的质粒构建体用于转化玉米叶原生质体细胞。
使用具有表1中限定的EXP序列的表30中所列的质粒构建体。构建了三个对照质粒(pMON30098、pMON42410和pMON30167)，其具有已知的驱动CP4或GFP的组成型调控元件，并将这三个对照质粒用于由这些EXP序列驱动的相对CP4表达水平与已知的组成型表达元件驱动的CP4表达的比较。按照以上所述的，还使用了两个其他的质粒(pMON19437和pMON63934)以评价转化效率和存活力。各个质粒含有由组成型EXP序列驱动的特定荧光素酶编码序列。
按照以上实施例2中所述的，使用基于PEG的转化方法来转化玉米叶原生质体。与以上实施例2相似地进行CP4和荧光素酶的测量。以下表30中显示了以百万分之一(ppm)表示的CP4蛋白表达的平均水平。
表30.玉米叶原生质体中的平均CP4蛋白表达。
如表30中可以看到的，EXP-Sv.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：128)，EXP-Sv.Ubq1：1：8(SEQID NO：132)，EXP-Sv.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：133)，EXP-Zm.UbqM1：1：6(SEQ ID NO：137)，EXP-Zm.UbqM1：1：8(SEQ ID NO：145)，EXP-Zm.UbqM1：1：7(SEQ ID NO：141)，EXP-SETit.Ubq1：1：5(SEQ ID NO：117)，EXP-SETit.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：123)，EXP-SETit.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：124)和EXP-Sb.Ubq6：1：2(SEQ ID NO：153)以接近于或高于EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1和EXP-Os.Act1：1：1驱动的CP4表达水平的水平驱动CP4转基因的表达。EXP序列EXP-Sb.Ubq4：1：2(SEQ ID NO：151)显示了驱动CP4表达的能力，但表达水平低于组成型对照的水平。
从用以上所述的质粒构建体稳定转化的植物也可以获得与以上相似的数据，例如，后代世代R0、R1或F1或更后世代的植物。同样，可以研究来自其它质粒构建体的表达。例如，pMON141619包含EXP序列EXP-ANDge.Ubq1：1：8，而pMON142862由EXP序列EXP-ERIra.Ubq1：1：8组成。可以以这种方式分析这些和其他构建体。
实施例7：使用CP4转基因盒扩增子分析玉米原生质体中驱动CP4的调控元件。
该实施例证明了EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)，EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQID NO：8)，EXP-ANDge.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：10)，EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)，EXP-ANDge.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：14)，EXP-ANDge.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：16)，EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)，EXP-ERIra.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：25)，EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)，EXP-ERIra.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：29)，EXP-ERIra.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：31)，EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：13(SEQ ID NO：114)，EXP-Cl.Ubq1：1：14(SEQ ID NO：115)，EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ ID NO：116)，EXP-Cl.Ubq1：1：16(SEQ ID NO：93)和EXP-Cl.Ubq1：1：17(SEQ ID NO：97)在玉米原生质体中驱动草甘膦耐受性基因CP4的表达的能力。将这些EXP序列克隆至植物二元转化质粒构建体中。将所得到的植物表达载体用作扩增模板来产生转基因盒扩增子，其由泛素可操作地5’连接质体靶向的草甘膦耐受性EPSPS编码序列(CP4，US RE39247)的EXP序列和来自根癌农杆菌的左边界区组成，该草甘膦耐受性EPSPS编码序列可操作地5’连接T-AGRtu.nos-1：1：133’UTR。将所得到的质粒构建体用于转化玉米叶原生质体细胞。
按照以上实施例2中所述的，使用基于PEG的转化方法来转化玉米叶原生质体。使用基于ELISA的试验来进行两种CP4的测量。以下表31和32中显示了以百万分之一(ppm)表示的CP4蛋白表达的平均水平。
在第一个系列的实验中，在转化的玉米叶原生质体中分析通过由EXP序列EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)，EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)，EXP-ANDge.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：10)，EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)，EXP-ANDge.Ubq1：1：11(SEQ IDNO：14)，EXP-ANDge.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：16)，EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)，EXP-ERIra.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：25)，EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)，EXP-ERIra.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：29)，EXP-ERIra.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：31)，EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：13(SEQ ID NO：114)，EXP-Cl.Ubq1：1：14(SEQ IDNO：115)和EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ ID NO：116)构成的扩增子驱动的CP4表达，并且与组成型对照EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)和EXP-Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：164)驱动的CP4表达水平相比较。以下表31中显示了以百万分之一(ppm)表示的CP4蛋白表达的平均水平。
表31.玉米叶原生质体中的平均CP4蛋白表达。
如以上表31中可看到的，EXP序列EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)，EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)，EXP-ANDge.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：10)，EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)，EXP-ANDge.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：14)，EXP-ANDge.Ubq1：1：12(SEQID NO：16)，EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)，EXP-ERIra.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：25)，EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)，EXP-ERIra.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：29)，EXP-ERIra.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：31)，EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：13(SEQ ID NO：114)，EXP-Cl.Ubq1：1：14(SEQ ID NO：115)和EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ ID NO：116)能够驱动CP4表达。所有EXP序列以比组成型对照EXP-Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：164)高得多的水平驱动CP4表达，除了一个EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ ID NO：116)。表达水平低于EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)的水平。
在第二个系列的实验中，在转化的玉米叶原生质体中分析由EXP序列EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：16(SEQ ID NO：93)和EXP-Cl.Ubq1：1：17(SEQ ID NO：97)构成的扩增子驱动的CP4表达，并且与组成型对照EXP-Os.Act1：1：1(SEQID NO：164)驱动的CP4表达水平相比较。以下表32中显示了以百万分之一(ppm)表示的CP4蛋白表达的平均水平。
表32.玉米叶原生质体中的平均CP4蛋白表达。
如以上表32中可以看到的，EXP序列EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：16(SEQ ID NO：93)和EXP-Cl.Ubq1：1：17(SEQ ID NO：97)能够驱动CP4表达。所有三个EXP序列驱动的表达水平都高于组成型对照EXP-Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：164)的水平。
实施例8：小麦原生质体中驱动CP4的调控元件的分析。
该实施例证明了EXP-Sv.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：128)，EXP-Sv.Ubq1：1：8(SEQ IDNO：132)，EXP-Sv.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：133)，EXP-Zm.UbqM1：1：6(SEQ ID NO：137)，EXP-Zm.UbqM1：1：8(SEQ ID NO：145)，EXP-Zm.UbqM1：1：7(SEQ ID NO：141)，EXP-SETit.Ubq1：1：5(SEQ ID NO：117)，EXP-SETit.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：123)，EXP-SETit.Ubq1：1：6(SEQ IDNO：124)，EXP-Sb.Ubq4：1：2(SEQ ID NO：151)和EXP-Sb.Ubq6：1：2(SEQ ID NO：153)驱动小麦叶原生质体中的CP4表达的能力。使用本领域已知的以及以上实施例2和5中所描述的方法，将这些EXP序列克隆至植物二元转化质粒构建体中。
按照实施例5中所概述的，构建了三个对照质粒(pMON30098，pMON42410，如之前所述，以及pMON43647，其包含来自根癌农杆菌的右边界区、可操作地5’连接质体靶向的草甘膦耐受性EPSPS编码序列(CP4，US RE39247)(其可操作地5’连接T-AGRtu.nos-1：1：133’UTR)的EXP-Os.Act1+CaMV.35S.2xA1-B3+Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：138)和具有驱动CP4或GFP的已知组成型调控元件的左边界区(B-AGRtu.左边界))。
按照之前实施例中所述的，使用基于PEG的转化方法来转化小麦叶原生质体，除了每次试验使用1.5×105个原生质体细胞。按照以上实施例6中所述的，进行了荧光素酶和CP4转基因表达的分析。以下表34中呈现了通过CP4ELISA测定的平均CP4表达水平。
表34.小麦叶原生质体细胞中的平均CP4蛋白表达。
与玉米原生质体相比时，小麦原生质体中通过EXP序列和已知的组成型EXP序列EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1驱动的CP4表达的总量证明了小麦原生质体中不同的CP4表达水平。
几个EXP序列在小麦原生质体中以低于已知的组成型EXP序列EXP-Os.Act1+CaMV.35S.2xA1-B3+Os.Act1：1：1和EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1的水平驱动CP4表达。在该试验中，两个EXP序列，EXP-Zm.UbqM1：1：6(SEQ ID NO：137)和EXP-SETit.Ubq1：1：5(SEQ ID NO：117)在小麦原生质体中提供了高于已知的组成型EXP序列的CP4表达水平。EXP-Zm.UbqM1：1：2以最高水平驱动CP4表达，其中表达水平分别比EXP-Os.Act1+CaMV.35S.2xA1-B3+Os.Act1：1：1和EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1高2.2至3.4倍。所分析的所有EXP序列证明了在小麦细胞中驱动CP4表达的能力。
实施例9：使用CP4转基因表达盒扩增子分析小麦原生质体中驱动CP4的调控元件。
该实施例证明了EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)，EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQID NO：8)，EXP-ANDge.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：10)，EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)，EXP-ANDge.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：14)，EXP-ANDge.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：16)，EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)，EXP-ERIra.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：25)，EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)，EXP-ERIra.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：29)，EXP-ERIra.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：31)，EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：13(SEQ ID NO：114)，EXP-Cl.Ubq1：1：14(SEQ ID NO：115)，EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ ID NO：116)，EXP-Cl.Ubq1：1：16(SEQ ID NO：93)和EXP-Cl.Ubq1：1：17(SEQ ID NO：97)在小麦原生质体中驱动草甘膦耐受性基因CP4表达的能力。将这些EXP序列克隆至植物二元转化质粒构建体中。将所得到的植物表达载体用作扩增模板来产生转基因盒扩增子，其由泛素EXP序列和来自根癌农杆菌的左边界区组成，所述EXP序列可操作地5’连接质体靶向的草甘膦耐受性EPSPS编码序列(CP4，US RE39247)，其可操作地5’连接T-AGRtu.nos-1：1：133’UTR。将所得到的扩增子用于转化玉米叶原生质体细胞。
按照以上实施例2中所述的，使用基于PEG的转化方法来转化小麦叶原生质体。使用基于ELISA的试验来进行两种CP4的测量。以下表35和36中显示了以百万分之一(ppm)表示的CP4蛋白表达的平均水平。
在第一个系列的实验中，在转化的小麦叶原生质体中分析通过由EXP序列EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)，EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)，EXP-ANDge.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：10)，EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)，EXP-ANDge.Ubq1：1：11(SEQ IDNO：14)，EXP-ANDge.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：16)，EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)，EXP-ERIra.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：25)，EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)，EXP-ERIra.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：29)，EXP-ERIra.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：31)，EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：13(SEQ ID NO：114)，EXP-Cl.Ubq1：1：14(SEQ IDNO：115)和EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ ID NO：116)组成的扩增子驱动的CP4表达，并且与组成型对照EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)和EXP-Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：164)驱动的CP4表达水平相比较。以下表35中显示了以百万分之一(ppm)表示的CP4蛋白表达的平均水平。
表35.小麦叶原生质体中的平均CP4蛋白。
如以上的表31中可以看到的，EXP序列EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)，EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)，EXP-ANDge.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：10)，EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)，EXP-ANDge.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：14)，EXP-ANDge.Ubq1：1：12(SEQID NO：16)，EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)，EXP-ERIra.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：25)，EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)，EXP-ERIra.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：29)，EXP-ERIra.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：31)，EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：13(SEQ ID NO：114)，EXP-Cl.Ubq1：1：14(SEQ ID NO：115)和EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ ID NO：116)能够驱动CP4表达。所有EXP序列以比组成型对照EXP-Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：164)高得多的水平来驱动CP4表达水平，除了一个例外EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ ID NO：116)。对于大部分EXP序列，表达水平为EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)大致相同的水平，或低于EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)的水平。
在第二个系列的实验中，在转化的小麦叶原生质体中分析了由EXP序列EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：16(SEQ ID NO：93)和EXP-Cl.Ubq1：1：17(SEQ ID NO：97)组成的扩增子驱动的CP4表达，并且与组成型对照EXP-Os.Act1：1：1(SEQID NO：164)驱动的CP4表达水平相比较。以下表32中显示了以百万分之一(ppm)表示的CP4蛋白表达的平均水平。
表36.小麦叶原生质体中的平均CP4蛋白表达。
如以上表36中可以看到的，EXP序列EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：16(SEQ ID NO：93)和EXP-Cl.Ubq1：1：17(SEQ ID NO：97)能够驱动CP4表达。所有三个EXP序列驱动的表达水平高于组成型对照EXP-Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：164)的水平。
实施例10：甘蔗原生质体中驱动CP4的调控元件的分析。
该实施例证明了EXP-Sv.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：128)，EXP-Sv.Ubq1：1：8(SEQ IDNO：132)，EXP-Sv.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：133)，EXP-Zm.UbqM1：1：6(SEQ ID NO：137)，EXP-Zm.UbqM1：1：8(SEQ ID NO：145)，EXP-Zm.UbqM1：1：7(SEQ ID NO：141)，EXP-SETit.Ubq1：1：5(SEQ ID NO：117)，EXP-SETit.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：123)，EXP-SETit.Ubq1：1：6(SEQ IDNO：124)，EXP-Sb.Ubq4：1：2(SEQ ID NO：151)，EXP-Sb.Ubq6：1：2(SEQ ID NO：153)和EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)在甘蔗叶原生质体中驱动CP4表达的能力。将EXP序列克隆至植物二元转化质粒构建体中。所得到的载体含有来自根癌农杆菌的右边界区、可操作地5’连接质体靶向的草甘膦耐受性EPSPS编码序列(CP4，US RE39247)(其可操作地5’连接T-AGRtu.nos-1：1：13(SEQ ID NO：127)或T-CaMV.35S-1：1：1(SEQ ID NO：140)3′UTR)的泛素EXP序列和来自根癌农杆菌的左边界区(B-AGRtu.左边界)。使用PEG转化方法，将所得到的质粒构建体用于转化甘蔗叶原生质体细胞。
质粒构建体pMON129203，pMON12904，pMON12905，pMON129210，pMON129211，pMON129212，pMON129200，pMON129201，pMON129202，pMON129219和pMON129218描述于以上的表12中。
用驱动CP4的已知组成型调控元件构建了三个对照质粒(以上所述的pMON30167；也包含EXP-Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：164)的pMON130803和包含EXP-P-CaMV.35S-enh-1：1：13/L-CaMV.35S-1：1：2/I-Os.Act1-1：1：19(SEQ ID NO：139)的pMON132804)，并且用于比较通过以下表37中所列的泛素EXP序列驱动的相对CP4表达水平。
使用基于PEG的转化方法来转化甘蔗叶原生质体。以下表37中呈现了通过CP4ELISA测定的平均CP4表达水平。
表37.甘蔗叶原生质体细胞中的平均CP4蛋白表达。
如以上表37中可以看到的，EXP序列证明了在甘蔗原生质体中驱动CP4表达的能力。表达水平与由EXP-Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：164)驱动的CP4表达相似或更高。一个EXP序列，EXP-Zm.UbqM1：1：8(SEQ ID NO：145)，证明了在甘蔗原生质体中与EXP-P-CaMV.35S-enh-1：1：13/L-CaMV.35S-1：1：2/I-Os.Act1-1：1：19(SEQ ID NO：139)相比时更高的表达水平。
实施例11：使用CP4转基因盒扩增子分析甘蔗原生质体中驱动CP4的调控元件。
该实施例证明了EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)，EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQID NO：8)，EXP-ANDge.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：10)，EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)，EXP-ANDge.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：14)，EXP-ANDge.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：16)，EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)，EXP-ERIra.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：25)，EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)，EXP-ERIra.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：29)，EXP-ERIra.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：31)，EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：13(SEQ ID NO：114)，EXP-Cl.Ubq1：1：14(SEQ ID NO：115)和EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ ID NO：116)在甘蔗原生质体中驱动草甘膦耐受性基因CP4表达的能力。将这些EXP序列克隆至植物二元转化质粒构建体中。将所得到的植物表达载体用作扩增模板来产生转基因盒扩增子，其由泛素EXP序列和来自根癌农杆菌的左边界区组成，所述EXP序列可操作地5’连接质体靶向的草甘膦耐受性EPSPS编码序列(CP4，US RE39247)(其可操作地5’连接T-AGRtu.nos-1：1：133’UTR)。将所得到的扩增子用于转化甘蔗叶原生质体细胞。
按照以上实施例2中所述的，使用基于PEG的转化方法来转化甘蔗叶原生质体。使用基于ELISA的分析来进行两种CP4的测量。
在转化的甘蔗叶原生质体中分析通过由EXP序列EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ IDNO：5)，EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)，EXP-ANDge.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：10)，EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)，EXP-ANDge.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：14)，EXP-ANDge.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：16)，EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)，EXP-ERIra.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：25)，EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)，EXP-ERIra.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：29)，EXP-ERIra.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：31)，EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：13(SEQ ID NO：114)，EXP-Cl.Ubq1：1：14(SEQ IDNO：115)和EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ ID NO：116)组成的扩增子驱动的CP4表达，并且与组成型对照EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1(SEQ ID NO：170)和EXP-Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：164)驱动的CP4表达水平相比较。以下表38中显示了以百万分之一(ppm)表示的CP4蛋白表达的平均水平。
表38.甘蔗叶原生质体中的平均CP4蛋白表达。
如以上表38中可以看到的，EXP序列EXP-ANDge.Ubq1：1：7(SEQ ID NO：5)，EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)，EXP-ANDge.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：10)，EXP-ANDge.Ubq1：1：6(SEQ ID NO：12)，EXP-ANDge.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：14)，EXP-ANDge.Ubq1：1：12(SEQID NO：16)，EXP-ERIra.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：22)，EXP-ERIra.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：25)，EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)，EXP-ERIra.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：29)，EXP-ERIra.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：31)，EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Cl.Ubq1：1：13(SEQ ID NO：114)和EXP-Cl.Ubq1：1：14(SEQ ID NO：115)能够驱动CP4表达。EXP-Cl.Ubq1：1：15(SEQ ID NO：116)在该试验中没有显示出表达CP4表达。
实施例12：转基因玉米中驱动GUS的调控元件的分析。
用含有驱动β-葡糖苷酸酶(GUS)转基因表达的EXP序列的植物表达载体转化玉米植物，并且分析所得到植物的GUS蛋白表达。使用本领域已知的方法，将泛素EXP序列克隆至植物二元转化质粒构建体中。
所得到的植物表达载体含有来自根癌农杆菌的右边界区、用于测试EXP序列的第一转基因盒(所述EXP序列可操作地连接以上所述具有可加工内含子GUS-2的β-葡糖苷酸酶(GUS)编码序列，其可操作地5’连接来自水稻脂质转移蛋白基因的3’UTR(T-Os.LTP-1：1：1，SEQ ID NO：141))、用于选择赋予除草剂草甘膦抗性的转化植物细胞的第二转基因选择盒(通过水稻肌动蛋白1启动子驱动)和来自根癌农杆菌的左边界区。将所得到的质粒用于转化玉米植物。表39列出了质粒名称、EXP序列和SEQ ID NO(其也描述于表1中)。
表39.二元植物转化质粒和相关的EXP序列。
质粒构建体 EXP序列 SEQ ID NO： 数据
pMON142865 EXP-ANDge.Ubq1：1：8 8 R0和R1
pMON142864 EXP-ERIra.Ubq1：1：8 27 R0和R1
pMON142729 EXP-Cl.Ubq1：1：12 90 R0
pMON142730 EXP-Cl.Ubq1：1：11 95 R0
pMON132047 EXP-Cl.Ubq1：1：23 108 R0
pMON132037 EXP-SETit.Ubq1：1：10 119 R0和F1
pMON131957 EXP-SETit.Ubq1：1：11 125 F1
pMON131958 EXP-Sv.Ubq1：1：11 130 R0和F1
pMON131959 EXP-Sv.Ubq1：1：12 136 R0
pMON131961 EXP-Zm.UbqM1：1：10 139 R0
pMON131963 EXP-Zm.UbqM1：1：12 143 R0
pMON131962 EXP-Zm.UbqM1：1：11 149 R0
pMON132932 EXP-Sb.Ubq4：1：2 151 R0
pMON132931 EXP-Sb.Ubq6：1：3 155 R0
pMON132974 EXP-Sb.Ubq7：1：2 157 R0和F1
使用农杆菌介导的转化来转化植物，例如，如U.S.专利申请公开20090138985中所述的。
将组织化学GUS分析用于转化植物的定性表达分析。用GUS染色溶液X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-葡糖苷酸)(1毫克/毫升)孵育完整组织切片合适的时间长度，冲洗，并且目测检测蓝染色。通过使用选定的植物器官和组织的直接目视观察或在显微镜下观察来定性地测定GUS活性。研究R0植物在根和叶以及花粉囊、抽穗丝和发育中的种子和授粉后21天(21DAP)的胚芽中的表达。
对于定量分析，从转化玉米植物的选定组织提取总蛋白。在50微升的总反应体积中，将一微克的总蛋白用于荧光底物4-甲基伞形基-β-D-葡糖苷酸(MUG)。反应产物4-甲基伞形酮(4-MU)在高pH下荧光最大，其中羟基被离子化。加入碳酸钠的碱性溶液同时停止试验和调节pH以用于定量荧光产物。使用设定在激发2mm和发射3mm下的缝隙宽度，使用具有Micromax读数器的Fluoromax-3(Horiba；Kyoto，日本)在365nm的激发，445nm的发射下测量荧光。
对于各转化观察到的平均R0 GUS表达呈现于以下的表40和41中。对用pMON131957(EXP-SETit.Ubq1：1：11，SEQ ID NO：125)转化的转化体进行的R0GUS分析没有通过质量标准。在F1代分析了这些转化体，并且在该实施例中进一步呈现如下。
表40.根和叶组织中的平均R0GUS表达。
表41.玉米繁殖器官(花粉囊、抽穗丝)和发育的种子(胚芽和胚乳)中的平均R0GUS表达。
在R0玉米植物中，叶和根中的GUS表达水平在泛素EXP序列之间不同。尽管所有的EXP序列证明了在稳定转化的植物中驱动GUS转基因表达的能力，但各个EXP序列显示了相对于其他EXP序列的独特表达模式。例如，对于EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)和EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)在根发育的早期阶段(V4和V7)观察到了高水平的GUS表达，并且在VT阶段下降。EXP-Zm.UbqM1：1：10(SEQ ID NO：139)驱动的根表达显示在V3没有表达，但在V7表达是高的，然后到VT阶段下降。通过EXP-Zm.UbqM1：1：11(SEQ ID NO：149)驱动的根表达在从阶段V3、V7至VT的整个发育过程中保持相似水平。在用EXP-Cl.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：90)、EXP-Cl.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：95)和EXP-Cl.Ubq1：1：23(SEQ ID NO：108)转化的植物中，观察到根表达从早期发育(V3/V4)至V7阶段提高，然后从V7至V8阶段下降。GUS表达水平在叶组织中也显示出显著的不同。用EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)和EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)在早期发育(V3/V4)中产生了最高水平的叶表达，其在V7至VT阶段下降。使用EXP-Zm.UbqM1：1：10(SEQ ID NO：139)、EXP-Zm.UbqM1：1：11(SEQID NO：149)、EXP-Zm.UbqM1：1：12(SEQ ID NO：143)和EXP-Cl.Ubq1：1：23(SEQ ID NO：108)，GUS表达从V3至VT阶段保持；使用EXP-SETit.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：119)和EXP-Sb.Ubq6：1：3(SEQ ID NO：155)降至较低程度。使用EXP-Cl.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：90)、EXP-Cl.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：95)和EXP-Cl.Ubq1：1：23(SEQ ID NO：108)，叶中的表达从V3至V7至VT阶段提高，而使用EXP-Sv.Ubq1：1：12(SEQ ID NO：136)和EXP-Sb.Ubq4：1：2(SEQ IDNO：151)，表达从V3至VT阶段下降。
同样，关于繁殖组织(花粉囊和抽穗丝)和发育的种子(21DAP胚芽和胚乳)，观察到对于每个EXP序列独特的不同表达模式。例如，使用EXP-Zm.UbqM1：1：10(SEQ ID NO：139)、EXP-Zm.UbqM1：1：11(SEQ ID NO：149)、EXP-Zm.UbqM1：1：12(SEQ ID NO：143)和EXP-Cl.Ubq1：1：23(SEQ ID NO：108)，在花粉囊和抽穗丝以及发育的种子中观察到高水平的表达。使用EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)和EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)，在花粉囊和抽穗丝中的表达是高的，但在发育的种子中是低的。由EXP-Sb.Ubq7：1：2(SEQ IDNO：157)驱动的表达在繁殖组织中高，且在发育的胚芽中高，但在发育的胚乳中较低。EXP序列EXP-Sb.Ubq4：1：2(SEQ ID NO：151)只显示了在花粉囊中的表达，但在抽穗丝中未表达，且在发育的种子中的表达低得多。关于繁殖组织和发育的种子，EXP-Sv.Ubq1：1：11(SEQ IDNO：130)显示了与EXP-Sb.Ubq4：1：2(SEQ ID NO：151)相似的模式，但EXP-Sb.Ubq4：1：2(SEQID NO：151)显示了在根和叶组织中表达，而EXP-Sv.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：130)在这些相同组织中的表达低得多。
将对于单拷贝插入进行选择的R0代转化体与非转基因LH244系杂交(获得F1)或自花授粉(获得R1)以产生F1或R1种子群。在任一种情况中，选择杂合的F1或R1植物用于研究。按照之前所述的，在整个发育过程中，在选定的组织中测量GUS表达水平。用于该研究的F1或R1组织包括：吸胀种子胚芽、吸胀种子胚乳、根和发芽后(DAG)4天的胚芽鞘；V3阶段的叶和根；V8阶段的根和成熟叶；根、成熟叶、VT阶段(抽穗时，繁殖之前)花粉囊、花粉、叶和衰老的叶；R1穗、抽穗丝、根和节间；授粉后(DAP)12天的仁；以及21和38DAP的胚芽和胚乳。还对于包含pMON132037(EXP-SETit.Ubq1：1：10，SEQ ID NO：119)、pMON131957(EXP-SETit.Ubq1：1：11，SEQ ID NO：125)、pMON131958(EXP-Sv.Ubq1：1：11，SEQ ID NO：130)和pMON132974(EXP-Sb.Ubq7：1：2，SEQ ID NO：157)的转化体，对暴露于干旱和寒冷胁迫条件的F1植物分析了选定的组织样品。在寒冷和干旱暴露后，获取V3根和叶组织样品。
通过停止灌溉4天以使含水量相对于完全灌溉植物的初始含水量降低至少50％，在用pMON132037(EXP-SETit.Ubq1：1：10，SEQ ID NO：119)、pMON131957(EXP-SETit.Ubq1：1：11，SEQ ID NO：125)、pMON131958(EXP-Sv.Ubq1：1：11，SEQ ID NO：130)和pMON132974(EXP-Sb.Ubq7：1：2，SEQ ID NO：157)转化的F1，V3植物中诱导干旱应激。干旱实验方案基本上由以下步骤组成。使V3阶段植物缺水。随着玉米植物经历干旱，叶子的形状将从叶正常的健康和未折叠的外观变成在中脉维管束显示出折叠并且从叶尖至茎观察时显现为V-形的叶子。这种形态学的变化通常在停止灌溉后大约2天时开始发生，并且在之前的实验中显示与大约50％的失水相关，如通过停止灌溉前的盆重量和在未灌溉的植物中观察到叶卷曲形态时的盆重量来测量的。当叶子显示出萎蔫时，如通过叶子的向内卷曲(V-形)所表明的，则认为植物处于干旱条件下。据认为这种应激水平是亚致死应激的形式。一旦各株植物显示出如上所定义的干旱诱导，将植物破坏以获取根和叶样品。
除了干旱，还将用pMON132037(EXP-SETit.Ubq1：1：10，SEQ ID NO：119)、pMON131957(EXP-SETit.Ubq1：1：11，SEQ ID NO：125)、pMON131958(EXP-Sv.Ubq1：1：11，SEQID NO：130)和pMON132974(EXP-Sb.Ubq7：1：2，SEQ ID NO：157)转化的F1V3阶段植物暴露于寒冷条件以确定调控元件是否显示出寒冷诱导的GUS表达。在V3阶段的寒冷胁迫下，测试整株植物的GUS表达的诱导。将V3阶段玉米植物暴露于12℃温度的生长室中24小时。将生长室中的植物在每平方米每秒800微摩尔白光照度下生长，具有十小时白光和十四小时黑暗的光周期。冷暴露后，获取叶和根组织的样品用于定量GUS表达。
按照以上所述的测量GUS表达。对于各个组织样品测定的平均F1GUS表达呈现于以下的表42和43中。
表42.用pMON142864和pMON142865转化的植物中的平均F1GUS表达。
器官 pMON142864 pMON142865
V3叶 86 74
V3根 41 52
V8叶 109 123
V8根 241 252
VT花，花粉囊 168 208
VT叶 158 104
R1穗轴 171 224
R1抽穗丝 314 274
R1根 721 308
R1节间 428 364
R2种子-12DAP 109 72
R3种子-21DAP-胚芽 45 32
R3种子-21DAP-胚乳 175 196
R5种子-38DAP-胚芽 163 58
R5种子-38DAP-胚乳 90 69
表43.用pMON132037、pMON131957、pMON131958和pMON132974转化的植物中的平均F1GUS表达。
在F1玉米植物中，取样的各种组织中的GUS表达水平在泛素EXP序列之间不同。尽管所有EXP序列显示了在稳定转化的F1玉米植物中驱动GUS转基因表达的能力，但各个EXP序列显示出相对于其他序列的独特表达模式。例如，R1根表达对于EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)是EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)的大约两倍。38DAP的发育种子胚芽中的GUS表达对于EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)比EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ IDNO：8)几乎高三倍。相反，V3和V8阶段的叶和根表达对于EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)和EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)大致相同。
吸胀种子(胚芽和胚乳组织)中的F1GUS表达在用EXP-Sb.Ubq7：1：2(SEQ ID NO：157)转化的植物中比用EXP-SETit.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：119)、EXP-SETit.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：125)和EXP-Sv.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：130)转化的那些高得多。干旱引起用EXP-SETit.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：119)、EXP-SETit.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：125)、EXP-Sv.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：130)和EXP-Sb.Ubq7：1：2(SEQ ID NO：157)转化的植物中的V3根表达增加，但在用EXP-SETit.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：125)、EXP-Sv.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：130)和EXP-Sb.Ubq7：1：2(SEQ ID NO：157)转化的植物中只有叶表达增加。使用EXP-SETit.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：125)，干旱增强的V3表达最高。在用EXP-Sb.Ubq7：1：2(SEQID NO：157)转化的植物中，花粉表达也比用EXP-SETit.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：119)、EXP-SETit.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：125)和EXP-Sv.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：130)转化的那些植物中高得多。R1节间中的表达在用EXP-SETit.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：119)和EXP-Sv.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：130)时最高，而在用EXP-SETit.Ubq1：1：11(SEQ ID NO：125)转化的植物中的最低。
各个EXP序列显示了在稳定转化的玉米植物中驱动转基因表达的能力。然而，各个EXP序列对于各个组织具有独特的表达模式，并且提供了根据获得所需结果需要的组织表达策略来选择将会提供特定转基因的最佳表达的EXP序列的机会。该实施例证明了从同源基因分离的EXP序列在转化的植物中不必定是具有相同的性能，并且只可以通过对各个EXP序列的特性的经验研究才可以确定该表达，而不可以基于启动子抽来源的基因同源性来预测。
实施例13：转基因玉米中驱动CP4的调控元件的分析。
用含有驱动CP4转基因表达的EXP序列的植物表达载体转化玉米植物，并且分析所得到植物的CP4蛋白表达。
将EXP序列EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)、EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ IDNO：27)、EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)、EXP-Sv.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：133)和EXP-Zm.UbqM1：1：7(SEQ ID NO：141)克隆至植物二元转化质粒构建体中。所得到的载体含有来自根癌农杆菌的右边界区、可操作地5’连接质体靶向的草甘膦耐受性EPSPS编码序列(CP4，US RE39247)(其可操作地5’连接T-AGRtu.nos-1：1：13(SEQ ID NO：127)3'UTR)的泛素EXP序列和来自根癌农杆菌的左边界区。以下表44显示了用于转化玉米的质粒构建体和相应的EXP序列。
表44.用于转化玉米的CP4质粒构建体和相应的EXP序列。
质粒构建体 EXP序列 SEQ ID NO： 数据
pMON141619 EXP-ANDge.Ubq1：1：8 8 R0和F1
pMON142862 EXP-ERIra.Ubq1：1：8 27 R0和F1
pMON129221 EXP-Cl.Ubq1：1：10 98 R0和F1
pMON129205 EXP-Sv.Ubq1：1：9 133 R0和F1
pMON129212 EXP-Zm.UbqM1：1：7 141 R0
将所得到的质粒用于转化玉米植物。转化的植物进行一个或两个拷贝插入T-DNA的选择，并且生长于温室中。在特定的发育阶段，从R0转化植物取样选定的组织，并且使用CP4ELISA分析测量那些组织中的CP4蛋白水平。对于各个转化观察到的平均CP4表达呈现于以下的表45和46中，并且图示于图7中。
表45.R0转化玉米植物中的平均叶和根CP4表达。
表46.R0转化玉米植物中繁殖组织和发育的种子中的平均CP4表达。
EXP序列 SEQ ID VT穗 R1抽 R3胚 R3胚
NO： 穗丝 芽 乳
EXP-ANDge.Ubq1：1：8 8 24.14 5.55 7.29 4.91
EXP-ERIra.Ubq1：1：8 27 19.20 10.27 12.60 4.70
EXP-Cl.Ubq1：1：10 98 18.70 16.21 8.26 8.82
EXP-Sv.Ubq1：1：9 133 7.10 4.72 3.13 1.74
EXP-Zm.UbqM1：1：7 141 67.25 11.21 7.85 10.69
如可在表45和46中看到的，EXP序列EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)、EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)、EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)、EXP-Sv.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：133)和EXP-Zm.UbqM1：1：7(SEQ ID NO：141)中的每一个都能够在从R0转化植物取样的全部组织中驱动CP4表达。高于驱动CP4的EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)的包含驱动CP4的EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)和EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)的转化体的根和叶中的较高CP4表达可能与植物对草甘膦施用的植物性耐受水平相关，如对于这些转化体群所观察到的(参见以下的实施例14)。
对于各个取样组织的表达水平，各EXP序列呈现出独特的表达模式。例如，尽管对于EXP序列EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)和EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)，在叶、根和穗中的CP4表达相似，但使用EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)在抽穗丝中的表达只有ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：21)驱动的表达的一半。这对于其中需要组成型表达但优选抽穗丝组织中的表达较低的转基因的表达可能是有利的。
将R0转化玉米植物与非转基因LH244品种杂交以产生F1种子。分析所得到的F1代种子的转基因盒的分离，并且选择CP4盒杂合的植物用于CP4表达的分析。将种子种植于温室中，并且产生两组植物，一组喷洒草甘膦，而另一组未喷洒。使用标准的基于ELISA的分析在选定的组织中分析CP4的表达。平均CP4表达显示于以下的表47和48中。
表47.F1转化玉米植物中的平均CP4表达。
器官 pMON141619 pMON142862 pMON129221
V4叶 11.50 13.51 7.68
V4根 12.48 12.60 10.29
V7叶 16.59 20.21 12.01
V7根 11.00 13.62 8.15
VT叶 39.88 44.85 29.42
VT根 17.43 21.83 13.43
VT花，花粉囊 52.74 55.72 53.62
R1抽穗丝 16.01 23.81 14.42
R3种子-21DAP-胚芽 33.29 57.96 51.64
R3种子-21DAP-胚乳 2.99 3.20 6.44
如可在以上表47中看到的，叶和根中的CP4表达在用pMON141619(EXP-ANDge.Ubq1：1：8，SEQ ID NO：5)和pMON142862(EXP-ERIra.Ubq1：1：8，SEQ ID NO：27)转化的F1转化体中比用pMON129221(EXP-Cl.Ubq1：1：10，SEQ ID NO：98)转化的那些转化体中高。花粉囊组织中的表达对于所有三个EXP序列相似，但使用EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ IDNO：27)的抽穗丝中的表达最高。发育的胚芽(21DAP)中的表达在包含驱动CP4的EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)和EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)的转化体中最高。发育的胚乳中的表达在包含驱动CP4的EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)的转化体中较高。
表48.F1转化玉米植物中的平均CP4表达。
如可在以上的表47-48中看到的，CP4表达在用pMON129205(EXP-Sv.Ubq1：1：9，SEQID NO：133)转化的F1转化体的所有组织中都低于用pMON141619(EXP-ANDge.Ubq1：1：8，SEQID NO：8)、pMON142862(EXP-ERIra.Ubq1：1：8，SEQ ID NO：27)和pMON129221(EXP-Cl.Ubq1：1：10，SEQ ID NO：98)转化的那些。
所分析的各个EXP序列所产生的独特表达模式提供了产生如下的转基因植物的机会：其中为了最佳性能或效率，表达可以微调以进行转基因表达的小调节。此外，这些驱动不同转基因表达的EXP序列的经验测试可以产生如下结果：其中一个特定EXP序列最适于一个或一类特定转基因的表达，而发现另一个EXP序列对于不同的转基因或转基因类别是最佳的。
实施例14：R0转基因玉米植物中植物性草甘膦耐受性的分析。
用含有驱动CP4转基因表达的EXP序列的植物表达载体转化玉米植物，并且评估所得到植物对草甘膦施用的植物性和繁殖性耐受性。
评估以上实施例13中所述的分别用pMON141619，pMON142862，pMON129221，pMON129205和pMON129212转化的并且包含驱动CP4的EXP序列EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ IDNO：8)，EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)，EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)，EXP-Sv.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：133)和EXP-Zm.UbqM1：1：7(SEQ ID NO：141)的F1转化玉米植物在喷施草甘膦时的植物性和繁殖性耐受性。将各个事件的十株F1植物分成两组，第一组由接受草甘膦喷洒且处于V4和V8发育阶段的五株植物组成；而第二组的五株植物未喷洒(即，对照)。使用Roundup以1.5a.e./英亩(a.e.酸当量)的施用率通过散播叶面喷雾施用来施用草甘膦。七至十天后，评估各植物的叶子的损伤。比较各个事件的未喷洒和喷洒的植物来评价植物性耐受性(表49中的Veg To1)，并且将损伤等级量表用于提供对植物性耐受性的最终评级(T=耐受，NT=不耐受)。此外，对于各个事件中的所有植物分析种子组。比较对照植物和喷洒的植物之间的种子组测量值，并且基于喷洒植物相对于对照的百分种子组，对于各个事件给出繁殖性耐受性(表49中的Repro To1)的赋值(T=耐受，NT=不耐受)。以下表49显示了对于V4和V8阶段喷洒的各个事件的植物性和繁殖性耐受性评级。后面的字母“T”表示耐受，而“NT”表示不耐受。
表49.V4和V8阶段的单个转化玉米事件的叶损伤评级。
从以上的表49，基于没有超过十的评分的损伤等级，测试的包含CP4转基因盒的所有转化事件证明了完全的植物性耐受性，所述CP4转基因盒包含EXP序列EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)、EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)和EXP-Zm.UbqM1：1：7(SEQ IDNO：141)。九个包含EXP-ANDge.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：8)的事件中的四个事件和九个包含EXP-ERIra.Ubq1：1：8(SEQ ID NO：27)的事件中的六个事件对草甘膦施用是植物性和繁殖性耐受的。相反，包含EXP-Cl.Ubq1：1：10(SEQ ID NO：98)的事件是植物性耐受的或繁殖性耐受的，但不是同时具有两种耐受性的。只有一个包含EXP-Sv.Ubq1：1：9(SEQ ID NO：133)的事件显示了植物性耐受性，并且没有一个测试的事件是繁殖性耐受的。所有包含EXP-Zm.UbqM1：1：7(SEQ ID NO：141)的事件证明了植物性耐受，但繁殖性耐受的评价仍然在进行中。
实施例15：使用不同的3’端内含子/外显子剪接点序列分析表达。
用包含驱动GUS表达的EXP序列的植物表达构建体转化玉米和小麦叶原生质体，EXP序列包含相同的启动子和前导序列，但在内含子/外显子剪接点序列5’-AG-3’后具有不同的3’端核苷酸，以观察表达是否受到序列中轻微变化的影响。还将表达与两个组成型对照质粒的表达进行了比较。
构建了包含GUS表达盒的植物表达构建体。所得到的载体包含薏苡泛素启动子P-Cl.Ubq1-1：1：1(SEQ ID NO：80)，其可操作地5’连接前导序列L-Cl.Ubq1-1：1：1(SEQ IDNO：81)，其可操作地5’连接以下表50中所示的内含子元件(各自就在紧接内含子/外显子剪接点5’-AG-3’序列后的最3’端包含不同的核苷酸)，其可操作地5’连接于与T-ARGtu.nos-1：1：13(SEQ ID NO：127)3′UTR可操作地5’连接的GUS编码序列。以下表50显示了植物表达构建体和相应的3’端序列。
表50.植物表达构建体、内含子和内含子/外显子剪接点序列5’-AG’-3’后的3’端序列
按照之前所述的转化玉米和小麦原生质体，并且分析GUS和荧光素酶表达。以下表51显示了玉米和小麦原生质体表达的平均GUS和RLuc值。
表51.玉米和小麦原生质体细胞的平均GUS和RLuc值。
将以上表46中的各个薏苡泛素EXP序列的GUS/RLuc值用于相对于两个组成型对照EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)和EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1(SEQ IDNO：163)进行标准化，并且呈现于以下的表52中。
表52.相对于EXP-Os.Act1：1：9(SEQ ID NO：179)和EXP-CaMV.35S-enh+Ta.Lhcb1+Os.Act1：1：1(SEQ ID NO：163)的薏苡泛素EXP序列的标准化表达值。
如以上表52中所示的，各个薏苡泛素EXP序列在玉米和小麦中提供了高于任一个组成型对照的表达。对于所有薏苡(Coix)泛素EXP序列，玉米原生质体中的表达相对相似。小麦中的表达变化较多。在内含子/外显子剪接点序列5’-AG-3’后的不同3’端核苷酸的使用没有显示出明显影响GUS的表达，除了通过EXP-Cl.Ubq1：1：20(SEQ ID NO：102)驱动的GUS。EXP-Cl.Ubq1：1：20在内含子/外显子剪接点5’-AG-3’序列后包含3’端核苷酸序列5’-GAC-3’，并且引起表达相对于其他薏苡泛素EXP序列略有下降。所得到的剪接的信使RNA的评价显示出使用驱动GUS表达的EXP-Cl.Ubq1：1：20(SEQ ID NO：102)所表达的mRNA中大约10％未正确剪接。使用其他薏苡泛素EXP序列从GUS表达得到的mRNA显示出正确加工。该实验提供了如下证据：对于实施例1的表2中呈现的任一内含子变体的任一3’端核苷酸应当适用于转基因表达盒中而没有显著的活性损失和不需加工，例外是3’端序列5’-GAC-3’，其被发现只与内含子元件1-Cl.Ubq1-1：1：9(SEQ ID NO：103)相关。
实施例16：源自调控元件的增强子。
增强子源自本文中提供的启动子元件，如以SEQ ID NO：2、6、9、11、13、15、17、19、23、26、28、30、32、34、38、40、42、46、50、56、60、64、66、70、74、76、78、80、84、86、88、91、96和135呈现的那些。增强子元件可以由一个或多个顺式调控元件组成，其在可操作地5’或3’连接启动子元件时，或可操作地5’或3’连接于可操作与启动子连接的其他增强子元件时，可以增强或调节转基因的表达，或提供转基因在特定细胞类型或植物器官中或在发育或生理节律的特定时间点的表达。通过从从如上所述允许本文中提供的启动子启动转录的启动子(包括其片段)除去TATA盒或功能相似元件和任何下游序列来制得增强子，其中除去TATA盒或功能相似元件和TATA盒的下游序列。本文中提供了源自启动子元件P-Cl.Ubq1-1：1：1的增强子元件E-Cl.Ubq1-1：1：1(SEQ ID NO：89)来说明源自启动子元件的增强子。
增强子元件可以源自本文中提供的启动子元件并且使用本领域已知的方法克隆以可操作地5’或3’连接于启动子元件，或可操作地5’或3’连接于与启动子可操作地连接的其他增强子元件。或者，可以使用本领域已知的方法克隆增强子元件以可操作地连接于一个或多个拷贝的增强子元件(其可操作地5’或3’连接启动子元件，或可操作地5’或3’连接与启动子可操作地连接的其他增强子元件)。增强子元件还可以克隆以可操作地5’或3’连接源自不同属生物体的启动子元件，或可操作地5’或3’连接源自其他属生物体或相同属生物体的其他增强子元件(其可操作地连接源自相同或不同属生物体的启动子)，从而形成嵌合的调控元件。使用与之前实施例中所述构建体相似的本领域已知方法来构建GUS表达植物转化载体，其中所得到的植物表达载体含有来自根癌农杆菌的右边界区；测试调控或嵌合调控元件的第一转基因盒(其包含调控或嵌合调控元件)，可操作地连接源自玉米(Z.mays)HSP70热休克蛋白的内含子(I-Zm.DnaK-1：1：1SEQ ID NO：144)或本文中呈现的任何内含子或任何其他内含子，可操作地连接具有可加工内含子(GUS-2，SEQ ID NO：160)或无内含子(GUS-1，SEQ ID NO：159)的β-葡糖苷酸酶(GUS)编码序列，可操作地连接来自根癌农杆菌的胭脂碱合成酶3′UTR(T-AGRtu.nos-1：1：13，SEQ ID NO：161)或来自水稻脂质转移蛋白基因的3′UTR(T-Os.LTP-1：1：1，SEQ ID NO：175)；用于选择赋予除草剂草甘膦(通过水稻肌动蛋白1启动子驱动)或可选地抗生素卡那霉素(通过水稻激动蛋白1启动子驱动)抗性的转化植物细胞的第二转基因选择盒和来自根癌农杆菌的左边界区。通过以上所述的方法或通过本领域已知的其他农杆菌介导的或颗粒轰击方法，将所得到的质粒用于转化玉米植物或其他属的植物。或者，使用本领域已知的方法转化源自玉米或其他属植物的原生质体细胞以进行瞬时分析。
在稳定的或瞬时的植物分析中，评价通过包含一个或多个增强子的调控元件驱动的GUS表达，以确定增强子元件对转基因表达的作用。基于经验的实验和使用各个调控元件组合物观察到的最终基因表达调控，进行了对一个或多个增强子元件的修饰或一个或多个增强子元件的复制。改变所得到的调控或嵌合调控元件中一个或多个增强子的相对位置可以影响调控或嵌合调控元件的转录活性或特异性，并且经验地进行测定以确认用于玉米植物或其他属植物内所需转基因表达特征的最佳增强子。
实施例17：使用植物源的原生质体分析GUS活性的内含子增强。
基于实验以及与无内含子表达载体对照的比较来选择内含子，以根据经验选择用于最佳转基因表达的内含子和载体T-DNA元件排列的构造。例如，在除草剂抗性基因(如赋予草甘膦耐受性的CP4)的表达中，希望的是在繁殖组织以及营养性组织内具有转基因表达以防止施用除草剂时产量的损失。这种情况中的内含子将基于其可操作地连接组成型启动子时增强赋予除草剂抗性的转基因的表达的能力来选择，特别是在转基因植物的繁殖细胞和组织内，并且由此在喷施除草剂时为转基因植物提供植物性和繁殖性耐受性。在大部分泛素基因中，5'UTR由前导序列组成，其具有嵌于其中的内含子序列。因此使用包含启动子、前导序列和内含子的完整5'UTR分析源自这样的基因的表达元件。为了获得不同的表达特征或调节转基因表达的水平，可以除去这些表达元件中的内含子或用异源内含子来替代。
使用基因组DNA重叠群，鉴定了本文中作为SEQ ID NO：4、7、21、24、36、44、48、52、54、58、62、68、72、82、92、94、101、103、105、107、109、111、113、118、120、122、127、129、131、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158和182呈现的内含子，其与表达的序列标记簇或cDNA重叠群相比较以鉴定基因组DNA内的外显子和内含子序列。此外，5'UTR或前导序列还用来限定在基因序列编码被一个或多个内含子中断的前导序列的条件下一个或多个内含子的内含子/外显子剪接点。使用本领域已知的方法将内含子克隆至植物转化载体中，以可操作地3’连接转录调控元件和前导片段以及可操作地5’连接第二前导片段或编码序列，例如，如图1中呈现的两个转基因盒中所描绘的。
因此，例如，第一个可能的转基因盒(图8中的转基因盒构造1)由启动子或嵌合启动子元件[A]组成，其可操作地5’连接前导元件[B]、可操作地5’连接测试内含子元件[C]、可操作地连接编码区[D](其可操作地连接3'UTR元件[E])。或者，第二个可能的转基因盒(图8中的转基因盒构造2)由启动子或嵌合启动子元件[F]组成，其可操作地5’连接第一前导元件或第一前导元件片段[G]、可操作地5’连接测试内含子元件[H]、可操作地5’连接第二前导元件或第一前导元件第二片段[I]、可操作地连接编码区[J](其可操作地连接3'UTR元件[K])。此外，第三个可能的转基因盒(图8中的转基因盒构造3)由启动子或嵌合启动子元件[L]组成，其可操作地5’连接前导元件[M]、可操作地5’连接编码序列元件的第一片段[N]、可操作地5’连接内含子元件[O]、可操作地5’连接编码序列元件的第二片段[P](其可操作地连接3'UTR元件[Q])。转基因盒构造3设计成允许内含子以产生完整的开放阅读框而在编码序列的第一和第二片段之间没有移码的方式来剪接。
作为SEQ ID NO：4、7、21、24、36、44、48、52、54、58、62、68、72、82、92、94、101、103、105、107、109、111、113、118、120、122、127、129、131、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158和182呈现的内含子的5’端的前6个核苷酸和3’端的最后6个核苷酸分别表示内含子/外显子剪接点之前和之后的核苷酸。例如，可以通过具有另外的附加序列(即，天然或人工的)来修饰这些短的6核苷酸序列，以利于内含子克隆至植物转化载体中，只要保留来自SEQ ID NO：4、7、21、24、36、44、48、52、54、58、62、68、72、82、92、94、101、103、105、107、109、111、113、118、120、122、127、129、131、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158和182的5’端的第一和第二个核苷酸(GT)以及3’端的第四和第五个核苷酸(AG)，因此保留内含子的内含子/外显子剪接点。如以上讨论的，可能优选的是避免紧接在剪接位点(GT)的5’端之前使用核苷酸序列AT或核苷酸A，以及避免紧接在剪接位点(AG)3’端之后分别使用核苷酸G或核苷酸序列TG，以消除信使RNA加工成最终转录产物的过程中形成不合需要的起始密码子的可能。
通过瞬时分析或稳定植物分析中增强表达的能力来分析内含子的增强作用。对于内含子增强的瞬时分析，使用本领域已知的方法构建基础植物载体。将内含子克隆至基础植物载体中，其包含由组成型启动子组成的表达盒，所述组成型启动子如花椰菜花叶病毒启动子P-CaMV.35S-enh-1：1：9(SEQ ID NO：176)，其可操作地5’连接前导元件L-CaMV.35S-1：1：15(SEQ ID NO：177)，可操作地5’连接测试内含子元件(例如，SEQ ID NO：4、7、21、24、36、44、48、52、54、58、62、68、72、82、92、94、101、103、105、107、109、111、113、118、120、122、127、129、131、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158和182之一)，可操作地连接具有可加工内含子(GUS-2，SEQ ID NO：160)或无内含子(GUS-1，SEQ ID NO：159)的β-葡糖苷酸酶(GUS)编码序列，可操作地连接来自根癌农杆菌的胭脂碱合成酶3′UTR(T-AGRtu.nos-1：1：13，SEQ ID NO：161)。用基础植物载体和以上实施例2中之前描述的荧光素酶对照载体转化源自玉米或其他属植物组织的原生质体细胞，并且测试活性。为了比较内含子增强表达的相对能力，将GUS值表示为GUS与荧光酶活性的比率，并且与包含可操作地连接已知的内含子标准(如源自玉米HSP70热休克蛋白的内含子I-Zm.DnaK-1：1：1(SEQ IDNO：178))的组成型启动子的构建体以及包含组成型启动子但没有可操作连接启动子的内含子的构建体赋予的那些水平相比较。
对于以SEQ ID NO：4、7、21、24、36、44、48、52、54、58、62、68、72、82、92、94、101、103、105、107、109、111、113、118、120、122、127、129、131、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158和182呈现的内含子的稳定植物分析，与之前实施例中所述的构建体相似地构建GUS表达植物转化载体，其中所得到的植物表达载体含有来自根癌农杆菌的右边界区；由组成型启动子组成的用于测试内含子的第一转基因盒，所述组成型启动子如花椰菜花叶病毒启动子P-CaMV.35S-enh-1：1：9(SEQ ID NO：176)，其可操作地5’连接前导元件L-CaMV.35S-1：1：15(SEQ ID NO：177)，可操作地5’连接本文中提供的测试内含子元件，可操作地连接具有可加工内含子(GUS-2，SEQ ID NO：160)或无内含子(GUS-1，SEQ ID NO：159)的β-葡糖苷酸酶(GUS)编码序列，可操作地连接来自根癌农杆菌的胭脂碱合成酶3′UTR(T-AGRtu.nos-1：1：13，SEQ ID NO：161)；用于选择赋予草甘膦(通过水稻肌动蛋白1启动子驱动)或可选地抗生素卡那霉素(通过水稻激动蛋白1启动子驱动)抗性的转化植物细胞的第二转基因选择盒和来自根癌农杆菌的左边界区。通过以上所述的方法或通过本领域已知的农杆菌介导方法，将所得到的质粒用于转化玉米植物或其他属的植物。选择单拷贝或低拷贝数的转化体用于与用与测试载体相同的植物转化载体(但不含测试内含子)转化的单拷贝或低拷贝数转化的植物比较，以确定测试内含子是否提供了内含子介导的增强作用。
可以以多种方式修饰以SEQ ID NO：4、7、21、24、36、44、48、52、54、58、62、68、72、82、92、94、101、103、105、107、109、111、113、118、120、122、127、129、131、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158和182呈现的任一内含子，如删除内含子序列内的片段，其可以降低可以增强表达的内含子片段的表达或复制。此外，内含子内可以影响特定细胞类型或组织和器官的表达特异性的序列可以复制或改变或删除以影响转基因的表达和表达模式。此外，本文中提供的内含子可以进行修饰以除去任何可能的起始密码子(ATG)(其可能引起从不正确剪接的内含子表达无意的转录产物而成为不同的、较长的或截短的蛋白质。一旦根据经验测试了内含子，或已经基于实验进行了改变，则将内含子用于增强稳定转化植物中转基因的表达，所述稳定转化的植物可以是任何属的单子叶植物或双子叶植物，只要内含子提供转基因的增强。内含子还可以用于增强其他生物体中的表达，如藻类、真菌或动物细胞，只要内含子提供可操作在与其连接的转基因的表达的增强或减弱或特异性。
* * * * * * *
尽管已经说明和描述了本发明的原理，本领域技术人员应当清楚，本发明的排列和细节可以改变而不脱离这些原理。我们要求在权利要求的精神和范围内的所有变化。本文中引用的所有出版物和公开的专利文件在此按引用并入本文中作为参考，如同每篇单独的出版物或专利申请特意和单独表明并入作为参考一样。

Claims (5)

1.一种DNA分子，其包含：
a)由SEQ ID NO:1-5和8-10中任一个组成的DNA序列；和
b)异源可转录多核苷酸分子，
其中所述DNA序列可操作地与所述异源可转录多核苷酸分子连接。
2.权利要求1的DNA分子，其中所述DNA序列包含基因调控活性。
3.权利要求1的DNA分子，其中所述异源可转录多核苷酸分子包含具有农艺学意义的基因。
4.权利要求3的DNA分子，其中所述具有农艺学意义的基因赋予植物除草剂耐受性。
5.权利要求3的DNA分子，其中具有农艺学意义的基因赋予植物抗虫性。
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