DE60028388T2

DE60028388T2 - Auf ubiquitin basierendes modifiziertes regulatorisches system

Info

Publication number: DE60028388T2
Application number: DE60028388T
Authority: DE
Inventors: Andrew Goldsbrough
Original assignee: Monsanto UK Ltd
Current assignee: Monsanto UK Ltd
Priority date: 1999-09-09
Filing date: 2000-09-07
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2020-09-08
Also published as: HUP0202852A3; WO2001018220A1; EP1210446B1; ZA200201758B; PL354747A1; US6878818B1; AU769567B2; AU7515500A; CA2384517A1; PT1210446E; ATE328098T1; ES2265978T3; HU225171B1; DK1210446T3; DE60028388D1; HUP0202852A2; CZ2002695A3; EP1210446A1; CA2384517C

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen die Genexpression und insbesondere Regulatorsysteme zur Regulation der Genexpression, basierend auf einem spezifischen Ubiquitin-Regulatorsystem (auf Ubiquitin basierendes regulatorisches System, URS), sowie die Verwendung dieses Regulatorsystems in Kombination mit einem exprimierbaren Strukturgen, vorzugsweise einem in Pflanzen exprimierbaren Strukturgen, zur gesteuerten Expression des genannten Strukturgens und regulierten Expressionskontrolle, beispielsweise mittels erhöhter Temperatur.
Hintergrund der Erfindung
Gentechnische Veränderung von Pflanzen
Die Hürde zur erfolgreichen Erzeugung gentechnisch veränderter Pflanzen der Hauptgetreidearten wird zur Zeit Pflanzenart für Pflanzenart überwunden. Der Begriff "gentechnische Veränderung" beschreibt die Manipulation des Genoms einer Pflanze, typischerweise das Einbringen eines Fremdengens in die Pflanze, oder die Modifikation der Pflanzengene, um so die Synthese von Genprodukten der Pflanze zu steigern oder zu verringern. Üblicherweise werden Gene in eine oder mehrere Pflanzen-Zellen eingebracht, die anschließend zu intakten, vermehrungsfähigen, wachstumsfähigen Pflanzen herangezogen werden können, wobei diese vollständig transformiert sein können oder Chimere darstellen können, bei denen einzelne Gewebe transformiert sein können, andere jedoch nicht. Diese Pflanzen können selbstbestäubt oder mit anderen Pflanzen der gleichen oder einer kompatiblen Art kreuzbestäubt werden, wodurch das in der Keimbahn vorliegende Fremdgen oder Fremdgene in landwirtschaftlich nutzbare Pflanzen-Sorten eingezüchtet werden können.
Die zur Zeit zur genetischen Veränderung von Pflanzenlinien verwendeten Strategien umfassen typischerweise zwei sich ergänzende Verfahren. Das erste Verfahren umfasst die genetische Transformation einer oder mehrerer speziell charakterisierte Arten von Pflanzenzellen. Der wie hierin verwendete Begriff "Transformation" bedeutet, daß ein Fremdgen, typischerweise in Form eines genetischen Konstrukts, in das Genom der einzelnen Pflanzenzellen eingebracht wird.
Dieser Einbau wird mit Hilfe eines Vektors erreicht, der in das Pflanzengenom integriert. Das zweite Verfahren umfasst dann die Regeneration der transformierten Pflanzenzellen in vollständige fortpflanzungsfähige Pflanzen. Weder der Transformations- noch der Regenerationssvorgang muß zu 100% erfolgreich sein, jedoch hinreichenden zuverlässig und reproduzierbar sein, damit ein angemessener Prozentsatz der Zellen transformiert und zu intakten Pflanzen regeneriert werden kann.
Die EP-A-0342926 offenbart ein pflanzliches (Mais) Ubiquitin-Regulatorsystem, umfassend ein Hitzeschock-Element (umfassend zwei sich überlappende Konsensus-Hitzeschock-Elemente), einen Promotor, eine Transkriptions-Startstelle, ein Intron und eine Translations-Startstelle. Es wird angenommen, daß die Hitzeschock-Element-Komponente dieses Regulatorsystems die Hitze-Induzierbarkeit der Expression der assoziierten DNS-Sequenz in Zellen von Dikotyledonen oder Monokotyledonen nach permissiven Hitzeschock verleiht.
Das Pflanzliches Ubiquitin-Regulatorsystem bezieht sich auf eine ungefähr 2 kb Nucleotidsequenz 5' der Translations-Startstelle des Ubiquitin-Gens und umfaßt Sequenzen, welche die Initiation der Transkription bedingen, die Expressionsstärke steuern, Stress-Gene induzieren und die Expression als Antwort auf Stress verstärken. Das gleichzeitig den Promotor (eine etwa 1 kb Nucleotidsequenz) und die regulatorischen Funktionen umfassende Regulatorsystem entspricht der DNS-Sequenz, welche die regulatorische Steuerung oder Modulation der Genexpression vorsieht. Ein unter der regulatorischen Kontrolle des pflanzlichen Ubiquitin-Regulatorsystems stehendes Strukturgen bedeutet, daß ein Strukturgen solchermaßen positioniert wird, daß die gesteuerte Expression dieses Gens durch die das Ubiquitin-Regulatorsystem umfassenden Sequenzen kontrolliert wird.
Promotoren sind DNS-Elemente, welche die Transkription von RNS in Zellen steuern. Zusammen mit anderen regulatorischen Elementen, welche die gewebsspezifische und zeitliche Spezifität der Genexpression steuern, kontrollieren die Promotoren die Entwicklung von Organismen.
In der Vergangenheit gab es konzertierte Bemühungen, Promotoren einer breiten Vielfalt von Pflanzen und Tieren zu identifizieren und zu isolieren, insbesondere solche Promotoren, die eine hohe konstitutive Expression vermitteln und in der Lage sind, eine stabile Expression unter Stressbedingungen aufrechtzuerhalten.
Die vorliegende Erfindung basiert auf Modifikationen des pflanzlichen Ubiquitin-Regulatorsystems.
Zusammenfassung der Erfindung
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird somit eine DNS-Sequenz vorgesehen, umfassend ein nicht hitze-induzierbares Ubiquitin-Regulatorsystem, das im wesentlichen die Nucleotidsequenz gemäß SEQ. ID. NO. 8 umfasst.
Im folgenden wird das Ubiquitin-Regulatorsystem, welches Teil einer DNS-Se quenz in Übereinstimmung mit dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform ist, als modifiziertes Ubiquitin-Regulatorsystem (mURS) in Bezug genommen.
Das mURS umfaßt im wesentlichen ein, wie in der EP-A-0342926 offenbartes, pflanzliches URS, beispielsweise ein URS aus Mais. Der Begriff "im wesentlichen umfassend" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß das mURS abgesehen von Regionen, in denen das mURS beispielsweise durch Fehlen von Hitzeschock-Elementen modifiziert ist im wesentlichen einem unmodifizierten URS entspricht.
Das mURS kann somit, wie beispielsweise in der EP-A-342926 offenbart, ein Intron umfassen.
Ein mURS kann beispielsweise durch Modifikation eines URS mittels Entfernung eines oder mehrerer Hitzeschock-Elemente erzeugt werden, zum Beispiel unter Verwendung gebräuchlicher, dem Fachmann bekannter Techniken zur Manipulation von DNS.
In einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung ein DNS-Kontrukt, umfassend eine erfindungsgemäße DNS-Sequenz sowie ein in Pflanzen exprimierbares Strukturgen unter regulatorischer Kontrolle des Ubiquitin-Regulatorsystems genannter Sequenz vor.
Die Erfindung sieht darüberhinaus einen Expressionsvektor, umfassend ein solches DNS-Konstrukt vor.
Das erfindungsgemäße mURS kann in analoger Art und Weise wie das in der EP-A-0342926 beschriebene URS verwendet werden, auf welches Dokument hiermit für weitere Details in Bezug genommen wird. Insbesondere kann das mURS zur gesteuerten Expression eines damit assoziierten Strukturgens in Zellen, insbesondere pflanzlichen Zellen (Monokotyledone oder Dikotyledone) verwendet werden.
Die Erfindung umfaßt somit die erfindungsgemäße Verwendung einer DNS-Sequenz, eines DNS-Konstrukts oder eines Expressionsvektors zur Transformation von Zellen, insbesondere Pflanzenzellen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt sieht ein Verfahren zur Transformation von Wirtszellen vor, insbesondere Pflanzenzellen, umfassend das Einbringen einer erfindungsgemäßen DNS-Sequenz, eines DNS-Konstrukts oder Expressionsvektors in eine Zelle.
Verfahren zur Erzielung einer solchen Transformation sind dem Fachmann bekannt und umfassen im wesentlichen die Schritte der Herstellung eines pflanzlichen Expressionsvektors, umfassend eine Protein-codierende Sequenz und das erfindungsgemäße modifizierte Ubiquitin-Regulatorsystem, und Einbringen des Expressionsvektors in eine Pflanzenzelle.
Vorzugsweise wird die Pflanzenzelle zu einer Pflanze fortgepflanzt und die Protein-codierende Sequenz exprimiert. Die vorliegende Erfindung umfaßt darüberhinaus eine transgene Pflanzenzelle, Pflanze oder Samen, umfassend ein Genkon strukt, umfassend das modifizierte Ubiquitin-Regulatorsystem.
Bei der genannten Pflanze handelt es sich vorzugsweise um eine Monokotyledone, wie beispielsweise Weizen, Gerste, Hafer, Roggen oder Mais. Am meisten bevorzugt ist Weizen.
Die Erfindung schließt weiterhin in ihrem Umfang eine Wirtszelle ein, insbesondere eine Pflanzenzelle, in die eine erfindungsgemäße DNS-Sequenz, ein DNS-Konstrukt oder ein Expressionsvektor eingebracht worden ist.
Darüberhinaus sieht die Erfindung ein Verfahren zur konstitutiven Expression eines Strukturgens in einer Wirtszelle vor, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: Einbringen des mit einer wie oben definierten erfindungsgemäßen DNS-Sequenz funktionell verknüpften Strukturgens in die Wirtszelle und Auslösen der konstitutiven Expression des Strukturgens.
Das modifizierte Ubiquitin-Regulatorsystem oder der Promotor können verkürzt werden, um das kleinste noch zur Expression fähige Fragment zu bestimmen. Verfahren zum Verkürzen/Schneiden schließen die Deletion von Sequenzen sowie den Abbau der Sequenz mit einem Restriktionsenzym oder einer anderen Nuclease ein, um im wesentlichen die selben Eigenschaften und/oder Aktivität der ungekürzten Sequenz zu erhalten. Diese Verfahren sind im Stand der Technik der Molekularbiologie bekannt.
Um die Promotoraktivität zu bestimmen, wird üblicherweise ein transientes Reportergen-Expressionssystem verwendet. In solch einem System oder einer Analyse würde das zu untersuchende Fragment an ein Reportergen geknüpft und damit eine Pflanzenzelle transformiert. Geeignete Reportergene schließen die Chloramphenicol-acetyltransferase (CAT), Luciferase (Lux) und die β-Glucoronidase (GUS) ein.
Das erfindungsgemäße mURS ist im allgemeinen identisch mit einem unmodifizierten URS, mit dem Unterschied, daß es durch Hitze nicht induzierbar ist (und möglicherweise auch nicht in Reaktion auf andere Stressbedingungen). Die Erfindung sieht somit ein neuartiges Regulatorsystem vor, das damit assoziierten DNS-Sequenzen eine nicht hitze-induzierbare konstitutive Expression verleiht. Der Vorteil dieses Systems liegt darin, daß die dadurch in transformierten Pflanzenzellen vermittelte Expression der assoziierten DNS-Sequenzen stabil ist und nicht von Änderungen der Umgebungstemperatur beeinflußt wird, wie dies bei einem, beispielsweise in der EP-A-0342926 beschriebenen unmodifiziertem System der Fall wäre.
Es konnte gezeigt werden, daß das mURS eine starke, mit der eines unmodifizierten (Wild-Typ) URS vergleichbare konstitutive Expression vermittelt und stabile konstitutive Expression unter Hitzestress-Bedingungen ergibt.
Die EP-A-0342926 beinhaltet Definitionen verschiedener auch in vorliegender Beschreibung verwendeter Begriffe, eingeschlossen "Expression", "Promotor", "regu latorische Kontrolle", "Strukturgen", "pflanzliches Ubiquitin-Regulatorsystem", "Hitzeschock-Elemente" und "Introns". Diese Definitionen sind auch für die in der vorliegenden Beschreibung verwendeten Begriffe gültig.
Die Erfindung wird zur Veranschaulichung in den folgenden Beispielen und unter Bezugnahme auf die angefügten Zeichnungen und Tabellen näher beschrieben, worin:
1 eine Restriktionskarte des Plasmids pPBI96-36 darstellt;
2 die vorausgesagte Sequenz der mURS-Sequenz in pPBI97-U3 mit der KpnI-Stelle, welche die umrahmten überlappenden Hitzeschock-Elemente im Wild-Typ URS ersetzt (diese Figur entspricht SEQ. ID. NO. 8) zeigt;
3 eine Restriktionskarte des Plasmids pPBI97-dUG1 darstellt;
4 eine Restriktionskarte des Plasmids PPBI97-2BdUN1 darstellt.
5 die Restriktionskarte des Plasmids pUN1, enthaltend das Wild-Typ-URS, welches das durch NpTII selektierbare Marker-Gen steuert, zeigt.
6 ein Balkendiagramm darstellt, das die gemittelte relative NptII-Expression jedes Transformationsereignisses nach Hitzeschock (grau) und ohne Hitzeschock (schwarz) darstellt. Ergebnisse für transgene Wild-Typ-URS-Linien sind in Auflistung (a) und Ergebnisse des mURS sind in Auflistung (b) gezeigt.
7 eine Schemazeichnung einer Partikelbeschußkammer (nicht maßstabsgetreu) darstellt.
Tabellen 1 und 2 die Menge der NptII-Expression jeder Pflanze (Expression im Vergleich zur rRNS-Kontrolle) mit und ohne Hitzeschock-Behandlung sowie das Transformationsereignis, von dem die Pflanzen abgeleitet wurden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Amplifikation eines mURS unter Verwendung von genomischer Mais-DNS als Template
Mittels PCR-Amplifikation zweier DNS-Fragmente unter Verwendung genomischer Mais-DNS (Mais-Genotyp B73) als Template, gefolgt von Ligation der zwei Fragmente zur Bildung eines einzelnen Fragments, dem die Konsensus-Hitzeschock-(HS)-Elemente fehlen, wurde ein mURS hergestellt. Anstelle der HS-Elemente wurde eine KpnI-Restriktionsstelle eingeführt.
Die verwendeten PCR-Primer wurden basierend auf der von Liu et al., 1995 (Biochem Cell Biol. 73: 19–30; Datenbankeintragung ZMU29159) veröffentlichten Sequenzinformation konzipiert. Um das HS-Element aus dem Wild-Typ-URS zu deletieren und durch eine diagnostische KpnI-Stelle zu ersetzen, wurden zwei Fragmente unter Verwendung der Primerkombinationen HS1 + Ubi3-3 und HS2 + Ubi5-2, deren Sequenzen weiter unten genannt werden, amplifiziert. Die Primer Ubi5-2 und Ubi3-3 sind homolog zu Sequenzen in der von Liu et al. veröffentlichten Promotorsequenz. Die Primer HS1 und HS2 sind homolog zu Sequenzen, die unmittelbar am jeweiligen 3'- und 5'-Ende der zwei überlappenden HS-Elemente im oben beschriebenen Ubiquitinpromotor lokalisiert sind. Diese beiden Primer besitzen an deren 5'-Enden jeweils einen KpnI-Schwanz (gezeigt in fettgedruckten Lettern der Sequenzen).
Die amplifizierten Produkte wurden in den pGEM TEasy (Promega) subkloniert, um die Plasmide pPBI97-U1 und pPBI97-U2 zu erzeugen. Mittles Restriktionsverdauanalyse wurde die richtige Orientierung für die anschliessende Subklonierung nachgewiesen. Mittels Subklonierung eines KpnI-SacI-Fragments aus pPBI97-U1 in die KpnI/SacI-Stellen von pPBI97-U2 wurde eine, den Promotor und das Intron umfassende Volllängen-(2 Kb)-mURS-Sequenz hergestellt, um so pPBI97-U3 zu erzeugen. Die vorausgesagte Sequenz des klonierten mURS-Fragmentes in pPBI97-U3 ist in 2 als SEQ ID No. 8 gezeigt. Die KpnI-Stelle, welche die überlappenden Hitzeschock-Elemente im Wild-Typ-URS ersetzt, durch Umrahmung hervorgehoben. Das pPBI97-U3 enthält eine Sequenz mit ungefähr 35 Basenpaare an seinem 5'-Ende und eine Sequenz mit ungefähr 40 Basenpaare an seinem 3'-Ende, wobei beide Sequenzen nicht im Plasmid pAHC25 oder seinen Derivaten vorkommen.
Das mURS wurde als PstI-Fragment aus pPBI97-U3 in die PstI-Stellen des pPBI96-36 transferiert, wodurch das Wild-Typ-URS in pPBI96-36 (1) ersetzt wird, um pPBI97-dUG1 (auch als p97-dUG1 bezeichnet) zu erzeugen (3). Die Orientierung des modifizierten Promotors wurde mittels der KpnI-Stelle bestimmt, welche im modifizierten, nicht jedoch im Wild-Typ-Promotor vorliegt. pPBI96-36 und pPBI97-dUG1 sind identisch, mit Ausnahme davon, daß pPBI96-36 das Wild-Typ-URS aus pAHC25 enthält, wohingegen pPBI97-dUG1 das mURS aus Plasmid pPBI97-U3 enthält.
Die Funktion des mURS in pPBI97-dUG1 wurde mittels transienter Transformationsanalyse durch Partikelbeschuß unterschiedlicher Pflanzengewebe und im Vergleich der durch das Wild-Typ-URS in pPBI96-36 vermittelten Expression bestimmt.
Die folgenden Pflanzengewebe wurden analysiert: unreife Embryonen von Weizen und Hafer, Weizenblätter, Weizenwurzeln, Tabakblätter, Zellsuspensionen der Ölpalme.
Nach Beschuß wurden die Gewebe vor histochemischen Analyse 24 Stunden bei 20°C inkubiert.
Die durch die GUS-Expression sichtbar gemachten Ergebnisse zeigten im Vergleich der beiden verschiedenen Plasmide keinen Unterschied, was nahelegt, daß die Deletion der Hitzeschock-Sequenz nicht die Fähigkeit des modifizierten Promotors beeinträchtigt, in diesen Geweben und unter genannten Bedingungen hohe Mengen an konstitutiver Expression zu vermitteln.
Beispiel 2
Das aus dem Mais-Genom abgeleitete mURS in pPBI97-dUG1 wurde auch stromaufwärts einer Neomycin-phosphotransferase (NptII)-Sequenz transferiert, um ein Plasmid pPBI97-2BdUN1 (auch als P97-2BdUN1 bezeichnet) zu erzeugen (4). Dieses Plasmid wurde wie in der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 00/15810 beschrieben und im folgenden wiederholt erfolgreich als selektierbares Markerkonstrukt bei der stabilen Transformation von Weizen verwendet.
Beispiel 3
Das mURS verleiht nicht hitze-induzierbare konstitutive Expression
Transformation der Pflanze
Unreife Embryonen (IMEs) der Weizensorte Bob White wurden mit pPBI97 2BdUN1, umfassend das mURS, welches das NptII selektierbare Markergen steuert, beschossen. In unabhängigen Experimenten wurden IMEs darüberhinaus mit dem Plasmid pUN1 (5), umfassend das NptII steuernde Wild-Typ-URS beschossen.
Es wurde eine Anzahl unabhängiger Primär-Transformanten (Ro-Generation) erzeugt.
Hitzeschock-Behandlung
Für die Analyse der Hitzeinduzierbarkeit wurden insgesamt fünf pPBI97 2BdUN1-Transformanten und zwei t pUN1-Transformanten ausgewählt. Die Primär-Transformanten wurden zum Auskeimen gerbacht und der R1-Keim gesammelt. Es wurden zwischen 22 und 25 R1-Keime pro unabhängigem Transformantionsereignis ausgesät und die Keimlinge mittels Blattausbleich-Analyse auf ihre NptII-Aktivität untersucht. Insgesamt 8–12 bei der Blattausbleichanalyse positive NptII-Pflanzen jedes Usprungstransformationseignisses wurden selektiert und in einem Gewächshaus bis zur 2–3-blättrigen Wachstumsstufe wachsen gelassen. Anschließend wurden die Pflanzen aus dem Gewächshaus entfernt und 4–6 Pflanzen jedes Ereignisses einer Hitzeschock-Behandlung für 2 Stunden bei 42 Grad C in einem Vulcan^TM-Inkubator unterzogen und 4–6 Pflanzen jedes Ereignisses bei Raumtemperatur belassen, d.h. nicht hitzschockbehandelt. Von allen Linien, sowohl den hitzeschock behandelten als auch den nicht hitzeschockbehandelten, wurde Blattmaterial geerntet und bis zur Analyse bei –70°C gelagert.
RNS-Isolierung und Northern Blotting
Das gefrorene Blattgewebe jeder Pflanze wurde in einem Braun-Mikrodismembrator^TM bis zu einem feinen Pulver in flüssigem Stickstoff verrieben. Aus ungefähr 100 mg gefrorenem und verriebenem Gewebe wurde die Gesamt-RNS unter Verwendung des Qiagen Rneasy^TM-Extraktionskits gemäß Herstellerangaben extrahiert. 15 μg Gesamt-RNS wurden auf 1%-iger Agarose, 2,21 M Formaldehyd, 40 mM MOPS, pH 7,0, 10 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA-Gel in 40 mM MOPS, pH 7, 10 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA Laufpuffers bei 1 V/cm über Nacht einer Elektrophorese unterzogen. Die Gele wurden kurz in sterilem destilliertem Wasser gewaschen und über Nacht auf HyBond N⁺ (Amersham International) gemäß Standardprotokoll (Sambrook et al., 1989) geblottet. Die Blots wurden anschließend zerlegt und für 2 Stunden luftgetrocknet, bevor eine UV-Fixierung bei 312 nm für 2 Minuten erfolgte.
Sondenmarkierung und Hybridisierung
25 ng einer geeigneten Sonde (NptII oder ribosomales 25S-Fragment aus Weizen) wurden mittels des Rediprime 11^TM-Systems (Amersham International) unter Verwendung von α³²PdCTP (Amersham International) nach Herstellerangaben radioaktiv markiert. Die Blots wurden über Nacht bei 65°C in 0,6 M NaCl, 20 mM Pipes, 4 mM Na₂EDTA·2H₂O, 0,2% Gelatine, 0,2% Ficoll400, 0,2% PVP-360, 10 mM Na₄P₂O₇·10H₂O, 0,8% SDS, 0,5 mg/ml denaturierter Lachssperma-DNS hybridisiert. Die Waschschritte nach Hybridisierung erfolgten in 30 mM NaCl, 2 mM NaH₂PO₄·2H₂O, 0,2 mM Na₂EDTA·2H₂O, 0,1% SDS bei Raumtemperatur für 30 Minuten, anschließend bei 65° für 10 Minuten. Die Blots wurden auf Typhoon^TM General Purpose-Phosphorimagerraster in Abhängigkeit der Signalstärke für 1–2 Tage ausgelegt und die Raster auf einem Typhoon^TM-Phosphorimager ausgelesen, um die Signalintensität zu quantifizieren.
Die NptII-Expression wurde relativ zur Menge der ribosomalen RNS bestimmt, um die Abweichung der Gesamt-RNS-Beladung zu standardisieren.
Ergebnisse:
In Tabelle 1 ist die relative NptII-Expression in Abkömmlinge zweier unabhängiger pUN1 (Wild-Typ URS)-Transformantionsreignisse (Linien 694 und 695) gezeigt (Tabelle 1). Die durchschnittliche Expression der Abkömmlinge der Linie 694 nach Hitzeschock war 5-mal stärker, als die der bei Raumtemperatur gehaltenen Abkömmlinge (6a). Dementsprechend zeigte die Expression in Abkömmlingen der Linie 695 eine 3,4-fache Induktion nach Hitzeschock (6a). Dies bestätigt, daß das Wild-Typ URS hitzeinduzierbar ist.
In Tabelle 2 ist die relative NptII-Expression in Abkömmlingen fünf voneinander unabhängiger (Linien 563, 564, 578, 604, 618) pPBI97 2BdUN1 (mURS)-Transformationsereignisse gezeigt. In allen Linien war durchschnittliche Expression nach Hitzeschock entweder gerringer oder vergleichbar mit der in Pflanzen, die bei Raumtemperatur gehalten wurden, was nahelegt, daß die Expression des mURS nicht hitzeinduzierbar ist (6b). Dies wiederum zeigt, daß das Entfernen der Hitzeschock-Elemente aus dem URS zu einem nicht hitzeinduzierbaren Muster der Expression führt.
Tabelle 1
Tabelle 2
In den oben beschriebenen Beispielen verwendete Methoden und Materialien
Das hierin beschriebene Weizentransformationsverfahren basiert größtenteils auf einem von Barcelo und Lazzeri (1995) offenbarten Verfahren: Transformation von Cerealien mittels Mikroprojektilbeschuß von unreifen Infloreszenz- und Scutellumgeweben; Methods in Molecular Biology-Plant Gene Transfer and Expression Protocols (Bd. 49), 113–123; Jones H (Hrgb.) Humana Press Inc., Totowa, NJ.
Embryonale Weizenpflanzen des Sommerweizens der BobWhite-Sorte wurden in einem Gewächshaus bei einer Tageslänge von 16 Stunden mit zusätzlichem Licht herangezogen, um eine minimale Lichtintensität von 500 μMol m^–2s^–1 in einer Höhe von 0,5 m oberhalb des höchsten Blattes zu erzielen. Die Gewächshaustemperaturen wurden bei 19°C +/– 1°C während des Tages und 14°C +/– 1°C bei Nacht gehalten.
Die unreifen Weizenembryonen wurden aus dem heranwachsenden Weizen geerntet. Die Samen wurden geerntet und die Embryonen ungefähr 12 Tage nach Bestäubung in Kultur genommen, wobei die Embryonen zu diesem Zeitpunkt eine ungefähre Länge von 1 mm erreicht hatten. Die Samen wurden für 5 Minuten in 70%-igem Ethanol gewaschen und anschließend in einer 10%-igen Lösung Domestos-Bleichmittel (Domestos ist ein Markenname) über 15 Minuten sterilisiert, gefolgt von 6 Waschschritten mit sterilem destilliertem Wasser. Nach Entfernung der Embryonalachse wurden die Embryonen mit der Achsenoberfläche nach unten auf festem Agargel MM1-Medium (Sigma Katalog Nr. A-3301) ausgelegt. Das allgemeingültige Rezept für MM1 wird in Anhang 1, und die Rezepte für die unterschiedlichen Bestandteile in Anhang 2 wiedergegeben. Die Embryonen wurden vor Beschuß für ein bis zwei Tage bei 24°C +/– 1°C in Dunkelheit gehalten.
Es wurden die Plasmide pUN1 und p97-2BdUN1 verwendet, um Selektionsmarker zu bilden. Die Plasmide pUN1 und p97-2BdUN1 enthalten chimere Promotor-NptII-Genfusionsprodukte und sehen eine Transformantenselektion gegen eine Vielfalt von Aminoglykosid-Antibiotika vor, eingeschlossen Kanamycin, Neomycin, Genticin und Paromycin.
Zum Einbringen der Plasmide in die Pflanzenzellen wurde ein Partikelbeschuß angewendet. Um die Plasmid-DNS auf 0,6 μm Goldpartikel aufzubringen wurde das folgende Verfahren verwendet (BIO-RAD Katalog Nummer 165-2262): Insgesamt 5 μg Plasmid-DNS wurden zu 50 μl einer zuvor für eine Minute ultraschallbehandelten Goldpartikelsuspension (10 mg/ml) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Nach kurzem Vortexen während drei Sekunden wurden 50 μl einer 0,5 M Lösung Calciumchlorid und 20 μl einer 0,05 M Lösung spermidinfreier Base an den gegenüberliegenden Enden des Mikrozentrifugenröhrchendeckels aufgebracht. Der Röhrcheninhalt wurden durch Verschließen des Deckels und Abklopfen des Calciumchlorids und des Spermidins vom Röhrchendeckel vermischt. Nach Vortexen für drei Sekunden wurde die Suspension anschließend bei 13.000 Upm für 5 Sekunden zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet in 150 μl reinem Alkohol resuspendiert. Dies setzt das Abschaben der Goldpartikel von der Innenseite des Röhrchens unter Verwendung der Pipettenspitze voraus. Nach einem weiteren Vortexschritt für drei Sekunden wurde die Probe erneut zentrifugiert und das Pellet in reinem Ethanol bei einem Gesamtvolumen von 85 μl aufgenommen. Die Partikel wurden kurz gevortext und für 5 Sekunden in einem Camlab Trisonic T310 Ultraschallwasserbad ultraschallbehandelt, um eine feine Dispersion zu erzeugen. Ein Aliquot von 5 μl der DNS-beschichteten Goldpartikel wurde in der Mitte eines Makroträgers (BIO-RAD Katalog Nr. 115-2335) aufgetragen und für 30 Minuten getrocknet. Der Partikelbeschuß erfolgte unter Verwendung einer, schematisch in 7 gezeigten Biolisti^TM PDS-1000/He-Kammer (BIO-RAD Instruments, Hercules, CA) bei einem Heliumdruck von 650 und 900 psi (Sprengscheiben: BIO-RAD Katalog Nummer 165-2327 und 165-2328).
Wie die 7 zeigt, umfaßt die dargestellte Vakuumkammer ein Gehäuse 10, dessen innere Seitenwände eine Reihe von Einbuchtungen 12 zur Aufnahme von Einlegeböden aufweisen, wie beispielsweise den gezeigten Probeeinlegeboden 14, der sich von der Oberkante des Gehäuses aus gesehen auf der vierten Ebene befindet. Eine Berstscheibe 16 ist in einer He-Druckschockröhre 18 nahe der Gehäuseoberseite angebracht. Eine Auflage 20, die sich von der Gehäuseoberseite aus gesehen in der zweiten Einbuchtung der Einbuchtungen 12 befindet, trägt die Einheit 22, die einen Stoppschirm umfasst sowie eine Anzahl von Ringen 24, wobei sich 11 Ringe unterhalb der Aufnahme 20 und 3–4 Ringe oberhalb der Aufnahme 20 befinden. Der Makroträger 26 ist auf der Oberseite der Einheit 22 angebracht. Die ungefähre Entfernung der Berstscheibe 16 zum Makroträger 26 beträgt 25 mm, mit einer ungefähren Entfernung des Makroträgers 26 zum Stoppschirm von 7 mm und einer ungefähren Entfernung des Stoppschirms zum Probeneinschub 14 von 67 mm. Die Oberseite der Einheit 22 ist etwa 21 mm von der Unterseite der Druckschockröhre 18 entfernt und die Unterseite der Einheit 22 etwa 31 mm von der Oberseite des Probeneinschubs 14.
Unreife Embryonen wurden zwischen Tag 1 und 2 nach der Kultur beschossen. Für den Beschuß wurden die unreifen Embryonen in einer kreisförmigen Anordnung von etwa 1 cm Durchmesser, umfassend 20–100 Embryonen, gruppiert, wobei die Seite der Embryonalachse auf dem MM1-Medium nach unten zeigte. Eine das Gewebe enthaltende Petrischale wurde, wie in 7 gezeigt, auf den Einschub 14 auf dem vierten Einschubniveau von oben gesehen, in die Kammer gelegt. In der Kammer wurde anschließend ein Vakuum von 723,9 mm (28,5 inch) Hg erzeugt. Der Makroträger 26 wurde unter Verwendung von Berstmembranen, welche bersten, wenn der He-Druck in der Schockröhre 18 650 oder 900 psi (45,71 bar oder 63,29 bar) erreicht, mittels einer Heliumschockwelle beschleunigt. 1 Stunde nach Beschuß wurden die beschossenen Embryonen mit 10 Embryonen pro 9 cm Petrischale auf MM1-Medium gesetzt und anschließend für 2–3 Wochen bei 24°C in ständiger Dunkelheit gehalten. Während dieses Zeitraums bildete sich der somatische embryogene Callus auf den beschossenen Embryonen.
Nach 2–3 Wochen wurden die Embryonen auf ein verfestigtes Agar-Regenerationsmedium transferiert, bekannt als R-Medium, und einer Tageslänge von 16 Stunden bei 24°C inkubiert. Das allgemeine Rezept für das R-Medium ist in An hang 1 gegeben. Die Embryonen wurden alle 2–3 Wochen auf frische Platten transferiert. Zur Selektion der Transformanten mit dem NptII-Gen wurden drei unterschiedliche Behandlungen herangezogen: 1) Geneticin (GIBCO-BRL Katalog Nr. 10131-019) wurde unmittelbar beim Transfer in das Regenerationsmedium (bei 50 mg/l) eingebracht und 50 mg/l bei den anschließenden Transfers auf Regenerationsmedium beibehalten. 2) & 3) Embryonen wurden zuerst ohne Selektion für 12 Tage und 2–3 Woche repektive f Regenerationsmedium transferiert und anschließend auf ein Medium transferiert, das 50 mg/l Geneticin enthielt. Nach 2–3 Passagen auf Regenerationsmedium wurden regenerierende Sprößlinge in individuelle Kulturröhrchen, enthaltend 15 ml Regenerationsmedium bei halber Salzstärke, transferiert, unter Selektion durch 35 mg/l Geneticin. Nach Wurzelausbildung wurden die regenerierten Pflanzen in Erde und ins Gewächshaus transferiert.
Blattausbleich-Analyse
Primäre Transformanten und Abkömmlinge wurden mittels der Blattausbleich-Analyse, wie beschrieben im Plant Physiol. (1997), 115: 971–980, idnetifiziert. Blattstückchen wurden mit Paromomycin vakuuminfiltriert und nach 2–3 Tagen auf Resistenz untersucht. Dieses Verfahren wurde durch Vergleich mit Ergebnissen aus der Analyse der genomischen DNS mittels Southern-Blotting bestätigt.
Genomische DNS-Isolierung und Southern-Analysen
Die Southern-Analysen der primären Transformanten und des Materials von Abkömmlingen wurden wie folgt durchgeführt: Gefriergetrocknetes Blattgewebe wurde kurz in einem Kontes^TM-Mörser mit Pestil verrieben und genomische DNS wie in Fulton et al., 1995 beschrieben extrahiert. wurden Mit einem geeigneten Restriktionsenzym wurden 5 μg DNS nach Herstellervorgaben verdaut und über Nacht einer Elektrophorese auf einem 1%-igen Agarosegel unterzogen, anschließend das Gel fotografiert, gewaschen und gemäß dem Southern-Verfahren unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, NY) auf Hybond N+^TM (Amesham International) geblottet. Nach dem Blotten wurden die Filter luftgetrocknet, anschließend bei 65°C für 1–2 Stunden gebacken und bei 312 nm für 2 Minuten UV-fixiert.
Die Sondenherstellung und Markierung zur Southern-Analyse von transformiertem Material wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
Die GUS-Histochemie wurde im wesentlichen wie in Jefferson (1987), Plant Molecular Biology Reporter, 5(4), 387–405 beschrieben, durchgeführt. Anhang 1. Rezept für 2-fach konzentriertes MM1-Medium
Sterilfiltration und Zugabe eines äquivalenten Volumens von Moulten 2-fach Agargel (10 g/l). Rezept für 2-fach konzentriertes R-Medium
Sterilfiltration und Zugabe eines äquivalenten Volumens von Moulten 2-fach Agar (16 g/Liter) Anhang 2 Rezepte für die Bestandteile des MM1- und R-Mediums Mikrosalze L (1000-fach Stammlösung)
Sterilfiltrierung durch 22 μm-Membranfilter
Lagerung bei 4°C Makrosalze MS (10-fach Stammlösung)
NB: Lösen des CaCl₂ vor Mischen mit anderen Komponenten
NB; Herstellung von KH₂PO₄ getrennt in sterilem H₂O und Zugabe zum Schluss.
Lagerung der Lösung bei 4°C nach Autoklavieren Modifizierte MS Vitamine (1000-fach Stammlösung)
Lagerung der Lösung in 10 ml Aliquots bei –20°C 3 Aminosäurelösung (25-fach Stammlösung)
Lagerung der Lösung in 40 ml Aliquots bei –20°C Makrosalze L7 (10-fach Stammlösung)
NB: Lösen des CaCl₂ vor Mischen mit anderen Komponenten
NB; Erzeugen von KH₂PO₄ getrennt in 50 ml H₂O und Zugabe zum Schluss
Lagerung der Lösung bei 4°C nach Autoklavieren Vitamine/Inositol (200-fach Stammlösung)
Lagerung der Lösung in 40 ml Aliquots bei –20°C
SEQUENZLISTE

Claims

DNS, umfassend ein Ubiquitin-Regulatorsystem, dem Hitzeschock-Elemente fehlen, worin das Ubiquitin-Regulatorsystem eine DNS mit der Nucleotidsequenz gemäß SEQ. ID. NR. 8 umfaßt.
DNS gemäß Anspruch 1, worin das Ubiquitin-Regulatorsystem ein Intron umfaßt.
DNS-Konstrukt, umfassend eine DNS gemäß irgendeinem der vorangehenden Ansprüche und ein unter regulatorischer Kontrolle des Ubiquitin-Regulatorsystems der genannte DNS in Pflanzen exprimierbares Struktur-Gen.
Expressions-Vektor, umfassend ein DNS-Konstrukt gemäß Anspruch 3.
Verwendung einer DNS, eines DNS-Kontrukts oder Expressions-Vektors gemäß irgendeinem der vorangehenden Ansprüche zur Transformation von Pflanzen-Zellen.
Verfahren zur Transformation einer Pflanzen-Zelle durch Einbringen einer DNS, eines DNS-Konstrukts oder Expressions-Vektors gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 in die Zelle.
Isolierte Wirtszelle, vorzugsweise Pflanzen-Zelle, in die eine DNS, ein DNS-Konstrukt oder Expressions-Vektor gemäß den Ansprüchen 1–4 eingebracht worden ist.
Verfahren zur Expression eines Struktur-Gens in einer Pflanzen-Zelle, umfassend die Schritte: Einbringen eines mit einer DNS gemäß den Ansprüchen 1 oder 2 funktionell verknüpften Struktur-Gens in die Wirtszelle; und Auslösen der konstitutiven Expression des Struktur-Gens durch die Wirtszelle.
Transgene Pflanze, umfassend die DNS gemäß den Ansprüchen 1 oder 2 oder umfassend das DNS-Konstrukt gemäß Anspruch 3 oder umfassend den Expressions-Vektor gemäß Anspruch 4.
Pflanze gemäß Anspruch 10, worin die Pflanze eine Monokotyledone, wie beispielsweise Weizen, Gerste, Hafer, Roggen oder Mais ist.
Pflanzensamen, umfassend die DNS gemäß Ansprüchen 1 oder 2 oder umfassend das DNS-Konstrukt gemäß Anspruch 3 oder umfassend den Expressions-Vektor gemäß Anspruch 4.