DE69932868T2

DE69932868T2 - Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz für einen Promotor

Info

Publication number: DE69932868T2
Application number: DE69932868T
Authority: DE
Inventors: Douglas Des Moines Rice
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1998-02-26
Filing date: 1999-02-25
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2019-02-26
Also published as: US6177611B1; DE69933713D1; ATE342985T1; ZA991528B; ATE336580T1; ES2270227T3; WO1999043797A2; AU2880399A; AU762993B2; PT1056864E; EP1056864A2; AR014072A1; AU762993C; ATE278782T1; DE69932868D1; ES2273127T3; CA2315546C; DE69920879T2; DE69933713T2; CA2315546A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie der Pflanzen, und insbesondere die Regulation der Genexpression in Pflanzen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Expression heterologer DNA-Sequenzen in einer Wirtspflanze ist von der Anwesenheit eines funktionell verknüpften Promotors, der innerhalb der Pflanzenzelle funktionell ist, abhängig. Die Wahl der Promotorsequenz wird bestimmen, wann und wo die heterologe DNA-Sequenz innerhalb des Organismus exprimiert wird. Folglich werden, wo kontinuierliche Expression in den ganzen Zellen einer Pflanze erwünscht ist, konstitutive Promotoren verwendet. Dagegen sind, wo Genexpression als Antwort auf einen Stimulus erwünscht ist, induzierbare Promotoren das regulatorische Element der Wahl. In jedem Fall können zusätzliche regulatorische Sequenzen stromaufwärts und/oder stromabwärts von der Kernpromotorsequenz in Expressionskonstrukten von Transformationsvektoren eingeschlossen sein um unterschiedliche Level konstitutiver oder induzierbarer Expression heterologer Nukleotidsequenzen in einer transgenen Pflanze herbeizuführen.
Oft ist es wünschenswert, konstitutive Expression einer DNA-Sequenz in den ganzen Zellen eines Organismus zu haben. Beispielsweise könnte eine erhöhte Resistenz einer Pflanze gegen Infektion durch Pathogene, die aus dem Boden oder der Luft stammen, durch genetische Manipulation des Genoms der Pflanze, um einen konstitutiven Promotor, funktionell verknüpft mit einem heterologen Pathogenresistenzgen, zu umfassen, so dass Pathogenresistenzproteine kontinuierlich in den ganzen Geweben der Pflanze exprimiert werden, erreicht werden.
Alternativ könnte es wünschenswert sein, die Expression einer nativen DNA-Sequenz innerhalb der Gewebe einer Pflanze zu inhibieren um einen gewünschten Phänotyp zu erzielen. In diesem Fall könnte eine solche Inhibition durch Transformation der Pflanze, um einen konstitutiven Promotor, funktionell verknüpft mit einer Antisense-Nukleotidsequenz, zu umfassen, so dass konstitutive Expression der Antisensesequenz ein RNA-Transkript produziert, das mit der Translation der mRNR der nativen DNA-Sequenz interferiert, erreicht werden.
Folglich sind Isolierung und Charakterisierung konstitutiver Promotoren, die als regulatorische Regionen zur konstitutiven Expression interessierender heterologer Nukleotidsequenzen dienen können, zur genetischen Manipulation von Pflanzen, um spezifische phänotypische Eigenschaften zu haben, erforderlich.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Zusammensetzungen und Verfahren für das Regulieren der Expression heterologer Nukleotidsequenzen in einer Pflanze sind bereitgestellt.
Die Erfindung stellt deshalb ein isoliertes Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz für einen Promotor, der fähig ist, Transkription in einer Pflanzenzelle zu initiieren, wobei die Nukleotidsequenz ausgewählt ist aus:

(a) einer Nukleotidsequenz, die die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz umfasst;
(b) einer Nukleotidsequenz, die mit der Eingangsnummer ATCC Nr. 207120 hinterlegt ist;
(c) einer Nukleotidsequenz, die mindestens 40 aufeinander folgende Nukleotide der Sequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist;
(d) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Sequenz von a), b) oder c) hybridisiert; und
(e) einer Nukleotidsequenz, die mindestens 70% Sequenzidentität mit einer Sequenz aufweist, die in a) oder b) angeführt ist, bereit.

Die Erfindung stellt außerdem ein DNA-Konstrukt, umfassend eine Nukleotidsequenz der Erfindung, funktionell verknüpft mit einer heterologen Nukleotidsequenz von Interesse, bereit.
Die Erfindung stellt außerdem einen Vektor, umfassend das DNA-Konstrukt gemäß der Erfindung, bereit.
Die Erfindung stellt außerdem eine Wirtszelle bereit, in deren Genom des erfindungsgemäße DNA-Konstrukt stabil inkorporiert ist.
Eine Zusammensetzung, umfassend eine neue Nukleotidsequenz für einen konstitutiven Pflanzenpromotor, isoliert von dem Maisgen, das ein Metallothionein codiert, wird bereitgestellt.
Ein Verfahren zur konstitutiven Expression einer heterologen Nukleotidsequenz in einer Pflanze unter Verwendung der hierin offenbarten Promotorsequenz wird außerdem bereitgestellt. Das Verfahren umfasst Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Transformationsvektor, der eine heterologe Nukleotidsequenz, funktionell verknüpft mit dem Pflanzenpromotor der vorliegenden Erfindung, umfasst, und Regenerieren einer stabil transformierten Pflanze aus der transformierten Pflanzenzelle.
Die Erfindung stellt außerdem eine Pflanzenzelle oder eine Pflanze, stabil transformiert mit einem DNA-Konstrukt gemäß der Erfindung, und einen Samen einer solchen Pflanze bereit.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt den Plasmidvektor PHP3953, der das GUS-Gen, funktionell verknüpft mit dem Ubiquitinpromotor, umfasst. Promotorfragmente der vorliegenden Erfindung wurden in dieses Plasmid anstelle des Ubiquitinpromotors rekloniert, und die resultierende Plasmid-DNA war verfügbar zur Verwendung in Transformationsstudien um auf Promotoraktivität zu untersuchen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist ein Nukleinsäurernolekül, das eine neue Nukleotidsequenz für einen Pflanzenpromtor, spezifischer den konstitutiven Promotor für das Maisgen, das Metallothionein-1 codiert, umfasst. Die Nukleotidsequenz für diesen Promotor ist in SEQ ID NO:1 dargestellt. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, umfassend eine Nukleotidsequenz, codierend die DNA-Sequenz, hinterlegt in einem bakteriellen Wirt als ATCC-Eingangsnummer Nr. 207120, und Varianten und Fragmente davon. Der Promotor für dieses Maisgen wurde aus der 5'-untranslatierten Region, die ihren zugehörigen Transkriptionsstartort flankiert, isoliert. Verfahren für das Isolieren von Promotorregionen sind im Fachgebiet gut bekannt. Das spezifische Verfahren, das verwendet wurde, um den Promotor der vorliegenden Erfindung zu erhalten, ist unten in Beispiel 1 beschrieben.
Ein Plasmid, das die Promotor-Nukleotidsequenz der Erfindung enthält, ist bei der American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia hinterlegt worden, und ihm ist die Eingangsnummer Nr. 207120 zugeteilt worden. Diese Hinterlegung wird gemäß dem Budapester Vertrag für die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren aufrechterhalten werden.
Die Erfindung umfasst eine isolierte oder im Wesentlichen gereinigte Nukleinsäurezusammensetzung. Ein „isoliertes" oder „gereinigtes" Nukleinsäuremolekül oder ein biologisch aktiver Anteil davon ist im Wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium, wenn es durch rekombinante Verfahren hergestellt ist, oder im Wesentlichen frei von chemischen Präkursoren oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert ist. Vorzugsweise ist eine „isolierte" Nukleinsäure frei von Sequenzen (vorzugsweise Protein-codierende Sequenzen), die naturgemäß die Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, von dem die Nukleinsäure stammt, flankieren (d.h. Sequenzen, die an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure lokalisiert sind). Beispielsweise kann, in verschiedenen Ausführungsformen, das isolierte Nukleinsäuremolekül weniger als ungefähr 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0, 5 kb oder 0,1 kb an Nukleotidsequenzen, die naturgemäß das Nukleinsäuremolekül in genomischer DNA der Zelle, von der die Nukleinsäure stammt, enthalten.
„Promotor" soll eine regulatorische Region von DNA bezeichnen, die gewöhnlich eine TATA-Box umfasst, die fähig ist, RNA-Polymerase II zum Initiieren von RNA-Synthese bei dem zugehörigen Transkriptions-Startort für eine bestimmte codierende Sequenz zu dirigieren. Ein Promotor kann zusätzlich andere Erkennungssequenzen umfassen, die im Allgemeinen stromaufwärts oder 5' von der TATA-Box positioniert sind, und die als Upstream-Promotor-Elemente bezeichnet sind und die die Transkripitions-Startgeschwindigkeit beeinflussen. Es wird erkannt, dass es, nachdem die Nukleotidsequenz für die hierin offenbarte Promotorregion identifziert worden ist, innerhalb des Stands der Technik ist, weitere regulatorische Elemente in der 5'-untranslatierten Region stromaufwärts von der speziellen, hierin identifizierten Promotorregion zu isolieren und zu identifizieren. Folglich kann die hierin offenbarte Promotorregion ferner stromaufwärts liegende regulatorische Elemente („upstream regulatory elments") umfassen, die gewebespezifische Expression irgendeiner heterologen Nukleotidsequenz, funktionell verknüpft mit der offenbarten Promotorsequenz, verleihen. Siehe insbesondere australisches Patent Nr. AU-A-7775:1/94 und US-Patent Nrn. 5 466 785 und 5 635 618.
Die Maispromotorsequenz der vorliegenden Erfindung ermöglicht, wenn sie innerhalb eines DNA-Konstrukts eingebaut ist, so dass der Promotor funktionell verknüpft mit einer interessierenden heterologen Nukleotidsequenz ist, die konstitutive Expression der heterologen Nukleotidsequenz in den Zellen einer Pflanze, die stabil mit diesem DNA-Konstrukt transformiert ist. „Heterologe Nukleotidsequenz" soll eine Sequenz bezeichnen, die nicht naturgemäß mit der Promotorsequenz vorkommt. Während diese Nukleotidsequenz heterolog zu der Promotorsequenz ist, kann sie zu der Wirtspflanze homolog oder nativ oder heterolog oder fremd sein. "Konstitutiv" soll Expression in den Zellen überall in einer Pflanze zur meisten Zeit und in den meisten Geweben bezeichnen.
Die isolierte Promotorsequenz der vorliegenden Erfindung kann als ein schwacher konstitutiver Promotor klassifiziert werden. Im Allgemeinen soll durch „schwacher Promotor" ein Promotor bezeichnet werden, der die Expression einer codierenden Sequenz auf einem niedrigen Level antreibt. Mit „niedriger Level" sollen Level von ungefähr 1/10.000 Transkripten bis 1/100.000 Transkripten bis etwa 1/500.000 Transkripten bezeichnet werden. Umgekehrt treibt ein starker Promotor die Expression einer codierenden Sequenz auf einem hohen Level oder bei ungefähr 1/10 Transkripten bis etwa 1/100 Transkripten bis etwa 1/1.000 Transkripten an.
Die Nukleotidsequenz für den konstitutiven Promotor der vorliegenden Erfindung kann die natürlich vorkommende Sequenz sein oder eine beliebige Sequenz, die substantielle Homologie aufweist. „Substantielle Homologie" soll eine Sequenz bezeichnen, die substantielle funktionale und strukturelle Äquivalenz mit der nativen oder natürlich vorkommenden Sequenz aufweist. Irgendwelche funktionalen oder strukturellen Unterschiede zwischen substantiell homologen Sequenzen beeinflussen das Vermögen der Sequenz, als ein Promotor zu wirken, wie er in der vorliegenden Erfindung offenbart ist, nicht. Folglich wird jede Sequenz, die substantielle Sequenzhomologie mit der Sequenz des konstitutiven Promotors der vorliegenden Erfindung aufweist, konstitutive Expression einer funktionell verknüpften heterologen Nukleotidsequenz dirigieren. Zwei Promotornukleotidsequenzen werden als substantiell homolog erachtet, wenn sie wenigstens etwa 50%, 60%, bis zu 70%, im Allgemeinen etwa 80%, vorzugsweise etwa 85%, 90%, bis zu 98% Sequenzhomologie aufweisen.
Substantiell homologe Sequenzen der vorliegenden Erfindung schließen Varianten der offenbarten Sequenzen, wie z.B. jene, die aus ortsgerichteter Mutagenese resultieren, sowie synthetisch abgeleitete Sequenzen ein. Verfahren für Mutagenese und Nukleotidsequenzänderungen sind im Fachgebiet gut bekannt. Siehe beispielsweise Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154:367-382; US-Patent Nr. 4 873 192; Walker et al., Hrsg. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) und die darin zitierten Referenzen. Folglich schließt die Promotor-Nukleotidsequenz der Erfindung sowohl die natürlich vorkommenden Sequenzen, als auch mutierte und synthetisch abgeleitete Formen ein. Im Allgemeinen werden er findungsgemäße Nukleotidsequenzvarianten wenigstens ungefähr 50%, 60% oder bis 70%, im Allgemeinen ungefähr 80%, und vorzugsweise ungefähr 85%, 90% oder bis zu 98%, Sequenzidentität zu ihren entsprechenden nativen Nukleotidsequenzen aufweisen.
Fragmente der hierin offenbarten Promotor-Nukleotidsequenz sind von der vorliegenden Erfindung auch umfasst. „Fragment" soll einen Teil der Promotor-Nukleotidsequenz bedeuten. Fragmente einer Promotor-Nukleotidsequenz können ihre biologische Aktivität beibehalten. Folglich kann beispielsweise weniger als die gesamte hierin offenbarte Promotorsequenz verwendet werden um die Expression einer interessierenden, funktionell verknüpften Nukleotidsequenz, wie z.B. einer Nukleotidsequenz, die für ein heterologes Protein codiert, anzutreiben. Es liegt innerhalb des Könnens eines Fachmanns zu bestimmen, ob derartige Fragmente Expressionslevel herabsetzen oder die Art der Expression, d.h. konstitutive Expression, verändern. Alternativ behalten Fragmente einer Promotornukleotidsequenz, die als Hybridisierungssonden verwendbar sind, im Allgemeinen diese biologische Aktivität nicht bei.
Nukleinsäuremoleküle, die Fragmente einer Promotornukleotidsequenz sind, umfassen wenigstens 40, 45, 50, 75, 100, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200 oder 1.300 Nukleotide, oder bis zu der Anzahl an Nukleotiden, die in einer hierin offenbarten Volllängen-Promotornukleotidsequenz vorhanden sind (d.h. 1.300 für SEQ ID NO: 1). Im Allgemeinen umfassen Fragmente einer Promotorsequenz, die ihre biologische Aktivität beibehalten, wenigstens 40 zusammenhängende Nukleotide, vorzugsweise wenigstens 50 zusammenhängende Nukleotide, bevorzugter wenigstens 75 zusammenhängende Nukleotide und noch bevorzugter wenigstens 1.00 zusammenhängende Nukleotide der hierin offenbarten Promotornukleotidsequenz. Bevorzugte Fragmentlängen hän gen von der Zielsetzung ab und werden außerdem abhängig von der Promotorsequenz variieren.
Die Nukleotidsequenzen solcher Fragmente werden für gewöhnlich die TATA-Erkennungssequenz der Promotorsequenz umfassen. Solche Fragmente können durch Verwendung von Restriktionsenzymen, um die natürlich vorkommende, hierin offenbarte Promotornukleotidsequenz zu spalten, erhalten werden; können erhalten werden durch Synthetisieren einer Nukleotidsequenz von der natürlich vorkommenden Sequenz der Promotor-DNA-Sequenz; oder können erhalten werden durch die Verwendung von PCR-Technologie. Siehe insbesondere Mullis et al. (1987) Methods Enzymol. 155:335-350 und Erlich, Hrsg. (1989) PCR Technology (Stockton Press, New York). Varianten dieser Promotorfragmente wie jene, die aus ortspezifischer Mutagenese resultieren, sind von den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die offenbarte Promotornukleotidsequenz kann verwendet werden um homologe Promotorsequenzen in anderen Pflanzenarten zu isolieren. Im Fachgebiet sind Verfahren zur Hybridisierung von Nukleinsäuresequenzen leicht zugänglich. Promotorsequenzen von anderen Pflanzen können nach wohlbekannten Verfahren, basierend auf ihrer Sequenzhomologie zu der hierin dargelegten Promotorsequenz isoliert werden. Bei diesen Verfahren wird die ganze oder ein Teil der bekannten Nukleotidsequenz als eine Sonde verwendet, die selektiv an andere Promotornukleotidsequenzen hybridisiert, die in einer Population klonierter genomischer DNA-Fragmente oder cDNA-Fragmente (d.h. genomische DNA- oder cDNA-Bank) eines ausgewählten Organismus vorhanden sind.
Um andere homologe Promotorsequenzen zu erhalten, kann die gesamte Promotornukleotidsequenz oder Teile davon als Sonden, die zum spezifischen Hybridisieren an entsprechende Promotor sequenzen imstande sind, verwendet werden. Um spezifische Hybridisierung unter einer Vielfalt von Bedingungen zu erreichen, schließen derartige Sonden Sequenzen ein, die unikal sind und vorzugsweise wenigstens ungefähr 10 Nukleotide lang sind, und am meisten bevorzugt ungefähr wenigstens 20 Nukleotide lang sind. Derartige Sonden können verwendet werden um die interessierenden Promotorsequenzen eines ausgewählten Organismus durch das wohlbekannte Verfahren der Polymerasekettenreaktion (PCR) zu amplifizieren. Dieses Verfahren kann zur Isolierung zusätzlicher Promotorsequenzen eines gewünschten Organismus oder als ein diagnostischer Assay, um die Anwesenheit von Promotorsequenzen in einem Organismus festzustellen, verwendet werden.
Derartige Verfahren schließen das Hybridisierungsscreenen ausplattierter DNA-Banken (entweder Plaques oder Kolonien; siehe z.B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) und Amplifizierung durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotidprimern (siehe z.B. Innis et al., Hrsg. (1990) PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, Academic Press, New York) ein.
Beispielsweise kann die Hybridisierung derartiger Sequenzen unter Bedingungen von reduzierter Stringens, mittlerer Stringens oder sogar unter stringenten Bedingungen (beispielsweise Bedingungen, dargestellt durch eine Waschstringens von 35-40% Formamid mit 5 × Denhardt's Lösung, 0,5% SDS und 1 × SSPE bei 37°C; Bedingungen, dargestellt durch eine Waschstringens von 40-45% Formamid mit 5 × Denhardt's Lösung, 0,5% SDS und 1 × SSPE bei 42°C; bzw. Bedingungen dargestellt durch eine Waschstringens von 50% Formamid mit 5 × Denhardt's Lösung, 0,5% SDS und 1 × SSPE bei 42°C) für DNA für die hierin offenbarte Promotorsequenz in einem Standard-Hybridisierungs-Assay durchgeführt werden. Siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Im Allgemeinen werden homologe Sequenzen, die Promotorsequenzen sind und an die hierin offenbarte Promotorsequenz hybridisieren, wenigstens 70% homolog und sogar 80%, 85%, 90%, 95% homolog oder homologer mit der offenbarten Sequenz sein. D.h., die Sequenzähnlichkeit der Sequenzen kann schwanken, wobei wenigstens ungefähr 70% und sogar 80%, 85%, 90%, 95% oder 98% Sequenzähnlichkeit geteilt werden.
Die folgenden Ausdrücke werden verwendet um die Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehr Nukleinsäuren zu beschreiben: (a) „Referenzsequenz", (b) „Vergleichsfenster", (c) „Sequenzidentität", (d) „Prozent Sequenzidentität" und (e) „substantielle Identität".

(a) Wie hierin verwendet, ist „Referenzsequenz" eine definierte Sequenz, die als Basis für einen Sequenzvergleich verwendet wird. Eine Referenzsequenz kann eine Teilmenge oder die Gesamtheit einer spezifizierten Sequenz sein; beispielsweise also ein Segment einer Volllängen-cDNA oder Gensequenz oder die gesamte cDNA oder Gensequenz.
(b) Wie hierin verwendet, bezieht sich „Vergleichsfenster" auf ein zusammenhängendes und spezifiziertes Segment einer Polynukleotidsequenz, wobei die Polynukleotidsequenz in dem Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) im Vergleich zu der Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) zur optimalen Anordnung der zwei Sequenzen umfassen kann. Im Allgemeinen ist das Vergleichsfenster wenigstens 20 zusammenhängende Nukleotide lang und kann wahlweise 30, 40, 50, 100 oder länger sein. Der Fachmann versteht, dass typischerweise eine Lückenstrafe eingeführt ist und von der Anzahl der Übereinstimmungen subtrahiert wird um eine hohe Ähnlichkeit zu einer Referenzsequenz wegen eines Einschlusses von Lücken in der Polynukleotidsequenz zu vermeiden.

Verfahren zur vergleichenden Sequenzanordnung sind im Fachgebiet gut bekannt. Optimale vergleichende Sequenzanordnung kann mit dem lokale Homologie-Algorithmus („local homology algorithm") von Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; mit dem Homologie-Anordnungsalgorithmus („homology alignment algorithm") von Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443; durch das Suche-nach-Ähnlichkeit-Verfahren („search for similarity method") von Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444; durch computerisierte Ausführungen dieser Algorithmen, die einschließen, aber nicht begrenzt sind auf: CLUSTAL im PC/Gen-Programm von Intelligenetics, Mountain View, California; GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetik-Software-Paket („Wisconsin Genetics Software Package", Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin; durchgeführt werden; das CLUSTAL-Programm ist von Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nuc. Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Computer Applications in the Biosciences 8:155-65, und Person et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331; gut beschrieben. Bevorzugte Computeranordnungsverfahren schließen außerdem die BLASTP-, BLASTN- und BLASTX-Algorithmen (siehe Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410) ein. Anordnung wird außerdem oft durch Betrachtung und manuelle Anordnung durchgeführt.

(c) Wie hierin verwendet, beziehen sich „Sequenzidentität" oder „Identität" im Kontext zweier Nukleinsäuresequenzen auf die Reste in den zwei Sequenzen, die dieselben sind, wenn sie zur maximalen Übereinstimmung über einem spezifizierten Vergleichsfenster angeordnet werden.
(d) Wie hierin verwendet, bedeutet „Prozent Sequenzidentität" den Wert, der durch Vergleichen zweier optimal angeordneter Sequenzen über einem Vergleichsfenster bestimmt wird, wobei der Anteil der Polynukleotidsequenz im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) im Vergleich zur Referenzsequenz (welche keine Additionen oder Deletionen umfasst) zur optimalen Anordnung der beiden Sequenzen umfassen kann. Der Prozentsatz wird durch Bestimmen der Anzahl von Positionen, bei denen die identische Nukleinsäurebase in beiden Sequenzen vorkommt, was die Anzahl zusammenpassender Positionen ergibt, Teilen der Anzahl zusammenpassender Positionen durch die Gesamtzahl von Positionen im Vergleichsfenster und Multiplizieren des Ergebnisses mit 100 um den Prozentsatz an Sequenzidentität zu ergeben, berechnet.
(e)(i) Der Ausdruck „substantielle Identität" von Polynukleotidsequenzen bedeutet, dass ein Polynukleotid eine Sequenz umfasst, die wenigstens 70% Sequenzidentität, vorzugsweise wenigstens 80%, bevorzugter wenigstens 90%, und am meisten bevorzugt wenigstens 95%, verglichen mit einer Referenzsequenz unter Verwendung eines der beschriebenen Anordnungsprogramme unter Verwendung von Standardparametern, aufweist.

Ein weiterer Hinweis, dass Nukleotidsequenzen substantiell identisch sind, ist, wenn zwei Moleküle unter stringenten Bedingungen aneinander hybridisieren. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass sie ungefähr 5°C bis ungefähr 20°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (T_m, „thermal melting point") für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und definiertem pH sind. Die T_m ist die Temperatur (bei definierter/m Ionenstärke und pH), bei der 50% der Zielsequenz an eine perfekt zusammenpassende Sonde hybridisieren. Typischerweise sind stringente Waschbedingungen jene, bei denen die Salzkonzentration bei pH 7 ungefähr 0,02 molar ist, und die Temperatur wenigstens ungefähr 50, 55 oder 60°C ist.
Die Nukleotidsequenz für den konstitutiven Promotor, offenbart in der vorliegenden Erfindung, sowie eine Variante oder ein Fragment davon, ist verwendbar bei der genetischen Manipulation einer beliebigen Pflanze, wenn eingebaut innerhalb eines DNA-Konstrukts, so dass die Promotorsequenz funktionell verknüpft ist mit einer heterologen Nukleotidsequenz, deren konstitutive Expression zu kontrollieren ist, um eine gewünschte phänotypische Antwort zu erzielen. Mit „funktionell verknüpft" ist gemeint, dass sich die Transkription oder Translation der heterologen Nukleotidsequenz unter dem Einfluss der Promotorsequenz befindet. Auf diese Weise wird die Nukleotidsequenz für den Promotor der Erfindung in Expressionskassetten zusammen mit heterologen Nukleotidsequenzen zur Expression in der interessierenden Pflanze bereitgestellt. Es wird anerkannt, dass die erfindungsgemäße Promotorsequenz auch mit ihrer nativen codierenden Sequenz verwendet werden kann, um Expression der nativen codierenden Sequenz zu vergrößern oder zu verringern und dadurch in einer Änderung im Phänotyp der transformierten Pflanze zu resultieren.
Derartige Expressionskassetten werden eine Transkriptions-Startregion umfassen, die die Promotornukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung oder Varianten oder Fragmente davon, funktionell verknüpft mit der heterologen Nukleotidsequenz, deren Expression durch den hierin offenbarten konstitutiven Promotor kontrolliert werden soll, umfasst. Eine derartige Expressionskassette ist mit einer Vielfalt von Restriktionsstellen zur Insertion der Nukleotidsequenz, die unter der Transkriptionsregulation der regulatorischen Regionen sein soll, versehen. Die Expressionskassette kann außerdem selektierbare Markergene enthalten.
Um Transkriptionslevel zu erhöhen, können Verstärker in Kombination mit der erfindungsgemäßen Promotorregion verwendet werden. Verstärker sind Nukleotidsequenzen, die zur Erhöhung der Expression einer Promotorregion wirken. Verstärker sind im Fachgebiet bekannt und schließen die SV40-Verstärkerregion, das 35S-Verstärkerelement und dergleichen ein.
Die Transkriptionskassette wird in der 5'- bis 3'-Richtung der Transkription eine Transkriptions- und Translations-Startregion, eine interessierende heterologe Nukleotidsequenz und eine Transkriptions- und Translations-Terminationsregion, funktional in Pflanzen, einschließen. Die Terminationsregion kann für die Transkriptions-Startregion, umfassend die Promotornukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung, natürlich sein, kann für die interessierende DNA-Sequenz natürlich sein oder kann von einer anderen Quelle abstammen. Geeignete Terminationsregionen sind von dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens erhältlich, wie z.B. die Octopinsynthase- und Nopalinsynthase-Terminationsregionen. Siehe außerdem Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17:7891-7903; Joshi et al. (1987) Nuc. Acid Res. 15:9627-9639.
Die Expressionskassette, die die Promotorsequenz der vorliegenden Erfindung, funktionell verknüpft mit einer heterologen Nukleotidsequenz, umfasst, kann außerdem wenigstens eine zusätzliche Nukleotidsequenz für ein Gen, das in den Organismus co-transformiert werden soll, enthalten. Alternativ kann/kön nen die zusätzliche(n) Sequenz(en) auf einer anderen Expressionskassette bereitgestellt werden.
Wo es angebracht ist, können die heterologen Nukleotidsequenz, deren Expression unter der Kontrolle der Promotorsequenz der vorliegenden Erfindung sein soll, und irgendeine/irgendwelche zusätzliche(n) Nukleotidsequenz(en) für erhöhte Expression in der transformierten Pflanze optimiert sein. D.h., diese Nukleotidsequenzen können unter Verwendung von Pflanzen-bevorzugten LCodons für verbesserte Expression synthetisiert werden. Im Fachgebiet sind Verfahren zum Synthetisieren Pflanzen-bevorzugter Nukleotidsequenzen verfügbar. Siehe beispielsweise US-Patente Nrn. 5 380 831 und 5 436 391 und Murray et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17:477-498.
Zusätzliche Sequenzmodifikationen sind bekannt um Genexpression in einem zellulären Wirt zu verstärken. Diese schließen die Eliminierung von Sequenzen, die ungewollte Polyadenylierungssignale codieren, Exon-Intron-Spleißstellensignale, Transposon-ähnliche Wiederholungen und andere derartige gut charakterisierte Sequenzen, die für die Genexpression schädlich sein können, ein. Der G-C-Gehalt der heterologen Nukleotidsequenz kann an Level, die für einen gegebenen zellulären Wirt Durchschnitt sind, wie unter Bezugnahme auf bekannte Gene, die in der Wirtszelle exprimiert werden, berechnet, angepasst werden. Wenn möglich, wird die Sequenz modifiziert um vorhergesagte mRNA-Haarnadel-Sekundärstrukturen zu vermeiden.
Die Expressionskassetten können zusätzlich 5'-Leadersequenzen im Expressionskassettenkonstrukt enthalten. Solche Leadersequenzen können zur Verstärkung der Translation wirken. Translationsleader sind im Fachgebiet bekannt und schließen ein: Picornavirusleader, beispielsweise EMCV-Leader (Encephalomyocarditis-5'-nicht-codierende Region) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); Potyviruslea der, beispielsweise TEV-Leader (Tabakätzvirus, "Tobacco Etch Virus")(Allison et al. (1986)); MDMV-Leader (Mais-Verzwergungs-Mosaikvirus, "Maize Dwarf Mosaic Virus") (Virology 154:9-20); Bindungsprotein für die schwere Kette von menschlichem Immunoglobulin (BiP, "human immunoglobulin heavy-chain binding protein") (Macejak und Sarnow (1991) Nature 353:90-94); untranslatierter Leader von der Hüllprotein-mRNA von Luzerne-Mosaikvirus ("alfalfa mosaic virus") (AMV RNA 4) (Jobling und Gehrke (1987) Nature 325:622-625); Tabak-Mosaikvirus-Leader (TMV, "tobacco mosaic virus") (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, Seiten 237-256); und Mais-chlorotisch-Scheckungsvirus-Leader (MCMV, "maize chlorotic mottle virus") (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Siehe auch Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84:965-968. Andere Verfahren, die dafür bekannt sind, die Translation und/oder mRNA-Stabilität zu verstärken, z.B. Introns und dergleichen, können außerdem verwendet werden.
In jenen Fällen, wo es wünschenswert ist, das konstitutiv exprimierte Produkt der heterologen Nukleotidsequenz auf eine bestimmte Organelle, wie z.B. den Chloroplasten oder das Mitochondrion, gerichtet oder an der Zelloberfläche oder extrazellulär sezerniert zu haben, kann die Expressionskassette ferner eine für ein Transportpeptid codierende Sequenz umfassen. Derartige Transitpeptide sind im Fachgebiet gut bekannt und schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf das Transitpeptid für das Acylträgerprotein, die kleine Untereinheit von RUBISCO, Pflanzen-EPSP-Synthase und dergleichen.
Beim Vorbereiten der Expressionskassette können die verschiedenen DNA-Fragmente manipuliert werden um für die DNA-Sequenzen in der richtigen Orientierung und, weil erforderlich, im richtigen Leserahmen zu sorgen. Was das betrifft, können Verbindungsstücke oder Linker verwendet werden um die DNA- Fragmente zu verbinden, oder es können andere Manipulationen involviert werden um für geeignete Restriktionsstellen, das Entfernen überflüssiger DNA, das Entfernen von Restriktionsstellen oder dergleichen, zu sorgen. Zu diesem Zweck können beispielsweise in vitro-Mutagenese, Primerreparatur, Restriktion, Doppelstrangbildung, Resubstitutionen, Transitionen und Transversionen involviert sein.
Die Expressionskassette, die die Promotorsequenz der vorliegenden Erfindung, funktionell verknüpft mit einer interessierenden heterologen Nukleotidsequenz, umfasst, kann verwendet werden, um eine beliebige Pflanze zu transformieren. Auf diese Weise können genetisch modifizierte Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe, Samen und dergleichen erhalten werden. Transformationsprotokolle können abhängig von der Art der Pflanze oder Pflanzenzelle, d.h. Monokotyledone oder Dikotyledone, die das Ziel der Transformation ist, variieren. Geeignete Verfahren zum Transformieren von Pflanzenzellen schließen Mikroinjektion (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), Elektroporation (Riggs et al. (1986) Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 83:5602-5606), Agrobacterium-vermittelte Transformation (Hinchee et al. (1988) Biotechnology 6:915-921), direkten Gentransfer (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), und ballistische Partikelbeschleunigung (siehe beispielsweise Sanford et al., US-Patent 4 945 050; Tomes et al. (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, Hrsg. Gamborg und Phillips (Springer-Verlag, Berlin); und McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926) ein. Siehe auch Weissinger et al. (1988) Annual Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (Zwiebel); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (Sojabohne); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (Sojabohne); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (Reis); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (Mais); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (Mais); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (Mais); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839; Hooydaas-Van Slogteren und Hooykaas (1984) Nature (London) 311:763-764; Bytebier et al. (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliengewächse); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, Hrsg. G.P. Chapman et al. (Longman, New York), S. 197-209 (Pollen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418; und Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (Whiskervermittelte Transformation); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (Elektroporation); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255, und Christou und Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (Reis); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (Mais via Agrobacterium tumefaciens).
Die Zellen, die transformiert worden sind, können gewöhnlichen Verfahren gemäß zu Pflanzen kultiviert werden. Siehe beispielsweise McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Diese Pflanzen können dann gezüchtet werden und entweder mit demselben Stamm oder verschiedenen Stämmen bestäubt werden, und das resultierende Hybrid weist konstitutive Expression des gewünschten identifizierten phänotypischen Charakteristikums auf. Zwei oder mehr Generationen können kultiviert werden um sicherzustellen, dass die konstitutive Expression des gewünschten phänotypischen Charakteristikums stabil aufrecht erhalten und vererbt wird, und dann ist erreicht worden, dass die geernteten Samen die konstitutive Expression des gewünschten phänotypischen Charakteristikums sicherstellen.
Die hierin offenbarten Promotornukleotidsequenzen und Verfahren sind beim Regulieren der konstitutiven Expression einer beliebigen heterologen Nukleotidsequenz in einer Wirtspflan ze, um den Phänotyp einer Pflanze zu variieren, verwendbar. Verschiedene Phänotypänderungen, einschließlich des Modifizierens der Fettsäurezusammensetzung in einer Pflanze, des Änderns des Aminosäuregehalts einer Pflanze, des Änderns des Pathogenabwehrmechanismus einer Pflanze und dergleichen, sind von Interesse. Diese Ergebnisse können durch Bereitstellen der Expression heterologer Produkte oder verstärkter Expression endogener Produkte in Pflanzen erreicht werden. Alternativ können die Ergebnisse durch Sorgen für eine Abnahme der Expression einer oder mehrerer endogener Produkte, insbesondere Enzyme oder Co-Faktoren in der Pflanze, erreicht werden. Diese Änderungen resultieren in einer Phänotypänderung der transformierten Pflanze.
Gene von Interesse spiegeln die kommerziellen Märkte und Interessen jener, die an der Entwicklung des Ernteguts bzw. von Nutzpflanzen beteiligt sind, wider. Erntegüter bzw. Nutzpflanzen und Märkte von Interesse ändern sich, und weil Entwicklungsländer sich den Weltmärkten öffnen, werden auch neue Erntegüter und Technologien auftauchen. Des Weiteren wird sich, weil unser Verständnis agronomischer Merkmale und Charakteristika, wie z.B. Ertrag und Heterosis, zunimmt, die Auswahl von Genen zur Transformation dementsprechend ändern. Allgemeine Kategorien von interessierenden Genen schließen beispielsweise jene Gene, die an Information beteiligt sind, wie z.B. Zinkfinger, jene Gene, die an Kommunikation beteiligt sind, wie z.B. Kinasen, und jene Gene, die an Grundfunktionen beteiligt sind, wie z.B. Hitzeschockproteine, ein. Spezifischere Kategorien von Transgenen schließen beispielsweise Gene, die wichtige Merkmale für Agronomie, Insektenresistenz, Krankheitsresistenz, Herbizidresistenz, Sterilität, Korneigenschaften und kommerzielle Produkte codieren, ein. Interessierende Gene schließen im Allgemeinen jene Gene, die am Öl-, Stärke-, Kohlenhydrat- oder Nährstoff-Stoffwechsel beteiligt sind, und auch jene, die Korngröße, Saccharosebeladung und dergleichen betreffen, ein.
Agronomisch wichtige Merkmale, wie z.B. Öl-, Stärke- und Proteingehalt, können zusätzlich zum Verwenden traditioneller Züchtungsverfahren genetisch verändert werden. Modifikationen schließen Erhöhen des Gehalts von Ölsäure, gesättigten und ungesättigten Ölen, Erhöhen der Level von Lysin und Schwefel, Bereitstellen essentieller Aminosäuren und außerdem Stärkemodifikation, ein. Hordothionin-Proteinmodifikationen sind in den US-Patentanmeldungs-Serien-Nrn. („US Patent Application Serial Nos.") 08/838 763, eingereicht am 10. April 1997, von der sich WO 94/16078, veröffentlicht am 21. Juli 1994, ableitet; 08/824 379, eingereicht am 26. März 1997, von der sich WO 96/38562, veröffentlicht am 5. Dezember 1996, ableitet; 08/824 382, eingereicht am 26. März 1997, von der sich WO 96/38563, veröffentlicht am 5. Dezember 1996, ableitet; und US-Patent Nr. 5 703 409, beschrieben. Ein weiteres Beispiel ist Lysin- und/oder Schwefel-reiches Samenprotein, codiert vom Sojabohne-2S-Albumin, beschrieben in US-Serien-Nr. 08/618 911, eingereicht am 20. März 1996, von der sich WO 97/35023, veröffentlicht am 25. September 1997, ableitet; und der Chymotrypsin-Inhibitor aus Gerste, Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165: 99-106.
Derivate der codierenden Sequenz können durch ortsgerichtete Mutagenese angefertigt werden um den Level vorgewählter Aminosäuren im codierten Polypeptid zu erhöhen. Beispielsweise stammt das Gen, das für das Gerstenpolypeptid mit hohem Lysinanteil (BHL, „barley high lysine polypeptide") codiert, vom Gerstenchymotrypsin-Inhibitor, PCT/US97/20441, eingereicht am 31. Oktober 1997, das hierin durch Referenz aufgenommen ist. Andere Proteine schließen Methionin-reiche Pflanzenproteine, wie z.B. aus Sonnenblumenkernen (Lilley et al. (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs, Hrsg. Applewhite (American Oil Chemists Society, Champaign, Illinois), S. 497-502; hierin durch Referenz aufgenommen)); Getreide (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71:359; von denen beide hierin durch Referenz aufgenommen sind); und Reis (Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123), ein. Andere agronomisch wichtige Gene codieren für Latex, Floury 2, Wachstumsfaktoren, Samenspeicherfaktoren und Transkriptionsfaktoren.
Insektenresistenzgene können für Resistenz gegen Schädlinge, die einen großen Störeinfluss auf den Ertrag haben, wie z.B. Wurzelnematode, Erdraupe, Maiszüngler und dergleichen, codieren. Derartige Gene schließen beispielsweise Gene für giftiges Protein von Bacillus thuringiensis (US-Patent Nrn. 5 366 892; 5 747 450; 5 737 514; 5 723 756; 5 593 881; Geiser et al. (1986) Gene 48:109); Lectine (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825); und dergleichen ein.
Gene, die für Krankheitsresistenzmerkmale codieren, schließen Entgiftungsgene, wie z.B. gegen Fumonosin (US-Patentanmeldungs-Serien-Nr. 08/484 815, eingereicht am 7. Juni 1995, von der sich WO 96/06175, veröffentlicht am 29. Februar 1996, ableitet); Avirulenzgene (avr-Gen) und Krankheitsresistenzgene R-Gen (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); und dergleichen ein.
Herbizidresistenzmerkmale können Gene, die für Resistenz gegen Herbizide, die zur Inhibierung der Aktivität von Acetolactatsynthase (ALS-Gen) wirken, insbesondere die Herbizide der Sulfonylharnstoffart, codieren (z.B. das Acetolactatsynthasegen (ALS-Gen)), das Mutationen, insbesondere die S4- und/oder Hra-Mutation(en), enthält, die zu derartiger Resis tenz führen), Gene, die für Resistenz gegen Herbizide, die zur Inhibierung der Aktivität von Glutaminsynthase wirken, wie z.B. Phosphinothricin oder Basta, codieren (z.B. das bar-Gen), oder andere derartige im Fachgebiet bekannte Gene. Das bar-Gen codiert für Resistenz gegen das Herbizid Basta, das nptII-Gen codiert für Resistenz gegen die Antibiotika Kanamycin und Geneticin, und das ALS-Gen codiert für Resistenz gegen das Herbizid Chlorsulfuron.
Sterilitätsgene können außerdem in einer Expressionskassette codiert sein und sorgen für eine Alternative zu physikalischem Entfahnen. Beispiele von in dieser Hinsicht verwendeten Genen schließen Gene, spezifisch für männliches Gewebe, und Gene mit männlichen Sterilitäts-Phänotypen, wie z.B. QM, beschrieben in US-Patent Nr. 5 583 210, ein. Andere Gene schließen Kinasen und jene Gene, die für Verbindungen codieren, die entweder für die männliche oder weibliche gametophytische Entwicklung giftig sind, ein.
Die Kornqualität spiegelt sich in Merkmalen wider, wie z.B. dem Gehalt und den Arten von gesättigten und ungesättigten Ölen, der Qualität und Quantität essentieller Aminosäuren und dem Gehalt an Cellulose. In Mais stellen modifizierte Hordothioninproteine, beschrieben in US-Patent-Anmeldungs-Serien-Nrn. 08/838 763, eingereicht am 10. April 1997, von der sich WO 94/16078, veröffentlicht am 21. Juli 1994, ableitet; 08/824 379, eingereicht am 26. März 1997, von der sich WO 96/38562, veröffentlicht am 5. Dezember 1996, ableitet; 08/824 382, eingereicht am 26. März 1997, von der sich WO 96/38563, veröffentlicht am 5. Dezember 1996, ableitet; und US-Patent Nr. 5 703 409, erteilt am 30. Dezember 1997, Beschreibungen von Proteinmodifikationen für gewünschte Zwecke bereit.
Kommerzielle Merkmale können außerdem auf einem Gen oder auf Genen codiert sein, die beispielsweise Stärke für die Ethanolherstellung vergrößern könnten oder für die Expression von Proteinen sorgen könnten. Eine weitere wichtige kommerzielle Verwendung transformierter Pflanzen ist die Herstellung von Polymeren und Biokunststoffen, wie im US-Patent Nr. 5 602 321, erteilt am 11. Februar 1997, beschrieben. Gene, wie z.B. B-Kethothiolase, PHBase (Polyhydroxyburyratsynthase) und Acetoacetyl-CoA-Reduktase (siehe Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) ermöglichen die Expression von Polyhydroxyalkanoaten (PHAs).
Exogene Produkte schließen Pflanzenenzyme und Produkte sowie jene von anderen Quellen, einschließlich Prokaryoten und anderen Eukaryoten, ein. Derartige Produkte schließen Enzyme, Cofaktoren, Hormone und dergleichen, ein. Die Proteinlevel, insbesondere von modifizierten Proteinen, die verbesserte Aminosäureverteilung aufweisen um den Nährstoffwert der Pflanze zu verbessern, können erhöht werden. Dies wird durch die Expression derartiger Proteine, die einen verbesserten Aminosäuregehalt aufweisen, erreicht.
Folglich kann die heterologe Nukleotidsequenz, funktionell verknüpft mit dem hierin offenbarten konstitutiven Promotor, ein Strukturgen sein, das ein interessierendes Protein codiert. Beispiele solcher heterologen Gene schließen ein, sind aber nicht limitiert auf Gene, codierend Proteine, die Resistenz gegenüber abiotischem Stress, wie z.B. Dürre, Temperatur, Salinität und Toxinen, wie z.B. Pestiziden und Herbiziden, oder gegenüber biotischem Stress, wie z.B. Angriffen durch Pilze, Viren, Bakterien, Insekten und Nematoden, und Entwicklung von mit diesen Organismen assoziierten Krankheiten, verleihen. Spezifischer ist der hierin offenbarte und als ein schwacher konstitutiver Promotor identifizierte konstitutive Promotor, beim Transformieren von Pflanzen verwend bar, um konstitutiv ein Avirulenzgen zu exprimieren, wie offenbart in den gleichzeitig anhängigen Anmeldungen, beide mit dem Titel „Methods for Enhancing Disease Resistance in Plants", US-Anmeldungs-Serien-Nr. 60/075 151, eingereicht 26. Februar 1998 und US-Anmeldungs-Serien-Nr. 60/092 464, eingereicht 11. Juli 1998, von beiden stammt WO 99/43823, veröffentlicht 2. September 1999, ab. So ein schwacher Promotor kann Aktivierung des Pflanzenverteidigungssystems kurz vor hypersensitivem Zelltod verursachen. Folglich besteht eine Aktivierung des Pflanzenverteidigungssystems bei Leveln, die ausreichend sind, um vor Pathogeninvasion zu schützen. In diesem Zustand besteht wenigstens partielle Aktivierung des Pflanzenverteidigungssystems, wobei die Pflanze erhöhte Spiegel an antipathogenen Faktoren, wie z.B. PR-Proteinen, d.h. PR-1, „cattiness", a-Glucanasen, etc.; Sekundärmetaboliten; Phytoalexinen; reaktiven Oxygenspezies; und dergleichen produziert.
Alternativ kann die heterologe Nukleotidsequenz, funktionell verknüpft mit dem hierin offenbarten konstitutiven Promotor, eine Antisense-Sequenz für ein targetiertes Gen bzw. Ziel-Gen sein. Mit „Antisense-DNA-Nukleotidsequenz" soll eine Sequenz bezeichnet: werden, die in inverser Orientierung zur normalen 5'- bis 3'-Orientierung der Nukleotidsequenz ist. Wenn in eine Pflanzenzelle abgegeben, verhindert Expression der Antisense-DNA-Sequenz normale Expression der DNA-Nukleotidsequenz für das targetierte Gen. Die Antisense-Nukleotidsequenz codiert ein RNA-Transkript, das komplementär ist zu und hybridisieren kann an der/die endogene(n) Messenger-RNA (mRNA), produziert durch Transkription der DNA-Nukleotidsequenz für das targeitierte Gen. In diesem Fall wird die Produktion des nativen Proteins, codiert von dem targetierten Gen, inhibiert, um eine gewünschte phänotypische Antwort zu erreichen. Folglich kann die hierin offenbarte Promotorsequenz funktionell mit Antisense-DNA-Sequenzen verknüpft sein, um die Ex- Pression eines nativen Proteins in der Pflanze zu reduzieren oder zu inhibieren.
Die folgenden Beispiele sind zum Zwecke der Veranschaulichung und nicht zum Zwecke der Einschränkung angeführt.
EXPERIMENTELLES
Die Promotorregion für das Maisgen, das ein Metallothionein codiert, wurde aus Maispflanzen isoliert und kloniert. Dieses Gen wurde als eine Quelle eines konstitutiven Promotors, basierend auf der Expression während der Entwicklung und auf der räumlichen Expression seines Genprodukts, ausgewählt. Das Verfahren zu seiner Isolierung ist unten beschrieben.
Metallothioneine bilden eine Klasse von Proteinen, die in niedriger Kopienanzahl in Zellen überall in einer Pflanze konstitutiv exprimiert werden. Expression dieser Proteine in Säugerzellen ist induzierbar in Antwort auf Stress und auf erhöhte Konzentrationen an Spurenelementen und Hormonen. Die neue Promotorsequenz für ein Maisgen, codierend eines dieser Metallothioneine, met-1, ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt.
Beispiel 1: Isolation von Promotorsequenz
Die Vorgehensweise zur Promotorisolation ist in dem Benutzerhandbuch für den GenomeWalker-Kit, der von Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, Kalifornien, verkauft wird, beschrieben. Genomische DNA aus Mais Linie A63 wurde durch Vermahlen 10 Tage alter Keimlingsblätter in flüssigem Stickstoff extrahiert, und die DNA wurde wie von Chen und Dellaporta (1994) in The Maize Handbook, Hrsg. Freeling und Walbot (Springer Verlag, Berlin) beschrieben, präpariert. RNase A wurde zu 10 μg/ml zugegeben und dann bei 37°C eine Stunde lang inkubiert. Die DNA wurde dann einmal mit Phenol-Chloroform extra hiert, dann mit Chloroform, dann mit Ethanol gefällt und in TE (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert. Die DNA wurde dann genau wie in dem GenomeWalker-Benutzerhandbuch (Clontech PT3042-1 Version PR68687) beschrieben, verwendet. Im Wesentlichen wurde die DNA separat mit den Restriktionsenzymen DraI, EcoRV, PvuII, ScaI und StuI, alles stumpfe-Enden-Schneider, verdaut. Die GenomeWalker-Adaptoren wurden dann an die Enden der restriktionsverdauten DNA ligiert. Die resultierende DNA wird als DL1-DL5 bezeichnet.
Zur Isolierung der spezifischen Promotorregion wurden zwei nicht-überlappende, Gen-spezifische Primer (27 Bp lang) von den Sequenzen abundanter ESTs in der Pioneer/HGS-Datenbank entworfen. Die Primer wurden entworfen, um die Region stromaufwärts der codierenden Sequenz, d.h. die 5'-untranslatierte Region und Promotorregion des Gens, zu amplifizieren. Die Sequenzen der Primer sind unten angegeben. Die erste Runde PCR wurde mit jeder DNA-Probe (DL1-5) mit Clontech-Primer AP1 (Sequenz 5'-gtaatacgactcactatagggc-3'; SEQ ID NO: 2) und dem Gen-spezifischen Primer (gsp)1 mit der folgenden Sequenz durchgeführt:
Metallothionein-gsp1-Sequenz: 5'-gtacttcttgccgcacttgcagcttga-3' (SEQ ID NO: 3).
PCR wurde in einem Thermocycler vom Modell PTC-100 mit Hot-Bonnet von MJ Research (Watertown, Massachusetts) unter Verwendung von Reagenzien, die mit dem GenomeWalker-Kit bereitgestellt waren, durchgeführt. Die folgenden Zyklusparameter wurden verwendet: 7 Zyklen von 2 s bei 94°C, dann 3 min bei 72°C, gefolgt von 32 Zyklen von 2 s bei 94°C und 3 min bei 67°C. Schließlich wurden die Proben 4 min lang bei 67°C gehalten und dann bis zur weiteren Analyse bei 4°C gehalten.
Wie im Benutzerhandbuch beschrieben, wurde die DNA von der ersten Runde PCR dann verdünnt und als eine Matrize in einer zweiten Runde PCR unter Verwendung des Clontech-AP2-Primers (Sequenz 5'-actatagggcacgcgtggt-3'; SEQ ID NO: 4) und Genspezifischem Primer (gsp)2 mit der folgenden Sequenz verwendet:
Metallothionein-gsp2-Sequenz: 5'-agccgcagcttgatccgcagttgcaag-3' (SEQ ID NO: 5).
Die Zyklusparameter für die zweite Runde waren: 5 Zyklen von 2 s bei 94°C, dann 3 min bei 72°C, gefolgt von 20 Zyklen von 2 s bei 94°C und 3 min bei 67°C. Schließlich wurden die Proben 4 min lang bei 67°C gehalten und dann bei 4°C gehalten.
Ungefähr 10 μl jeder Reaktion wurden auf einem 0,8%-igen Agarosegel laufen gelassen und Banden (gewöhnlich 500 Bp oder größer) wurden ausgeschnitten, mit dem Sephaglas-BandPrep-Kit (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) gereinigt und in den TA-Vektor pCR2.l (Invitrogen, San Diego, Kalifornien) kloniert. Klone wurden zur Verifizierung sequenziert, und die DNA der Mini-prep wurde dann 1:30 in Wasser verdünnt und 1 μl wurde mit Gen-spezifischem Primer (gsp)3 (Sequenzen unten) und dem Clontech-AP2-Primer mit den folgenden Zyklusparametern amplifiziert: fünf Zyklen von 2 s bei 94°C, 30 s bei 46°C, min bei 72°C, gefolgt von 20 Zyklen von 2 s bei 94°C, 3 min bei 67°C, dann 4 min bei 67°C, dann bei 4°C gehalten.
Metallothionein-gsp3-Sequenz:
5'-gaccatggtgtcgtgtggatccccttgtggtgc-3' (SEQ ID NO: 6).
Zehn μl der resultierenden amplifizierten DNA wurden auf einem 0,8%-igen Agarosegel laufen gelassen, mit Sephaglas gereinigt und in den PCR2.1-TA-Vektor kloniert. Die endgültige Sequenz wurde auf den resultierenden Plasmiden bestimmt.
Beispiel 2: Daten für transiente Genexpression unter Verwendung der Promotorsequenz
Ein Assay für transiente Genexpression wurde verwendet, um die klonierte DNA auf Promotoraktivität zu testen. Der Promotor wurde in Plasmid PHP3953 (1), das mit BglII und SphI oder mit BglII und PvuII verdaut war, um den Ubiquitin-Promotor zu entfernen, rekloniert. Das neue Promotorfragment wurde anstelle des Ubiquitin-Promotors eingeführt, so dass die 5'-untranslatierte Region und das Intron von Ubiquitin nun zwischen dem Testpromotor und dem GUS-Reportergen waren.
Experimente wurden mit unreifen Keimlingen, im Wesentlichen der skutellaren Oberfläche, durchgeführt. Unreife GS3-Maiskeimlinge wurden 9-11 Tage nach Bestäubung unter Verwendung eines Skalpells aus Ähren isoliert. Vor der Keimlingisolierung wurden bestäubte Ähren mit einem Mikrodetergens und 25% handelsüblicher Bleichmischung oberflächensterilisiert und dann mit 3 Austauschen von sterilem H₂O gewaschen. Isolierte unreife Keimlinge (1,4-1,7 mm) wurden auf Bombardierungsmedium gelegt und in einem Zielgitter in Vorbereitung auf Bombardierung ausgerichtet.
Unreife Keimlinge wurden dann mit dem biolistischen Wolfram-Partikel-Verfahren („tungsten particle biolistic method") (Tomes et al. (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, Hrsg. Gamborg und Phillips (Springer Verlag, Berlin); Koziel et al. (1993) Bio/Technology 11:194-200) unter Verwendung eines Hochdruck-Partikelabgabesystems („high pressure particle delivery system") (Biolistic-Particle-Delivery-System-Modell PDS-100 von DuPont) transformiert. Plasmid-DNA, umfassend die Promotorsequenz der Erfindung, funktionell verknüpft mit dem GUS-Gen, wurde in die unreifen Maiskeimlinge bombardiert. Folgend auf 40-stündige Kultur wurden bombardierte Keimlinge mit X-Gluc- Färbungslösung (McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6(87):923-926) 12 Stunden lang bei 37°C im Dunkeln gefärbt. GUS-Aktivität wurde dann unter Verwendung des Ubiquitin-Promotors als eine Kontrolle, durch Zählen blauer Flecken nach Färben für GUS-Aktivität wie anderswo beschrieben (siehe Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405) gemessen. Daten für transiente Expression sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1: Promotoraktivität, wie gemessen durch transiente Expression von GUS (siehe Christensen und Quail (1989) Plant Mol. Biol. 12.619-632 hinsichtlich Details der Ubiquitin-Promotoraktivität).
Promotoraktivität der Promotorsequenz für das Metallothionein-Gen war signifikant geringer als die des Ubiquitin-Promotors, was anzeigt, dass dies ein schwacher konstitutiver Promotor ist.
Beispiel 3: Transformation und Regeneration transgener Pflanzen
Unreife GS3-Maiskeimlinge wurden mit einem Plasmid, das die Promotorsequenz, funktionell verknüpft mit dem GUS-Gen, enthält, plus einem Plasmid, das das selektierbare Markergen PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37), das Resistenz gegen das Herbizid Bialaphos verleiht, enthält, bombardiert. Eine Transformation wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Siehe Appendix für Beispiele von Bombardierungs- (560Y), Selektions- (560R), Hormon-enthaltendes Regenerations- (288J) und Hormon-freiem (272V) Medium.
Einen Tag nach Bombardierung wurden die Keimlinge vom Bombardierungsmedium in Selektionsmedium, das 3 mg/Liter Bialaphos enthielt, transformiert und alle 2 Wochen auf Selektionsmedium subkultiviert. Nach ungefähr 10 Wochen Selektion wurden Klone mit selektionsresistentem Kallus in Hormon-enthaltendes Medium transferriert um Pflanzenregeneration zu initiieren. Im Anschluss an somatische Keimlingsreifung (2-4 Wochen) wurden gut entwickelte somatische Keimlinge in Medium zum Keimen transferriert und zu dem beleuchteten Kulturenraum transferriert. Etwa 7-10 Tage später wurden sich entwickelnde Setzlinge 7-10 Tage lang in Hormon-freies Medium in Röhrchen transferriert, bis die Setzlinge gut etabliert waren. Pflanzen wurden dann in Einsätze in Flachpaletten (äquivalent zu 2,5'' -Topf), die Topferde enthielten, transferriert und 1 Woche lang in einer Klimakammer kultiviert, anschließend zusätzliche 1-2 Wochen lang im Gewächshaus kultiviert, dann in klassische 600 Töpfe (1,6 Gallonen) transferriert und bis zur Reife kultiviert.
Promotoraktivität in transformierten Pflanzengeweben wurde durch Messen der Expression von GUS festgestellt. Pflanzengewebeproben wurden in die Vertiefungen von Zellkulturclustern mit 12 Vertiefungen gelegt und mit X-Gluc-Färbelösung 12 Stunden lang bei 37°C im Dunkeln gefärbt. Proben wurden dann auf GUS-Färbung ausgewertet. Die Punktzahl für GUS-Färbung reichte von 0 (negativ) bis 6 (höchste). Diese Färbungspunktzahlen dienten als ein Maß des Levels der GUS-Expression. Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Vier Transformationsereignisse sind für den met-1-Promotor evaluiert worden. Insgesamt erzielten drei Ereignisse starke GUS-Expression und ein Ereignis erzielte mittlere Expression. GUS-Expression wurde in allen Pflanzengeweben einschließlich Blatt, Wurzel, Lieschblättern, Narbenfäden und Fahne gefun den, wobei diese Gewebe meistens Färbepunktzahlen von 4-5 aufwiesen.
Der Ubiquitin-Promotor wurde als eine Kontrolle verwendet. Fünf Transformationsereignisse sind evaluiert worden. Insgesamt erzielten zwei Ereignisse starke GUS-Expression, und drei Ereignisse erzielten schwache Expression. GUS-Expression wurde in allen Pflanzengeweben, einschließlich Blatt, Wurzel, Lieschblätter, Narbenfäden und Fahne, gefunden. Bei jenen Transformationsereignissen, die starke Expression aufwiesen, wurde GUS in allen verschiedenen Geweben exprimiert, wobei die Gewebe zumeist Färbepunktzahlen von 4-5 aufwiesen. Bei jenen Transformationsereignissen, die schwache Expression aufwiesen, war GUS in Blatt, Wurzel und Fahne exprimiert, wobei diese Gewebe zumeist Färbepunktzahlen von 1-3 aufwiesen. Es gab sehr wenig GUS-Expression in Lieschblätter- und Narbenfädengeweben bei jenen Transformationsereignissen, die schwache Expression aufwiesen.
Tabelle 2: Gus-Expression, wie vom erfindungsgemäßen met-1-Promotor angetrieben.
APPENDIX 272 V
Anweisungen:

@ = Zugabe nach Hochbringen auf Volumen
Lösen der Bestandteile in blank filtriertem D-I H₂O in Aufeinanderfolge
Einstellen auf pH 5,6
Auf Volumen bringen mit blank filtriertem D-I H₂O nach Einstellen des pHs
Sterilisieren und Abkühlen auf 60°C.
## = Lösen von 0,100 g Nicotinsäure; 0,020 g Thiamin.HCl; 0,100 g Pyridoxin.HCL; und 0,400 g Glycin in 875,000 ml blank filtriertem D-I H₂O in Aufeinanderfolge. Auf Volumen bringen mit blank filtriertem D-I H₂O. Herstellen von 400-ml-Portionen. Thiamin.HCL und Pyridoxin.HCL sind im Dunkelexsikkator („Dark Desiccator"). Lagerung einen Monat lang, sofern keine Kontamination oder Präzipitation auftaucht, ansonsten Herstellung einer frischen Stammlösung.
Gesamtvolumen (1) = 1,00

288 J
Anweisungen:

@ = Zugabe nach Hochbringen auf Volumen, Lösen der Bestandteile in blank filtriertem D-I H₂O in Aufeinanderfolge
Einstellen auf pH 5,6
Auf Volumen bringen mit blank filtriertem D-I H₂O nach Einstellen des pHs
Sterilisieren und Abkühlen auf 60°C.
Zugabe von 3,5 g/l Gelrite für Zellbiologie
## = Lösen von 0,100 g Nicotinsäure; 0,020 g Thiamin.HCl; 0,100 g Pyridoxin.HCL; und 0,400 g Glycin in 875,000 ml blank filtriertem D-I H₂O in Aufeinanderfolge. Auf Volumen bringen mit blank filtriertem D-I H₂O. Herstellen von 400-ml-Portionen. Thiamin.HCL und Pyridoxin.HCL sind im Dunkelexsikkator („Dark Desiccator"). Lagerung einen Monat lang, sofern keine Kontamination oder Präzipitation auftaucht, ansonsten Herstellung einer frischen Stammlösung.
Gesamtvolumen (1) = 1,00

560 R
Anweisungen:

@ = Zugabe nach Hochbringen auf Volumen
# = Zugabe nach Sterilisieren und Abkühlen auf Temp.
Lösen der Bestandteile in D-I H₂O in Aufeinanderfolge
Einstellen des pHs auf 5,8 mit KOH
Auf Volumen bringen mit D-I H₂O
Sterilisieren und auf Raumtemperatur abkühlen
Gesamtvolumen (1) = 1,00

560 Y
Anweisungen:

@ = Zugabe nach Hochbringen auf Volumen
# = Zugabe nach Sterilisieren und Abkühlen auf Temp.
Lösen der Bestandteile in D-I H₂O in Aufeinanderfolge
Einstellen des pHs auf 5,8 mit KOH
Auf Volumen bringen mit D-I H₂O
Sterilisieren und auf Raumtemperatur abkühlen
**Kürzeres Autoklavieren wegen erhöhter Saccharose**
Gesamtvolumen (1) = 1,00

Alle in der Beschreibung genannten Publikationen und Patentanmeldungen sind ein Beispiel für den Level jenes Fachmanns, den diese Erfindung betrifft.
Obwohl die vorangehende Erfindung zum Zwecke der Verständnisklarheit in gewissen Details durch Veranschaulichung und Beispiel beschrieben worden ist, wird es nahe liegen, dass gewisse Änderungen und Modifikationen im Rahmen der beigefügten Ansprüche praktiziert werden können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz für einen Promotor, der fähig ist, die Transkription in einer Pflanzenzelle zu initiieren, wobei die Nukleotidsequenz ausgewählt ist aus: a) einer Nukleotidsequenz, die die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz umfasst; b) einer Nukleotidsequenz, die mit der Eingangsnummer ATCC No. 207120 hinterlegt ist; c) einer Nukleotidsequenz, die mindestens 40 aufeinanderfolgende Nukleotide der Sequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist; d) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Sequenz von a), b) oder c) hybridisiert; e) einer Nukleotidsequenz, die mindestens 70% Sequenzidentität zu einer Sequenz aufweist, die in a) oder b) angeführt ist.
DNA-Konstrukt, das eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 1, funktionell verknüpft mit einer interessierenden heterologen Nukleotidsequenz, umfasst.
Vektor, der das DNA-Konstrukt nach Anspruch 2 umfasst.
Wirtszelle, in deren Genom das DNA-Konstrukt nach Anspruch 2 stabil eingebaut ist.
Verfahren zur konstitutiven Expression einer heterologen Nukleotidsequenz in einer Pflanze, wobei das Verfahren das Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem DNA-Konstrukt, wie es in Anspruch 2 definiert ist, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Pflanze eine monokotyledone oder eine dikotyledone Pflanze ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die monokotyledone Pflanze Mais ist.
Pflanzenzelle, die stabil mit einem DNA-Konstrukt, wie es in Anspruch 2 definiert ist, transformiert ist.
Pflanze, die stabil mit einem DNA-Konstrukt, wie es in Anspruch 2 definiert ist, transformiert ist.
Pflanzenzelle nach Anspruch 8, wobei die Pflanzenzelle von einer monokotyledonen oder dikotyledonen Pflanze stammt.
Pflanze nach Anspruch 9, wobei die Pflanze eine monokotyledone oder dikotyledone Pflanze ist.
Pflanzenzelle nach Anspruch 10 oder Pflanze nach Anspruch 11, wobei die monokotyledone Pflanze Mais ist.
Samen der Pflanze nach Anspruch 9, 11 oder 12, umfassend ein DNA-Konstrukt nach Anspruch 2.