JP6775953B2 - Ｆａｄ３性能座および標的化切断を誘導可能である対応する標的部位特異的結合タンパク質 - Google Patents

Ｆａｄ３性能座および標的化切断を誘導可能である対応する標的部位特異的結合タンパク質 Download PDF

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関連出願の相互参照
本出願は、これによりその開示の全体が参照により組み込まれる、２０１２年９月７日出願の米国仮特許出願第６１／６９７，８５４号の利益、およびこれによりその開示の全体が参照により組み込まれる、２０１３年５月７日出願の米国仮特許出願第６１／８２０，２６０号に対する優先権を主張するものである。
本開示は、概して組換え植物技術に使用するため（例えば、トランスジェニック植物を産生するため）の組成物および方法に関する。より具体的には、本開示は、対象となる任意の核酸の部位特異的導入に使用され得るゲノム中の座を含む植物細胞および植物に関する。
多くの植物が、例えば、農業的価値を改善するために、望ましい形質を導入するために外因性核酸（例えば、導入遺伝子）で遺伝的に形質転換されている。遺伝子形質転換を通して達成され得る農業的価値の改善の例は、改善した栄養価、増加した収量、有害生物または病気耐性、乾燥およびストレス耐性、改善した園芸品質（例えば、改善した色素沈着および／または成長）、除草剤耐性、植物からの産業上有用な化合物および／または材料の製造、ならびに／あるいは医薬品の製造を含む。クローニング遺伝子の植物細胞への導入および安定な繁殖可能なトランスジェニック植物の回収が、植物の遺伝子改変を複数世代を通して安定にし、それによって作物植物の遺伝子操作を可能にするために使用され得る。
遺伝子形質転換およびトランスジェニック植物産生のための方法では、外因性ＤＮＡが真核植物細胞の核またはプラスミドＤＮＡに典型的にはランダムに導入され、引き続いて組み込まれた外因性ＤＮＡを含む細胞が単離され、その後安定に形質転換した植物が再生される。トランスジェニック植物は、典型的にはアグロバクテリウム媒介形質転換技術によって産生された。これらの技術での成功が、対象となる核酸分子を植物のゲノムに導入するための他の方法、例えば、プロトプラストへのＰＥＧ媒介ＤＮＡ取り込み、微粒子銃およびケイ素ウィスカー媒介形質転換の開発を刺激した。
しかしながら、これらの植物形質転換法の全てにおいて、植物ゲノムに組み込まれる外因性核酸は、植物細胞のゲノムにランダムに、かつ予測不可能なコピー数で組み込まれる。Terada et al.(2002) Nat Biotechnol 20(10):1030；Terada et al.(2007) Plant Physiol 144(2):846；D'Halluin et al.(2008) Plant Biotechnology J.6(1):93。 例えば、導入遺伝子はしばしば、導入遺伝子全体またはその一部の配列反復の形態で組み込まれる。このような複雑な組込みパターンは、一般的に（例えば、転写後遺伝子サイレンシング機構を通した転写ＲＮＡの破壊により、または組み込まれたＤＮＡのメチル化の誘導により）組み込まれた核酸の発現レベルに悪影響を及ぼす。また、組込み部位の位置が一般的に組み込まれた核酸の発現レベルに影響を及ぼす。さらに、外因性ＤＮＡの組込みは、組込みが起こるゲノムの領域に破壊性効果をもたらし、それによって標的領域の正常な機能に影響を及ぼすまたはこれを妨害して望ましくない副作用をもたらし得る。前記を含む因子の組み合わせは、同じ方法によって作成されたものでさえ、異なるトランスジェニック植物細胞と植物系統との間で導入遺伝子または外因性ＤＮＡの発現レベル（および農学的品質全体）における広い変動をもたらす。組込みがランダムであるために、これらの効果は専門家によって制御され得ないが、専門家は望ましい特性を有する新規な植物を産生しようと試みている。
前記の考慮は、特定の外因性核酸を植物に導入することの効果が調査される場合はいつでも、有意な結果を得るために、多数のトランスジェニック植物系統が産生および分析されなければならないことを要する。同様に、所望の表現型を有するトランスジェニック植物を提供するための特定の組み込まれた核酸を含むトランスジェニック植物の産生においては、核酸の最適な発現を有する、ならびにトランスジェニック植物の表現型および性能全体への副作用が最小であるまたは無い植物系統の選択を可能にするために、大集団の独立に作成されたトランスジェニック植物系統が作成されなければならない。これらの実際的な考慮は、複数の外因性核酸を挿入することによって（例えば、遺伝子スタッキング）作成されるトランスジェニック植物においてさらなる重要性を帯びる。このような植物では、現象、例えば、転写後遺伝子サイレンシングが増幅され得る。
植物への導入遺伝子挿入を制御しようとしていくつかの方法が開発されてきた。例えば、Kumar and Fladung (2001) Trends Plant Sci.6:155-9を参照されたい。これらの方法は、原核生物と下等真核生物の両方でうまく適用されてきた相同組換えに基づく導入遺伝子組込みに頼るものである。Paszkowski et al.(1988) EMBO J.7:4021-6。しかしながら、植物では近年まで、導入遺伝子組込みのための支配的機構は、組換えＤＮＡ鎖間の相同性をほとんど伴わない非正統的組換えに基づいてきた。そのため、この分野での主な課題は、非正統的組換えを介したずっと効率的な組込みイベントによって隠されている、まれな相同組換えイベントの検出および選択的産生である。さらに、標的化された相同組換えイベントの選択的産生および検出が達成されたとしても、この戦略の最大の利益を実現するために、このイベントが宿主ゲノム中の望ましい位置に標的化されなければならない。
例えば、標的化された遺伝子形質転換の想定される利益は、ランダムな組込みから得られる形質転換イベントと比べた、導入遺伝子発現のイベント間変動性の減少である。さらなる想定される利益は、導入された核酸をスクリーニングし、形質転換構築物をソートし、得られたトランスジェニック植物の望ましい特徴全体に寄与するイベントをもたらすために要求されるイベントの数の有意な減少である。これらの利益を実現するために要求される重要な因子は、導入遺伝子性能が一貫しており、可能であれば宿主植物に対する有害効果が排除または最小化されるゲノム中の特異的位置の同定である。
近年、ゲノムＤＮＡの標的化切断のための方法および組成物が記載されている。例えば、標的化突然変異誘発を誘導し、細胞ＤＮＡ配列の標的化欠失を誘導し、かつ所定の染色体座において標的化組換えおよび組込みを促進するために、このような標的化切断イベントが使用され得る。例えば、全ての目的のためにその開示の全体が参照により組み込まれる、Urnov et al.(2010) Nature 435(7042):646-51；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書；第２００５０２０８４８９号明細書；第２００５００２６１５７号明細書；第２００５００６４４７４号明細書；第２００６０１８８９８７号明細書；第２００９０２６３９００号明細書；第２００９０１１７６１７号明細書；第２０１０００４７８０５号明細書；第２０１１０２０７２２１号明細書；第２０１１０３０１０７３号明細書；第２０１１０８９７７５号明細書；第２０１１０２３９３１５号明細書；第２０１１０１４５９４０号明細書；および国際公開第２００７／０１４２７５号パンフレットを参照されたい。切断は、特異的ヌクレアーゼ、例えば、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化物質様作動因子ヌクレアーゼ（transcription-activator like effector nuclease）（ＴＡＬＥＮ）の使用、または特異的切断を導くために操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）を用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用を通して起こり得る。米国特許出願公開第２００８０１８２３３２号明細書は、植物ゲノムの標的化改変のための非標準ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の使用を記載しており；米国特許出願公開第２００９０２０５０８３号明細書は、植物ＥＰＳＰＳ座のＺＦＮ媒介標的化改変を記載しており；米国特許出願公開第２０１００１９９３８９号明細書は、植物Ｚｐ１５座の標的化改変を記載しており、米国特許出願公開第２０１１０１６７５２１号明細書は、脂肪酸生合成に関与する植物遺伝子の標的化改変を記載している。さらに、Moehle et al.(2007) Proc.Natl.Acad, Sci.USA 104(9):3055-3060は、特定の座における標的化遺伝子付加のための設計されたＺＦＮの使用を記載している。米国特許出願公開第２０１１００４１１９５号明細書は、ホモ接合型二倍体生物を作成する方法を記載している。
しかしながら、ＦＡＤ３座において所望の導入遺伝子が標的化挿入された植物の産生を含む、植物のＦＡＤ３遺伝子の発現を改変および／または調節するための組成物および方法が依然として必要とされている。
米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書 米国特許出願公開第２００５０２０８４８９号明細書 米国特許出願公開第２００５００２６１５７号明細書 米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書 米国特許出願公開第２００６０１８８９８７号明細書 米国特許出願公開第２００９０２６３９００号明細書 米国特許出願公開第２００９０１１７６１７号明細書 米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号明細書 米国特許出願公開第２０１１０２０７２２１号明細書 米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書 米国特許出願公開第２０１１０８９７７５号明細書 米国特許出願公開第２０１１０２３９３１５号明細書 米国特許出願公開第２０１１０１４５９４０号明細書 国際公開第２００７／０１４２７５号パンフレット 米国特許出願公開第２００８０１８２３３２号明細書 米国特許出願公開第２００９０２０５０８３号明細書 米国特許出願公開第２０１００１９９３８９号明細書 米国特許出願公開第２０１１０１６７５２１号明細書 米国特許出願公開第２０１１００４１１９５号明細書
Terada et al. (2002) Nat Biotechnol 20(10):1030 Terada et al. (2007) Plant Physiol 144(2):846 D'Halluin et al. (2008) Plant Biotechnology J.6(1):93 Kumar and Fladung (2001) Trends Plant Sci.6:155-9 Paszkowski et al. (1988) EMBO J.7:4021-6 Urnov et al. (2010) Nature 435(7042):646-51 Moehle et al.(2007) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 104(9): 3055-3060
本開示は、（例えば、植物、藻類および真菌類において）ＦＡＤ３遺伝子の発現を調節するための組成物および方法、ならびに対象となる核酸配列（例えば、外因性核酸配列）の宿主細胞への標的化組込みのための部位としてのこれらの座の使用を記載する。いくつかの実施形態では、宿主細胞が、そのいずれかまたは全てが選択的に改変および／または破壊され得る１つまたはそれ以上のＦＡＤ３配列（例えば、ホモログ（homeologue）および／またはパラログ）を含む１つまたはそれ以上のゲノムを含み得る。具体的な例では、本開示が、セイヨウアブラナ（Brassica napus）（すなわち、セイヨウアブラナ系統、ＤＨ１２０７５）のＦＡＤ３Ａ、ＦＡＤ３Ａ’、ＦＡＤ３Ｃ’および／またはＦＡＤ３Ｃ遺伝子、ならびに対応するホモログまたはパラログ、ならびに対象となる核酸配列の標的化組込みのための座としてのその使用を記載する。本明細書に記載されるように、ＦＡＤ３遺伝子は宿主の脂肪酸生合成に関与しているが、（例えば、ＦＡＤ３コード配列への外因性核酸の組込みによる）改変または破壊は、結果として生じる宿主生物に予想外に全く有害効果をもたらさないまたは最小の有害効果しかもたらさない。
また、本明細書においては、ＦＡＤ３座において特異的核酸配列の切断および／または組込みを行うことができるポリペプチドと協力した１つまたはそれ以上の特定のＦＡＤ３座の使用も記載される。ＦＡＤ３座の切断および／または組込みを行うことができるポリペプチドと協力したＦＡＤ３座の使用の例は、ジンクフィンガータンパク質、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬドメイン、ＴＡＬＥＮ、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、リコンビナーゼ、ロイシンジッパー、ＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓおよび当業者に公知のその他のものからなる群から選択されるポリペプチドを含む。特定の例は、部位特異的ＤＮＡ結合ドメインポリペプチドおよび切断ドメインポリペプチド（例えば、ヌクレアーゼ）を含むキメラ（「融合」）タンパク質、例えば、ジンクフィンガーポリペプチドおよびＦｏｋＩヌクレアーゼポリペプチドを含むＺＦＮタンパク質を含む。例えば、本明細書においては、対応するホモログまたはパラログを切断することなく、ＦＡＤ３Ａ、ＦＡＤ３Ａ’、ＦＡＤ３Ａ’’、ＦＡＤ３Ｃ、ＦＡＤ３Ｃ’、ＦＡＤ３Ｃ’’およびこれらの組み合わせにおける二本鎖切断を結合および誘導するよう設計された特定のＺＦＮのインビトロおよびインビボでの有効性および特異性の証明が記載される。いくつかの実施形態では、宿主の農学的性能に及ぼす有害な影響が最小限でありながら、その後宿主中で発現される対象となる核酸の部位特異的組込みを行うために、特定のＦＡＤ３座が前記ポリペプチドのいずれかと共に使用され得る。
特定の態様では、本明細書において、ＦＡＤ３遺伝子に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが記載される。いくつかの実施形態では、このようなポリペプチドが、標的化二本鎖切断を誘導し得る、および／または切断部位での対象となる核酸の組換えを促進し得るように、ヌクレアーゼ（切断）ドメインまたはハーフドメイン（例えば、ＺＦＮ、リコンビナーゼ、トランスポサーゼ、または改変ＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬドメイン、ＴＡＬＥＮ、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を含むホーミングエンドヌクレアーゼ（homing endonuclease）を含むホーミングエンドヌクレアーゼ）、ならびに／あるいはリガーゼドメインを含んでもよい。特定の実施形態では、ＦＡＤ３座を標的化するＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ切断機能ドメインであってもよい。いくつかの実施形態では、外因性核酸を、１つまたはそれ以上のＦＡＤ３座（例えば、植物または動物種）で相同組換えを示す宿主生物（例えば、植物または動物種）のゲノムに導入するために前記ポリペプチドが使用され得る。特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインが、１つまたはそれ以上のジンクフィンガー（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９もしくはそれ以上のジンクフィンガー）を含み、ＦＡＤ３遺伝子中の任意の配列に結合するよう操作され得る（自然には起こらない）ジンクフィンガータンパク質を含む。本明細書に記載されるジンクフィンガータンパク質のいずれも、標的遺伝子のコード配列中または隣接配列（例えば、プロモーターもしくは他の発現要素）中の標的部位に結合し得る。特定の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質が、例えば、表４に示されるように、ＦＡＤ３遺伝子中の標的部位に結合する。代表的なＦＡＤ３結合ジンクフィンガーのヘリックス認識領域が表３に示される。ジンクフィンガータンパク質の構成ジンクフィンガー結合ドメインの１つまたはそれ以上は、標準（Ｃ２Ｈ２）ジンクフィンガーまたは非標準（例えば、Ｃ３Ｈ）ジンクフィンガー（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端ジンクフィンガーが非標準フィンガーであり得る）であり得る。
また、本明細書においては、ＦＡＤ３遺伝子を破壊または編集する方法も記載される。さらに、本明細書においては、本発明の実施形態による方法によって産生された遺伝子組換え宿主生物（例えば、トランスジェニック植物）が記載される。特定の例では、本発明の実施形態による方法によって産生されたトランスジェニック生物が、限定されないが、藻類、真菌類、単子葉植物、双子葉植物等であり得る。
前記および他の特徴は、添付の図面を参照して進むいくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるだろう。
パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号(SEQ ID NO:)７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ａ１の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ｂ１の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ｃ１の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ｄ１の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ｅ１の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ｆ１の続き） （図１Ｆ２の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ｇ１の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ｈ１の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ｉ１の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ｊ１の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ｋ１の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ｌ１の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ｍ１の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ｎ１の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ｏ１の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ｐ１の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ｑ１の続き） （図１Ｑ２の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ｒ１の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 （図１Ｓ１の続き） パネルＡ〜ＴはＡｌｉｇｎＸ（登録商標）を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列（配列番号７〜１２）の配列アラインメントを示す。 隣接結合距離に基づいてＪａｌｖｉｅｗ ｖ２．３を用いて作成されたＦＡＤ３遺伝子配列の系統樹を示す。標識化配列は以下のように対応する：ＦＡＤ３Ａ’／Ａ’’は本出願の全体にわたってＦＡＤ３Ａ’として記載される；ハプロタイプ２は本出願の全体にわたってＦＡＤ３Ｃ’として記載される；ハプロタイプ１は本出願の全体にわたってＦＡＤ３Ｃ’’として記載される；またハプロタイプ３は本出願の全体にわたってＦＡＤ３Ａ’’として記載される。 ｐＤＡＢ１０７８２８のプラスミドマップを示す。 ｐＤＡＢ１０７８２９のプラスミドマップを示す。 ｐＤＡＳ０００２７１のプラスミドマップを示す。 ｐＤＡＳ０００２７２のプラスミドマップを示す。 ｐＤＡＳ０００２７３のプラスミドマップを示す。 ｐＤＡＳ０００２７４のプラスミドマップを示す。 ｐＤＡＳ０００２７５のプラスミドマップを示す。 ｐＤＡＳ００００３１のプラスミドマップを示す。 ｐＤＡＳ００００３６のプラスミドマップを示す。 ｐＤＡＳ００００３７のプラスミドマップを示す。 ｐＤＡＢ１０７８２７のプラスミドマップを示す。 ｐＤＡＢ１０７８２８のプラスミドマップを示す。 ｐＤＡＳ０００３４０のプラスミドマップを示す。 ｐＤＡＳ０００３４１のプラスミドマップを示す。 ｐＤＡＳ０００３４２のプラスミドマップを示す。 ｐＤＡＳ０００３４３のプラスミドマップを示す。 プライマーの位置ならびにＦａｄ３Ｃの開始および終止コドンに対するその位置を示す概略図である。パネルＡは野生型Ｆａｄ３Ｃ座についてのプライマー部位の位置を示す。パネルＢはドナー組込みを確認するためのプライマー部位の位置、およびドナーがＦａｄ３Ｃ座に組み込まれ得る可能な配向を示す。 プライマーの位置ならびにＦａｄ３Ｃの開始および終止コドンに対するその位置を示す概略図である。パネルＡは野生型Ｆａｄ３Ｃ座についてのプライマー部位の位置を示す。パネルＢはドナー組込みを確認するためのプライマー部位の位置、およびドナーがＦａｄ３Ｃ座に組み込まれ得る可能な配向を示す。 パネルＡおよびＢは、指示されるＺＦＮおよびドナープラスミドを用いた改変後の配列アラインメントを示す。図２０ＡはＺＦＮ２８０５１−２Ａ−２８０５２によって認識される二本鎖切断におけるｐＤＡＳ０００３４１のｔＧＦＰカセットとＦａｄ３Ｃのジャンクションから増幅された配列アラインメントを示す。「：」は切断部位に位置する欠失を示している。配列番号３００〜配列番号３１３がアラインメントに示されている。 ＺＦＮ２８０５１−２Ａ−２８０５２およびＺＦＮ２８０５３−２Ａ−２８０５４によって認識される二本鎖切断におけるｐＤＡＳ０００３４３のｔＧＦＰカセットとＦａｄ３Ｃのジャンクションから増幅された配列アラインメントを示す。「：」は切断部位に位置する欠失を示している。配列番号３１４〜配列番号３２７がアラインメントに示されている。 パネルＡおよびＢはＺＦＮ２８０５１−２Ａ−２８０５２によって認識される二本鎖切断におけるｐＤＡＳ０００３４０のｈｐｈカセットとＦＡＤ３Ｃのジャンクションから増幅された配列の配列アラインメントを示す。「サンプル」はアッセイされた各植物に固有の識別子である。「：」は切断部位に位置する欠失を示している。図２１Ａに示される配列は５’ジャンクションについてのものであり、図２１Ｂに示される配列は３’ジャンクションについてのものである。配列番号３６８〜配列番号３７５が図２１Ａのアラインメントに示されている。配列番号３７６〜配列番号３７７が図２１Ｂのアラインメントに示されている。 ＺＦＮ２８０５３−２Ａ−２８０５４によって認識される二本鎖切断におけるｐＤＡＳ０００３４２のｈｐｈカセットとＦＡＤ３Ｃのジャンクションから増幅された配列の配列アラインメントを示す。「サンプル」はアッセイされた各植物に固有の識別子である。「：」は切断部位に位置する欠失を示している。図２２に示される配列は３’ジャンクションについてのものである。配列番号３７８〜配列番号３７９がアラインメントに示されている。 パネルＡおよびＢはＺＦＮ２８０５１−２Ａ−２８０５２によって認識される二本鎖切断におけるｐＤＡＳ０００３４０のｈｐｈカセットとＦＡＤ３Ｃのジャンクションから増幅された配列の配列アラインメントを示す。「：」は切断部位に位置する欠失を示している。図２３Ａに示される配列は５’ジャンクションについてのものであり、ボックス（Ｂ）に示される配列は３’ジャンクションについてのものである。配列番号３２８〜配列番号３３４が図２３Ａのアラインメントに示されている。配列番号３３５〜配列番号３４２が図２３Ｂのアラインメントに示されている。 パネルＡおよびＢはＺＦＮ２８０５３−２Ａ−２８０５４によって認識される二本鎖切断におけるｐＤＡＳ０００３４２のｈｐｈカセットとＦＡＤ３Ｃのジャンクションから増幅された配列の配列アラインメントを示す。「：」は切断部位に位置する欠失を示している。図２４Ａに示される配列は５’ジャンクションについてのものであり、図２４Ｂに示される配列は３’ジャンクションについてのものである。配列番号３４３〜配列番号３４６が図２４Ａのアラインメントに示されている。配列番号３４７〜配列番号３５１が図２４Ｂのアラインメントに示されている。
配列表
核酸配列は、米国特許法施行規則第１．８２２条に定義されるヌクレオチド塩基についての標準的な文字略語を用いて示される。１本鎖のみの各核酸配列が示されるが、示される鎖への任意の言及により、相補鎖が含まれると理解される。
Ｉ．いくつかの実施形態の概要
本発明の実施形態は、組み込まれた核酸によって影響を及ぼされるものを超えて宿主の他の表現型に大いに悪影響を及ぼすことのない、外因性核酸（例えば、導入遺伝子）の宿主ゲノムへの標的化組込みのための手法を確立する。単一の宿主ゲノム中の複数の核酸を「スタッキングする」ために、いくつかの実施形態が使用され得る。このような手法は、４つの相互接続技術の開発および配置を使用する：特異的ゲノムＤＮＡ位置への二本鎖切断の導入を可能にする標的化技術（例えば、Puchta et al.(1993) Nucleic Acids Res.21:5034-40；Siebert and Puchta (2002) Plant Cell 14:1121-31；D'Halluin et al.(2008) Plant Biotechnol.J.6(1):93-102；Cai et al.(2009) Plant Mol.Biol.69(6):699-709；Shukla et al.(2009) Nature 459(7245):437-41)；Shan et al.(2103) Nature Biotechnol.31:686-680；Le et al.(2013) Nature Biotechnol 31: 688-691；Nekrasov et al.(2013) Nature Biotechnol.31:691-693、Ainely et al.(2013) Plant Biotechnol.J.(On Line 19 Aug)参照）；最適化外因性（ドナー）核酸の送達を可能にする送達技術（Bibikova et al.(2003) Science 300(5620):764）；標的化ドナーＤＮＡ組込みのためにＨＤＲまたはＮＨＥＪ頻度を増加させるための、（相同組換えまたはＮＨＥＪ経路のいずれかに位置する）宿主遺伝子の改変を伴う組込み技術；標的化組込みイベントを富化し特徴付けるための分析ツール；および遺伝的に十分定義されかつ形質転換された宿主生物に大いに悪影響を及ぼすことなく世代にわたる安定な遺伝子発現を支持する特異的な所望の宿主ゲノム位置（「性能座（performance loci）」）。また、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書；第２００５０２０８４８９号明細書；第２００５００２６１５７号明細書；第２００５００６４４７４号明細書；第２００６０１８８９８７号明細書；第２００９０２６３９００号明細書；第２００９０１１７６１７号明細書；第２０１０００４７８０５号明細書；第２０１１０２０７２２１号明細書；第２０１１０３０１０７３号明細書；第２０１１０８９７７５号明細書；第２０１１０２３９３１５号明細書；第２０１１０１４５９４０号明細書；第２００８０１８２３３２号明細書；第２００９０２０５０８３号明細書；第２０１００１９９３８９号明細書；第２０１１０１６７５２１号明細書も参照されたい。例えば、植物では、性能座は、座で導入遺伝子が挿入されたトランスジェニック植物の農学的または品質特性に対する負の影響が無視できるまたは存在しない座である。
本明細書に記載される実施形態は、植物ＦＡＤ３遺伝子が外因性核酸（例えば、遺伝子；非コードＤＮＡ配列、例えば、操作されたランディングパッド（Engineered Landing Pad）（ＥＬＰ）（米国特許出願第12/011,735号明細書）および操作された導入遺伝子挿入プラットホーム（ＥＴＩＰ）（係属中の米国特許出願第61/697882号明細書）；および植物形質転換ユニット）の標的化挿入のための性能座であるという予期しない知見を利用する。植物におけるＦＡＤ３座の遍在性の性質、ならびにアブラナ、トウモロコシ、ヒマワリ、コムギ、ワタおよびダイズにおけるＦＡＤ３の変化またはノックアウトが農学的または品質の不利益を有さないという証拠は、ＦＡＤ３座を商業的に関連する植物種にわたる広範なクラスの性能座と証明する。
いくつかの実施形態は、例えば、標的部位特異的ＤＮＡ認識および切断タンパク質の送達および発現から生じる、ＦＡＤ３座における部位特異的二本鎖ＤＮＡ切断を利用する。具体的な例では、このようなＦＡＤ３特異的ＤＮＡ認識および切断タンパク質が、例えば、限定されないが、ＺＦＮ；ＴＡＬＥＮ；ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｈｉｎ、ＲｅｃＡ、ＴｒｅおよびＦＬＰリコンビナーゼ）；メガヌクレアーゼ、および前記のいずれかまたはその同等物に由来する操作タンパク質であり得る。切断は、特異的切断を導くよう操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）を用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いても行われ得る。いくつかの実施形態では、このような二本鎖切断が、例えば、相同組換え修復（Homology Directed Repair）（ＨＤＲ）または非相同末端結合（Non-Homologous End Joining）（ＮＨＥＪ）によって、ＦＡＤ３性能座中の切断部位でのドナー核酸の組込みを介して修復され得る。
本開示は、例えば、アブラナ（セイヨウアブラナ）のＦＡＤ３Ａまたは３Ｃ座、およびＦＡＤ３Ａまたは３Ｃ座において外因性核酸を組み込むために利用され得る対応するＦＡＤ３特異的ＺＦＮを記載することによって、性能座としてのＦＡＤ３座の有用性を示す。
本発明の実施形態は、当分野における多くの未解決の課題に対処する。例えば、本明細書に記載される標的化組込み手法の選択性は、不必要な遺伝子導入イベントの排除に要求される度重なる野外試験の必要性を低減または排除することができる（この試験は関与する資源およびこの区域における負担となる規制要求のために高価である）。さらに、本明細書に記載される標的化ＤＮＡ挿入手法は、導入遺伝子スタッキングのプロセスにおいて特に有益となり得る。
いくつかの実施形態では、対象となる核酸を直接標的化するために内因性ＦＡＤ３座における野生のヌクレオチド配列が使用され得るが、対象となるさらなる核酸分子の宿主への組込みが促進されるように、核酸が最初に宿主の少なくとも１つのＦＡＤ３座に標的化され得る。他の例では、ＤＮＡ認識部位（例えば、ジンクフィンガー認識部位）に隣接する宿主生物の野生の配列（例えば、本質的にランダムに産生された核酸配列）と相同でないヌクレオチド配列が利用され得る。
ＩＩ．用語
特許請求の範囲を含む本出願で使用される場合、例えば、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数および単数形の用語は、別段の明確な指示がない限り、複数指示対象を含む。したがって、例えば、「植物（plant）」、「植物（the plant）」または「植物（a plant）」への言及は、複数の植物も指す。さらに、文脈に応じて、「植物（plant）」という用語の使用は、その植物の遺伝的に類似または同一の子孫も指し得る。同様に、「核酸」という用語は、核酸分子の多くのコピーを指し得る。同様に、「プローブ」という用語は、多くの類似または同一のプローブ分子を指し得る。
数値範囲は、その範囲を定義する数を含み、定義される範囲内の各整数および非整数分数を明示的に含む。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本開示に記載される種々の実施形態の概観を容易にするために、具体的な用語の以下の説明が提供される：
単離された：「単離された」生物学的成分（例えば、核酸またはタンパク質）は、該成分の化学的または機能的変化をもたらしながら（例えば、核酸は、染色体で核酸と残りのＤＮＡを結合している化学結合を破断することによって染色体から単離され得る）、該成分が自然に生じる生物の細胞中の他の生物学的成分（例えば、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、およびタンパク質）から実質的に分離されている、別に産生されている、または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質は、標準的精製法によって精製された核酸分子およびタンパク質を含む。この用語はまた、宿主細胞での組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質およびペプチドも包含する。
交雑：植物に関して本明細書で使用される場合、「交雑する」または「交雑した」という用語は、子孫（例えば、細胞、種子および植物）を産生するための受粉を介した配偶子の融合を指す。この用語は、性的交雑（すなわち、ある植物の別の植物による受粉）と自殖（すなわち、例えば、同じ植物からの花粉および胚珠を用いた自家受粉）の両方を包含する。
戻し交雑：核酸配列を植物に導入するために戻し交雑法が使用され得る。この技術は、新しい形質を植物に導入するために数十年間広く使用されてきた。Jensen, N., Ed.Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988。典型的な戻し交雑プロトコルでは、対象となる元の品種（反復親）が、移植するための対象となる核酸配列を保有する第２の品種（非反復親）と交雑される。次いで、この交雑から得られた子孫が反復親と再度交雑され、非反復親から移植された核酸配列に加えて、反復植物の所望の形態学的および生理学的特性の本質的に全てが変換植物で取り戻された植物が得られるまでこのプロセスが繰り返される。
遺伝子移入：本明細書で使用される場合、「遺伝子移入」という用語は、特定の座における対立遺伝子（または外因性核酸を含む改変対立遺伝子）の遺伝的背景への伝達を指す。いくつかの実施形態では、座における特異的対立遺伝子の遺伝子移入が、同じ種の２つの親（親の少なくとも一方はそのゲノム中に特異的対立遺伝子型を有する）の間での性的交雑を介して対立遺伝子を少なくとも１つの子孫に伝達することによって起こり得る。特異的対立遺伝子を含む子孫が、所望の遺伝的背景を有する系統と繰り返し戻し交雑され得る。特異的対立遺伝子型が遺伝的背景で固定された新しい品種を産生するために、戻し交雑子孫が特異的対立遺伝子型について選択され得る。いくつかの実施形態では、特異的対立遺伝子の遺伝子移入が、２つのドナーゲノム（例えば、融合プロトプラスト）（ドナーゲノムの少なくとも一方はそのゲノム中に特異的対立遺伝子型を有する）の間での組換えによって起こり得る。遺伝子移入は、例えば、限定されないが、破壊または改変された対立遺伝子；導入遺伝子；ＰＴＵ；およびＥＬＰであり得る特異的対立遺伝子型の伝達を伴い得る。
生殖質：本明細書で使用される場合、「生殖質」という用語は、個々の植物、植物のグループ（例えば、植物系統、品種および科）、および植物または植物のグループに由来するクローンのまたはこれらから得られる遺伝物質を指す。生殖質は生物もしくは細胞の一部であり得る、またはこれは生物もしくは細胞とは別（例えば、単離されている）であり得る。一般に、生殖質は、植物の遺伝的質の基礎である特定の分子構造を有する遺伝物質を提供する。本明細書で使用される場合、「生殖質」は、特定の植物の細胞；種子；特定の植物の組織（例えば、そこから新しい植物が栽培され得る組織）；および特定の植物の種子以外の部分（例えば、葉、茎、花粉および細胞）を指す。本明細書で使用される場合、「生殖質」という用語は「遺伝物質」と同義であり、そこから植物が繁殖され得る種子（または他の植物材料）を指すために使用され得る。「生殖質バンク」は、そこから公知の栽培品種が栽培され得る、およびそこから新しい栽培品種が産生され得る、異なる種子または他の遺伝物質（各遺伝子型が独自に同定されている）の組織的収集物を指し得る。
遺伝子：本明細書で使用される場合、「遺伝子」（または「遺伝要素」）という用語は、機能的重要性を有する遺伝的ゲノムＤＮＡ配列を指し得る。遺伝子は野生の核酸であっても、ゲノムに組み込まれた核酸であってもよい。「遺伝子」という用語は、例えば、限定されないが、遺伝的ゲノムＤＮＡ配列によってコードされているｃＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡを指すためにも使用され得る。
核酸分子：本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は、ヌクレオチド（すなわち、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよび／または前記のいずれかの改変型）のポリマー型を指し得る。本明細書で使用される「核酸分子」は、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。この用語は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡならびにこれらの合成型および混合ポリマーのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含む。この用語は、一本鎖、二本鎖、部分的二重鎖、三重鎖、ヘアピン、円形および南京錠構造を含む任意の形態的構造を含む。核酸分子は、天然ヌクレオチドおよび改変ヌクレオチドのいずれかまたは両方を含むことができる。このようなヌクレオチドは、天然および／または非天然ヌクレオチド結合によって結合され得る。
核酸分子は、当業者によって容易に認識されるように、化学的もしくは生化学的に改変されていてもよく、または誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。このような改変は、例えば、限定されないが、ラベル；メチル化；類似体による天然ヌクレオチドの１つまたはそれ以上の置換；およびヌクレオチド間改変（例えば、無電荷結合、例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデートおよびカルバメート；荷電結合、例えば、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート；ペンダント部分、例えば、ペプチド；インターカレーター、例えば、アクリジンおよびソラレン；キレート剤；アルキル化剤；および改変結合、例えば、αアノマー核酸）を含む。
外因性：「外因性」分子は、ポリヌクレオチドについてはヌクレオチド配列および／またはゲノム位置（すなわち、座）に関して（およびポリペプチドについてはアミノ酸配列および／または細胞局在に関して）、特定の系（例えば、生殖質、品種、エリート品種および／または植物）に生まれつき備わっていない分子である。実施形態では、外因性または異種性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、生物系（例えば、植物細胞、植物遺伝子、特定の植物種もしくは品種、および／または植物染色体）に人工的に供給されており、かつ特定の生物系に生まれつき備わっていない分子であり得る。したがって、「外因性」としての核酸の指定は、その核酸が天然源以外の源に由来することを示す、またはその核酸が非天然構造、遺伝子位置もしくは要素の配列を有することを示し得る。
対照的に、例えば、「野生の」または「内因性」核酸は、染色体またはその核酸が天然で通常見られる他の遺伝物質中に通常存在するもの以外の核酸要素を含まない核酸（例えば、遺伝子）である。内因性遺伝子転写産物は、その天然の染色体座でヌクレオチド配列によってコードされ、細胞に人工的に供給されていない。
作動可能に連結された（operably linked）：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にある場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列と作動可能に連結されている。組換え的に産生されると、作動可能に連結された核酸配列は一般的に隣接しており、必要な場合には同じリーディングフレーム中の２つのタンパク質コード領域を連結する。しかしながら、要素は作動可能に連結されるために隣接している必要はない。
プロモーター：プロモーターは、一般的に核酸の転写を増強する核酸の（５’領域に向かって）上流に位置するＤＮＡの領域である。プロモーターは、作動可能に連結されている核酸の適当な活性化または抑制を可能にする。プロモーターは、転写因子によって認識される特異的配列を含む。これらの因子がプロモーターＤＮＡ配列に結合し、ＲＮＡポリメラーゼ、すなわち核酸のコード領域からＲＮＡを合成する酵素の動員をもたらす。形質転換された：ベクターが核酸分子を細胞中に移す場合、ベクターは細胞を「形質転換する」または「形質導入する」。核酸分子が、核酸分子の細胞ゲノムへの組込みまたはエピソーム複製によって、細胞により安定的に複製されるようになると、細胞は核酸分子により「形質転換されている」。本明細書で使用される場合、「形質転換」という用語は、核酸分子が細胞に導入され得る全ての技術を包含する。例は、限定されないが、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション；プラスミドベクターを用いた形質転換；エレクトロポレーション（Fromm et al.(1986) Nature 319:791-3）；リポフェクション（Felgner et al.(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7）；マイクロインジェクション（Mueller et al.(1978) Cell 15:579-85）；アグロバクテリウム媒介移入（Fraley et al.(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7）；直接ＤＮＡ取り込み；および微粒子銃（Klein et al.(1987) Nature 327:70）を含む。
導入された：本明細書で使用される場合、「導入された」という用語は、外因性核酸の細胞への転位に言及する場合には、当分野で利用可能な任意の方法論を用いた核酸の細胞への組込みを指す。この用語は、例えば、限定されないが、トランスフェクション；形質転換；および形質導入を含む核酸導入法を包含する。
導入遺伝子：本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、対象となる外因性核酸コード配列を指す。例えば、導入遺伝子は産業的もしくは薬学的に有用な化合物、または望ましい農業的形質（例えば、除草剤耐性もしくは有害生物耐性）に寄与する発現産物をコードし得る。さらなる例では、導入遺伝子がアンチセンス核酸であってもよく、アンチセンス核酸の発現は標的核酸配列の発現を阻害する。導入遺伝子は、導入遺伝子と作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーター）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＦＡＤ３座において部位特異的標的化によって導入される対象となる核酸分子が導入遺伝子である。しかしながら、他の実施形態では、対象となる核酸分子がＰＴＵ、ＥＬＰ、ＥＴＩＰまたは内因性核酸配列（例えば、内因性核酸配列の追加の外因性ゲノムコピーが望まれる場合）であり得る。
要素は、構造ＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡも含むことができる。このようなＲＮＡは、限定されないが、ポスティング（posting）に影響を及ぼすまたは除草剤耐性を与えることを含む外因性または内因性遺伝子を改変することができる。
組換え：本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、ヒトの介入によって変えられた材料（例えば、核酸、遺伝子、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド）を指す。例えば、組換え分子の一部または要素の配列は野生の配列でなくてもよく、および／または組換え分子の一次配列は、例えば、その発現および／または活性を最適化するためにその野生の配列から変更されていてもよい。自然の環境または状態で組換え材料を産生するまたはそこから取り出すために材料が変化され得る。一例として、オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列がその自然の状況から取り出され、人工核酸分子（例えば、ベクター）にクローニングされた場合、核酸のオープンリーディングフレームは組換えである。組換え分子（例えば、組換え核酸）を産生するためのプロトコルおよび試薬は、当分野で一般的であり、その使用は日常的である。「組換え」という用語はまた、本明細書において、組換え材料を含む細胞または生物（例えば、組換え核酸を含む植物および／または植物細胞）も指し得る。いくつかの例では、組換え生物がトランスジェニック生物である。
ベクター：本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、少なくとも１つの核酸セグメントを細胞に移入することができるポリヌクレオチドまたは他の分子を指す。ベクターは場合により、ベクター維持を媒介するおよび／またはその意図した使用を可能にする成分／要素（例えば、複製に必要な配列、薬剤もしくは抗生物質耐性を与える遺伝子、マルチクローニングサイト、および／またはクローニングされた遺伝子の発現を可能にする作動可能に連結されたプロモーター／エンハンサー要素）を含んでもよい。ベクターは、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、または植物もしくは動物ウイルスに由来し得る。「クローニングベクター」、「シャトルベクター」または「サブクローニングベクター」は、一般的にクローニングまたはサブクローニング工程を促進するための作動可能に連結された要素を含む（例えば、マルチクローニングサイトは複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む）。
発現ベクター：本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、特定の宿主生物においてコード配列の発現を促進することができる作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列を含むベクターを指す。例えば、細菌発現ベクターは、細菌においてコード配列の発現を促進することができる。同様に、植物発現ベクターは、植物細胞においてコード配列の発現を促進することができる。原核生物において発現を促進するポリヌクレオチド配列は、例えば、限定されないが、プロモーター；オペレーター；およびリボソーム結合部位を含み得る。真核生物発現ベクター（例えば、植物発現ベクター）は、例えば、原核生物発現ベクターで使用されるものとは一般的に異なるプロモーター；エンハンサー；終止シグナル；およびポリアデニル化シグナル（および他の配列）を含み得る。
配列同一性：２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用される「配列同一性」または「同一性」という用語は、指定された比較窓にわたって最大の対応で整列された場合に、同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の値は、比較窓にわたって２つの最適整列配列（例えば、核酸配列およびアミノ酸配列）を比較することによって決定され得、比較窓中の配列の一部は２つの配列の最適整列のための（付加も欠失も含まない）基準配列と比べて付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。配列同一性は、同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両配列中で生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較窓中の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって百分率として計算される。
比較のために配列を整列させる方法は当分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv.Appl.Math.2:482；Needleman and Wunsch (1970) J.Mol.Biol.48:443；Pearson and Lipman (1988) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44；Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3；Corpet et al.(1988) Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang et al.(1992) Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson et al.(1994) Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana et al.(1999) FEMS Microbiol.Lett.174:247-50に記載されている。配列アラインメント法および相同性計算の詳細な検討は、Altschul et al.(1990) J.Mol.Biol.215:403-10に見出され得る。
国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）； Altschul et al.(1990)）が配列を整列させるために使用され得、これはいくつかの配列解析プログラムに関連して使用するために、国立生物工学情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの供給源から、およびインターネット上で入手可能である。どのようにこのプログラムを用いて配列同一性を決定するかについての説明は、ＢＬＡＳＴ（商標）についての「ヘルプ」の項目でインターネット上で入手可能である。核酸配列を比較するために、デフォルトパラメータを用いて、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」機能が使用され得る。基準配列との類似性が大きい核酸配列は、この方法で評価されると、同一性百分率の増加を示すだろう。
本明細書で使用される場合、「実質的に同一の」という用語は、８０％超同一であるヌクレオチド配列を指し得る。例えば、実質的に同一のヌクレオチド配列は、基準配列と少なくとも８５％；少なくとも８６％；少なくとも８７％；少なくとも８８％；少なくとも８９％；少なくとも９０％；少なくとも９１％；少なくとも９２％；少なくとも９３％；少なくとも９４％；少なくとも９５％；少なくとも９６％；少なくとも９７％；少なくとも９８％；少なくとも９９％；または少なくとも９９．５％同一であり得る。
座：本明細書で使用される場合、「座」という用語は、測定可能な特性（例えば、形質）に対応するゲノム上の位置を指す。いくつかの実施形態では、特に対象となる座がＦＡＤ３遺伝子のゲノム位置であり、この遺伝子の破壊は野生型遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現を減少させるまたは排除する。座は、サザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ中に座中に含まれる特有のヌクレオチド配列にハイブリダイズするプローブによって定義され得る。
マーカー：本明細書で使用される場合、「マーカー」は特定の対立遺伝子を有するおよび／または特定の形質もしくは表現型を示すと見られる植物を同定するために使用され得る遺伝子またはヌクレオチド配列を指す。マーカーは、所与のゲノム座で変異として記載され得る。遺伝子マーカーは、短ＤＮＡ配列、例えば、単一塩基対変化（一塩基多型、すなわち「ＳＮＰ」）を囲む配列、または長配列、例えば、ミニサテライト／単純反復配列（「ＳＳＲ」）であり得る。「マーカー対立遺伝子」は、特定の植物中に存在するマーカーのバージョンを指す。本明細書で使用されるマーカーという用語は、植物染色体ＤＮＡのクローン化セグメント（例えば、ＦＡＤ３座、あるいは改変および／または破壊ＦＡＤ３座を含むセグメント）を指し得、同様にまたはあるいは、植物染色体ＤＮＡのクローン化セグメントに相補的なＤＮＡ分子を指し得る。当業者によって認識されるように、マーカーに包含するための追加の隣接ヌクレオチド配列を得る工程がほとんど無限に反復され（染色体の長さによってのみ限定される）、それによって染色体に沿って追加のマーカーが同定され得る。上記の多様なマーカーのいずれかおよび全てが本発明のいくつかの実施形態で使用され得る。
いくつかの実施形態では、生殖質中の（「標的」配列によって特徴付けられる）導入遺伝子またはマーカーの存在は、核酸プローブ、例えば、オリゴヌクレオチドの使用を通して検出され得る。プローブはＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。オリゴヌクレオチドプローブは、合成的にまたはクローニングによって調製され得る。適当なクローニングベクターは当業者に周知である。ＲＮＡプローブは当分野で公知の手段によって、例えば、ＤＮＡ分子テンプレートを用いて合成され得る。
オリゴヌクレオチドプローブは標識されていても非標識であってもよい。例えば、限定されないが、ニックトランスレーションによる放射標識；ランダムプライミング；および末端デオキシトランスフェラーゼによるテーリング（使用されるヌクレオチドが、例えば、放射性３２Ｐで標識される）を含む、核酸分子を標識するための多種多様な技術が存在する。使用され得る他の標識は、例えば、限定されないが、発蛍光団；酵素；酵素基質；酵素補因子；および酵素阻害剤を含む。あるいは、単独でまたは他の反応性薬剤と併せて、検出可能なシグナルを提供する標識の使用は、受容体が結合するリガンドによって置き換えられ得、ここでは受容体が（例えば、上に示される標識によって）標識されて、単独でまたは他の試薬と併せて、検出可能なシグナルを提供する。例えば、Leary et al.(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4045-9を参照されたい。
プローブは、検出される導入遺伝子またはマーカーの正確なコピーであり得る。プローブはまた、検出される導入遺伝子またはマーカーを含む染色体ＤＮＡのクローン化セグメントと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、またはこれからなる核酸分子であり得る。プローブは、追加の核酸配列、例えば、プロモーター；転写シグナル；および／またはベクター配列をさらに含んでもよい。
プローブは、ゲノムからの標的ヌクレオチド配列および追加の隣接ヌクレオチド配列の全部または一部を含んでもよい。これは本明細書において「隣接プローブ」と呼ばれる。追加の隣接ヌクレオチド配列は、染色体からの隣接ヌクレオチド配列が慣用的に理解されるように元のマーカーの５’または３’側にあるかどうかに応じて、元の標的の「上流」または「下流」と呼ばれる。プローブは元の標的のヌクレオチド配列と隣接しないヌクレオチド配列を含んでもよく、このプローブは本明細書において「非隣接プローブ」と呼ばれる。非隣接プローブの配列は、非隣接プローブが元のマーカーまたは導入遺伝子と連結するように、染色体上の元の標的の配列の十分近くに位置し得る。
いくつかの実施形態では、プローブが、検出される標的の正確なコピーに「特異的にハイブリダイズ可能」または「特異的に相補的」である核酸分子である。「特異的にハイブリダイズ可能」および「特異的に相補的」は、核酸分子と標的との間で安定かつ特異的な結合が起こるのに十分な程度の相補性を示す用語である。核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能となるためにその標的配列と１００％相補的である必要はない。特異的結合が望まれる条件下、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で核酸と非標的配列の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合に、核酸分子は特異的にハイブリダイズ可能である。
特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択するハイブリダイゼーション法の性質ならびにハイブリダイズしている核酸配列の組成および長さに応じて変化するだろう。一般的に、洗浄時間もストリンジェンシーに影響を及ぼすが、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーションバッファのイオン強度（特に、Ｎａ＋および／またはＭｇ＋＋濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するだろう。特定の程度のストリンジェンシーを達成するために要求されるハイブリダイゼーション条件に関する計算は、当業者に公知であり、例えば、Sambrook et al.(ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11；およびHames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985に論じられている。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらなる詳細な指示および手引きは、例えば、Tijssen, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays」 in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993；およびAusubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995に見出され得る。
本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的との間のミスマッチが２５％未満である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」はさらなる特定のレベルのストリンジェンシーを含む。したがって、本明細書で使用される場合、「中等度ストリンジェンシー」条件は、２５％超の配列ミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり；「中程度ストリンジェンシー」の条件は、１５％超のミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり；また「高ストリンジェンシー」の条件は、１０％超のミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。「極めて高ストリンジェンシー」の条件は、６％超のミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。
特定の実施形態では、ストリンジェントな条件が、６ｘ生理食塩水−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）バッファ、５ｘデンハルト液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ断片化サケ精巣ＤＮＡ中６５℃でのハイブリダイゼーション、引き続いて２ｘＳＳＣバッファおよび０．５％ＳＤＳ、引き続いて１ｘＳＳＣバッファおよび０．５％ＳＤＳ、そして最後に０．２ｘＳＳＣバッファおよび０．５％ＳＤＳ中６５℃での１５〜３０分の連続的洗浄である。
連鎖（不）平衡：本明細書で使用される場合、「連鎖平衡」という用語は、マーカーおよび第２の核酸（例えば、導入遺伝子、ＰＴＵおよび第２のマーカー）が独立に分離する、すなわち、マーカーおよび第２の核酸が子孫間でランダムにソートする状態を指す。連鎖平衡を示す核酸は（それらが同じ染色体上にあろうとなかろうと）連結していないとみなされる。本明細書で使用される場合、「連鎖不平衡」は、マーカーおよび第２の核酸がランダムでない様式で分離する；すなわち、核酸が５０％未満の組換え頻度を有する（したがって、定義によると、同じ連鎖群上で５０ｃＭ未満離れている）状態を指す。いくつかの例では、連鎖不平衡を示す核酸は連結しているとみなされる。
連結した、密に連結した、および極めて密に連結した：本明細書で使用される場合、マーカーと第２の核酸（例えば、導入遺伝子、ＰＴＵおよび第２のマーカー）との間の連鎖は、染色体上の核酸が次の世代の個体に一緒に伝えられる測定可能な確率を示す現象を指し得る。したがって、あるマーカーと第２の核酸の連鎖は、組換え頻度として測定および／または表現され得る。２つの核酸が互いに近いほど、この確率が「１」に近くなる。したがって、「連結した」という用語は、０．５より大きい確率（マーカー／遺伝子が異なる染色体上に位置する場合、独立組み合わせから予測される）で、第２の核酸と一緒に伝えられる１つまたはそれ以上の遺伝子またはマーカーを指し得る。遺伝子（例えば、導入遺伝子）の存在が個体の表現型に寄与する場合、遺伝子に連結したマーカーは表現型に連結していると言われ得る。したがって、「連結している」という用語は、マーカーと遺伝子との間、またはマーカーと表現型との間の関係を指し得る。
相対的遺伝的距離（交差度数によって決定され、センチモルガン（ｃＭ）で測定される）は、一般的に２つの連結したマーカーまたは遺伝子が染色体上で互いに離れている物理的距離（塩基対で測定される）に比例する。１センチモルガンは、１％組換え頻度を示す（すなわち、２つのマーカーの間で交差イベントが１００回の細胞分裂毎に１回起こる）２つの遺伝子マーカーの間の距離として定義される。一般に、あるマーカーが別のマーカーまたは遺伝子と近いほど（これらの間の距離が遺伝的距離に関して測定されようと、物理的距離に関して測定されようと）、これらがより密に連結している。染色体距離は形質間の組換えイベントの頻度にほぼ比例するので、組換え頻度と相関するおおよその物理的距離が存在する。この相関は、主要な作物植物（Helentjaris and Burr (eds.) (1989) Development and Application of Molecular Markers to Problems in Plant Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY；Gresshoff (ed.) (1994) Plant Genome Analysis. CRC Press, Boca Raton, FL；Lander et al.(1987) Genomics 1:174-81；Tanksley et al.(1988) 「Molecular mapping of plant chromosomes」 In Chromosome Structure and Function. Gustafson and Appels (eds.) Plenum Press, NY, pp.157-73）および多くの他の生物にわたって一般的に知られているまたは容易に決定可能である。例えば、１ｃＭは酵母では約２．５〜３．０ｋｂ、シロイヌナズナでは約１４０ｋｂ、ヒマワリでは約４００ｋｂおよびユーカリでは約３５０ｋｂに相当する。
「連結している」という用語は、本明細書においては５０％未満（すなわち、５０ｃＭ未満）の組換え頻度を示す１つまたはそれ以上の核酸を指し得る。例えば、「連結している」核酸は、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、および約１０％以下の頻度で再結合し得る。前記組換え頻度に対応する同じ染色体上の（異なる染色体上の核酸は連鎖平衡であると予想される）このような核酸間の物理的距離は宿主ゲノムに依存し、上に示されているように容易に計算され得る。
本明細書で使用される場合、「密に連結している」という用語は、約２０％以下（すなわち、約２０ｃＭ以下）の組換え頻度を示す１つまたはそれ以上の核酸を指し得る。例えば、「密に連結している」核酸は、２２％以下、約１８％以下、約１６％以下、約１４％以下、約１２％以下、約１０％以下、約８％以下、約６％以下、約４％以下、および約２％以下の頻度で再結合し得る。
本明細書で使用される場合、「極めて密に連結している」という用語は、約１０％以下（すなわち、約１０ｃＭ以下）の組換え頻度を示す１つまたはそれ以上の核酸を指し得る。例えば、「極めて密に連結している」核酸は、１１％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、および約１％以下の頻度で再結合し得る。
特定の核酸が特定の表現型に寄与するポリペプチドをコードする遺伝子に近いほど（遺伝的距離に関して測定されようと、物理的距離に関して測定されようと）、特定の核酸は表現型とより密に連結している。前記を考慮して、特定の遺伝子または表現型と連結している核酸は、遺伝子または表現型と密に連結している核酸、および極めて密に連結している核酸を含むと認識されるだろう。いくつかの実施形態では、特定の核酸がＦＡＤ３座（例えば、改変または破壊されたＦＡＤ３座）に近いほど（遺伝的距離に関して測定されようと、物理的距離に関して測定されようと）、特定の核酸はＦＡＤ３座において組み込まれている外因性核酸によって与えられる任意の形質／表現型と（または非改変座の場合、野生型ＦＡＤ３表現型と）より密に連結している。したがって、組み込まれた外因性核酸を含むＦＡＤ３座と連結している、密に連結しているおよび／または極めて密に連結している遺伝子マーカーは、組み込まれた核酸を含む生物（例えば、植物および植物品種）を同定する、組み込まれた核酸によって与えられる表現型を含む生物を同定する、ならびにこのような組み込まれた核酸および／または組み込まれた核酸によって与えられる表現型を他の適合性生物中で繁殖させるためのＭＡＳプログラムで有用となり得る。
マーカー利用育種：本明細書で使用される場合、「マーカー利用育種」という用語は、１つまたはそれ以上の形質（例えば、ポリジーン形質）のために直接植物を育種する手法を指し得る。現在の実際問題として、植物育種家は、容易に検出可能な形質、例えば、花の色、種皮の外観、または農業経済学的に望ましい形質に関連するアイソザイム変異形を同定しようと試みている。その結果、植物育種家は、容易に検出可能な形質の分離に従うことによって、分離している育種集団の農学的形質に従う。しかしながら、対象となる形質と、植物育種に使用するために利用可能な容易に検出可能な形質との間のこれらの連鎖関係はほとんど存在しない。本発明のいくつかの実施形態では、マーカー利用育種が、対象となる形質に寄与する外因性核酸が組み込まれたＦＡＤ３座に連結した１つまたはそれ以上の遺伝子マーカー（例えば、ＳＮＰ、アイソザイムおよび／またはＳＳＲマーカー）を同定する工程と、１つまたはそれ以上の遺伝子マーカーの分離に従うことによって分離している育種集団の対象となる形質に従う工程とを含む。いくつかの例では、１つまたはそれ以上の遺伝子マーカーの分離が、１つまたはそれ以上の遺伝子マーカーの存在について子孫植物からの遺伝子サンプルをアッセイすることによって、１つまたはそれ以上の遺伝子マーカーのためのプローブを利用して決定され得る。マーカー利用育種は、植物品種の改善のための時間および費用効率的なプロセスを提供する。
形質または表現型：「形質」および「表現型」という用語は本明細書において互換的に使用される。本開示の目的のために、特に対象となる形質は、例えば、作物植物において発現され得るような農業経済学的に重要な形質、および標的化組込みイベントからの導入遺伝子発現産物の産生を含む。「分子表現型」という用語は、（１つまたはそれ以上の）分子の集団のレベルで検出可能な表現型を指し得る。いくつかの例では、分子表現型は、分子レベルでのみ検出可能であり得る。表現型の検出可能な分子は核酸（例えば、ゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡ）；タンパク質；および／または代謝産物であり得る。例えば、分子表現型は、（例えば、植物発育の特定の段階における、または環境条件もしくはストレスに応じた）１つまたはそれ以上の遺伝子産物についての発現プロファイルであり得る。
量的形質座位：遺伝子（相加、優先および上位）および環境の影響により絶えず変化する形質は一般的に「量的形質」と呼ばれる。量的形質は、表現型の連続分布をもたらす遺伝子発現への環境的影響、および多遺伝子遺伝によってもたらされる複雑な分離パターンの２つの因子に基づいて「質的」または「離散」形質から識別され得る。量的形質の発現に関連するゲノムの１つまたはそれ以上の領域の同定が、このような領域を「量的形質座位（「ＱＴＬ」）と定義する。
植物：本明細書で使用される場合、「植物」という用語は、全植物、植物に由来する細胞もしくは組織培養物、および／または前記のいずれかの任意の部分を指し得る。したがって、「植物」という用語は、例えば、限定されないが、全植物；植物成分および／または器官（例えば、葉、茎および根）；植物組織；種子；ならびに植物細胞を包含する。植物細胞は、例えば、限定されないが、植物中および／または植物の細胞、植物から単離された細胞、ならびに植物から単離された細胞の培養を通して得られた細胞であり得る。
「トランスジェニック植物」は、その細胞の少なくとも１つの中に外因性ポリヌクレオチドを含む植物である。「トランスジェニック」という用語は、本明細書において、その遺伝子型が外因性核酸の存在によって変えられた任意の細胞、細胞系、カルス、組織、植物部位、または植物を指すために使用される。したがって、この用語は、外因性ポリヌクレオチドを含むように最初に変えられたトランスジェニック生物および細胞、ならびに最初のトランスジェニック生物または細胞の交雑または無性繁殖によって作成された生物および細胞を包含する。本明細書で使用される「トランスジェニック」という用語は、従来の植物育種法（例えば、非トランスジェニック生物のみの交雑）または天然のイベント（例えば、ランダム多家受粉、非組換えウイルス感染、非組換え細菌形質転換、非組換え転位および自然突然変異）によって導入されたゲノム（染色体または染色体外）変化を包含しない。
植物「系統」、「品種」または「株」は、同じ血統を有する個々の植物の群である。ある系統の植物は、一般的にある程度近交系であり、一般的にほとんどの遺伝子座（例えば、ＦＡＤ３座）でホモ接合性および同種である。「亜系統」は、同じ祖先に由来する他の類似の近交系サブセットとは遺伝的に異なる共通の祖先からの子孫の近交系サブセットを指し得る。いくつかの実施形態では、「亜系統」は、残りの分離座がほとんどまたは全ての座にわたってホモ接合性となるまで、Ｆ３〜Ｆ５世代で選択される個々のトランスジェニック植物からの種子を近親交配することによって産生され得る。
「結合タンパク質」は、別の分子に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、これは（ホモダイマー、ホモトリマー等を形成するために）自身に結合することができる、および／または異なるタンパク質の１つまたはそれ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、２つ以上の型の結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、１つまたはそれ以上のジンクフィンガーを通して配列特異的様式でＤＮＡに結合するタンパク質または大型タンパク質中のドメインであり、ジンクフィンガーはその構造が亜鉛イオンの配位を通して安定化される結合ドメイン中のアミノ酸配列の領域である。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は通常、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたはそれ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥとその同族の標的ＤＮＡ配列の結合に関与する。単一「反復単位」（「反復」とも呼ばれる）は、典型的には長さ３３〜３５個のアミノ酸であり、天然のＴＡＬＥタンパク質中の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタパク質のヘリックス認識領域の操作（１つまたはそれ以上のアミノ酸を変化させる）を通して、所定のヌクレオチド配列に結合するよう「操作」され得る。そのため、操作ＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然タンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作する方法の非限定的例は、設計および選択である。設計ＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が原則として合理的な基準から生じる、天然で生じないタンパク質である。設計のための合理的な基準は、置換ルールならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計の情報を記憶するデータベース中の情報を処理するための計算機化アルゴリズムの適用、ならびにデータの結合を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書；第６，４５３，２４２号明細書；および第６，５３４，２６１号明細書；を参照されたい；また国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；国際公開第９８／５３０５９号パンフレット；国際公開第９８／５３０６０号パンフレット；国際公開第０２／０１６５３６号パンフレットおよび国際公開第０３／０１６４９６号パンフレットならびに米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生が経験的プロセス、例えば、ファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択から主に生じる、天然で見られないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号明細書；米国特許第５，９２５，５２３号明細書；米国特許第６，００７，９８８号明細書；米国特許第６，０１３，４５３号明細書；米国特許第６，２００，７５９号明細書；国際公開第９５／１９４３１号パンフレット；国際公開第９６／０６１６６号パンフレット；国際公開第９８／５３０５７号パンフレット；国際公開第９８／５４３１１号パンフレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／６０９７０号パンフレット；国際公開第 ０１／８８１９７号パンフレット；国際公開第０２／０９９０８４号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破損を指す。切断は、それだけに限らないが、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含む種々の方法によって開始され得る。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は２つの異なる一本鎖切断イベントの結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらし得る。特定の実施形態では、融合ポリペプチドが標的化二本鎖ＤＮＡ切断に使用される。
「切断ハーフドメイン（cleavage half-domain）」は、第２のポリペプチド（同一または異なる）と併せて、切断活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第１および第２の切断ハーフドメイン」、「＋および−切断ハーフドメイン」ならびに「右および左切断ハーフドメイン」という用語は、二量体化する対の切断ハーフドメインを指すために互換的に使用される。
「操作切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作切断ハーフドメイン）と共に絶対ヘテロダイマーを形成するよう改変された切断ハーフドメインである。全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書、第２００７０２１８５２８号明細書、第２００８／０１３１９６２号明細書および第２０１１／０２０１０５５号明細書も参照されたい。
二本鎖ＤＮＡ切断をもたらす手段：本明細書で使用される場合、「二本鎖ＤＮＡ切断をもたらす手段」という用語は、米国特許法第１１２条第６パラグラフによって認可される特別請求規定を援用することが意図されている。具体的には、「二本鎖ＤＮＡ切断をもたらす手段」は、二本鎖ＤＮＡ分子の両鎖を切断することができる分子構造を指す。このような構造は、多くの公知のヌクレアーゼタンパク質、例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに含まれるポリペプチドドメインを含み、触媒ドメインはタンパク質Ｍｍｅｌ、コリシンＥ７（ＣＥＡ７＿ＥＣＯＬＸ）、コリシンＥ９、ＡＰＦＬ、ＥｎｄＡ、エンドＩ（ＥＮＤ１＿ＥＣ０ＬＩ）、ヒトエンドＧ（ＮＵＣＧ＿ＨＵＭＡＮ）、ウシエンドＧ（ＮＵＣＧ＿ＢＯＶＩＮ）、Ｒ．ＨｉｎＰｌｌ、ｌ−Ｂａｓｌ、ｌ−Ｂｍｏｌ、ｌ−Ｈｍｕｌ、ｌ−Ｔｅｖｌ、ｌ−Ｔｅｖｌｌ、ｌ−Ｔｅｖｌｌｌ、ｌ−Ｔｗｏｌ、Ｒ．Ｍｓｐｌ、Ｒ．Ｍｖａｌ、ＮｕｃＡ、ＮｕｃＭ、Ｖｖｎ、Ｖｖｎ＿ＣＬＳ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ（ＮＵＣ＿ＳＴＡＡＵ）、ブドウ球菌ヌクレアーゼ（ＮＵＣ＿ＳＴＡＨＹ）、小球菌ヌクレアーゼ（ＮＵＣ＿ＳＨＩＦＬ）、エンドヌクレアーゼｙｎｃＢ、エンドデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＥＮＲＮ＿ＢＰＴ７）、Ｍｅｔｎａｓｅ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＤＩ Ａ、Ｎｔ．ＢｓｐＤ６ｌ（Ｒ．ＢｓｐＤ６ｌ大型サブユニット）、ｓｓ．ＢｓｐＤ６ｌ（Ｒ．ＢｓｐＤ６ｌ小型サブユニット）、Ｒ．ＰＩｅｌ、Ｍｌｙｌ、Ａｌｗｌ、Ｍｖａｌ２６９ｌ、Ｂｓｒｌ、Ｂｓｍｌ、Ｎｂ．ＢｔｓＣＩ、Ｎｔ．ＢｔｓＣＩ、Ｒｌ．Ｂｔｓｌ、Ｒ２．Ｂｔｓｌ、ＢｂｖＣＩサブユニット１、ＢｂｖＣＩサブユニット２、ＢｐｕｌＯＩαサブユニット、ＢｐｕｌＯＩβサブユニット、Ｂｍｒｌ、Ｂｆｉｌ、ｌ−Ｃｒｅｌ、ｈＥｘｏｌ（ＥＸ０１ＪＨＵＭＡＮ）、酵母Ｅｘｏｌ（ＥＸ０１＿ＹＥＡＳＴ）、大腸菌Ｅｘｏｌ、ヒトＴＲＥＸ２、マウスＴＲＥＸ１、ヒトＴＲＥＸ１、ウシＴＲＥＸ１、ラットＴＲＥＸ１、ヒトＤＮＡ２、酵母ＤＮＡ２（ＤＮＡ２＿ＹＥＡＳＴ）からなる群から選択される。
二本鎖ＤＮＡ切断を修復する手段：本明細書で使用される場合、「二本鎖ＤＮＡ切断を修復する手段」という用語も、米国特許法第１１２条第６パラグラフによって認可される特別請求規定を援用することが意図されている。具体的には、「二本鎖ＤＮＡ切断を修復する手段」は、例えば、単一の二本鎖ＤＮＡ分子を切断することによって産生される末端を連結する、または単一の二本鎖ＤＮＡを切断することによって産生される一端と外因性二本鎖ＤＮＡ分子の末端を連結することによって、二本鎖ＤＮＡ分子の末端の連結を促進／触媒することができる分子構造を指す。このような構造は、多くの公知のリガーゼタンパク質、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼに含まれるポリペプチドドメインを含む。いくつかの例では、同じ分子構造が、二本鎖ＤＮＡ切断をもたらす手段と、二本鎖ＤＮＡ切断を修復する手段の両方として作用することができ、ここでは同じ構造が二本鎖ＤＮＡ分子の切断と修復の両方を促進する（例えば、Ｈｉｎリコンビナーゼ）。
ゲノム中の部位特異的二本鎖切断の誘導は、相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復を通して二本鎖切断を回復させる宿主植物細胞ＤＮＡ修復経路を誘導する。植物では、科学文献が、野生のゲノムまたは予備操作位置への正確な遺伝子またはドナーＤＮＡ組込みが、標的化二本鎖切断に隣接する配列との種々の量の配列相同性を含む入来ドナーＤＮＡ構築物を伴っていることを報告している。このようなドナーの特定の標的座への組込みは、おそらくＨＤＲ経路に頼っている。植物における遺伝子標的化のためにＨＤＲアプローチにもっぱら頼ることは、ＨＤＲ修復経路が、ＮＨＥＪと比べると支配的ＤＮＡ修復経路ではないという報告のために、制限を有し得る。 標的特異的ＤＮＡ切断（ＺＦＮ、ＴＡＬｅＮｓまたは操作メガヌクレアーゼ等）を利用する公開されている植物科学文献では、ＮＨＥＪ経路が特異的点突然変異（挿入または欠失）をゲノムに導入する方法として報告されている。ここでは、本発明者らは、０〜１０ｂｐ未満の相同性領域を有する種々のドナーＤＮＡ設計の存在下で、（ＺＦＮ、ＴＡＬｅＮｓ等によって誘導される）部位特異的二本鎖切断が、植物におけるＮＨＥＪ修復経路を介して標的化切断において特異的に挿入され得ることを報告する。 線状から環状の一本鎖から二本鎖に及ぶ小型の１〜１０ｂｐとの相同性が０の種々の異なるＤＮＡドナー設計が、ＮＨＥＪ経路を用いて特異的位置に標的化され得る。ＮＨＥＪベースのドナーＤＮＡ植物ゲノム標的化は、「付着末端捕捉」に基づくことができ、ここではＦｏｋ１（または他のＩＩ型エンドヌクレアーゼドメイン）によって産生されたゲノム中の標的化二本鎖切断および対応する付着末端がＮＨＥＪドナーＤＮＡ設計となる。付着末端ドナーＤＮＡは、予め定義されたオーバーハングを有する線状ドナーＤＮＡとして細胞に直接送達され得る。代替手法は、宿主標的ＺＦＮおよび標的認識部位と同一の少なくとも１つのＺＦＮ認識部位を含む環状ＤＮＡドナー分子を同時送達することによってインビボでドナーＤＮＡ付着末端を産生することである。少なくとも１つのＺＦＮの発現が、宿主ゲノムＤＮＡ（野生のまたは予備操作された）および環状ドナーＤＮＡを切断して、宿主ＮＨＥＪ修復経路を用いて回復される付着末端を産生する。
ドナー分子上に１つまたはそれ以上のＺＦＮ切断部位を有することが可能である（ドナー分子全体を直線化するための単一ＺＦＮ切断部位、小型ドナーＤＮＡ断片を放出するための２つの同じＺＦＮ部位、またはドナーから断片および宿主ゲノムＤＮＡから対応する断片（ＤＮＡ置換）を放出するための２つの異なるＺＦＮ部位）。
したがって、ドナーポリヌクレオチドは一本鎖および／または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり得、線状または環状型で細胞に導入され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号明細書および第２０１１０２０７２２１号明細書を参照されたい。ある場合、本発明の実施形態は、線状外因性（ドナー）核酸、これらの核酸を含む組成物、ならびにこれらの線状ドナー分子を製造および使用する方法も含み得る。特定の実施形態では、線状ドナー分子が、導入される細胞中に安定的に持続する。他の実施形態では、線状ドナー分子が、例えば、ドナー分子の端部に１つまたはそれ以上の塩基対間の１つまたはそれ以上のホスホロチオエートホスホジエステル結合を配置することによって、エキソヌクレアーゼ切断に耐えるよう改変される。線状外因性核酸は、一本鎖特異的ＤＮＡを含んでもよい。
ＩＶ．ＦＡＤ３性能座
ＦＡＤ３（脂肪酸デサチュラーゼ３）と命名される座は、植物中の脂肪酸含量の複雑な多遺伝子形質の遺伝に関与するＱＴＬに含まれる。ＦＡＤ３は、リノール酸（１８：２）のリノレン酸（Ｃ１８：３）への不飽和化を担う酵素をコードしている。Tanhuanpaa et al.(1998) Mol. Breed. 4:543-50; Schierholt et al.(2001) Crop Sci. 41:1444-9。
植物油生合成経路において、脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ）は植物脂質生合成において重要な役割を果たしており、その活性は脂肪酸組成に有意に影響を及ぼす。ＦＡＤは植物中に豊富にあり、発現解析が、ＦＡＤ ｍＲＮＡが過剰に産生されていることを示唆した。さらに、ＦＡＤ遺伝子は、種々の組織および細胞型、ならびにプラスチドおよび小胞体を含む細胞内区画で発現している。
植物の脂肪酸組成、および多くの用途におけるそこから産生される油の性能は、主要な脂肪酸構成成分であるオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸（Ｃ１８：３）の相対濃度によって決定される。これらの脂肪酸の濃度は、酵素ＦＡＤ２およびＦＡＤ３の機能によって主に調節される。オレイン酸は以下のスキームにしたがって、植物中でリノール酸およびリノレン酸に変換される：
ＦＡＤ３遺伝子は、それだけに限らないが、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、シロイヌナズナ、コムギ、イネ科牧草、イネ、ヒマワリおよびアブラナ属を含む主要な植物および藻類の種で同定されており、ＦＡＤ３発現の改変は、このような生物における脂肪酸プロファイルの変化をもたらす。さらに、改変ＦＡＤ３遺伝子を含む植物が商品化されており、ＦＡＤ３遺伝子の破壊は、宿主植物への農学的不利益なしに宿主植物によって産生される油の栄養的および機能的特性を改善することができることが示されている。例えば、Ｎｅｘｅｒａ（登録商標）ブランド（Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＬＬＣ）で商品化されているアブラナおよびヒマワリ品種は、野生型アブラナおよびヒマワリのプロファイルと比べると、高いオレイン酸、低いリノール酸および低いリノレン酸（および低い飽和脂肪酸）組成によって特徴付けられる。欧州、北米およびオーストラリアで栽培されている主なアブラナの種は、セイヨウアブラナ、ブラッシカ・オレラセア（B. oleracea）（二倍体Ｃゲノムを有する）およびブラッシカ・ラパ（B. rapa）（二倍体Ａゲノムを有する）のハイブリダイゼーションから生じたと考えられる倍数体アブラナ属の種である。細胞遺伝学研究は、ＡＡおよびＣＣゲノムが互いに部分的に相同性であるとして一定程度の近縁性を示すことを明らかにした。ＡゲノムとＣゲノムの両方が高い割合の相同遺伝子および／またはパラロガス遺伝子を含んでいる。したがって、ＡＡおよびＣＣゲノムが共通の祖先ゲノムに由来すると考えられる。Prakash and Hinata (1980) Opera Botanica 55:1-57。両祖先種のゲノムは技術的に二倍体として分類されるが、これらのゲノムは高い割合の互いに重複性である領域を含む。Song et al.(1991) Theor.Appl.Genet.82:296-304。詳細な小器官および核ＲＦＬＰ分析は、ブラッシカ・ラパのＡＡゲノムがセイヨウアブラナに１０個の染色体を与える一方で、ブラッシカ・オレラセアが母系ドナーとしてのそのＣＣゲノムから９個の染色体を与えることを明らかにした。Song et al.(1992) Genome 35:992-1001。両祖先ゲノム中のゲノム重複の数ならびにＡ、ＢおよびＣゲノム間での高い類似性の割合を通して、ＦＡＤ２およびＦＡＤ３遺伝子のいくつかのコピーが生じた。実際問題として、この事実は、特定の脂肪酸プロファイルをもたらすために、これらの遺伝子の改変および／または破壊されたコピーを有するアブラナを育種することを困難にする。
アブラナのＦＡＤ３の公知の機能遺伝子コピーの全てがＡゲノムのＮ４連鎖群に位置している。Scheffler et al.(1997) TAG 94(5):583-91; Schierholt et al.(2000) TAG 101(5-6):897-901。より最近では、アブラナにおける高いオレイン形質が、Ａゲノムに位置する改変および破壊されたＦＡＤ３遺伝子に関連付けられている。米国特許出願公開第２００６／０２４８６１１ Ａ１号明細書；Hu et al.(2006)「Identification and Mapping of FAD2 and FAD3 Mutations and Development of Allele-specific Markers for High Oleic and Low Linolenic Acid Contents in Canola (Brassica napus L.)」、Plant & Animal Genomes XIV Conference, January 14-18, 2006, San Diego, CA。ＦＡＤ３対立遺伝子の不活性化は、リノール酸のリノレン酸への不飽和化を低減することによってオレイン酸含量の制御に寄与する。この高いオレイン酸およびＦＡＤ３形質は、約７７％の特徴的なオレイン酸含量を有するセイヨウアブラナ品種（ＤＭＳ１００）で同定された。米国特許出願公開第２００６０２４８６１１号明細書を参照されたい。さらに、Ｆａｄ３および高いオレイン酸形質のアブラナへの遺伝子移入を助けるために遺伝子マーカーが開発されている。
ＦＡＤ３座は、植物の価値に悪影響を及ぼすことなく、かつ多くの目的のために、ＦＡＤ３発現の変化、油含量／比の変化ならびに／あるいは所望の導入遺伝子の組込みおよび発現を含むその価値を実際に増加させて、植物中で改変および／または破壊され得る。さらに、植物におけるＦＡＤ座の遍在的性質により、ＦＡＤ３座は、例えば、限定されないが、アブラナ；ダイズ；トウモロコシ；コムギ；イネ科牧草；アブラナ属の種；イネ；トマト；オオムギ；エンバク；ソルガム；ワタ；およびヒマワリ、ならびに真菌類および藻類を含む多くの種で少なくともいくつかの目的を損なうことなく改変および／または破壊され得る。本発明の実施形態は、ＦＡＤ３座、および外因性核酸の組込みのための性能座としてのその使用を含む。例では、ＦＡＤ３座が、例えば、限定されないが、宿主生物の生活環中にほぼ一貫したレベルの発現があること；および驚くべきことに、ＦＡＤ３座におけるドナーＤＮＡの挿入が宿主に質または適合性の不利益を誘導しないことを含む、性能座としてのその使用の状況の中で望ましいことが分かっているいくつかの特徴の少なくとも１つを示す。
本発明のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのＦＡＤ３座（例えば、ＦＡＤ３Ａおよび／またはＦＡＤ３Ｃ座）が、外因性核酸（例えば、対象となるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）の部位特異的組込みのための標的部位として使用される。特定の実施形態では、外因性核酸の組込みが改変された座をもたらす。例えば、外因性核酸の組込みは、破壊された（すなわち、不活性化された）ＦＡＤ３遺伝子を産生するように座を改変し得る。
いくつかの実施形態では、ＦＡＤ３座が配列番号２０〜２３、配列番号２５〜３８、配列番号４０〜４５、配列番号４７および配列番号４９からなる群から選択されるヌクレオチド配列の相補鎖に特異的にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ＦＡＤ３座は、配列番号２０〜２３、配列番号２５〜３８、配列番号４０〜４５、配列番号４７および配列番号４９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＦＡＤ３座が配列番号２０〜２３、配列番号２５〜３８、配列番号４０〜４５、配列番号４７および配列番号４９からなる群から選択されるヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＦＡＤ３座が配列番号２０〜２３、配列番号２５〜３８、配列番号４０〜４５、配列番号４７および配列番号４９からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約８５％同一のヌクレオチド配列を含むＦＡＤ３ホモログ（例えば、オルソログまたはパラログ）である。ＦＡＤ３ホモログは、例えば、限定されないが、配列番号２０〜２３、配列番号２５〜３８、配列番号４０〜４５、配列番号４７および配列番号４９からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％；少なくとも８５％；少なくとも約９０％；少なくとも約９１％；少なくとも約９２％；少なくとも約９３％；少なくとも約９４％；少なくとも約９５％；少なくとも約９６％；少なくとも約９７％；少なくとも約９８％；少なくとも約９９％；少なくとも約９９．５％；９９．６％、９９．７％、９９．８％および／または少なくとも約９９．９％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。このようなＦＡＤ３ホモログは、種々の生物について当業者に容易に利用可能な任意の完全または部分的ゲノムから容易に同定および単離され得る。
ＩＶ．ＦＡＤ３座における核酸の標的化組込み
ＦＡＤ３座における外因性核酸の部位特異的組込みは、当業者に公知の任意の技術によって達成され得る。いくつかの実施形態では、ＦＡＤ３座における外因性核酸の組込みが、細胞（例えば、単離細胞または組織もしくは生物中の細胞）を外因性核酸を含む核酸分子と接触させることを含む。例では、このような核酸分子が、核酸分子と少なくとも１つのＦＡＤ３座との間の相同組換えを促進する外因性核酸に隣接するヌクレオチド配列を含み得る。特定の例では、相同組換えを促進する外因性核酸に隣接するヌクレオチド配列が、ＦＡＤ３座の外因性ヌクレオチドと相補的であり得る。特定の例では、相同組換えを促進する外因性核酸に隣接するヌクレオチド配列が、予め組み込まれた外因性ヌクレオチドと相補的であり得る。いくつかの実施形態では、複数の外因性核酸が、１つのＦＡＤ３座において、例えば、遺伝子スタッキングで組み込まれ得る。
ＦＡＤ３座における核酸の組込みは、いくつかの実施形態では、宿主細胞の内因性細胞機構、例えば、限定されないが、内因性ＤＮＡおよび内因性リコンビナーゼ酵素によって促進（例えば、触媒）され得る。いくつかの実施形態では、ＦＡＤ３座における核酸の組込みが、宿主細胞に提供される１つまたはそれ以上の因子（例えば、ポリペプチド）によって促進され得る。例えば、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドは、ポリペプチドを宿主細胞と接触させることによって、またはポリペプチドを宿主細胞中で発現させることによって、（独立にまたはキメラポリペプチドの一部として）提供され得る。したがって、いくつかの例では、少なくとも１つのヌクレアーゼ、リコンビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が、ＦＡＤ３座において部位特異的に組み込まれる核酸と同時にまたは順次、宿主細胞に導入され得、少なくとも１つのヌクレアーゼ、リコンビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドが宿主細胞中のヌクレオチド配列から発現される。
Ａ．ＤＮＡ結合ポリペプチド
いくつかの実施形態では、部位特異的組込みが、例えば、宿主生物のゲノム中の特定のヌクレオチド配列を認識し、これに結合することができる因子を利用することによって達成され得る。例えば、多くのタンパク質が、部位特異的様式でＤＮＡを認識し、これに結合することができるポリペプチドドメインを含む。ＤＮＡ結合ポリペプチドによって認識されるＤＮＡ配列は、「標的」配列と呼ばれ得る。部位特異的様式でＤＮＡを認識し、これに結合することができるポリペプチドドメインは、一般的にドメインが元々単離されたタンパク質以外のポリペプチド中で発現する場合でさえ、正確に折り畳み、独立に機能して部位特異的様式でＤＮＡに結合する。同様に、ＤＮＡ結合ポリペプチドによる認識および結合のための標的配列は、一般的に大型ＤＮＡ構造（例えば、染色体）中に存在する場合でさえ、特に標的配列が位置する部位が可溶性細胞タンパク質にアクセス可能であることが知られているもの（例えば、遺伝子）である場合に、このようなポリペプチドによって認識され、結合され得る。
天然に存在するタンパク質から同定されたＤＮＡ結合ポリペプチドは、典型的には離散的ヌクレオチド配列またはモチーフ（例えば、コンセンサス認識配列）に結合するが、異なるヌクレオチド配列またはモチーフを認識するように多くのこのようなＤＮＡ結合ポリペプチドを改変する方法が当分野で公知である。ＤＮＡ結合ポリペプチドは、例えば、限定されないが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン；ロイシンジッパー；ＵＰＡ ＤＮＡ結合ドメイン；ＧＡＬ４；ＴＡＬ；ＬｅｘＡ；Ｔｅｔリプレッサー；ＬａｃＲ；およびステロイドホルモン受容体を含む。
いくつかの例では、ＤＮＡ結合ポリペプチドがジンクフィンガーである。個々のジンクフィンガーモチーフは、大きい範囲のＤＮＡ部位のいずれかに特異的に標的化および結合するよう設計され得る。標準Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２（および非標準Ｃｙｓ３Ｈｉｓ）ジンクフィンガーポリペプチドは、αヘリックスを標的ＤＮＡ二重螺旋の主溝に挿入することによって、ＤＮＡに結合する。ジンクフィンガーによるＤＮＡの認識はモジュール式であり；各フィンガーが主に標的中の３つの連続した塩基対に接触し、ポリペプチド中の数個の重要な残基が認識を媒介する。標的化エンドヌクレアーゼに複数のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを包含させることによって、標的化エンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性がさらに増加され得る（したがって、それによって与えられる任意の遺伝子調節効果の特異性も増加され得る）。例えば、Urnov et al.(2005) Nature 435:646-51を参照されたい。したがって、１つまたはそれ以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ポリペプチドは、宿主細胞に導入された標的化エンドヌクレアーゼが宿主細胞のゲノム中で特有のＤＮＡ配列と相互作用するように操作および利用され得る。
好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択された標的部位に結合するよう操作されているという点で非天然である。例えば、全て全体が参照により本明細書に組み込まれる、Beerli et al.(2002) Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo et al.(2001) Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan et al.(2001) Nature Biotechnol.19:656-660；Segal et al.(2001) Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo et al.(2000) Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；米国特許第６，４５３，２４２号明細書；第６，５３４，２６１号明細書；第６，５９９，６９２号明細書；第６，５０３，７１７号明細書；第６，６８９，５５８号明細書；第７，０３０，２１５号明細書；第６，７９４，１３６号明細書；第７，０６７，３１７号明細書；第７，２６２，０５４号明細書；第７，０７０，９３４号明細書；第７，３６１，６３５号明細書；第７，２５３，２７３号明細書；および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書；第２００７／０２１８５２８号明細書；第２００５／０２６７０６１号明細書を参照されたい。
操作ジンクフィンガー結合ドメインは、天然ジンクフィンガータンパク質と比べて新規な結合特異性を有することができる。操作法は、それだけに限らないが、合理的な設計および種々の型の選択を含む。合理的な設計は、例えば、トリプレット（またはクアドラプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを用いることを含み、ここでは各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配列が、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つまたはそれ以上のアミノ酸配列と関連する。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、共有されている米国特許第６，４５３，２４２号明細書および第６，５３４，２６１号明細書を参照されたい。
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む代表的な選択法は、米国特許第５，７８９，５３８号明細書；第５，９２５，５２３号明細書；第６，００７，９８８号明細書；第６，０１３，４５３号明細書；第６，４１０，２４８号明細書；第６，１４０，４６６号明細書；第６，２００，７５９号明細書；および 第６，２４２，５６８号明細書ならびに国際公開第９８／３７１８６号パンフレット；国際公開第９８／５３０５７号パンフレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／８８１９７号パンフレットおよび英国特許第２，３３８，２３７号明細書に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化が、例えば、共有されている国際公開第０２／０７７２２７号パンフレットに記載されている。
さらに、これらおよび他の文献に開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質は、例えば、長さが５個以上のアミノ酸のリンカーを含む、任意の適当なリンカー配列を用いて連結され得る。代表的なリンカー配列の長さ６個以上のアミノ酸については、米国特許第６，４７９，６２６号明細書；第６，９０３，１８５号明細書；および第７，１５３，９４９号明細書も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適当なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
標的部位の選択；ＺＦＰならびに融合タンパク質（および同タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築法は当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１５号明細書；第７８９，５３８号明細書；第６，４５３，２４２号明細書；第６，５３４，２６１号明細書；第５，９２５，５２３号明細書；第６，００７，９８８号明細書；第６，０１３，４５３号明細書；第６，２００，７５９号明細書；国際公開第９５／１９４３１号パンフレット；国際公開第９６／０６１６６号パンフレット；国際公開第９８／５３０５７号パンフレット；国際公開第９８／５４３１１号パンフレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／６０９７０号パンフレット；国際公開第０１／８８１９７号パンフレット；国際公開第０２／０９９０８４号パンフレット；国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；国際公開第９８／５３０５９号パンフレット；国際公開第９８／５３０６０号パンフレット；国際公開第０２／０１６５３６号パンフレットおよび国際公開第０３／０１６４９６号パンフレットに詳細に記載されている。
さらに、これらおよび他の文献に開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質は、例えば、長さが５個以上のアミノ酸のリンカーを含む、任意の適当なリンカー配列を用いて連結され得る。代表的なリンカー配列の長さ６個以上のアミノ酸については、米国特許第６，４７９，６２６号明細書；第６，９０３，１８５号明細書；および第７，１５３，９４９号明細書も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適当なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
いくつかの例では、ＤＮＡ結合ポリペプチドがＧＡＬ４からのＤＮＡ結合ドメインである。ＧＡＬ４は出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のモジュラートランス活性化因子であるが、多くの他の生物のトランス活性化因子としても作用する。例えば、Sadowski et al.(1988) Nature 335:563-4を参照されたい。この調節システムでは、出芽酵母のガラクトース代謝経路の酵素をコードする遺伝子の発現が利用可能な炭素源によってストリンジェントに調節される。Johnston (1987) Microbiol.Rev.51:458-76。これらの代謝酵素の転写制御は、正の調節タンパク質、ＧＡＬ４とＧＡＬ４が特異的に結合する１７ｂｐの対称ＤＮＡ配列（ＵＡＳ）との間の相互作用によって媒介される。
野生のＧＡＬ４は８８１個のアミノ酸残基を含み、９９ｋＤａの分子量を有する。ＧＡＬ４は、その組み合わせられた活性がインビボでＧＡＬ４の活性の原因となる機能的自律ドメインを含む。Ma and Ptashne (1987) Cell 48:847-53); Brent and Ptashne (1985) Cell 43(3 Pt 2):729-36。ＧＡＬ４のＮ末端の６５個のアミノ酸は、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインを含む。Keegan et al.(1986) Science 231:699-704; Johnston (1987) Nature 328:353-5。配列特異的結合は、ＤＮＡ結合ドメイン中に存在する６個のＣｙｓ残基によって配位された二価カチオンの存在を要する。配位カチオン含有ドメインは、ＤＮＡヘリックスの主溝との直接接触を介して１７ｂｐのＵＡＳの各端で保存されたＣＣＧトリプレットと相互作用し、これを認識する。Marmorstein et al.(1992) Nature 356:408-14。タンパク質のＤＮＡ結合機能は、活性化ドメインが転写を指示することができるように、Ｃ末端転写活性化ドメインをプロモーターの近くに配置する。
特定の実施形態で利用され得るさらなるＤＮＡ結合ポリペプチドは、例えば、限定されないが、ＡＶＲＢＳ３誘発性遺伝子からの結合配列；ＡＶＲＢＳ３誘発性遺伝子からのコンセンサス結合配列またはそこから操作された合成結合配列（例えば、ＵＰＡ ＤＮＡ結合ドメイン）；ＴＡＬ；ＬｅｘＡ（例えば、Brent & Ptashne (1985)、上記参照）；ＬａｃＲ（例えば、Labow et al.(1990) Mol.Cell.Biol.10:3343-56；Baim et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(12):5072-6参照）；ステロイドホルモン受容体（Ellliston et al.(1990) J.Biol.Chem.265:11517-121）；Ｔｅｔリプレッサー（米国特許第６，２７１，３４１号明細書）およびテトラサイクリン（Ｔｃ）の存在下ではｔｅｔオペレーター配列に結合するが、不在下では結合しない突然変異Ｔｅｔリプレッサー；ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合ドメイン；ならびにＧＡＬ４、ホルモン受容体およびＶＰ１６の融合を利用する、Wang et al.(1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(17):8180-4に記載されている調節システムの成分を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物に使用されるヌクレアーゼの１つまたはそれ以上のＤＮＡ結合ドメインが天然のまたは操作された（非天然の）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。キサントモナス（Xanthomonas）属の植物病原性細菌は、重要な作物植物において多くの病気を引き起こすことが知られている。キサントモナスの病原性は、２５種超の異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されるタンパク質の中には、植物転写活性化物質を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する転写活性化物質様（ＴＡＬ）エフェクターがある（Kay et al (2007) Science 318:648-651参照）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含んでいる。最もよく特徴付けられているＴＡＬエフェクターの１つがキサントモナス・カムペストリス病原型ベスカトリア（Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria）のＡｖｒＢｓ３である（Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136および国際公開第２０１００７９４３０号パンフレット参照）。ＴＡＬエフェクターは、タンデム反復の集中ドメインを含んでおり、各反復は、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の鍵となる約３４個のアミノ酸を含んでいる。さらに、ＴＡＬエフェクターは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含んでいる（概要については、Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272参照）。さらに、植物病原性細菌である青枯病菌（Ralstonia solanacearum）では、青枯病菌次亜種１菌株ＧＭＩ１０００および次亜種４菌株ＲＳ１０００においてキサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同性のｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と命名された２つの遺伝子が発見された（Heuer et al (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384参照）。これらの遺伝子は互いにヌクレオチド配列が９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおける１５７５ｂｐの欠失が異なる。しかしながら、両遺伝子産物は、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、米国特許第８，４２０，７８２号明細書および第８，４４０，４３１号明細書ならびに米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号明細書を参照されたい。
他の実施形態では、ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。系のＲＮＡ成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeats））座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）座（Jansen et al., 2002.Mol.Microbiol.43: 1565-1575；Makarova et al., 2002.Nucleic Acids Res.30: 482-496；Makarova et al., 2006.Biol.Direct 1: 7；Haft et al., 2005.PLoS Comput.Biol.1: e60）がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主のＣＲＩＳＰＲ座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子およびＣＲＩＳＰＲ媒介核酸切断の特異性をプログラミングすることができる非コードＲＮＡ要素の組み合わせを含む。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最も良く特徴付けられた系の１つであり、４つの連続工程で標的化ＤＮＡ二本鎖切断を行う。最初に、２つの非コードＲＮＡであるプレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡがプレｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、プレｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含む成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、標的認識のためのさらなる要件であるｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、プロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer adjacent motif）（ＰＡＭ）に隣接する標的ＤＮＡ上のプロとスペーサーとの間のワトソン−クリック塩基対形成を介して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに向ける。最後に、Ｃａｓ９が標的ＤＮＡの切断を媒介してプロトスペーサー中に二本鎖切断を作り出す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活動は３つの工程を含む：（ｉ）「適応」と呼ばれる工程で、外来ＤＮＡ配列をＣＲＩＳＰＲアレイに挿入して将来の攻撃を防ぐ、（ｉｉ）関連するタンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、引き続いて（ｉｉｉ）外来核酸によるＲＮＡ媒介干渉。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の自然な機能と関係し、外来ＤＮＡの挿入等の機能において役割を果たす。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質が天然Ｃａｓタンパク質の「機能的誘導体」であり得る。野生の配列のポリペプチドの「機能的誘導体」は、野生の配列のポリペプチドと共通の質的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」は、それだけに限らないが、対応する野生の配列のポリペプチドと共通の生物学的活性を有する限り、野生の配列の断片、ならびに野生の配列のポリペプチドおよびその断片の誘導体を含む。本明細書において考えられる生物学的活性は、機能的誘導体がＤＮＡ基質を断片に加水分解する能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異形、その共有結合改変、および融合体のいずれも包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の適当な誘導体は、それだけに限らないが、Ｃａｓタンパク質またはその断片の突然変異体、融合体、共有結合改変を含む。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣａｓタンパク質、ならびにＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞から得られても、化学的に合成されても、これらの２つの手順の組み合わせによってもよい。細胞はＣａｓタンパク質を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生するもしくは外因的に導入された核酸（この核酸は内因性Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコードする）からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝的に操作された細胞であり得る。いくつかの場合、細胞はＣａｓタンパク質を天然には産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝的に操作される。
特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチドが、宿主生物のゲノム核酸に含まれる標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、これに結合する。いくつかの例では、任意の数の個別の例の標的ヌクレオチド配列が宿主ゲノム中に見出され得る。標的ヌクレオチド配列は、生物のゲノム中でまれであり得る（例えば、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２または約１未満のコピーの標的配列がゲノム中に存在し得る）。例えば、標的ヌクレオチド配列は、生物のゲノム中の特有の部位に位置し得る。標的ヌクレオチド配列は、例えば、限定されないが、互いに関してゲノムの全体にわたってランダムに分布していてもよいし；ゲノム中の異なる連鎖群に位置していてもよいし；同じ連鎖群に位置していてもよいし；異なる染色体上に位置していてもよいし；同じ染色体上に位置していてもよいし；生物において類似の条件下で（例えば、同じ、または実質的に機能的に同一の調節因子の制御下で）発現する部位においてゲノム中に位置していてもよいし；ゲノム中に互いに接近して位置していてもよい（例えば、標的配列がゲノム座においてコンカテマーとして組み込まれた核酸中に含まれていてもよい）。
Ｂ．標的化エンドヌクレアーゼ
特定の実施形態では、キメラポリペプチドに標的配列との特異的結合を与えるために、標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、これに結合するＤＮＡ結合ポリペプチドが、キメラポリペプチドに含まれ得る。例では、これらのポリペプチドは上に記載されているので、このようなキメラポリペプチドは、例えば、限定されないが、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドを含み得る。ＤＮＡ結合ポリペプチド、ならびにヌクレアーゼ、リコンビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドを含むキメラポリペプチドは、他の機能的ポリペプチドモチーフおよび／またはドメイン、例えば、限定されないが、キメラタンパク質中の機能的ポリペプチド間に位置するスペーサー配列；リーダーペプチド；融合タンパク質を小器官（例えば、核）に標的化するペプチド；細胞酵素によって切断されるポリペプチド；ペプチドタグ（例えば、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ等）；およびキメラポリペプチドの機能に干渉しない他のアミノ酸配列を含んでもよい。
キメラポリペプチド中の機能的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチド）は作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドの機能的ポリペプチドが、キメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子を作成するために、少なくともインフレームの互いに連結した機能的ポリペプチドをコードする単一ポリヌクレオチドからの発現によって作動可能に連結され得る。代替実施形態では、キメラポリペプチドの機能的ポリペプチドが、他の手段、例えば、独立に発現するポリペプチドの架橋によって作動可能に連結され得る。
いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、これに結合するＤＮＡ結合ポリペプチドが、天然の単離タンパク質（またはその突然変異体）に含まれ、天然の単離タンパク質またはその突然変異体がヌクレアーゼポリペプチドも含む（また、リコンビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドを含んでもよい）。このような単離タンパク質の例は、ＴＡＬＥＮ、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｈｉｎ、ＴｒｅおよびＦＬＰリコンビナーゼ）、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、およびメガヌクレアーゼを含む。
本明細書で使用される場合、「標的化エンドヌクレアーゼ」という用語は、ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチドを含む天然のまたは操作された単離タンパク質およびその突然変異体、ならびにＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼを含むキメラポリペプチドを指す。（例えば、標的配列は座において野生の配列に含まれるので、または標的配列は、例えば、組換えによって座に導入されているので）ＦＡＤ３座に含まれる標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、これに結合するＤＮＡ結合ポリペプチドを含む任意の標的化エンドヌクレアーゼが特定の実施形態で利用され得る。
本発明の特定の実施形態で有用となり得るキメラポリペプチドのいくつかの例は、限定されないが、以下のポリペプチドの組み合わせを含む：ジンクフィンガーＤＮＡ結合ポリペプチド；ＦｏｋＩヌクレアーゼポリペプチド；ＴＡＬＥドメイン；ロイシンジッパー；転写因子ＤＮＡ結合モチーフ；ならびに例えば、限定されないが、ＴＡＬＥＮ、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｈｉｎ、ＲｅｃＡ、ＴｒｅおよびＦＬＰリコンビナーゼ）、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、メガヌクレアーゼから単離されたＤＮＡ認識および／または切断ドメイン；ならびに当業者に公知のその他。特定の例は、部位特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチドを含むキメラタンパク質を含む。キメラポリペプチドは、キメラポリペプチドを対象となる特定のヌクレオチド配列に標的化するために、キメラポリペプチドに含まれるＤＮＡ結合ポリペプチドの認識配列を変えるよう当業者に公知の方法によって操作され得る。
特定の実施形態では、キメラポリペプチドがＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガー、ＴＡＬエフェクタードメイン等）およびヌクレアーゼ（切断）ドメインを含む。切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼからの切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼからの切断ドメインおよびと異種性であり得る。異種性切断ドメインは任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られ得る。切断ドメインが得られ得る代表的なエンドヌクレアーゼは、それだけに限らないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含む。例えば、2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; and Belfort et al.(1997) Nucleic Acids Res.25:3379-3388を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵ＤＮアーゼＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Linn et al.(eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993も参照）。これらの酵素（またはその機能的断片）の１つまたはそれ以上が切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用され得る。
同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のために二量体化を要する、上に示される任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、切断に２つの融合タンパク質が要求される。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質が使用され得る。２つの切断ハーフドメインが同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来してもよいし、または各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来してもよい。さらに、２つの融合タンパク質のための標的部位は、好ましくは、互いに対して、２つの融合タンパク質とそれぞれの標的部位の結合が、切断ハーフドメインを、切断ハーフドメインが例えば、二量体化によって機能的切断ドメインを形成することを可能にする、互いに対する空間的配向に配置するように配置される。したがって、特定の実施形態では、標的部位の接近端が５〜８個のヌクレオチドまたは１５〜１８個のヌクレオチドによって分離されている。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が２つの標的部位の間に介在することができる（例えば、２〜５０個のヌクレオチド対またはそれ以上）。一般に、切断の部位は標的部位の間にある。
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、例えば、１つまたはそれ以上の外因性配列（ドナー／導入遺伝子）が結合（標的）部位でまたはその近くに組み込まれるように、（認識部位で）ＤＮＡに配列特異的に結合し、結合の部位でまたはその近くでＤＮＡを切断することができる。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上の認識部位からの９個のヌクレオチドおよび他方の鎖上の認識部位からの１３個のヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号明細書；第５，４３６，１５０号明細書および第５，４８７，９９４号明細書；ならびにLi et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4275-4279；Li et al.(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim et al.(1994a) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim et al.(1994b) J.Biol.Chem.269:31,978-31,982を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質が、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からの切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）と、１つまたはそれ以上の操作されていてもされていなくてもよいジンクフィンガー結合ドメインとを含む。
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能な代表的なＩＩＳ型制限酵素はＦｏｋＩである。この特定の酵素は二量体として活性である。Bitinaite et al.(1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95: 10,570-10,575。したがって、本開示の目的のために、開示の融合タンパク質に使用されるＦｏｋＩ酵素の一部が切断ハーフドメインとみなされる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合体を用いた細胞配列の標的化二本鎖切断および／または標的化置換のために、触媒活性切断ドメインを再構成するためにそれぞれがＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質が使用され得る。あるいは、ＤＮＡ結合ドメインと２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインとを含む単一のポリペプチド分子も使用され得る。
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持する、または多量体化（例えば、二量体化）して機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。
代表的なＩＩＳ型制限酵素は、全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００７０１３４７９６号明細書に記載されている。さらなる制限酵素も分離可能な結合ドメインと切断ドメインとを含み、これらも本開示によって考慮される。例えば、Roberts et al.(2003) Nucleic Acids Res.31:418-420を参照されたい。
特定の実施形態では、切断ドメインが、例えば、その全ての開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書；第２００６０１８８９８７号明細書および第２００８０１３１９６２号明細書に記載されているように、１つまたはそれ以上のホモ二量体化を最小化するまたは防ぐ操作切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン突然変異体とも呼ばれる）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位のアミノ酸残基は全てＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。
絶対ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの代表的な操作切断ハーフドメインは、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０および５３８位のアミノ酸残基に突然変異を含み、かつ第２の切断ハーフドメインがアミノ酸残基４８６および４９９に突然変異を含む対を含む。
したがって、一実施形態では、４９０の突然変異が、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し；５３８の突然変異がＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し；４８６の突然変異がＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）に置換し；４９９の突然変異がＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換する。具体的には、本明細書に記載される操作切断ハーフドメインは、一方の切断ハーフドメイン中の４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を突然変異させて「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と示される操作切断ハーフドメインを製造し、かつ別の切断ハーフドメイン中の４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を突然変異させて「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と示される操作切断ハーフドメインを製造することによって調製された。本明細書に記載される操作切断ハーフドメインは、異常な切断が最小化されたまたは消滅した絶対ヘテロ二量体突然変異体である。例えば、全ての目的のためにその開示の全体が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号明細書を参照されたい。
特定の実施形態では、操作切断ハーフドメインが、４８６、４９９および４９６位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付け）の突然変異、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基に置換する突然変異、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基に置換する突然変異および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基に置換する突然変異（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、操作切断ハーフドメインが、４９０、５３８および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付け）の突然変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に置換する突然変異、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に置換する突然変異および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基に置換する突然変異（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、操作切断ハーフドメインが、４９０および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付け）の突然変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に置換する突然変異、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基に置換する突然変異（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。（米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号明細書を参照されたい）。本明細書に記載される操作切断ハーフドメインは、任意の適当な方法を用いて、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書；第２００８０１３１９６２号明細書；および第２０１１０２０１０５５号明細書に記載されているような野生型切断ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的突然変異誘発によって調製され得る。
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を用いて核酸標的部位においてインビボで組み立てられ得る（例えば、米国特許出願公開第２００９００６８１６４号明細書参照）。このようなスプリット酵素の成分は別々の発現構築物で発現してもよいし、または個々の成分が例えば、自己切断２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって分離されている１つのオープンリーディングフレームで連結されていてもよい。成分は個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
Ｃ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ
具体的な実施形態では、キメラポリペプチドが、外因性核酸またはドナーＤＮＡが組み込まれ得る標的化部位特異的二本鎖ＤＮＡ切断に送達されるよう設計され得るカスタム設計のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である（参照により本明細書に組み込まれる、共有されている米国特許出願公開第２０１００２５７６３８号明細書参照）。ＺＦＮは、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）からの非特異的切断ドメインと、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインポリペプチドとを含むキメラポリペプチドである。例えば、Huang et al.(1996) J.Protein Chem.15:481-9；Kim et al.(1997a) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3616-20；Kim et al.(1996) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1156-60；Kim et al.(1994) Proc Natl.Acad.Sci.USA 91:883-7；Kim et al.(1997b) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12875-9；Kim et al.(1997c) Gene 203:43-9；Kim et al.(1998) Biol.Chem.379:489-95；Nahon and Raveh (1998) Nucleic Acids Res.26:1233-9；Smith et al.(1999) Nucleic Acids Res.27:674-81を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＺＦＮが非標準ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む（参照により本明細書に組み込まれる、共有されている米国特許出願公開第２００８０１８２３３２号明細書参照）。ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断し、二本鎖切断を導入するために、ヌクレアーゼドメインを介して二量体化しなければならない。結果として、このようなエンドヌクレアーゼからのヌクレアーゼドメインを含むＺＦＮも、標的ＤＮＡを切断するためにヌクレアーゼドメインの二量体化を要する。Mani et al.(2005) Biochem.Biophys.Res.Commun.334:1191-7; Smith et al.(2000) Nucleic Acids Res.28:3361-9。ＺＦＮの二量体化は、２つの隣接する正反対に配向したＤＮＡ結合部位によって促進され得る。前記。
ＺＦＮ系の柔軟性および特異性は、公知のリコンビナーゼ媒介遺伝子編集戦略によって以前は達成することができなかった一定レベルの制御をもたらす。一例として、ＺＦＮは、例えば、特異的核酸配列を認識するように容易に操作され得る。Wu et al.(2007) Cell.Mol.Life Sci.64:2933-44（全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９０２０５０８３号明細書、第２０１１０１８９７７５号明細書、第２０１１０１６７５２１号明細書および第２０１００１９９３８９号明細書参照）。ジンクフィンガー認識残基に関するコドンのランダム化は、恣意的に選択されたＤＮＡ配列に対して高い親和性を有する新しいフィンガーの選択を可能にする。さらに、ジンクフィンガーは天然のＤＮＡ結合分子であり、操作されたジンクフィンガーは生細胞でその設計された標的に作用することが示されている。したがって、ジンクフィンガーに基づくヌクレアーゼは、特異的であるが、恣意的な認識部位を標的化可能である。
特定の例では、外因性核酸を宿主の少なくとも１つのＦＡＤ３性能座に部位特異的に組み込む方法が、ＺＦＮを宿主の細胞に導入する工程を含み、ＺＦＮが標的ヌクレオチド配列を認識し、これに結合し、標的ヌクレオチド配列が宿主の少なくとも１つのＦＡＤ３座に含まれる。特定の例では、標的ヌクレオチド配列が、少なくとも１つのＦＡＤ３座以外の位置において宿主のゲノムに含まれない。例えば、ＺＦＮのＤＮＡ結合ポリペプチドは、（例えば、ＦＡＤ３座をシーケンシングすることによって）少なくとも１つのＦＡＤ３座中の同定された標的ヌクレオチド配列を認識し、これに結合するよう操作され得る。ＺＦＮを宿主の細胞に導入する工程を含む、外因性核酸を宿主の少なくとも１つのＦＡＤ３性能座に部位特異的に組み込む方法は、外因性核酸を細胞に導入する工程を含んでもよく、外因性核酸の少なくとも１つのＦＡＤ３座を含む宿主の核酸への組換えは、ＺＦＮの部位特異的認識および標的配列との結合（およびその後のＦＡＤ３座を含む核酸の切断）によって促進される。
ＶＩ．ＦＡＤ３座における組込みのための外因性核酸
本発明の実施形態は、少なくとも１つのＦＡＤ３座への部位特異的組込みのための外因性核酸、例えば、限定されないが、ＰＴＵ、ＥＬＰ、ＥＴＩＰまたはＯＲＦ；標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；および前記のいずれかまたは両方の少なくとも１つを含むベクターからなる群から選択される１つまたはそれ以上の核酸を含んでもよい。したがって、いくつかの実施形態で使用するための特定の核酸は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、構造ヌクレオチド配列および／またはＤＮＡ結合ポリペプチド認識および結合部位を含む。
Ａ．部位特異的組込みのための外因性核酸分子
上記のように、例えば、ポリペプチドの発現、突然変異遺伝子の修正または野生型遺伝子の発現増加のために、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも呼ばれる）が挿入される。ドナー配列が典型的には配置されるゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかであるだろう。ドナー配列は、対象となる位置での効率的なＨＤＲを可能にするための相同性の２つの領域が隣接した非相同性配列を含むことができる。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチン中の対象となる領域と相同性でない配列を含むベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンと相同性のいくつかの不連続領域を含むことができる。例えば、対象となる領域中に通常は存在しない配列の標的化挿入のために、前記配列がドナー核酸分子中に存在し、対象となる領域中の配列と相同性の領域が隣接していてもよい。
ドナーポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり得、線状または環状型で細胞に導入され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号明細書、第２０１１０２８１３６１号明細書、第２０１１０２０７２２１号明細書および米国特許出願第１３／８８９，１６２号明細書を参照されたい。線状型で導入される場合、ドナー配列の末端は当業者に公知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つまたはそれ以上のジデオキシヌクレオチド残基が線状分子の３’末端に付加される、および／または自己相補性オリゴヌクレオチドが一方または両方の末端に連結される。例えば、Chang et al.(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4959-4963；Nehls et al.(1996) Science 272:886-889を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するさらなる方法は、限定されないが、末端アミノ基の付加および改変ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミデートおよびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基の使用を含む。
ポリヌクレオチドは、さらなる配列、例えば、複製起点、プロモーターおよび抗生物質耐性をコードする遺伝子を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として、薬剤、例えば、リポソームもしくはポロキサマーと複合体化した核酸として導入され得る、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達され得る。
ドナーは一般的に、その発現が組込み部位の内因性プロモーター、すなわち、ドナーが組み込まれる内因性遺伝子（例えば、ＦＡＤ３）の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように組み込まれる。しかしながら、ドナーがプロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成型プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含んでもよいことが明らかであるだろう。
さらに、発現に要求されないが、外因性配列は、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルを含んでもよい。
実施形態において、ＦＡＤ３座を改変するために、少なくとも１つのＦＡＤ３座に部位特異的様式で組み込まれ得る外因性核酸は、例えば、限定されないが、対象となるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；農学的遺伝子を含む核酸；ＲＮＡｉ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸；またはＦＡＤ３遺伝子を破壊する核酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＦＡＤ３座を改変するために、外因性核酸がＦＡＤ３座において組み込まれ、農学的遺伝子またはヌクレオチド配列がＦＡＤ３座から宿主中で発現するように、核酸が農学的遺伝子または対象となるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの例では、対象となるポリペプチド（例えば、外来タンパク質）が、商業的な量で対象となるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から発現する。このような例では、対象となるポリペプチドが、宿主細胞、組織またはバイオマスから抽出され得る。いくつかの実施形態では、宿主が植物であり、対象となるポリペプチドの商業的製造のために用意される植物材料が植物、植物部位、植物組織または植物細胞である。いくつかの例では、植物部位が植物種子であり得る。植物バイオマスからのタンパク質抽出は、例えば、Heney and Orr (1981) Anal.Biochem.114:92-6で論じられている公知の方法によって達成され得る。
同様に、農学的遺伝子は、形質転換植物細胞、植物および／またはその子孫で発現され得る。例えば、植物は、少なくとも１つのＦＡＤ３座から農学的対象となる種々の表現型を発現するように特定の実施形態の方法を介して遺伝的に操作され得る。
いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドをコードする農学的遺伝子またはヌクレオチド配列を含む核酸が、例えば、限定されないが、有害生物または病気に対する耐性を与える遺伝子（例えば、Jones et al.(1994) Science 266:789（クラドスポリウム・フルバム（Cladosporium fulvum）に対する耐性のためのトマトＣｆ−９遺伝子のクローニング）； Martin et al.(1993) Science 262:1432; Mindrinos et al.(1994) Cell 78:1089（シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に対する耐性のためのＲＳＰ２遺伝子）；ＰＣＴ国際特許出願公開第９６／３０５１７号パンフレット（ダイズシストセンチュウに対する耐性）；ＰＣＴ国際特許出願公開第９３／１９１８１号パンフレット）；バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質、その誘導体、またはその上にモデル化される合成ポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、Geiser et al.(1986) Gene 48:109（Ｂｔδ−エンドトキシン遺伝子のクローニングおよびヌクレオチド配列；さらに、δ−エンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、例えば、ＡＴＣＣ寄託番号４００９８；６７１３６；３１９９５；および３１９９８で、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入され得る））；レクチンをコードする遺伝子（例えば、Van Damme et al.(1994) Plant Molec.Biol.24:25（いくつかのクンシラン（Clivia miniata）マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列）参照）；ビタミン結合タンパク質、例えば、アビジンをコードする遺伝子（ＰＣＴ国際特許出願公開第ＵＳ９３／０６４８７号パンフレット（害虫に対する殺幼虫剤としてのアビジンおよびアビジンホモログの使用）参照）；酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼ、プロテイナーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤をコードする遺伝子（例えば、Abe et al.(1987) J.Biol.Chem.262:16793（イネシステインプロテイナーゼ阻害剤のヌクレオチド配列）；Huub et al.(1993) Plant Molec.Biol.21:985（タバコプロテイナーゼ阻害剤ＩをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）；Sumitani et al.(1993) Biosci.Biotech.Biochem.57:1243（ストレプトマイセス・ニトロスポレウス（Streptomyces nitrosporeus）αアミラーゼ阻害剤のヌクレオチド配列）および米国特許第５，４９４，８１３号明細書参照）；昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン、例えば、エクジステロイドもしくは幼若ホルモン、その変異形、それに基づく模倣体、またはそのアンタゴニストもしくはアゴニストをコードする遺伝子（例えば、Hammock et al.(1990) Nature 344:458（クローニング幼若ホルモンエステラーゼのバキュロウイルス発現、幼若ホルモンの不活性化因子）参照）；発現すると、冒された有害生物の生理機能を破壊する昆虫特異的ペプチドまたは神経ペプチドをコードする遺伝子（例えば、Regan (1994) J.Biol.Chem.269:9（発現クローニングが昆虫利尿ホルモン受容体をコードするＤＮＡをもたらす）；Pratt et al.(1989) Biochem.Biophys.Res.Comm.163:1243（ディプロプテラ・パンタタ（Diploptera puntata）のアロスタチン）；および米国特許第５，２６６，３１７号明細書（昆虫特異的麻痺性神経毒をコードする遺伝子）参照）；ヘビ、スズメバチまたは他の生物によって天然に産生される昆虫特異的毒液をコードする遺伝子（例えば、Pang et al.(1992) Gene 116:165（サソリ昆虫毒性（insectotoxic）ペプチドをコードする遺伝子の植物における異種発現）参照）；モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する他の分子の高度蓄積を担う酵素をコードする遺伝子；生物学的活性分子の転写後改変を含む改変に関与する酵素、例えば、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂質分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼまたはグルカナーゼ（天然または合成のいずれも）をコードする遺伝子（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第９３／０２１９７号パンフレット（カラーゼ（callase）遺伝子のヌクレオチド配列）；さらに、キチナーゼコード配列を含むＤＮＡ分子は、例えば、寄託番号３９６３７および６７１５２で、ＡＴＣＣから得られ得る；Kramer et al.(1993) Insect Biochem.Molec.Biol.23:691（タバコスズメガキチナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）；およびKawalleck et al.(1993) Plant Molec.Biol.21:673（パセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列）参照）；シグナル伝達を刺激する分子をコードする遺伝子（例えば、Botella et al.(1994) Plant Molec.Biol.24:757（リョクトウカルモジュリンｃＤＮＡクローンについてのヌクレオチド配列）；およびGriess et al.(1994) Plant Physiol.104:1467（トウモロコシカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列）参照）；疎水性モーメントペプチドをコードする遺伝子（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第 ９５／１６７７６号パンフレット（真菌植物病原体を阻害するタキプレシンのペプチド誘導体）；およびＰＣＴ国際特許出願公開第９５／１８８５５号パンフレット（耐病性を与える合成抗微生物ペプチド）参照）；膜パーミアーゼ、チャネルフォーマーまたはチャネルブロッカーをコードする遺伝子（例えば、Jaynes et al.(1993) Plant Sci 89:43（トランスジェニックタバコ植物をシュードモナス・ソラナセアラム（Pseudomonas solanacearum）に対して耐性にするためのセクロピン−β溶解ペプチド類似体の異種発現）参照）；ウイルス侵入タンパク質またはこれに由来する複合毒素をコードする遺伝子（例えば、Beachy et al.(1990) Ann.rev.Phytopathol.28:451参照）；昆虫特異抗体またはこれに由来する免疫毒素をコードする遺伝子（例えば、Taylor et al., Abstract #497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgh, Scotland) (1994)（単鎖抗体断片の産生を介したトランスジェニックタバコにおける酵素不活性化）参照）；ウイルス特異抗体をコードする遺伝子（例えば、Tavladoraki et al.(1993) Nature 366:469（組換え抗体遺伝子を発現しているトランスジェニック植物はウイルス攻撃から保護される）参照）；病原体または寄生生物によって天然に産生される発育遅滞タンパク質をコードする遺伝子（例えば、Lamb et al.(1992) Bio/Technology 10:1436（真菌エンドα−１，４−Ｄ−ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼを可溶化することによって真菌定着および植物栄養放出を促進する）；Toubart et al.(1992) Plant J.2:367（マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特徴付け）参照）；植物によって天然に産生される発育遅滞タンパク質をコードする遺伝子（例えば、Logemann et al.(1992) Bio/Technology 10:305（オオムギリボソーム不活性化遺伝子を発現しているトランスジェニック植物は真菌病に対する増加した耐性を有する）参照）を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドをコードする農学的遺伝子またはヌクレオチドを含む核酸が同様におよび／または代わりに、例えば、限定されないが、除草剤、例えば、成長点または分裂組織を阻害する除草剤、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素に対する耐性を与える遺伝子（このカテゴリーの代表的な遺伝子は、例えば、それぞれLee et al.(1988) EMBO J.7:1241およびMiki et al.(1990) Theor.Appl.Genet.80:449に記載されているように突然変異ＡＬＳおよびＡＨＡＳ酵素をコードする；例えば、（組換え核酸の導入および／または野生型ＥＰＳＰ遺伝子（それだけに限らないが、ＣＰ４、ＤＭＭＧおよびＤＧＴ−２８を含む）の種々の形態のインビボ突然変異誘発を介して）突然変異５−エノイルピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）遺伝子；ａｒｏＡ遺伝子およびグリホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子によってそれぞれ与えられるグリホサート耐性）；他のホスホノ化合物、例えば、ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes）を含むストレプトマイセス属の種からのグルホシネートホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子；ならびにピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン（ＡＣＣａｓｅ阻害剤コード遺伝子）を含んでもよい。例えば、米国特許第４，９４０，８３５号明細書および第６，２４８，８７６号明細書（植物にグリホサート耐性を与えることができるＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列）を参照されたい。突然変異ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ寄託番号３９２５６で得られ得る。米国特許第４，７６９，０６１号明細書（突然変異ａｒｏＡ遺伝子のヌクレオチド配列）も参照されたい。欧州特許出願第０３３３０３３号明細書および米国特許第４，９７５，３７４号明細書は、除草剤、例えば、Ｌ−ホスフィノトリシンに対する耐性を与えることができる、グルタミンシンテターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示している。代表的なＰＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列は、欧州特許出願第０２４２２４６号明細書およびDeGreef et al.(1989) Bio/Technology 7:61（ＰＡＴ活性をコードするキメラｂａｒ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の製造）に提供されている。フェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン、例えば、セトキシジムおよびハロキシホップに対する耐性を与える遺伝子の例は、Marshall et al.(1992) Theor.Appl.Genet.83:435に記載されているＡｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡｃｃ１−Ｓ３遺伝子を含む。グリホサート耐性を与えることができるＧＡＴ遺伝子は、例えば、国際公開第２００５０１２５１５号パンフレットに記載されている。２，４−Ｄ−フェノキシプロピオン酸およびピリジルオキシオーキシン除草剤に対する耐性を与える遺伝子は、例えば、国際公開第２００５１０７４３７号パンフレットおよび国際公開第２００７０５３４８２号パンフレットに記載されている。
対象となるポリペプチドをコードする農学的遺伝子またはヌクレオチド配列を含む核酸は、例えば、限定されないが、光合成を阻害する除草剤、例えば、トリアジン（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）に対する耐性を与える遺伝子を含んでもよい。例えば、Przibila et al.(1991) Plant Cell 3:169（突然変異ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドによるクラミドモナス属の形質転換）を参照されたい。ニトリラーゼ遺伝子に関するヌクレオチド配列は米国特許第４，８１０，６４８号明細書に開示されており、これらの遺伝子を含むＤＮＡ分子はＡＴＣＣ寄託番号５３４３５；６７４４１；および６７４４２で入手可能である。Hayes et al.(1992) Biochem.J.285:173（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現）も参照されたい。
いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドをコードする農学的遺伝子またはヌクレオチド配列を含む核酸が同様におよび／または代わりに、例えば、限定されないが、付加価値形質、例えば、限定されないが、例えば、植物のステアリン酸含量を増加させるためにステアリルＡＣＰデサチュラーゼのアンチセンス遺伝子を用いて植物を形質転換することによって改変された脂肪酸代謝（例えば、Knultzon et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:2624参照）；例えば、フィターゼコード遺伝子の導入がフィターゼの衰弱を強化し、より多くの遊離ホスフェートを形質転換植物に付与する（例えば、 Van Hartingsveldt et al.(1993) Gene 127:87（クロコウジカビ（Aspergillus niger）フィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列；トウモロコシ中のフィターゼ含量を低下させるための遺伝子が導入されてもよく、例えば、これは低レベルのフィチン酸によって特徴付けられるトウモロコシ突然変異体の原因となり得る単一対立遺伝子に関連するＤＮＡをクローニングし、次いで再導入することによって達成され得る（Raboy et al.(1990) Maydica 35:383参照）参照）；および例えば、デンプンの分岐パターンを変える酵素をコードする遺伝子を用いて植物を形質転換することによってもたらされる改変された炭水化物組成（例えば、Shiroza et al.(1988) J.Bacteol.170:810（ストレプトコッカス属突然変異体フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）；Steinmetz et al.(1985) Mol.Gen.Genet.20:220（レバンスクラーゼ遺伝子）；Pen et al.(1992) Bio/Technology 10:292（α−アミラーゼ）；Elliot et al.(1993) Plant Molec.Biol.21:515（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）；Sogaard et al.(1993) J.Biol.Chem.268:22480（オオムギα−アミラーゼ遺伝子）；およびFisher et al.(1993) Plant Physiol.102:1045（トウモロコシ胚乳デンプン分岐酵素ＩＩ）参照）を与えるまたはこれに寄与する遺伝子を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、ＦＡＤ３座を改変するために、外因性核酸がＦＡＤ３座において組み込まれ、例えば、その後のＰＴＵまたはＥＬＰの部位における第２の外因性核酸の部位特異的組込みが促進されるように、核酸がＰＴＵまたはＥＬＰを含む。米国特許出願第１３／８８９，１６２号明細書も参照されたい。
標的化組込みを介した対象となる核酸分子の植物ゲノムへの標的化エンドヌクレアーゼ媒介組込みは、標的化エンドヌクレアーゼまたは標的化エンドヌクレアーゼコード核酸分子の送達、引き続いて宿主中での機能的標的化エンドヌクレアーゼタンパク質の発現を要する。機能的標的化エンドヌクレアーゼタンパク質が少なくとも１つのＦＡＤ３座の標的部位において二本鎖切断を誘導し、次いでこれが例えば、外因性核酸の座への相同性駆動組込みを介して修復されるように、標的化エンドヌクレアーゼが宿主細胞に送達されるまたはそこで発現するのと同時に外因性核酸も好ましくは宿主細胞中に存在する。当業者であれば、機能的標的化エンドヌクレアーゼタンパク質の発現が、それだけに限らないが、標的化エンドヌクレアーゼコード構築物の遺伝子組換え、および標的化エンドヌクレアーゼコード構築物の一過性発現を含むいくつかの方法によって達成され得ることを認識し得る。これらの両ケースで、ＦＡＤ３座における標的化組込みを駆動するために、機能的標的化エンドヌクレアーゼタンパク質の発現および外因性核酸の宿主細胞への送達が同時に達成され得る。
標的化エンドヌクレアーゼとしてＺＦＮを利用する実施形態で得られる特定の利点は、キメラジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメインの二量体化の必要条件が高レベルの配列、したがって切断特異性を与えることである。３つのフィンガーの各セットが９個の連続塩基対に結合するので、各ジンクフィンガードメインが完全な特異性を有する場合、２つのキメラヌクレアーゼが１８ｂｐの標的を有効に要求する。この長さの任意の所与の配列は、単一ゲノム中で特有であると予想される（約１０９ｂｐと仮定）。上記Bibikova et al.(2001) Mol.Cell.Biol.21(1):289-97; Wu et al.(2007)。さらに、さらなるフィンガーが強化された特異性を提供することができる（Beerli et al.(1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:14628-33；Kim and Pabo (1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:2812-7；Liu et al.(1997) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:5525-30）ので、さらなる特異性を提供するために各ＤＮＡ結合ドメイン中のジンクフィンガーの数が増加され得る。例えば、２４ｂｐ配列を認識する４−、５−、６−またはそれ以上のフィンガーＺＦＮ対を用いることによって、特異性がさらに増加され得る。Urnov et al.(2005) Nature 435:646-51。したがって、宿主植物ゲノムに導入された認識配列がゲノム中で特有となるように、ＺＦＮが使用され得る。
Ｂ．標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子
いくつかの実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が、標的化エンドヌクレアーゼ中に含まれるポリペプチドをコードする野生のヌクレオチド配列の操作（例えば、ライゲーション）によって操作され得る。例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドに対応する遺伝子のヌクレオチド配列を同定するために、ＤＮＡ結合ポリペプチドを含むタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列が調査され得、このヌクレオチド配列がＤＮＡ結合ポリペプチドを含む標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の要素として使用され得る。あるいは、例えば、遺伝暗号の縮重にしたがって、標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を推定するために、標的化エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列が使用され得る。
標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む代表的な核酸分子では、ヌクレアーゼポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列の最後のコドン、およびＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の最初のコドンが、例えば、イントロンまたは「ＳＴＯＰ」をコードすることなく、任意の数のヌクレオチドトリプレットによって分離され得る。同様に、ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列の最後のコドン、およびヌクレアーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の最初のコドンが、任意の数のヌクレオチドトリプレットによって分離され得る。これらのおよびさらなる実施形態では、ヌクレアーゼポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列およびＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の最後の（すなわち、核酸配列のほぼ３’）の最後のコドンが、そこに直接隣接する、または短ペプチド配列、例えば、合成ヌクレオチドリンカー（例えば、融合を達成するために使用されたかもしれないヌクレオチドリンカー）によってコードされるもの以下によってそこから分離されたさらなるポリヌクレオチドコード配列の最初のコドンと相レジスター（phase-register）で融合され得る。このようなさらなるポリヌクレオチド配列の例は、例えば、限定されないが、タグ、標的化ペプチド、および酵素切断部位を含む。同様に、第１および第２のポリヌクレオチド配列のほぼ５’（核酸配列中）の最初のコドンが、そこに直接隣接する、または短ペプチド配列以下によってそこから分離されたさらなるポリヌクレオチドコード配列の最後のコドンと相レジスターで融合され得る。
標的化エンドヌクレアーゼ中の機能的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド配列を分離する配列は、例えば、コードされるアミノ酸配列が標的化エンドヌクレアーゼの翻訳を有意に変えにくいような任意の配列からなることができる。公知のヌクレアーゼポリペプチドおよび公知のＤＮＡ結合ポリペプチドの自律的性質のために、例では介在配列はこれらの構造のそれぞれの機能に干渉しないだろう。
Ｃ．ベクターおよび発現構築物
いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドおよび／または標的化エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子が、発現のために細胞、組織または生物に導入され得る。例えば、少なくとも１つのＦＡＤ３座中に含まれるヌクレオチド配列を特異的に認識する標的化エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子が、標的化エンドヌクレアーゼの発現のために細胞に導入され得、また対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子が、例えば、発現した標的エンドヌクレアーゼによる座における二本鎖切断の導入後の相同組換えによって少なくとも１つのＦＡＤ３座に組み込まれ、対象となるポリペプチドが組み込まれたポリヌクレオチド配列から発現するように、細胞に導入され得る。
いくつかの実施形態では、核酸分子、例えば、前記の１つが、例えば、限定されないが、直線状プラスミドまたは閉環状プラスミドを含むベクター系であってもよい。特定の例では、ベクターが発現ベクターであってもよい。特定の実施形態による核酸配列は、例えば、核酸配列が１つまたはそれ以上の調節配列と作動可能に連結されるように、ベクターに組み込まれ得る。多くのベクターがこの目的のために利用可能であり、特定のベクターの選択は、例えば、ベクターに挿入される核酸のサイズ、ベクターを用いて形質転換される特定の宿主細胞、および／または発現することが望まれる任意のコードされたポリペプチドの量に依存し得る。ベクターは、典型的には種々の成分を含み、その素性はベクターの機能（例えば、ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）、およびベクターが適合性である特定の宿主細胞に依存する。
いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上のコード配列と作動可能に連結された調節配列が、核酸分子が増幅または発現される宿主細胞、例えば、細菌細胞、藻類細胞、真菌細胞または植物細胞中で機能するプロモーター配列であってもよい。いくつかの実施形態は、対象となるポリペプチドまたは標的化エンドヌクレアーゼをコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列と作動可能に連結された少なくとも１つの調節配列を含むヌクレオチド配列を含む植物形質転換ベクターを含むことができ、１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列は、対象となるポリペプチドまたは標的化エンドヌクレアーゼを産生するために、植物細胞、組織または生物中で調節配列の制御下で発現され得る。
いくつかの実施形態による核酸分子に使用するのに適したプロモーターは、その全てが当分野で周知である、誘導性、組織特異的、ウイルス、合成または構成型であるものを含む。本発明の実施形態に有用となり得るプロモーターの非限定的例は、米国特許第６，４３７，２１７号明細書（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）；第５，６４１，８７６号明細書（イネアクチンプロモーター）；第６，４２６，４４６号明細書（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）；第６，４２９，３６２号明細書（トウモロコシＰＲ−１プロモーター）；第６，２３２，５２６号明細書（トウモロコシＡ３プロモーター）；第６，１７７，６１１号明細書（構成型トウモロコシプロモーター）；第５，３２２，９３８号明細書、第５，３５２，６０５号明細書、第５，３５９，１４２号明細書および第５，５３０，１９６号明細書（３５Ｓプロモーター）；第６，４３３，２５２号明細書（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）；第６，４２９，３５７号明細書（イネアクチン２プロモーターおよびイネアクチン２イントロン）；第６，２９４，７１４号明細書（光誘導性プロモーター）；第６，１４０，０７８号明細書（塩誘導性プロモーター）；第６，２５２，１３８号明細書（病原体誘導性プロモーター）；第６，１７５，０６０号明細書（リン欠乏誘導性プロモーター）；第６，３８８，１７０号明細書（双方向性プロモーター）；第６，６３５，８０６号明細書（γ−コイキシン（coixin）プロモーター）；第５，４４７，８５８号明細書（ダイズヒートショックプロモーター）；ならびに米国特許出願第０９／７５７，０８９号明細書（トウモロコシクロロプラストアルドラーゼプロモーター）によって提供される。
さらなる代表的なプロモーターは、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ebert et al.(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16):5745-9）；オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍誘発プラスミドに維持される）；カリモウイルスプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーター（Lawton et al.(1987) Plant Mol.Biol.9:315-24）；ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Odell et al.(1985) Nature 313:810-2）；ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Walker et al.(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(19):6624-8）；スクロースシンターゼプロモーター（Yang and Russell (1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4144-8）；Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Chandler et al.(1989) Plant Cell 1:1175-83）；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター；ＣａＭＶ３５Ｓ（米国特許第５，３２２，９３８号明細書、第５，３５２，６０５号明細書、第５，３５９，１４２号明細書および第５，５３０，１９６号明細書）；ＦＭＶ３５Ｓ（米国特許第６，０５１，７５３号明細書および第５，３７８，６１９号明細書）；ＰＣ１ＳＶプロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号明細書）；ＳＣＰ１プロモーター（米国特許第６，６７７，５０３号明細書）；ならびにＡＧＲｔｕ．ｎｏｓプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｖ０００８７；Depicker et al.(1982) J.Mol.Appl.Genet.1:561-73；Bevan et al.(1983) Nature 304:184-7）を含む。
特定の実施形態では、核酸分子が組織特異的プロモーターを含んでもよい。組織特異的プロモーターは、生物の他の組織に対してプロモーターが特異的である組織中の作動可能に連結されたヌクレオチド配列の高レベルの転写を指示するヌクレオチド配列である。組織特異的プロモーターの例は、限定されないが、タペータム特異的プロモーター；葯特異的プロモーター；花粉特異的プロモーター（例えば、米国特許第７，１４１，４２４号明細書および国際ＰＣＴ公開第９９／０４２５８７号パンフレット参照）；胚珠特異的プロモーター（例えば、米国特許出願公開第２００１／０４７５２５ Ａ１号明細書参照）；果実特異的プロモーター（例えば、米国特許第４，９４３，６７４号明細書および第５，７５３，４７５号明細書参照）；および種子特異的プロモーター（例えば、米国特許第５，４２０，０３４号明細書および第５，６０８，１５２号明細書参照）を含む。いくつかの実施形態では、発育段階特異的プロモーター（例えば、発育の後期で活性のプロモーター）が使用され得る。
いくつかの実施形態で、核酸分子と作動可能に連結され得るさらなる調節配列は、翻訳リーダー配列として機能する、プロモーター配列とコード配列との間に位置する５’ＵＴＲを含む。翻訳リーダー配列は、完全にプロセシングを受けたｍＲＮＡ中に存在し、一次転写産物のプロセシングおよび／またはＲＮＡ安定性に影響を及ぼし得る。翻訳リーダー配列の例は、トウモロコシおよびペチュニアヒートショックタンパク質リーダー（米国特許第５，３６２，８６５号明細書）、植物ウイルスコートタンパク質リーダー、植物リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシゲナーゼリーダーなどを含む。例えば、Turner and Foster (1995) Molecular Biotech.3(3):225-36を参照されたい。５’ＵＴＲの非限定的例は、ＧｍＨｓｐ（米国特許第５，６５９，１２２号明細書）；ＰｈＤｎａＫ（米国特許第５，３６２，８６５号明細書）；ＡｔＡｎｔ１；ＴＥＶ（Carrington and Freed (1990) J.Virol.64:1590-7）；およびＡＧＲｔｕｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｖ０００８７；およびBevan et al.(1983)、上記）によって提供される。
いくつかの実施形態で、核酸分子と作動可能に連結され得るさらなる調節配列は、３’非翻訳配列、３’転写終結領域またはポリアデニル化領域も含む。これらはヌクレオチド配列の下流に位置する遺伝要素であり、ポリアデニル化シグナルおよび／または転写もしくはｍＲＮＡプロセシングに影響を及ぼすことができる他の調節シグナルを提供するポリヌクレオチドを含む。ポリアデニル化シグナルは、植物において、ポリアデニル酸ヌクレオチドのｍＲＮＡ前駆体の３’末端への付加を生じるように機能する。ポリアデニル化配列は、種々の植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡ遺伝子に由来し得る。３’転写終結領域の非限定的例は、ノパリンシンターゼ３’領域である（ｎｏｓ３’；Fraley et al.(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7）。異なる３’非翻訳領域の使用の例は、Ingelbrecht et al.(1989) Plant Cell 1:671-80で提供される。ポリアデニル化シグナルの非限定的例は、エンドウ（Pisum sativum）ＲｂｃＳ２遺伝子（Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al.(1984) EMBO J.3:1671-9）およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｅ０１３１２）からのものを含む。
特定の実施形態で有用となり得る調節配列に関するさらなる情報は、例えば、Goeddel (1990)「Gene Expression Technology」, Methods Enzymol.185, Academic Press, San Diego, CAに記載されている。
組換え核酸分子またはベクターは、形質転換細胞、例えば、植物細胞に選択可能な表現型を与える選択可能なマーカーを含んでもよい。選択可能なマーカーは、選択可能なマーカーを含む核酸分子を含む細胞または生物を選び出すためにも使用され得る。マーカーは、殺生物剤耐性、抗生物質耐性（例えば、カナマイシン、ジェネテシン（Ｇ４１８）、ブレオマイシンおよびハイグロマイシン）または除草剤耐性（例えば、グリホサート）をコードし得る。 選択可能なマーカーの例は、それだけに限らないが、カナマイシン耐性を与え、例えば、カナマイシンおよびＧ４１８を使用して選び出され得るｎｅｏ遺伝子；ビアラホス耐性を与えるｂａｒ遺伝子；グリホサート耐性を与える突然変異ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子；ブロモキシニルに対する耐性を与えるニトリラーゼ遺伝子；イミダゾリノンまたはスルホニル尿素耐性を与える突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）；およびメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子を含む。例えば、限定されないが、アンピシリン；ブレオマイシン；クロラムフェニコール；ゲンタマイシン；ハイグロマイシン；カナマイシン；リンコマイシン；メトトレキサート；ホスフィノトリシン；プロマイシン；スペクチノマイシン；リファンピシン；ストレプトマイシン；およびテトラサイクリンを含む化学薬剤に対する耐性を与える複数の選択可能なマーカーが利用可能である。このような選択可能なマーカーの例は、例えば、米国特許第５，５５０，３１８号明細書；第５，６３３，４３５号明細書；第５，７８０，７０８号明細書および第６，１１８，０４７号明細書に示されている。
核酸分子またはベクターが、同様にまたは代わりにスクリーニング可能なマーカーを含んでもよい。発現を監視するためにスクリーニング可能なマーカーが使用され得る。代表的なスクリーニング可能なマーカーは、種々の発色基質が知られている酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（Jefferson et al.(1987) Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405）；植物組織においてアントシアニン色素（赤色）の産生を調節する産物をコードするＲ座遺伝子（Dellaporta et al.(1988) 「Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac.」In 18th Stadler Genetics Symposium, P.Gustafson and R.Appels, eds., Plenum, NY (pp.263-82)）；β−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffe et al.(1978) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3737-41）；種々の発色基質が知られている酵素をコードする遺伝子（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色性セファロスポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子（Ow et al.(1986) Science 234:856-9）；発色性カテコールを変換するカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowski et al.(1983) Gene 46(2-3):247-55）；アミラーゼ遺伝子（Ikatu et al.(1990) Bio/Technol.8:241-2）；チロシンを、ＤＯＰＡおよび縮合してメラニンになるドーパキノンに酸化することができる酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katz et al.(1983) J.Gen.Microbiol.129:2703-14）；およびα−ガラクトシダーゼを含む。
例えば、対象となる特定のポリペプチドまたは特定の標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の全ては、当業者によって直ちに認識可能であるだろう。遺伝暗号の縮重が、特定のアミノ酸配列に有限数のコード配列を提供する。本発明の実施形態によるポリペプチドをコードする特定の配列の選択は専門家の裁量の範囲内にある。異なるコード配列は異なる用途に望ましくなり得る。
いくつかの実施形態では、例えば、特定の宿主の核酸中に含まれるポリヌクレオチド配列の発現を強化するために、核酸のヌクレオチドを改変することが望ましくなり得る。遺伝暗号は６４個の可能なコドンで冗長であるが、ほとんどの生物はこれらのコドンのサブセットを優先的に使用する。種において最も一般的に利用されているコドンは最適コドンと呼ばれ、あまり一般的に利用されていないものはレアまたは低使用頻度コドン（low-usage codon）として分類される。Zhang et al.(1991) Gene 105:61-72。コドンは、時々「コドン最適化」と呼ばれるプロセスで、特定の宿主の好ましいコドン使用を反映するよう置換され得る。特定の原核生物または真核生物宿主によって好まれるコドンを含む最適化コード配列が、例えば、翻訳速度を増加させるまたは望ましい特性（例えば、非最適化配列から産生される転写産物と比べて長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写産物を産生するために調製され得る。
核酸は、本発明の実施形態において、例えば、限定されないが、プロトプラストの形質転換（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号明細書参照）；乾燥／阻害−媒介ＤＮＡ取り込み（例えば、Potrykus et al.(1985) Mol.Gen.Genet.199:183-8参照）；電気穿孔（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号明細書参照）；炭化ケイ素繊維を用いた攪拌（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号明細書および第５，４６４，７６５号明細書参照）；アグロバクテリウム媒介形質転換（例えば、米国特許第５，５６３，０５５号明細書、第５，５９１，６１６号明細書、第５，６９３，５１２号明細書、第５，８２４，８７７号明細書、第５，９８１，８４０号明細書および第６，３８４，３０１号明細書参照）；ならびにＤＮＡコーティング粒子の加速（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号明細書、第５，５５０，３１８号明細書、第５，５３８，８８０号明細書、第６，１６０，２０８号明細書、第６，３９９，８６１号明細書および第６，４０３，８６５号明細書参照）を含む当業者に公知の任意の方法によって宿主細胞に導入され得る。これらのような技術の適用を通して、事実上いずれの種の細胞も安定的に形質転換され得る。いくつかの実施形態では、形質転換ＤＮＡが宿主細胞のゲノムに組み込まれる。多細胞種の場合、トランスジェニック細胞がトランスジェニック生物に再生され得る。例えば、トランスジェニック植物のゲノム中に本発明の１つまたはそれ以上の核酸配列を含むトランスジェニック植物を産生するために、これらの技術のいずれかが使用され得る。
発現ベクターを植物に導入するための最も広く利用されている方法は、アグロバクテリウムの自然形質転換システムに基づくものである。アグロバクテリウム・ツメファシエンスおよびアグロバクテリウム・リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換する植物病原性土壌細菌である。アグロバクテリウム・ツメファシエンスならびにアグロバクテリウム・リゾゲネスのＴｉおよびＲｉプラスミドがそれぞれ植物の遺伝子形質転換を担う遺伝子を導入する。Ｔｉ（腫瘍誘発）−プラスミドは、形質転換植物に運ばれる、Ｔ−ＤＮＡとして知られる大型セグメントを含む。Ｔｉプラスミドの別のセグメントであるｖｉｒ領域はＴ−ＤＮＡ導入を担う。Ｔ−ＤＮＡ領域は、それぞれ末端反復ヌクレオチド配列で構成された左手および右手境界に縁どられている。いくつかの改変バイナリーベクターでは、腫瘍誘発性遺伝子が欠失しており、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列に縁どられている外来ＤＮＡを導入するためにｖｉｒ領域の機能が利用される。Ｔ−領域はまた、例えば、トランスジェニック植物および細胞を効率的に回収するための選択可能なマーカー、ならびに導入するための挿入配列、例えば、本発明の融合タンパク質をコードする核酸のための複数のクローニングサイトを含んでもよい。
したがって、いくつかの実施形態では、植物形質転換ベクターが、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミド（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号明細書、第４，６９３，９７７号明細書、第４，８８６，９３７号明細書および第５，５０１，９６７号明細書；ならびに欧州特許第０１２２７９１号明細書）またはアグロバクテリウム・リゾゲネスのＲｉプラスミドに由来する。さらなる植物形質転換ベクターは、例えば、限定されないが、Herrera-Estrella et al.(1983) Nature 303:209-13；Bevan et al.(1983),上記；Klee et al.(1985) Bio/Technol.3:637-42；および欧州特許第０１２０５１６号明細書に記載されているもの、ならびに前記のいずれかに由来するものを含む。いくつかの多様な植物への遺伝子導入を媒介するために、植物と自然に相互作用する他の細菌、例えば、シノリゾビウム属、リゾビウム属およびメソリゾビウム属が改変され得る。これらの植物関連共生細菌は、非武装Ｔｉプラスミドと適当なバイナリーベクターの両方の獲得によって遺伝子導入に適格性にされ得る。
外因性ＤＮＡをレシピエント細胞に供給した後、形質転換細胞は、一般的にさらなる培養および植物再生のために同定される。形質転換細胞を同定する能力を改善するために、形質転換体を産生するために使用されるベクターと共に、前記の選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を使用することが望まれ得る。選択可能なマーカーが使用される場合、形質転換細胞は、これらの細胞を１つまたはそれ以上の選択剤に暴露することによって、潜在的に形質転換された細胞中で同定される。スクリーニング可能なマーカーが使用される場合、細胞は所望のマーカー遺伝子形質についてスクリーニングされ得る。
選択剤への暴露を生き延びた細胞、またはスクリーニングアッセイで陽性とスコア化された細胞が、植物の再生を支持する培地中で培養され得る。いくつかの実施形態では、任意の適当な植物組織培養培地（例えば、ＭＳおよびＮ６培地）が、さらなる物質、例えば、成長調節物質を含めることによって改変され得る。植物再生運動を開始するのに十分な組織が利用可能になるまで、または反復ラウンドの手動選択後、組織の形態が再生に適したものになるまで（例えば、少なくとも２週間）、組織が成長調節物質を含む基本培地に維持され、次いで、シュート形成を促す培地に移され得る。十分なシュート形成が起こるまで、培養物が定期的に移される。いったんシュートが形成されたら、これらは根形成を促す培地に移される。いったん十分な根が形成されたら、植物はさらなる成長および成熟のために土壌に移され得る。
再生植物中の対象となる核酸分子（例えば、本発明の少なくとも１つの融合タンパク質を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）の存在を確認するために、種々のアッセイが行われ得る。このようなアッセイは、例えば、分子生物学的アッセイ、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＰＣＲ、ならびに核酸シーケンシング；生化学的アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよび／またはウエスタンブロット法）または酵素機能によるタンパク質産物の存在の検出；植物部位アッセイ、例えば、葉または根アッセイ；および全再生植物の表現型の分析を含む。
組込みイベントは、例えば、対象となるヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって分析され得る。ＰＣＲジェノタイピングは、それだけに限らないが、ゲノムに組み込まれた対象となる核酸分子を含むと予想される単離宿主植物組織に由来するゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、引き続いてＰＣＲ増幅産物の標準的クローニングおよび配列解析を含むと理解される。ＰＣＲジェノタイピングの方法は十分に記載されており（例えば、Rios, G.et al.(2002) Plant J.32:243-53参照）、細胞培養物を含む任意の植物種または組織型に由来するゲノムＤＮＡに適用され得る。
アグロバクテリウム依存型形質転換法を用いて形成されたトランスジェニック植物は、典型的には単一から複数コピーの組換えＤＮＡを含む。単一組換えＤＮＡ配列は「トランスジェニックイベント」または「組込みイベント」と呼ばれる。このようなトランスジェニック植物は挿入されたＤＮＡ配列がヘテロ接合性である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子に関してホモ接合性のトランスジェニック植物が、単一外因性遺伝子配列を含む独立分離トランスジェニック植物を自身、例えばＦ０植物と有性交配（自殖）してＦ１種子を産生することによって得られ得る。産生されたＦ１種子の４分の１が導入遺伝子に関してホモ接合性となる。Ｆ１種子の出芽が、典型的にはＳＮＰアッセイまたはヘテロ接合体とホモ接合体との間の差異を認める熱増幅アッセイ（すなわち、接合生殖性アッセイ）を用いて、ヘテロ接合性について試験され得る植物をもたらす。
いくつかの実施形態における植物または植物細胞の核酸分子を用いた直接形質転換に加えて、特定の実施形態では、少なくとも１つのトランスジェニックイベントを有する第１の植物をこのようなイベントを欠く第２の植物と交雑することによって、トランスジェニック植物が調製され得る。例えば、外因性核酸が部位特異的様式で組み込まれた少なくとも１つの改変ＦＡＤ３座を含む核酸が、形質転換に修正可能な第１の植物系統に導入されてトランスジェニック植物を産生し、このトランスジェニック植物が第２の植物系統と交雑されて少なくとも１つの改変ＦＡＤ３座（およびそれゆえに外因性核酸）を第２の植物系統に遺伝子移入することができる。
再生植物中の対象となる核酸分子の存在を確認するために、種々のアッセイが行われ得る。このようなアッセイは、例えば、分子生物学的アッセイ、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ならびにＰＣＲ；生化学的アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよび／またはウエスタンブロット法）または酵素機能によるタンパク質産物の存在の検出；植物部位アッセイ、例えば、葉または根アッセイ；ならびに全再生植物の表現型の分析を含む。
標的化組込みイベントは、例えば、対象となる核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングされ得る。ＰＣＲジェノタイピングは、それだけに限らないが、ゲノムに組み込まれた対象となる核酸分子を含むと予想される単離宿主植物カルス組織に由来するゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、引き続いてＰＣＲ増幅産物の標準的クローニングおよび配列解析を含むと理解される。ＰＣＲジェノタイピングの方法は十分に記載されており（例えば、Rios, G.et al.(2002) Plant J.32:243-53参照）、細胞培養物を含む任意の植物種または組織型に由来するゲノムＤＮＡに適用され得る。標的化配列と導入配列の両方に結合するオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせがＰＣＲ増幅反応で連続的に使用され得るまたは多重化され得る。標的部位にアニールするよう設計されたオリゴヌクレオチドプライマー、導入された核酸配列、および／または２つの組み合わせが実行可能である。したがって、ＰＣＲジェノタイピング戦略は、（それだけに限らないが）植物ゲノム中の特異的配列の増幅、植物ゲノム中の複数の特異的配列の増幅、植物ゲノム中の非特異的配列の増幅、またはこれらの組み合わせを含み得る。当業者であれば、ゲノムを調べるためのプライマーと増幅反応のさらなる組み合わせを考案することができる。例えば、順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーのセットが、導入された核酸配列の境界の外側の標的に特異的な核酸配列にアニールするよう設計され得る。
順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、対象となる核酸分子中のコード領域に相当する配列、または対象となる核酸分子の他の部分で、対象となる導入された核酸分子に特異的にアニールするよう設計され得る。これらのプライマーは、上記プライマーと併せて使用され得る。オリゴヌクレオチドプライマーは所望の配列にしたがって合成され得、（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｅ、ＩＡから）商業的に入手可能である。増幅に、クローニングおよびシーケンシング、または増幅産物の直接配列解析が続き得る。当業者であれば、ＰＣＲジェノタイピング中に産生した増幅産物の解析のための代替法を認識するだろう。 一実施形態では、遺伝子標的に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーがＰＣＲ増幅に使用される。
ＶＩ．ＦＡＤ３性能座において組み込まれた核酸を含むトランスジェニック植物および植物材料
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変された（例えば、ＦＡＤ３座、外因性配列の破壊および／または標的化組込み）ＦＡＤ３座を含む植物細胞を含むトランスジェニック植物が提供される。特定の実施形態では、このような植物が、植物組織または植物細胞の形質転換、および全植物の再生によって産生され得る。さらなる実施形態では、このような植物が、部位特異的様式での少なくとも１つのＦＡＤ３座における外因性核酸の導入、または改変ＦＡＤ３座の生殖質への遺伝子移入を通して得られ得る。このような植物細胞を含む植物材料も提供される。このような植物材料は、植物細胞を含む植物から得られ得る。
少なくとも１つの改変ＦＡＤ３座を含む植物細胞を含むトランスジェニック植物または植物材料は、いくつかの実施形態では、以下の特性の１つまたはそれ以上を示し得る：植物の細胞中の標的化エンドヌクレアーゼの発現；植物の細胞中（またはその中のプラスチド中）の対象となるポリペプチドの発現；植物の細胞の核中の標的化エンドヌクレアーゼの発現；植物の細胞中の標的化エンドヌクレアーゼの局在化；植物の細胞のゲノム中のＦＡＤ３座における組込み；植物の細胞のゲノム中のＦＡＤ３座における対象となるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または農学的遺伝子の組込み；ならびに／あるいは植物の細胞のゲノム中のＦＡＤ３座において組み込まれたコード配列に対応するＲＮＡ転写産物の存在。このような植物は、例えば、限定されないが、植物の細胞のゲノム中のＦＡＤ３座において組み込まれた対象となるポリペプチドまたは農学的遺伝子によってその発現が調節される、内因性または導入遺伝子ヌクレオチド配列の発現から生じるもの；昆虫、他の有害生物および病原性因子に対する耐性；除草剤に対する耐性；強化された安定性、収量または貯蔵寿命；環境耐性；医薬製造；工業製品製造；および栄養強化を含む１つまたはそれ以上の望ましい形質をさらに有することができる。
本発明によるトランスジェニック植物は、その後本明細書に記載される方法によって少なくとも１つのＦＡＤ３座に組み込まれる核酸を用いて形質転換され得る任意の植物であり得る。したがって、植物は双子葉植物であっても単子葉植物であってもよい。本方法に使用可能な双子葉植物の非限定的例は、シロイヌナズナ、アルファルファ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、アブラナ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウマメ、コショウ、ラッカセイ、ジャガイモ、カボチャ、ラディッシュ、ナタネ、ホウレンソウ、ダイズ、スカッシュ、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコ、トマトおよびスイカを含む。本方法に使用可能な単子葉植物の非限定的例は、トウモロコシ、オオムギ、タマネギ、イネ、ソルガム、コムギ、ライムギ、アワ、サトウキビ、オートムギ、ライコムギ、スイッチグラスおよび芝草を含む。本発明によるトランスジェニック植物は任意の様式で使用または栽培され得る。
いくつかの実施形態は、本発明のトランスジェニック植物から製造された商品産物も提供する。商品産物は、例えば、限定されないが、少なくとも１つのＦＡＤ３座に組み込まれた１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を含む植物の食品、粗粉、油または粉砕穀物もしくは全粒粉または種子を含む。１つまたはそれ以上の商品または商品産物中の１つまたはそれ以上のこのようなヌクレオチド配列の検出は、商品または商品産物が少なくとも一部は本発明の実施形態により産生されたトランスジェニック植物から製造されたという事実上の証拠である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変ＦＡＤ３座を含む植物細胞を含むトランスジェニック植物または種子が、限定されないが、ＲＮＡｉ分子が転写されるトランスジェニックイベント；殺虫タンパク質（例えば、バチルス・チューリゲンシス（Bacillus thuringiensis）殺虫タンパク質）をコードする遺伝子；除草剤耐性遺伝子（例えば、グリホサートに対する耐性を提供する遺伝子）；およびトランスジェニック植物における望ましい表現型に寄与する遺伝子（例えば、増加した収量、変化した脂肪酸代謝または細胞質雄性不稔の修復）を含む、ゲノム中の少なくとも１つの他のトランスジェニックイベントを含んでもよい。
少なくとも１つの改変ＦＡＤ３座を含む植物細胞を含むトランスジェニック植物は、１つまたはそれ以上の望ましい形質を有することができる。このような形質は、例えば、昆虫、他の有害生物および病原性因子に対する耐性；除草剤に対する耐性；強化された安定性、収量または貯蔵寿命；環境耐性；医薬製造；工業製品製造；および栄養強化を含むことができる。望ましい形質は、望ましい形質を示す植物中で発現されるＦＡＤ３座における標的化組換えによって組み込まれた１つまたはそれ以上の核酸分子によって与えられ得る。したがって、いくつかの実施形態では、所望の形質が、少なくとも１つの改変ＦＡＤ３座の部位において植物のゲノム中に導入された、植物中の導入遺伝子の存在により得る。さらなる実施形態では、望ましい形質が、従来の育種を通して得られ、この形質は少なくとも１つの改変ＦＡＤ３座における標的化組換えによって組み込まれた１つまたはそれ以上の核酸分子によって与えられ得る。
本発明によるトランスジェニック植物は、少なくとも１つの改変ＦＡＤ３座の存在が望ましい任意の様式で使用または栽培され得る。したがって、植物は、特に、その後本発明による少なくとも１つのＦＡＤ３座に部位特異的様式で組み込まれる核酸分子を用いて形質転換されることによって、１つまたはそれ以上の所望の形質を有するように操作され、当業者に公知の任意の方法によって収穫および栽培され得る。
ＶＩＩ．ＦＡＤ３性能座において組み込まれた核酸を含むトランスジェニック植物のマーカー利用育種
アブラナ属の種においてＦａｄ２およびＦａｄ３と連結した（例えば、密に連結した）分子マーカーが提供される。例えば、ＨＯ形質（ＦＡＤ３）に関与する配列を含むＤＮＡセグメントが同定される。これらのセグメントは、ゲノム連鎖群中の突然変異対立遺伝子と連結した（例えば、密に連結した）マーカーの周りおよびその間に位置している。したがって、不活性化突然変異を有する突然変異ＦＡＤ３遺伝子を含む核酸分子も提供される。同定されるセグメント、およびそのマーカーは、一部はセイヨウアブラナゲノムの連鎖群中の位置によって、本主題に含まれる。
本明細書において引用される刊行物、特許および特許出願を含む全ての参考文献は、これにより、それらが本開示の明示的詳細と矛盾しない程度に参照により組み込まれ、あたかも各参考文献が参照により組み込まれることが個別的かつ具体的に示されており、かつ全体が本明細書に示されているのと同程度に組み込まれる。本明細書において論じられる参考文献は、本出願の出願日より前の開示についてのみ提供される。本発明者らが先行発明によってこのような開示に先立つ権利がないことの承認として解釈されるべきものは本明細書中にない。以下の実施例は、ある特定の特徴および／または実施形態を示すために提供される。これらの実施例は、本開示を例示される特定の特徴または実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。
実施例１：細菌人工染色体ライブラリーからのＦＡＤ３標的配列の同定
ＢＡＣライブラリー構築
細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーを商業的販売業者（Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｐｕｌｌｍａｎ、ＷＡ）から調達した。 ＢＡＣライブラリーは、セイヨウアブラナＬ．ｖａｒ．ＤＨ１０２７５から単離された高分子量ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）断片を含む１１０，５９２個のＢＡＣクローンを含んでいた。ｇＤＮＡをＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素のいずれかを用いて消化した。約１３５Ｋｂｐの単離ｇＤＮＡ断片をｐＣＣ１ＢＡＣベクター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に連結し、大腸菌菌株ＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。ＢＡＣライブラリーを、２つの異なる制限酵素を用いて構築した偶数のＢＡＣクローンで構成した。よって、ＨｉｎｄＩＩＩ構築ＢＡＣライブラリーを１４４個の個々の３８４ウェルプレートに含ませた。同様に、ＢａｍＨＩ構築ＢＡＣライブラリーを１４４個の個々の３８４ウェルプレートに含ませた。合計１１０，５９２個のＢＡＣクローンを単離し、２８８個の個々の３８４ウェルプレートに配列した。２８８個の個々の３８４ウェルプレートの各々は、急速ＰＣＲに基づくスクリーニングのための単一ＤＮＡ抽出として販売業者から供給された。得られたＢＡＣライブラリーは約１５ＧｂｐのｇＤＮＡを網羅し、これはセイヨウアブラナＬ．ｖａｒ．ＤＨ１０２７５ゲノム（セイヨウアブラナＬ．のゲノムの推定値は、Johnston et al.(2005) Annals of Botany 95:229-235に記載されているように約１．１３２Ｇｂｐである）の１２倍のゲノム被覆率（genome coverage）に相当する。
ＢＡＣライブラリーから単離されたＦＡＤ３コード配列の配列解析
構築したＢＡＣライブラリーを使用してＦＡＤ３遺伝子コード配列を単離した。シーケンシング実験を行ってセイヨウアブラナＬ．ｖａｒ．ＤＨ１０２７５から６つのＦＡＤ３遺伝子ホモログおよびパラログの特異的遺伝子配列を同定した。
ＦＡＤ３遺伝子配列を、モデル種シロイヌナズナ中で最初に同定した。遺伝子配列は、Ｌｏｃｕｓ Ｔａｇ：Ａｔ２ｇ２９９８０としてＧｅｎｂａｎｋに列挙されている。モデル植物種シロイヌナズナと二倍体ブラッシカ・ラパ、四倍体セイヨウアブラナの祖先の１つとの間の比較ゲノム関係は以前に記載されている。（Schranz et al.(2006) Trends in Plant Science 11(11):535-542）。特にＦＡＤ遺伝子に関して、比較解析は３〜４コピーの遺伝子が二倍体ブラッシカゲノム中に生じ得ると予測した。さらなる遺伝子マッピング研究がScheffler et al.(1997) Theoretical and Applied Genetics 94; 583-591によって行われた。これらの遺伝子マッピング研究の結果は、６コピーのＦＡＤ３遺伝子がセイヨウアブラナに存在することを示した。
以前のシーケンシングの努力は、同定されたセイヨウアブラナからのＦＡＤ３遺伝子に焦点を当て、Ａゲノム特異的コピーとＣゲノム特異的コピーの両方を遺伝的にマッピングした（Hu et al., (2006) Theoretical and Applied Genetics, 113(3): 497-507）。Ａｎｄｒｅｗ Ｓｈａｒｐｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ａｇｒｉ−ｆｏｏｄ Ｃａｎａｄａ、１０７ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｌａｃｅ、Ｓａｓｋａｔｏｏｎ、Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎによって、種子特異的ｃＤＮＡライブラリーからのＥＳＴ配列の収集が以前に構築され、植物系統ＤＨ１２０７５から配列決定された。倍加半数体アブラナ植物ＤＨ１２０７５全長遺伝子配列からのＥＳＴ収集は入手可能でなかったので、さらに正確にヌクレオチドと呼ばれる配列品質および信頼度の指標も入手可能でなかった。結果として、異なるＦＡＤ遺伝子配列解読間の配列変動は、ＦＡＤ３遺伝子ファミリーの種々のホモログおよびパラログの異なる遺伝子コピーに明解に帰せられず、ゲノム配列も入手可能でなかった。しかしながら、組み合わせ配列解析がＥＳＴならびにHu et al., (2006)に記載されている２つのＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｃ全長遺伝子配列を用いて行われると、これらの遺伝子の両方に一致するＥＳＴがさらなる４つのハプロタイプと一緒に同定された。結果として、ＦＡＤ３の合計６つの特有のハプロタイプが同定された。種々のＦＡＤ３ハプロタイプに入手可能な全てのデータのアセンブリ後、エクソン１中の高レベルのエクソン配列分散が同定された。エクソン１中のＦＡＤ３配列の分散は、遺伝子／対立遺伝子特異的ＰＣＲプライマーの設計に利用され得る機会として同定された。さらに、ハプロタイプ間で最小限に区別される（例えば、エクソン５、６、７および８はＦＡＤ３ＡとＦＡＤ３Ｃとの間で異なる１〜３ｂｐを有した）または配列変動のない（例えば、エクソン２および３）エクソンが同定された。
セイヨウアブラナＬ．ｖａｒ．ＤＨ１２０７５から構築されたＢＡＣライブラリーのシーケンシング解析は、６つのＢＡＣ配列（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６）の単離をもたらし、そこからＦＡＤ３Ａ（配列番号７）、ＦＡＤ３Ａ’（配列番号８）、ＦＡＤ３Ａ’’（配列番号９）、ＦＡＤ３Ｃ（配列番号１０）、ＦＡＤ３Ｃ’’（配列番号１１）およびＦＡＤ３Ｃ’（配列番号１２）遺伝子のコード配列を決定した。ＦＡＤ３Ａ、ＦＡＤ３Ａ’、ＦＡＤ３Ａ’’、ＦＡＤ３Ｃ、ＦＡＤ３Ｃ’’およびＦＡＤ３Ｃ’遺伝子配列を同定し、遺伝的にマッピングした。
配列アラインメントプログラムおよび同一性割合を用いた近隣結合系統樹を用いて６つのＦＡＤ３遺伝子の配列解析を行った。配列アラインメントを、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ １１．０コンピュータプログラムのＡｌｉｇｎＸ（登録商標）プログラム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を介して行い、図１に示す。ＡｌｉｇｎＸ（登録商標）は、類似性比較およびアノテーションのためにタンパク質または核酸配列の複数の配列アラインメントを作成するために修正Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを使用する。近隣結合系統樹を、Ｊａｌｖｉｅｗ ｖ２．３（登録商標）ソフトウェアを用いて作成し、図２に示す。（Waterhouse et al.(2009) Bioinformatics 25 (9) 1189-1191）。 ＦＡＤ３遺伝子を含むものとして同定されたコンティグを、シロイヌナズナ遺伝子のデータベースに対するＢＬＡＳＴｎクエリとして使用した。ＦＡＤ３遺伝子を含む６つのコンティグの各々の領域を、シロイヌナズナＦＡＤ３遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ａｔ２ｇ２９９８０）との比較を通して同定した。次いで、ＦＡＤ３コンティグを、全てのＦＡＤ３遺伝子が５’→３’配向になるように配向した。ＦＡＤ３コンティグを、可能な限り多くの２つの上流（５’）および１つの下流（３’）シロイヌナズナ遺伝子を含むようにトリミングした。いったん配向したら、ＦＡＤ３遺伝子の完全なコード領域を各コンティグから抽出し、これを使用して異なるＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバー間の関係を示す近隣結合系統樹を作成した。６つのＦＡＤ３ファミリーメンバーを３対のＦＡＤ３遺伝子にアラインメントした（図２）。
ＰＣＲに基づくスクリーニング
上記ＢＡＣライブラリーをスクリーニングするようにＰＣＲプライマーのコホートを設計した。プライマーを遺伝子ファミリーの全てのメンバーを増幅するユニバーサルプライマー、または標的化対立遺伝子増幅用の遺伝子特異的プライマーとして設計した。ＰＣＲプライマーを、２０ｂｐ長（＋／−１ｂｐ）となり、かつ５０％（＋／−８％）のＧ／Ｃ含量を含むように設計した。表１は設計および合成したプライマーを列挙している。ＢＡＣライブラリーのクローンをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介してプールおよびスクリーニングした。
２つの異なる条件セットをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用した。第１のシリーズのＰＣＲ反応は、１ＸＰＣＲバッファ（ｄＮＴＰを含む）；１．５ｍＭのＭｇＣｌ２；２００μＭの０．２５Ｕ Ｉｍｍｏｌａｓｅ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、ロンドン、英国）；２５０ｎＭの各プライマー；および約５〜１０ｎｇのテンプレートＤＮＡを含んでいた。第２のシリーズのＰＣＲ反応は、ゲノムＤＮＡの増幅用に開発したものであり、５〜１０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１ＸＰＣＲバッファ、２ｍＭのｄＮＴＰ、０．４μＭの順方向および逆方向プライマー、ならびに０．２５Ｕ Ｉｍｍｏｌａｓｅ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（（Ｂｉｏｌｉｎｅ、ロンドン、英国）を含んでいた。試薬を１３μＬの最終体積にプールし、ＭＪ ＰＴＣ２００（登録商標）サーモサイクラー（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）またはＡＢＩ ９７００ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて増幅した。上記ＰＣＲ条件で、Bryanら（Scottish Crops Research Institute annual report: 2001-2002）により記載されているスクリーニングシステムに基づく４次元スクリーニングアプローチを用いて、特異的プレートのＰＣＲに基づくスクリーニングを行った。プールしたＢＡＣライブラリーのＰＣＲに基づくスクリーニング後に、直接Ｓａｎｇｅｒシーケンシング法を用いて増幅ＰＣＲ産物をシーケンシングした。増幅産物を、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ｖ３．１プロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にしたがってエタノール、酢酸ナトリウムおよびＥＤＴＡを用いて精製し、ＡＢＩ３７３０ｘｌ（登録商標）自動化毛細管電気泳動プラットホームで電気泳動を行った。
ＰＣＲに基づくスクリーニングおよび確認Ｓａｎｇｅｒシーケンシングの後、種々の異なるＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバーを含むプレートの収集を同定した。合計６つの特有のＦＡＤ３ホモログおよびパラログ遺伝子配列を同定した（表２）。プレートスクリーニングを受けるための各ＦＡＤ３遺伝子配列当たり合計２つのプレートを選択してＦＡＤ３遺伝子を含むプレート中の特異的ウェルおよびクローンを同定した（表２）。特異的ウェルをプレートの両方について同定し、個々のクローンをＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバーの各々について選択した（表２）。
各々の同定されたＦＡＤ遺伝子ファミリーメンバーに対して単一のＢＡＣクローンを、シーケンシングを介してさらに解析した。製造業者の指示にしたがうＬａｒｇｅ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔキット（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いたシーケンシングのために、ＤＮＡをＢＡＣクローンについて単離し、調製した。製造業者の指示にしたがうＧＳ−ＦＬＸ Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いたシーケンシングのために、抽出ＢＡＣ ＤＮＡを調製した。最適データ出力のために対でプールしたＢＡＣを含む物理的にセクタ分割したＧＳ−ＦＬＸ ＴＩ Ｐｉｃｏ−タイタープレート（登録商標）を用いてシーケンシング反応を行った。ＢＡＣを対に合わせ、ここでＦＡＤ２遺伝子をＦＡＤ３遺伝子と対形成した。全ての作成した配列データをＮｅｗｂｌｅｒ ｖ２．０．０１．１４（登録商標）（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）によってアセンブルした。アセンブルしたコンティグを、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ｖ３．７（登録商標）（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて対応するＦＡＤ遺伝子の存在について手動で評価した。
全６つのＦＡＤ３遺伝子の全ゲノム配列を同定し、完全に特徴付けた後、ジンクフィンガーヌクレアーゼを、各特異的遺伝子ファミリーメンバーについての配列に結合するよう設計した。
実施例２：ＦＡＤ３遺伝子に特異的なジンクフィンガー結合ドメインの設計
ＦＡＤ３遺伝子座の種々の機能配列をコードするＤＮＡ配列に向けられたジンクフィンガータンパク質を前記のように設計した。例えば、Urnov et al.(2005) Nature 435:646-651を参照されたい。代表的な標的配列および認識ヘリックスを表３（ヘリックス認識領域設計）および表４（標的部位）に示す。表４では、ＺＦＰ認識ヘリックスが接触する標的部位のヌクレオチドが大文字で示されており、非接触ヌクレオチドが小文字で示されている。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）標的部位を、ＦＡＤ３の７つの標的部位に結合するように設計した。ＦＡＤ３ジンクフィンガー設計を、ＣＣＨＣ構造の少なくとも１つのフィンガーを有するタンパク質をコードするジンクフィンガー発現ベクターに組み込んだ。米国特許出願公開第２００８／０１８２３３２号明細書を参照されたい。特に、各タンパク質の最後のフィンガーは、ヘリックス認識のためのＣＣＨＣ骨格を有していた。非標準ジンクフィンガーコード配列を、４つのアミノ酸ＺＣリンカーおよびトウモロコシ（Zea mays）に由来するオペーク−２核移行シグナルを介してＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメイン（Wah et al., (1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10564-10569のアミノ酸３８４〜５７９）に融合してＦＡＤ３ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成した。融合タンパク質の発現を、比較的強い構成型プロモーター、例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーターに由来し、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＯＲＦ２３ ３’未翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１）が隣接するプロモーターによって駆動した。ゾセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルスからの自己加水分解２Ａコードヌクレオチド配列（Szymczak et al., 2004）を、構築物にクローニングした２つのＺＦＮの間に付加した。代表的なベクターを以下に記載する。
活性ヌクレアーゼを同定することが以前示された出芽酵母に基づく系を用いて、最適ジンクフィンガーを切断活性について検証した。例えば、米国特許出願公開第２００９０１１１１１９号明細書；Doyon et al.(2008) Nat Biotechnol 26:702-708；Geurts et al.(2009) Science 325:433を参照されたい。種々の機能性ドメインに関するジンクフィンガーをインビボでの使用のために選択した。推定ＦＡＤゲノムポリヌクレオチド標的部位に結合するよう設計、作成および試験された多数のＺＦＮのうち、１５個のＺＦＮを高レベルのインビボ活性を有するものとして同定し、さらなる実験のために選択した。これらのＺＦＮを、植物体中に特有のＦＡＤ３ゲノムポリヌクレオチド標的部位に効率的に結合し、これを切断することができるものとして特徴付けた。
実施例３：ＦＡＤ３遺伝子のジンクフィンガーヌクレアーゼ切断の評価
構築物アセンブリ
実施例２に記載されるように、酵母アッセイを用いて同定された、代表的なジンクフィンガーヌクレアーゼのＺＦＮ発現構築物を含むプラスミドベクターを、当分野で一般的に公知の技能および技術を用いて設計し、完成させた。各ジンクフィンガーコード配列を、ジンクフィンガーヌクレアーゼの上流に位置するオペーク−２核移行シグナル（Maddaloni et al.(1989) Nuc.Acids Res.17(18):7532）をコードする配列に融合した。
次に、オペーク−２核移行シグナル：：ジンクフィンガーヌクレアーゼ融合配列を、相補的オペーク−２核移行シグナル：：ジンクフィンガーヌクレアーゼ融合配列と対形成した。よって、各構築物は、ゾセア・アシグナウイルスからの２Ａ配列によって分離された２つのオペーク−２核移行シグナル：：ジンクフィンガーヌクレアーゼ融合配列で構成された単一のオープンリーディングフレームを含んでいた（Mattion et al.(1996) J.Virol.70:8124-8127）。融合タンパク質の発現を、比較的強い構成型プロモーター、例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーターに由来し、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＯＲＦ２３ ３’未翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ）が隣接するプロモーターによって駆動した。
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いてベクターをアセンブルした。制限エンドヌクレアーゼをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から得て、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＮＡライゲーションに使用した。供給業者の指示にしたがってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）またはＰｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミド調製を行った。アガローストリス酢酸ゲル電気泳動後にＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡ断片を単離した。全てのアセンブルしたプラスミドのコロニーを最初にミニプレップＤＮＡの制限消化によってスクリーニングした。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、商業的シーケンシング販売業者（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）によってシーケンシングした。配列データを、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いてアセンブルおよび分析した。セイヨウアブラナプロトプラストに送達する前に、プラスミドＤＮＡを、供給業者の指示にしたがってＰｕｒｅ Ｙｉｅｌｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）またはＰｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて大腸菌の培養物から調製した。
得られた１１個のプラスミド構築物；ｐＤＡＢ１０７８２４（ＺＦＮｓ２８０２５−２Ａ−２８０２６）、ｐＤＡＢ１０７８１５（ＺＦＮｓ２７９６１−２Ａ−２７９６２）、ｐＤＡＢ１０７８１６（ＺＦＮｓ２７９６９−２Ａ−２７９７０）、ｐＤＡＢ１０７８１７（ＺＦＮｓ２７９７３−２Ａ−２７９７４）、ｐＤＡＢ１０７８２５（ＺＦＮｓ２８０３５−２Ａ−２８０３６）、ｐＤＡＢ１０７８２６（ＺＦＮｓ２８０３９−２Ａ−２８０４０）、ｐＤＡＢ１０７８１８（ＺＦＮｓ２７９８７−２Ａ−２７９８８）、ｐＤＡＢ１０７８２７（ＺＦＮｓ２８０５１−２Ａ−２８０５２）、ｐＤＡＢ１０７８２１（ＺＦＮｓ２８００４−２Ａ−２８００５）、ｐＤＡＢ１０７８１９（ＺＦＮｓ２７９８９−２Ａ−２７９９０）、ｐＤＡＢ１０７８２８（ＺＦＮｓ２８０５３−２Ａ−２８０５４）（図３）、ｐＤＡＢ１０７８２９（ＺＦＮｓ２８０５５−２Ａ−２８０５６）（図４）、ｐＤＡＢ１０７８２０（ＺＦＮｓ２７９９１−２Ａ−２７９９２）、ｐＤＡＢ１０７８２２（ＺＦＮｓ２８０２１−２Ａ−２８０２２）およびｐＤＡＢ１０７８２３（ＺＦＮｓ２８０２３−２Ａ−２８０２４）を、制限酵素消化およびＤＮＡシーケンシングを介して確認した。
トランスフェクション用のＤＮＡの調製
上記ベクターのプラスミドＤＮＡを沈殿により滅菌し、１００％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し、ラミナーフローフード中で乾燥させた。ＤＮＡペレットを、下記のプロトプラスト細胞へのトランスフェクションのために０．７μｇ／μｌの最終濃度で滅菌再蒸留水３０μＬに懸濁した。プラスミドＤＮＡの調製を行って、一過性トランスフェクション用のスーパーコイルプラスミドＤＮＡおよび安定性トランスフェクション用の線状プラスミドＤＮＡを得た。キャリアＤＮＡ（例えば、魚類精子ＤＮＡ）の形質転換プラスミドへの付加はプロトプラスト細胞の一過性トランスフェクションに要求されない。一過性試験のために、１回の形質転換当たり、１０６個のプロトプラスト当たり約３０μｇのプラスミドを使用した。
トランスフェクション
セイヨウアブラナＬ．ｖａｒ．ＤＨ１０２７５のトランスフェクションをSpangenberg et al., (1986) Plant Physiology 66: 1-8に記載されているように完了し、培地処方物はSpangenberg G.and Protrykus I.(1995) Polyethylene Glycol-Mediated Direct Gene Transfer in Tobacco Protoplasts. In: Gene Transfer to Plants. (Protrykus I.and Spangenberg G.Eds.) Springer-Verlag, Berlinに記載されている。セイヨウアブラナ種子を７０％エタノールで表面消毒した。種子を７０％エタノール溶液１２ｍＬに浸漬し、カクテルを１０分間穏やかに揺動することによって混合した。７０％エタノール溶液を、デカントすることによって取り出し、１％ｗ／ｖ自亜塩素酸カルシウムおよび０．１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ−２０の種子消毒液と交換した。種子を種子消毒液に浸漬し、カクテルを２５分間穏やかに揺動することによって混合した。種子消毒液をデカントし、消毒した種子を滅菌水５０ｍＬで３回すすいだ。最後に、種子を、ペトリ皿中に置かれた滅菌８０ｍｍのＷｈａｔｍａｎ濾紙ディスク（登録商標）（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に移し、種子を滅菌水で軽く飽和させた。ペトリ皿をＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で密閉し、プレートを完全暗所下２５℃で１〜２日間インキュベートした。種子から実生出芽の兆候が観察された後、実生を固化ＧＥＭ培地を含むペトリ皿に移してさらなる種子の発芽を促した。実生をＧＥＭ培地において２５℃で４〜５日間インキュベートした。
一定体積の液体ＰＳ培地（約１０ｍＬ）を滅菌ペトリ皿にデカントした。滅菌鉗子およびメスを用いて、発育の４葉期にある４〜５日齢の実生の気生部分を除去し、捨てた。長さ２０〜４０ｍｍの胚軸セグメントを、小型の細胞質に富むプロトプラストの最高集団を産生するように決定した。胚軸セグメントを無菌的に切除し、液体ＰＳ培地に移した。切除した胚軸セグメントを一緒にグループ化し、５〜１０ｍｍのセグメントに横方向に切り分けた。次に、胚軸セグメントを新鮮なＰＳ培地に移し、室温で１時間インキュベートした。原形質分離した胚軸を、酵素溶液を含むペトリ皿に移した。胚軸セグメントの全てを溶液に浸漬するよう注意した。ペトリ皿をＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密閉し、穏やかに揺動しながら２０〜２２℃で１６〜１８時間一晩インキュベートした。
プロトプラスト細胞を胚軸セグメントから放出した。一晩の胚軸消化物を穏やかに攪拌してプロトプラストを酵素溶液に放出した。ペトリ皿をわずかに傾けて、酵素溶液および植物破片の消化懸濁液の移動を助けた。１０ｍＬピペットを用いて、消化懸濁液を滅菌プロトプラスト濾過（１００ミクロンメッシュのフィルタ）装置に移してプロトプラストを植物破片からさらに分離した。濾過装置を穏やかに叩いて、ふるいに引っかかった過剰な液体を放出した。約８〜９ｍＬのプロトプラスト懸濁液を穏やかに混合し、１４ｍＬ滅菌プラスチック丸底遠心管に分配した。各懸濁液をＷ５溶液１．５ｍＬで覆った。Ｗ５溶液を一定角度でプロトプラスト懸濁液上に慎重に分配し、最小限攪拌しながら１滴ずつ分配した。Ｗ５溶液のプロトプラスト懸濁液への添加は、プロトプラストに富む界面の生成をもたらした。この界面を、ピペットを用いて回収した。次に、回収したプロトプラストを新しい１４ｍＬ遠心管に移し、穏やかに混合した。血球計算器を用いて１ミリリットル当たりのプロトプラストの数を測定して、収率または得られたプロトプラストを決定した。葉組織を消化して葉肉プロトプラストを産生する方法を繰り返した。
次に、Ｗ５溶液を１０ｍＬ体積に添加し、Ｗ５溶液を除去する前にプロトプラストを７０ｇでペレット化した。残っているプロトプラスト懸濁液を、穏やかに振盪することによって再懸濁した。プロトプラスト懸濁液を含む各管にＷ５溶液５ｍＬを充填し、室温で１〜４時間インキュベートした。プロトプラスト懸濁液を７０ｇでペレット化し、Ｗ５溶液の全てを除去した。 次に、形質転換バッファ３００μＬを、単離プロトプラストを含むペレット化したプロトプラスト懸濁液の各々に添加した。管の各々について、プラスミドＤＮＡ１０μｇをプロトプラスト懸濁液に添加した。プラスミドＤＮＡは、上記ジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物を含んでいた。次に、予備加温ＰＥＧ４０００溶液３００μＬをプロトプラスト懸濁液に添加し、管を穏やかに叩いた。プロトプラスト懸濁液および形質転換混合物を攪拌することなく室温で１５分間インキュベートさせた。Ｗ５溶液さらに１０ｍＬを、Ｗ５溶液の各添加の間に管を穏やかに反転させながら、１ｍＬ、１ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、２ｍＬおよび３ｍＬの連続アリコートで各管に添加した。７０ｇで遠心分離機中で回転させることによって、プロトプラストをペレット化した。Ｗ５溶液の全てを除去して、純粋なプロトプラスト懸濁液を残した。
次に、Ｋ３培地０．５ｍＬをペレット化したプロトプラスト細胞に添加し、細胞を再懸濁した。再懸濁したプロトプラスト細胞をペトリ皿ならびに５ｍＬのＫ３および０．６ｍＬのＳｅａ Ｐｌａｑｕｅ（商標）アガロース（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、ＮＪ）の中心に１：１濃度で入れた。ペトリ皿を一回の穏やかな旋回動作で振盪し、室温で２０〜３０分間インキュベートさせた。ペトリ皿をＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密閉し、プロトプラストを完全な暗所中で２４時間培養した。暗所中でのインキュベーション後、ペトリ皿を薄明かり（５μＭｏｌｍ−２ｓ−１のＯｓｒａｍ Ｌ３６Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘ白色管）の下で６日間培養した。培養工程後、滅菌スパーテルを用いてプロトプラストを含むアガロースを４分割した。分離した４分の１区を、２０ｍＬのＡ培地を含む２５０ｍＬプラスチック培養容器に入れ、連続薄明かり下２４℃で１４日間、８０ｒｐｍおよび１．２５ｃｍ行程の回転振盪機でインキュベートし、次いで、分析して各ＺＦＮ構築物の活性のレベルを測定した。
アブラナプロトプラストからのゲノムＤＮＡ単離
トランスフェクトプロトプラストを、個々の１．５または２．０ｍＬマイクロチューブに供給した。細胞をバッファ溶液中チューブの底部でペレット化した。細胞を液体窒素中で瞬間凍結し、引き続いて、細胞を−４０℃および約１３３ｘ１０−３ｍＢａｒ圧力でＬａｂｃｏｎｃｏ Ｆｒｅｅｚｏｎｅ ４．５（登録商標）（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）において約４８時間凍結乾燥することによって、ＤＮＡ抽出を行った。凍結乾燥細胞を、組織破壊を要さず、プロトプラスト細胞を溶解バッファに直接添加したことを除いて、製造業者の指示にしたがってＤＮｅａｓｙ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）植物キットを用いたＤＮＡ抽出に供した。
アブラナプロトプラストにおけるゲノムＤＮＡ配列切断についてのＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｃ ＺＦＮの試験
ＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｃ遺伝子座中のＺＦＮ標的部位の設計を、複数対のＺＦＮが重複標的部位への設計となるようにクラスター化した。ＺＦＮ標的部位のクラスター化は、ＰＣＲプライマーが、重複ＺＦＮ標的部位の全てを包含するように１００ｂｐウィンドウ内の全てのＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｃ遺伝子ファミリーメンバーから隣接ゲノム配列を増幅するよう設計されることを可能にした。よって、Ｉｌｌｕｍｉｎａ短解読配列技術を用いて、トランスフェクトプロトプラストの標的ＺＦＮ部位の完全性を評価することができた。さらに、設計されたＰＣＲプライマーは、配列解読をＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｃ遺伝子ファミリーの特異的遺伝子メンバーに帰する特異的ヌクレオチド塩基を含むことを必要とした。そのため、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）活性がプライミング部位を除去して増幅を阻害し、それゆえにＮＨＥＪ活性の評価を歪め得る小さな欠失を引き起こすことが知られているので、ＰＣＲプライマーの全てが、いずれかのＺＦＮ標的切断部位から５〜１０ヌクレオチド離れて結合することが要求されるだろう。
プライマーを、ＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｃ遺伝子ファミリーについてのＺＦＮ標的座（表５）の全てに結合するよう設計し、ＰＣＲ増幅産物のＳａｎｇｅｒシーケンシングを通して全ての遺伝子ファミリーメンバーの増幅について経験的に試験した。いくつかの例では、全ての遺伝子ファミリーメンバーを識別するプライマーを開発することができなかったが（表６）、全ての例で、ＦＡＤ３ＡまたはＦＡＤ３Ｃの標的遺伝子配列を識別することができた。ＰＣＲプライマー設計後に、カスタムＤＮＡバーコード配列をＰＣＲプライマーに組み込み、これを使用して異なるＺＦＮ標的座を識別し、トランスフェクションおよびＺＦＮに対する特異的配列解読を同定した（表５および６）。
表５：ＦＡＤ３遺伝子ファミリーにおける設計ＰＣＲプライマーの増幅性能。「Ｘ」は遺伝子コピー検出特異性を示し、灰色陰付けの「＋」は当の特異的座において、２つのプライマーによって設計された配列解読を識別することができなかったことを示しており、「Ｎ／Ａ」は、座をこれらの特異的遺伝子コピーから増幅することができなかったことを示している。
ＺＦＮを用いてトランスフェクトされたアブラナプロトプラストのＤＮＡ抽出後に、標的ＺＦＮ座のＰＣＲ増幅を行って、ｉｌｌｕｍｉｎａの合成によるシーケンシング技術のための正しいフォーマットで必須の座特異的ＤＮＡ分子を産生した。各アッセイを２５ｎｇの出発ＤＮＡ（セイヨウアブラナゲノムの約１２，５００個細胞当量）に行うように最適化した。適当なレベルでＮＨＥＪ効率性および特異性を評価するために要求される被覆率を提供するために、１サンプル当たり複数の反応、すなわち個々のプロトプラストから採取したセイヨウアブラナゲノムの２００，０００コピーに相当する約１６回のＰＣＲ反応を行った。同じアッセイで試験する全てのサンプルについてＰＣＲ増幅マスターミックスを作成し、三連で行う１つの反応を、標的組織に行う最適サイクル数を決定し、ＰＣＲ増幅が試薬制限的になっておらず、まだ指数増幅段階にあることを保証するために使用される定量的ＰＣＲ法を用いてアッセイした。必要なネガティブコントロール反応による実験を、ＭＸ３０００Ｐサーモサイクラー（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて９６ウェルフォーマットで行った。
定量的ＰＣＲプラットホームから集められた出力から、蛍光の相対的増加をサイクル毎にプロットし、過剰サイクリングならびに共通の転写産物または分子の増幅を減少させようとして、十分な増幅をもたらすが、反応が試薬制限的になるのを許さない、１アッセイ当たりのサイクル数を決定した。未使用のマスターミックスは、定量的ＰＣＲ分析が完結し、サイクル数が決定されるまで氷上に残っており、その後、所望の数の反応管（１ＺＦＮアッセイ当たり約１６本）に等分し、ＰＣＲ反応を行った。
増幅後、単一ＺＦＮ座についてのサンプルを一緒にプールし、１ＺＦＮ当たり２００μＬのプールされた産物を、製造業者の指示にしたがって、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて洗浄した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ短解読技術を用いてサンプルをシーケンシングすることを可能にするために、さらなる対のエンドプライマーを、産生した断片上に増幅によって付着させることが必要とされた。これは、一部は第１ラウンドの増幅で付加された配列と相補的であるが、必要とされる対の末端配列も含むプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって達成された。テンプレートに共通の断片を過剰に増幅することなく対の末端配列を付加する、行うのに最適なＰＣＲサイクル数を、前記の定量的ＰＣＲサイクル分析を通過するサンプルパスを用いて再度決定した。
ＰＣＲ増幅後、産生産物を、製造業者の指示にしたがってＭｉｎＥｌｕｔｅカラム（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて洗浄し、２．５％アガロースゲル上で分離した。正しいサイズのバンドとしてＳｙｂｅｒ（登録商標）Ｓａｆｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて可視化したＤＮＡ断片をゲル抽出して、任意の残留ＰＣＲ産生プライマー−二量体または他の偽性断片を除去し、ＤＮＡを、製造業者の指示にしたがってＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キット（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル切片から抽出した。ゲル抽出の完了後、１：１．７のＤＮＡ対ビーズ比でＡＭＰｕｒｅ磁気ビーズ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を用いて、ＤＮＡのさらなる浄化を行った。次いで、１／４０，０００および１／８０，０００希釈で、かつ反応を三連で行って、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング用定量的ＰＣＲライブラリー定量化キット（ＫＡＰＡ）を用いて、ＤＮＡの濃度を評価した。定量的ＰＣＲ結果に基づいて、ＤＮＡを２ｎＭの標準濃度に希釈し、ＤＮＡシーケンシングのために全てのライブラリーを組み合わせた。ｃＢｏｔクラスター産生キット（登録商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ、ＣＡ）を用いてシーケンシング用のサンプルを調製し、製造業者の指示にしたがって１００ｂｐの対形成末端シーケンシング解読によりＩｌｌｕｍｉｎａ ＧＡ２ｘ（登録商標）でシーケンシングした。
標的ジンクフィンガー部位における非相同末端結合の検出のためのデータ解析法
シーケンシング反応および塩基呼び出し（base calling）のためにＩｌｌｕｍｉｎａ生物情報学パイプラインを用いて行われる一次データ呼び出しの完了後、各例において完全な解析を行って標的ＺＦＮ部位における欠失塩基を同定した。入力配列のリストに計算的にしたがってカスタムＰＥＲＬスクリプトを、ＤＮＡ配列からバーコードを抽出およびソートするように設計した。バーコードは、誤帰属配列解読を減少させるために、許容される３０超のＰｈｒｅｄスコアで基準配列に一致しなければならなかった。配列解読を使用された異なるバーコード群にビニングした後、品質フィルタを全ての配列に通過させた。品質フィルタは、第２のカスタム開発ＰＥＲＬスクリプトであった。「Ｎ」と呼ばれる塩基が４つ以上存在する場合、または中央Ｐｈｒｅｄスコアが２０未満である場合、または２０未満のＰｈｒｅｄスコアの連続塩基が３つ存在する場合、または配列解読の長さが４０より短い場合、配列解読を除外した。残りの配列を併合し、ここでは対の配列解読の両方がＮｅｘｔＧＥＮｅ（登録商標）（ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｓｔａｔｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ、ＰＡ）パッケージを用いて入手可能であった。次いで、残りの合併配列解読を、残りの配列識別子の終わりに記録された同定された冗長配列の数のカウントと共に第３のカスタムＰＥＲＬスクリプトを用いて、特有の配列解読の集合に減少させた。次いで、特有の配列解読を、ギャップドＦＡＳＴＡアラインメントファイルを作成するＮｅｘｔＧＥＮｅ（登録商標）ソフトウェアを用いてＦＡＤ３基準配列にアラインメントした。
ギャップドＦＡＳＴＡファイルを用いて、ギャップのある塩基位置数の入力基準への変換を第４のカスタムＰＥＲＬスクリプトを用いて行った。これは、異なる遺伝子ファミリーメンバー（異なる遺伝子ファミリーメンバー間のホモログまたはパラログ配列変動）を識別する塩基をアセンブルされたデータで同定することを可能にした。いったん塩基番号付けの変換を行ったら、各特有の配列解読についてのハプロタイプ報告を作成し、解読を特異的遺伝子ファミリーメンバーに割り当てることが可能となった。いったん解読を遺伝子によってグループ化したら、ＺＦＮ標的部位を囲む１０ｂｐウィンドウを同定し、評価した。１遺伝子当たりの欠失を含む配列の数を、欠損している塩基の数と共に記録した。
次いで、１０，０００配列解読当たりの、標的ＺＦＮ部位において１〜１０個の塩基が欠失した配列の数を用いて複数折れ線グラフとして、データを図表で示した。この解析をコントロールトランスフェクションと一緒に全てのＺＦＮトランスフェクションについて行った。いくつかの例では、野生のＤＮＡ配列中の反復が、標的ＺＦＮ部位中のシーケンシング誤差の増加をもたらし、このような誤差は、ＺＦＮを用いてトランスフェクトしたものまたはコントロールの両者の全てのサンプルで報告された単一塩基欠失の流行の増加として一般的に見ることができる。
これらの結果から、ＮＨＥＪのより大きな活性によって決定されるように、ＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｃ標的部位における最高レベルのＺＦＮ活性が観察された。プラスミドｐＤＡＢ１０７８２８（すなわち、ＺＦＮ２８０５３および２８０５４）ならびにｐＤＡＢ１０７８２９（すなわち、ＺＦＮ２８０５５および２８０５６）にコードされたＺＦＮを、有意なゲノムＤＮＡ切断活性および最小の非標的活性の特徴を与えられた操作された導入遺伝子組込みプラットホーム（ＥＴＩＰ）の植物体標的化のために選択した。
実施例４：操作された導入遺伝子組込みプラットホーム（ＥＴＩＰ）アブラナ植物系統のためのＤＮＡ構築物
当業者に一般的に公知の方法および技術を用いて、下記のプラスミドベクター構築物を構築した。この段落中に記載される特定の試薬および技術の適用は当業者に容易に公知となり、プラスミドベクター構築物を構築する所望の目的を達成するために、他の試薬および技術と容易に交換され得るだろう。制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から得た。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてライゲーションを完了した。１つのエントリーベクターを単一デスティネーションベクターに組み立てるために、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＧａｔｅｗａｙ反応を行った。１つのエントリーベクターを単一デスティネーションベクターに組み立てるために、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（商標）反応を行った。供給業者の指示にしたがってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）またはＰｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミド調製を行った。アガローストリス酢酸ゲル電気泳動後にＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡ断片を単離した。全てのアセンブルしたプラスミドのコロニーを最初にミニプレップＤＮＡの制限消化によってスクリーニングした。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、商業的シーケンシング販売業者（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）によってシーケンシングした。配列データを、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いてアセンブルおよび分析した。
コントロールベクター
コントロールベクターを使用して蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）細胞系ソーティング法を展開した。標準的なクローニング法を、２つの遺伝子発現カセットを含むコントロールベクター、ｐＤＡＳ００００３１（図１０：配列番号８５としてのＴ鎖インサート）の構築に使用した。第１の遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス１９ｓプロモーター（ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター；Shillito, et al., (1985) Bio/Technology 3; 1099-1103）：：ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ（ＨｙｇＲ）；米国特許第４，７２７，０２８号明細書）：：およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスオープンリーディングフレーム１ ３’未翻訳領域（ＡｔＯＲＦ１ターミネーター；Huang et al., (1990) J.Bacteriol.1990 172:1814-1822）を含んでいた。第２の遺伝子発現カセットは、トランス配向（例えば、頭部−頭部配向）のインフレーム融合体として、シロイヌナズナユビキチン１０プロモーター（ＡｔＵｂｉ１０プロモーター；Callis, et al., (1990) J.Biol.Chem., 265: 12486-12493）：：ｄｓＲＥＤ（ｄｓＲＥＤ（Ｄ）；米国特許第６，８５２，８４９号明細書）およびアラビドプシスのイントロン（イントロン番号１；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０２５６３９．１）：：アグロバクテリウム・ツメファシエンスオープンリーディングフレーム２３ ３’未翻訳領域（ＡｔＯＲＦ２３ターミネーター；米国特許第５，４２８，１４７号明細書）を含んでいた。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いてプラスミドベクターをアセンブルした。
実施例５：ＥＴＩＰアブラナ植物系統の作成
セイヨウアブラナの形質転換
ＦＡＤ３ＡおよびＦＡＤ３Ｃ部位特異的構築物（ｐＤＡＳ０００２７１〜ｐＤＡＳ０００２７５）ならびに付随的ＺＦＮ（ｐＤＡＢ１０７８２８および１０７８２９）についてのＥＴＩＰ構築物ならびにコントロールＤＳ−Ｒｅｄコントロール構築物（ｐＤＡＳ００００３１）は実施例４で前に記載されている。これらのバイナリーベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株ＧＶ３１０１：ＰＭ９０に形質転換した。いくらかの修正をした実施例３に記載のトランスフェクションプロトコルを用いて、セイヨウアブラナプロトプラスト細胞の形質転換を完了する。
プロトコルの修正は、Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅ（商標）アガロースの代わりにアルギン酸ナトリウムを使用することを含む。ＺＦＮ構築物とＥＴＩＰ構築物の両方をセイヨウアブラナプロトプラスト細胞に同時送達するトランスフェクション実験を、５：１のモル比のプラスミドＤＮＡを含むＤＮＡ濃度で完了する。他のＥＴＩＰおよびコントロールプラスミド構築物を、３０μｇのプラスミドＤＮＡの濃度で形質転換する。
プロトコルのさらなる修正は、１．５ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含む培地中での形質転換プロトプラスト細胞からの全植物の繁殖を含む。全植物の繁殖は、Ａ培地を２週間毎に交換し、プロトプラスト由来コロニーの増殖を監視することを要する。プロトプラスト由来コロニーが直径約２〜３ｍｍまで増殖した後、このコロニーを、固化ＭＳモルフォ培地（morpho medium）を含む１２ウェルＣｏｓｔａｒ（登録商標）プレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の個々のウェルに移す。カルスが直径８〜１０ｍｍのサイズまで増殖するまで、プレートを連続薄明かり下２４℃で１〜２週間インキュベートする。プロトプラスト細胞が直径１〜２ｃｍに達した後、プロトプラスト細胞を、ＭＳモルフォ培地を含む個々の２５０ｍＬ培養容器に移す。容器を１６時間光（２０μＭｏｌｍ−２ｓ−１のＯｓｒａｍ Ｌ３６Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘ白色管）および８時間暗所条件下２４℃でインキュベートする。１〜２週間以内に、複数のシュートが目に見えるようになる。シュートが長さ３〜４ｃｍに達した後、これをＭＳ培地を含む２５０ｍＬ培養容器に移す。２５０ｍＬ培養容器を１６時間光（２０μＭｏｌｍ−２ｓ−１のＯｓｒａｍ Ｌ３６Ｗ／２１ Ｌｕｍｉｌｕｘ白色管）および８時間暗所条件下２４℃でインキュベートする。シュートが小植物に発達するまで培養容器中に維持し、発達したらこれを温室に移して成熟まで成長させる。
実施例６：アブラナにおけるＥＴＩＰを含むＴ−ＤＮＡの組込みの分子確認
ＤＮｅａｓｙ ９６ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ抽出キット（商標）またはＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉキット（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ゲノムＤＮＡを全ての推定トランスジェニック植物の葉組織から抽出する。アグロバクテリウム・ツメファシエンスの持続性について試験するためのｐＴｉＣ５８順方向（配列番号８８ ＣＧＡＧＡＡＣＴＴＧＧＣＡＡＴＴＣＣ）およびｐＴｉＣ５８逆方向（配列番号８９ ＴＧＧＣＧＡＴＴＣＴＧＡＧＡＴＴＣＣ）からｖｉｒＣを増幅するよう設計されたプライマー、ゲノムＤＮＡの品質をチェックするためのセイヨウアブラナからアクチンを増幅するよう設計されたプライマー；アクチン順方向（配列番号９０ ＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧ）およびアクチン逆方向（配列番号９１ ＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧ）を用いたＰＣＲによって各植物からのゲノムＤＮＡを解析する。プライマーを、ＥＴＩＰによってコードされるｈｐｈ遺伝子；ＨＰＨ順方向（配列番号９２ ＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＡＣＧ）およびＨＰＨ逆方向（配列番号９３ ＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＴＡＧＣ）を増幅するように設計する。アクチンおよびｈｐｈに対するプライマーを用いて増幅した場合に、ｖｉｒＣプライマーからの産物を与えない植物および正しいサイズのアンプリコンを産生する植物をトランスジェニックと確認する。
各トランスジェニック植物からのｇＤＮＡを、Ｔ−ＤＮＡ領域の外側のバイナリーベクターを増幅するよう設計された５セットのプライマー［（１Ｆ配列番号９４ ＡＴＧＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＴＧＣＣ；１Ｒ配列番号９５ ＧＡＡＧＧＧＡＡＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＣＣ）（２Ｆ配列番号９６ ＴＧＣＧＣＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＣＡＡＡＴ；２Ｒ配列番号９７ ＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＴＴＣ）（３Ｆ配列番号９８ ＣＣＴＧＣＡＴＴＣＧＧＴＴＡＡＡＣＡＣＣ；３Ｒ配列番号９９ ＣＣＡＴＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＣＣＴＴＧＣ）（４Ｆ配列番号１００ ＡＴＴＣＣＧＡＴＣＣＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴ；４Ｒ配列番号１０１ ＧＣＣＡＡＣＧＴＴＧＣＡＧＣＣＴＴＧＣＴ）（５Ｆ配列番号１０２ ＧＣＣＣＴＧＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＡＡＧＴ；５Ｒ配列番号１０３ ＧＴＡＡＣＴＴＡＧＧＡＣＴＴＧＴＧＣＧＡ）］を用いたＰＣＲによって解析する第２のスクリーニングを完了する。正しいサイズおよび予想されるサイズのＰＣＲ産物がプライマーセット３および４を用いて増幅される植物を、骨格組込みを有するとみなす。
骨格組込みを有さない植物のＤＮＡを、修正したＣＴＡＢ法（Maguire et al,. (1994) Plant Molecular Biology Reporter , 12( 2): 106-109）を用いて、葉組織２０ｇから精製する。単離したｇＤＮＡをいくつかの制限酵素を用いて消化し、ｇＤＮＡ１０μｇをアガロースゲル上での電気泳動によって分離し、標準的サザンブロット法プロトコルを用いて膜に移動させる。製造業者の指示にしたがってＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を用いて、膜をプローブする。以下のプライマー：（ＩＰＴ−Ｆ配列番号１０４ ＴＣＴＣＴＡＣＣＴＴＧＡＴＧＡＴＣＧＧ；ＩＰＴ−Ｒ配列番号１０５ ＡＡＣＡＴＣＴＧＣＴＴＡＡＣＴＣＴＧＧＣ；ｄｓＲＥＤ−Ｆ配列番号１０６ ＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＴＧＡＧＡＡＣＧ；ｄｓＲＥＤ−Ｒ配列番号１０７ ＴＴＣＣＧＴＡＴＴＧＧＡＡＴＴＧＡＧＧ；ＰＡＴ−Ｆ配列番号１０８ ＴＴＧＣＴＴＡＡＧＴＣＴＡＴＧＧＡＧＧＣＧ；ＰＡＴ−Ｒ配列番号１０９ ＴＧＧＧＴＡＡＣＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＧＧ；ＥＬＰ−Ｆ配列番号１１０ ＡＴＧＡＴＡＴＧＴＡＧＡＣＡＴＡＧＴＧＧＧ；ＥＬＰ−Ｒ配列番号１１１ ＡＧＧＧＴＧＴＡＡＧＧＴＡＣＴＡＧＣＣ；Ｈｐｈ−Ｆ配列番号１１２ ＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＡＣＧ；Ｈｐｈ−Ｒ配列番号１１３ ＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＴＡＧＣ；アクチン−Ｆ配列番号１１４ ＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＧＡＧＣＴＡＣＣＣ；アクチン−Ｒ配列番号１１５ ＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧ）を用いて、ＥＬＰおよび内因性コントロール遺伝子、アクチンに対する各発現カセットに対するプローブをＥＴＩＰ構築物から増幅する。
単一コピーのＥＴＩＰのみを含む全植物から、ＥＴＩＰ配列を増幅および配列決定する。ＡＢＩ３７３０ｘＩ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＰＣＲ配列の直接シーケンシングによって、各Ｔ−ＤＮＡインサートの配列を解析する。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、Ｔ−ＤＮＡインサートをゲノムＤＮＡから増幅した。長さ約２Ｋｂｐの重複配列を増幅するために複数のプライマー対を用いて、Ｔ−ＤＮＡの増幅反応を完了する。各ＰＣＲ産物を複数のプライマーを用いてシーケンシングして完全な被覆率を確保する。ＰＣＲ反応を、エビアルカリホスファターゼおよびエンドヌクレアーゼＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理して、シーケンシングＰＣＲ反応の前に過剰のプライマーを不活性化する。各々の単一コピーＥＴＩＰ系のＴ−ＤＮＡインサートに隣接する配列を、別々に８つの制限エンドヌクレアーゼを用いた精製ゲノムＤＮＡの消化、引き続いて、制限エンドヌクレアーゼによって作成されたオーバーハングに特異的な二本鎖アダプターのライゲーションによって同定する。このライゲーション工程後、ＥＴＩＰの３’または５’末端のいずれかに対するビオチン化プライマー、および各アダプターに対するプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物をＡｍｐｕｒｅ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）ビーズ（商標）（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）上に捕捉し、洗浄する。ネステッドＰＣＲを行い、ＡＢＩ Ｓａｎｇｅｒ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇおよびＢｉｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１サイクル（商標）シーケンシングプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて全ての産物をシーケンシングする。配列データを、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いてアセンブルおよび分析する。
ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびｐＤＡＳ０００２７１〜ＰＤＡＳ０００２７５ ＥＴＩＰ構築物を用いて形質転換したＥＴＩＰトランスジェニックアブラナの結果
ＥＴＩＰおよびＺＦＮ構築物の形質転換を介して産生したトランスジェニックセイヨウアブラナイベントは、単一コピーの組込み、ＦＡＤ３Ａ座へのｐＤＡＳ０００２７３またはｐＤＡＳ２７５からの、およびＦＡＤ３Ｃ座へのｐＤＡＳ０００２７１、ｐＤＡＳ０００２７２またはｐＤＡＳ０００２７４からのＥＴＩＰポリヌクレオチド配列の全長Ｔ鎖挿入をもたらす。３〜４つのイベントを完全に特徴付け、組込みＥＴＩＰを含むことを確認する。確認を、イン−アウトＰＣＲ増幅法を用いて完了し、サザンブロット法を介してさらに検証する。選択されたＴ０イベントをＴ１発達段階に成長させる。Ｔ１植物をスクリーニングして組み込まれたＴ鎖の接合状態を決定する。スクリーニングイベントをホモ接合性、ヘミ接合性または無として分類する。
ホモ接合性イベントを使用して、前記の方法を介してプロトプラストを産生する。その後、プロトプラストを、ＥＴＩＰ配列内に組み込まれたジンクフィンガー結合部位およびＥＴＩＰの特異的領域と相同性を共有するドナープラスミドを標的化するよう設計されたＺＦＮと同時形質転換する。ＺＦＮがＥＴＩＰ座を切断し、ドナープラスミドを相同組換え修復を介してセイヨウアブラナ細胞のゲノムに組み込む。ドナープラスミドの組込みの結果として、部分的ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子が全長ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子に修復される。ここで完全に作動性のＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子の発現を使用して、ＦＡＣＳ法によってプロトプラスト細胞をソーティングする。推定トランスジェニック植物を、実施例７に記載されるＦＡＣＳ法を用いてソーティングし、単離プロトプラストを成熟植物に再生する。分子確認法を用いて、ドナープラスミドのＥＴＩＰ標的化植物への組込みを確認する。よって、ＥＴＩＰ座は、ドナーポリヌクレオチド配列の遺伝子標的化組込みのための部位特異的座として働く。
実施例７：プロトプラスト細胞のＦＡＣＳに基づくソーティング
ＤＳ−Ｒｅｄコントロール構築物、ｐＤＡＳ００００３１を用いてトランスフェクトされたセイヨウアブラナプロトプラストを、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｆｌｕｘ−Ｃｅｌｌソーター（商標）（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いてＦＡＣＳ媒介細胞ソーティングを介してソートした。実施例３に記載されるように、プロトプラスト細胞を単離およびトランスフェクトした。細胞をｐＤＡＳ００００３１を用いてトランスフェクトした後、表７に記載される条件でＦＡＣＳソーターを用いて細胞をソートした。
ＤＳ−ｒｅｄ導入遺伝子を発現したプロトプラストをソートおよび単離した。ソーターを用いて、ＦＡＣＳ単離プロトプラストをカウントした。ＦＡＣＳ単離後１日目に、約１ｘ１０５〜１．８ｘ１０５個の細胞を２４ウェルマイクロタイタープレートのウェルに入れた。細胞を５〜２０日間ビーズ培養に移した。ＦＡＣＳ単離後２日目に、約１ｘ１０４個の細胞を２または４ウェルマイクロタイタープレートのウェルに入れた類似の条件を試験した。試験した種々の条件が、生存している細胞の回収または全単離プロトプラスト細胞の９５〜９８％をもたらした。ＦＡＣＳソーティングプロトプラスト細胞を３〜２０日間ビーズ培養に移した。ＦＡＣＳソーティングプロトプラスト細胞を、上記プロトコルを用いて、１．５ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含む培地上で植物に再生した。分子確認プロトコルを介して、推定トランスジェニック植物がｐＤＡＳ００００３１からの無傷Ｔ鎖インサートを含むことを確認した。
ＦＡＣＳソーティング法は、いずれの蛍光導入遺伝子配列をスクリーニングするためにも直接適用可能であり、これを用いてゲノム座中のＥＴＩＰ領域の特異的部位中の相同性媒介修復を介して蛍光導入遺伝子により標的化される一定割合のセイヨウアブラナプロトプラスト細胞を単離する。
実施例８：ＮＨＥＪを介したセイヨウアブラナω３脂肪酸デサチュラーゼ（Ｆａｄ３）への標的化組込みおよびその破壊
Ｆａｄ３ＣおよびＦａｄ３Ａに特異的なジンクフィンガー結合ドメインの選択
同祖Ｆａｄ３遺伝子についての転写領域を同定し、特徴付け、ジンクフィンガーヌクレアーゼを、ドナー配列のＮＨＥＪ媒介標的化のためにこれらの部位に結合し、これを切断するように設計した。 Ｆａｄ３配列のホモログからのＤＮＡ配列に向けられたジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）を、上記のように設計および試験した。オンターゲット活性を示すＺＦＮから、高効率でＦａｄ３標的を切断した２つのジンクフィンガータンパク質を選択した：ＺＦＰ２８０５１−２Ａ−２８０５２は配列番号２５５ ５’−ｇｃｃｃａａｇｇａａｃＣＣＴＴＴＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴｃｔｔｃｇＴＡＣＴＣＧＧＣＣＡＣＧａｃｔｇｇｔａａｔｔｔａａｔ−３’を認識し、これはＦａｄ３Ｃゲノム座に特異的に結合し、これを切断することが示された。同様に、ジンクフィンガータンパク質２８０５３−２Ａ−２８０５４は、配列番号２５６ ５’−ａｇｃｇａｇａｇａａＡＧＣＴＴＡｔＴＧＣＡＡＣＴＴＣａａｃｔａｃＴＴＧＣＴＧＧＴＣＧＡＴＣＧＴＧＴＴｇｇｃｃａｃｔｃ−３’を認識し、これはＦａｄ３ＡおよびＦａｄ３Ｃゲノム座に特異的に結合し、これを切断することが示された。表８では、代表的な標的部位が示されており；ＺＦＰ認識ヘリックスが接触する標的部位のヌクレオチドが大文字で示されており、非接触ヌクレオチドが小文字で示されている。Ｆａｄ３Ｃとは異なるＦａｄ３のコピーのヌクレオチドを下線によって識別する。ＺＦＰ認識ヘリックスが接触する標的部位のヌクレオチドを表８に示す。
ＦＡＤ３ＣおよびＦＡＤ３Ａに特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする発現ベクターの設計および構築
Ｆａｄ３ジンクフィンガー設計を、ＣＣＨＣ構造の少なくとも１つのフィンガーを有するタンパク質をコードするジンクフィンガー発現ベクターに組み込んだ（米国特許出願公開第２００８／０１８２３３２号明細書）。特に、各タンパク質の最後のフィンガーは、ヘリックス認識のためのＣＣＨＣ骨格を有していた。非標準ジンクフィンガーコード配列を、４つのアミノ酸ＺＣリンカーおよびｓｏｐ２核移行シグナルを介してＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメイン（Wah et al., (1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10564-10569のアミノ酸３８４〜５７９）に融合した。ゾセア・アシグナウイルスからの自己加水分解２Ａコードヌクレオチド配列（Szymczak et al., 2004）を、２つのＺＦＮ融合タンパク質の間に付加した。ＺＦＮの発現を、強い構成型プロモーターおよびキャッサバ葉脈モザイクウイルスに由来し（Verdaguer et al, Plant Molecular Biology 1996, 31(6); 1129-1139）、アグロバクテリウム・ツメファシエンスｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム２３（ＯＲＦ２３）（Barker et al., Plant Molecular Biology 1983, 2(6); 335-50）からの３’ＵＴＲ（転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む）に隣接する５’未翻訳領域（ＵＴＲ）によって駆動させた。
ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いてベクターをアセンブルした。制限エンドヌクレアーゼをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から得て、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＮＡライゲーションに使用した。供給業者の指示にしたがってＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）またはＰｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミド調製を行った。アガローストリス酢酸ゲル電気泳動後にＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡ断片を単離した。アセンブルしたプラスミドのコロニーを最初にミニプレップＤＮＡの制限消化によってスクリーニングした。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、商業的シーケンシング販売業者（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）によってシーケンシングした。配列データを、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いてアセンブルおよび分析した。得られたプラスミド構築物：ｐＤＡＢ１０７８２７（ＺＦＮ２８０５１−２Ａ−２８０５２、図１３、配列番号２７３）およびｐＤＡＢ１０７８２８（ＺＦＮ２８０５３−２Ａ−２８０５４、図１４、配列番号２７４）を、制限酵素消化およびＤＮＡシーケンシングを介して確認した。
ＮＨＥＪ指向ＤＮＡ修復のための「ドナー」ベクターの設計および構築
遺伝子スプライシング（発現カセットを単一ＺＦＮ誘導二本鎖の切れ目に組み込んだ）および遺伝子編集（遺伝子の一部を、２つのＺＦＮ誘導二本鎖の切れ目の使用によって除去し、発現カセットを挿入してギャップを修復した）の、ＤＮＡのＦａｄ３への組込みの２つの戦略を試みた。
遺伝子スプライシングまたは遺伝子編集の各組込み法のために、２つのベクターを構築した。第１のものはターボＧＦＰ（ｔＧＦＰ）遺伝子発現カセットをコードし、第２のものは抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を与える遺伝子発現カセットをコードした。ｔＧＦＰ発現カセットは、シロイヌナズナポリユビキチン１０（ＵＢＱ１０）遺伝子のプロモーター、５’未翻訳領域およびイントロン（Norris et al, Plant Molecular Biology 1993, 21(5), 895-906）、続いてｔＧＦＰコード配列（Evrogen, Moscow, Russia）を含んでいた。ｔＧＦＰコード配列は、双子葉植物における発現のためにコドン最適化されており、アグロバクテリウム・ツメファシエンスｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム２３（ＯＲＦ２３）の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’未翻訳領域（ＵＴＲ）であった（Barker et al, Plant Molecular Biology 1983, 2(6), 335-50）。ハイグロマイシン耐性遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）からの５’ＵＴＲ（Cook and Penon Plant Molecular Biology 1990 14(3), 391-405）、続いてハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）遺伝子（Kaster et al Nucleic Acids Research 1983 11 (19), 6895-6911）を含む１９Ｓプロモーターを含んでいた。ｈｐｈ遺伝子は、双子葉植物における発現のためにコドン最適化されており、アグロバクテリウム・ツメファシエンスｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＲが隣接していた（Barker et al, Plant Molecular Biology 1983, 2(6), 335-50）。両カセットは、商業的遺伝子合成販売業者（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｅｇｅｎｓｂｅｒｇ、ドイツ）によって合成された。
ベクターｐＤＡＢ１０７８２にコードされているＺＦＮによって標的化されるＺＦＮ認識配列の２つのタンデムコピーをクローニングすることによって、遺伝子スプライシング実験用のベクターを構築した。ベクターｐＤＡＢ１０７８２７およびｐＤＡＢ１０７８２８にコードされているＺＦＮによって標的化されるＺＦＮ認識配列の各々の１コピーをクローニングすることによって、遺伝子編集実験用のベクターを構築した。両方の場合で、２つのＺＦＮ認識配列を、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼのための認識配列によって分離した。ｔＧＦＰおよびＨＰＨカセットを各ベクターのＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位にクローニングして、４つの「ドナー」ベクター：ｐＤＡＳ０００３４０（ハイグロマイシン耐性遺伝子スプライシングドナー：配列番号２７５、図１５）、ｐＤＡＳ０００３４１（ｔＧＦＰレポーター遺伝子スプライシングドナー：配列番号２７６、図１６）、ｐＤＡＳ００３４２（ハイグロマイシン耐性遺伝子編集ドナー：配列番号２７７、図１７）およびｐＤＡＳ０００３４３（ｔＧＦＰレポーター遺伝子編集ドナー：配列番号２７８、図１８）を得た。
アセンブルしたプラスミドのコロニーを、大腸菌の一晩培養物から精製したＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化によって最初にスクリーニングした。制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（商標）（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）およびＰｒｏｍｅｇａ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＩ）から得た。供給業者の指示にしたがってＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）またはＰｕｒｅ Ｙｉｅｌｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＩ）を用いて、プラスミド調製を行った。制限断片を得られた断片のアガロースゲル電気泳動によって確認した後、選択したクローンのプラスミドＤＮＡを、ＡＢＩ Ｓａｎｇｅｒ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇおよびＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１（商標）サイクルシーケンシングプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてシーケンシングした。配列データを、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いてアセンブルおよび分析した。
プロトプラスト単離用植物材料の維持
葉肉由来プロトプラストを、セイヨウアブラナ（ＤＨ１０２７５）の３週齢滅菌シュート培養物から単離した。対応する種子を、本明細書に記載される方法にしたがって発芽させた。種子を、７０％エタノールを用いて１分間表面消毒し、穏やかに振盪し、引き続いて滅菌再蒸留水で３〜４回すすいだ。その後、２０％漂白剤および１０μｌのＴｗｅｅｎ２０を用いて種子を消毒した。種子を、約１００ＲＰＭで１５分間卓上型振盪機で漂白剤によりさらに処理し、引き続いて滅菌再蒸留水で３〜４回すすぎ、種子を滅菌濾紙に慎重に移して過剰な水分を除去し、種子発芽培地（１／２濃度のＭＳ／Ｂ５ビタミン＋１％スクロース＋０．８％寒天；ｐＨ５．８）に蒔いた。
約５０〜６０ｍＬの培地を各Ｐｅｔｒｉ（商標）皿（１５Ｘ１００ｍｍ）に注ぎ入れ、プレートを、支持体を用いてわずかな角度をつけて置いた。約５０個の種子を各プレートに入れた。プレートを１６時間／日の光（２０μｍｏｌｍ−２ｓ−１）下２２℃で６日間直立でインキュベートした。０．５ｃｍサイズの胚軸セグメントを、６日齢実生から切り裂き、シュート誘導培地（ＭＳ／Ｂ５ビタミン＋３％スクロース＋５００ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ＋ＢＡＰ（１３μｍ）＋ゼアチン（５μｍ）＋硝酸銀（５ｍｇ／Ｌ）＋０．８％寒天（ｐＨ５．８））上で培養した。培地を１００ｘ２０ｍｍ滅菌ＰＥＴＲＩ（商標）皿に注ぎ入れ、１プレート当たり約２０個の外植片を培地上に配置した。３〜４週間後に現れたシュート成長点をシュート伸長培地（ＭＳ／Ｂ５ビタミン＋２％スクロース＋５００ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ＋ＢＡＰ（２μｍ）＋ＧＡ−３（０．１μｍ）＋０．８％寒天（ｐＨ５．８）、および２５０ｍＬ培養容器に注ぎ込んだ）に移し、培養物を間に１ラウンドの継代培養を含む４週間、この培地に維持した。次いで、２〜３ｃｍ高さのシュートを、根の発育のために根発生培地（１／２濃度のＭＳ／Ｂ５ビタミン＋１％スクロース＋５００ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ＋ＩＢＡ（２．５μｍ）＋０．６％寒天（ｐＨ５．８）、および７００ｍＬ培養容器に注ぎ込んだ）に移した。根づいたシュートを、使用前に２〜３ラウンドの間、茎挿しとして３〜４週間の間隔で、新鮮な根発生培地中で継代培養した。培養物を１６時間／日の光（３０μｍｏｌｍ−２ｓ−１）下２２℃で終始維持した。
葉肉プロトプラストの単離および精製
インビトロで成長させたＤＨ１２０７５セイヨウアブラナ植物を、葉肉プロトプラストを単離するための外植片源として使用した。プロトプラストを単離するために、３〜４週齢の小植物からの第３〜第４の上完全展開葉を、鋭利なメスを用いてプロトプラスト単離用の小片（０．５〜１ｍｍ）に切断した。葉材料２５０〜５００ｍｇを消化バッファ（Ｋ４培地に溶解した１．２％（ｗ／ｖ）セルラーゼ「Ｏｎｏｚｕｋａ（商標）」Ｒ１０および０．２％（ｗ／ｖ）Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ（登録商標）Ｒ１０（Spangenberg et al., 1998））２５ｍＬで処理することによって、酵素消化を行った。葉材料および消化バッファを含むＰＥＴＲＩ（商標）皿をＰａｒａｆｉｌｍ（商標）で密閉し、暗所中室温で１２〜１５時間インキュベートした。一晩のインキュベーション後、消化物を、ＢＤ（登録商標）セルストレーナー（メッシュサイズ７０μｍ）を通して濾過した。１４ｍＬ丸底チューブに回収したプロトプラスト懸濁液（５〜６ｍＬ）に、Ｗ５洗浄バッファ（１５４ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌおよび５ｍＭグルコース；ｐＨ５．８ Menzel et al.(1981)）１ｍＭを重ねた。
プロトプラスト懸濁液を４００ＲＰＭで１０分間さらに遠心分離した。遠心分離後、界面相に浮遊したプロトプラストを引き込み、Ｗ５バッファ１０ｍＬを用いて４００ＲＰＭで１０分間の遠心分離によって洗浄した。最後の洗浄後、単離プロトプラストを、Ｗ５バッファ１ｍＬ当たり１Ｘ１０６個のプロトプラストの密度で再懸濁し、トランスフェクション前に１時間インキュベートした。
プロトプラスト収率および生存率の評価
Sambrook and Russell, (2006)の方法にしたがって、血球計算器を用いてプロトプラスト収率を評価した。プロトコルにわずかな小さい修正をしてHuang et al.(1996)によって記載されているように、０．５Ｍのマンニトールに溶解した４００ｍｇ／Ｌのエバンスブルー染色剤を用いて細胞生存率を試験した。
ＰＥＧ４０００媒介ＤＮＡ送達
セイヨウアブラナプロトプラストに送達する前に、各ドナーおよびＺＦＮ構築物のプラスミドＤＮＡを、供給業者の指示にしたがってＰｕｒｅ Ｙｉｅｌｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて大腸菌の培養物から調製した。ドナーおよびＺＦＮプラスミドＤＮＡのアリコートを３つのモル比で調製した：１：１（各プラスミド３０μｇ）、５：１（プラスミドＤＮＡ計３０μｇに対するドナープラスミド：ＺＦＮプラスミド）および１０：１（プラスミドＤＮＡ計３０μｇに対するドナープラスミド：ＺＦＮプラスミド）。さらに、ドナーのみおよびＺＦＮのみのアリコート（３０μｇ）をコントロールとして調製した。ＰＥＧ４０００媒介形質転換を介してセイヨウアブラナプロトプラストに送達されたＤＮＡの量を表９に要約する。
プラスミドＤＮＡの各アリコートを、形質転換バッファ（１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）および０．５Ｍマンニトール；ｐＨ５．８）１００μｌ、引き続いてＰＥＧ溶液（０．４Ｍマンニトールおよび０．１Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２中４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００（ｐＨ６〜７）Spangenberg and Potrykus (1995)）１５０μｌに懸濁した１００万個のプロトプラスト（生存率≧９５）に適用した。室温で１０〜１５分のインキュベーション後、Ｗ５バッファ５ｍＬを滴加し、プロトプラストを穏やかに混合した。Ｗ５バッファさらに５ｍＬを緩流としてプロトプラスト懸濁液に添加した。プロトプラストを穏やかに混合し、４００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、Ｗ５上清を慎重に除去してペレットの形態のプロトプラストを残した。次いで、トランスフェクトプロトプラストを、ビーズ型培養物に包埋するまで室温でＷ５バッファ１ｍＬ中でインキュベートした。トランスフェクトプロトプラストは、以下に記載されるアルギン酸ナトリウム法にしたがって包埋した。
生存可能なミクロカルス（microcalli）を回収するための葉肉由来プロトプラストの培養
培地中に包埋する前に、トランスフェクトプロトプラストを４００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、Ｗ５バッファを慎重に除去した。次いで、プロトプラストを０．５Ｍマンニトール１．０ｍＬに再懸濁し、氷上でインキュベートした。プロトプラスト溶液に、等体積の１．０％アルギン酸ナトリウムを添加し、穏やかに混合した。プロトプラスト懸濁液を、包埋するまで氷中でインキュベートした。ビーズ形成溶液（０．４Ｍマンニトール＋５０ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ５．８））を、血清ピペットを用いて滅菌６ウェルプレートに移した（１ウェル当たり３〜４ｍＬ）。正確に１．０ｍＬのプロトプラスト懸濁液を、１ｍＬピペットを用いてビーズ形成溶液に滴加し、各トランスフェクトサンプル（約５ｘ１０５個のプロトプラスト）を１ウェル当たりに包埋させた。プロトプラスト懸濁液を室温で１〜２時間インキュベートしてアルギン酸ナトリウムビーズを形成した。インキュベーション期間後、ビーズ形成溶液を慎重に取り出し、１．５ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを補充したＫ３＋Ｈ：Ａの１：２混合物培地（Spangenberg et al 1998）４〜５ｍＬと交換した。プロトプラストを振盪機（５０ＲＰＭ）において暗所中２２℃で３〜４週間培養した。３〜４週間後、脱重合バッファ（０．３Ｍマンニトール＋２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．８））で処理することによって、耐性ミクロカルス（０．５〜１．０ｍｍ）を放出した。液体培地を除去した後、脱重合バッファ３〜４ｍＬを、ビーズ型培養物を含む各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。滅菌鉗子を用いて、ビーズを穏やかに混合してミクロカルスの効率的な放出を強化した。次に、滅菌１．０ｍＬピペットを使用して、ゲル化剤を穏やかに混合し、これを脱重合バッファに放出させ、その後除去した。ミクロカルスを、液体Ａ培地５ｍＬを用いて２回洗浄し、ミクロカルスを十分な量の液体Ａ（液体Ａ ５０ｍＬを設定された細胞体積（ＳＣＶ：これは全ての放出されたミクロカルスを滅菌５０または１５ｍＬファルコンチューブに移し、５分間沈降させた後に測定した）１ｍＬに使用した）に再懸濁した。ミクロカルスを均一に混合した後、液体Ａ培地中に懸濁したミクロカルス０．５ｍＬをＢ１培地（ＭＳ／ＭＳ ビタミン＋３．５％スクロース＋５００ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ＋ＢＡＰ（５μｍ）＋ＮＡＡ（５μｍ）＋２，４−Ｄ（５μｍ）＋１．５ｍｇ／Ｌハイグロマイシン＋０．７％アガロースＩ型（ｐＨ６．０）および１００ｘ２０ｍｍ滅菌ＰＥＴＲＩ（商標）皿に注ぎ込んだ）に移し、さらなる液体Ａ培地１〜２ｍＬを用いて、ミクロカルスをＢ１培地に均一に分配し、過剰の液体Ａ培地を各プレートから慎重に除去した。微小孔テープを用いてプレートを密閉し、胚成熟を強化した。培養物を１６時間／日の光（３０μｍｏｌｍ−２ｓ−１）下２２℃で維持した。
葉肉由来プロトプラストからのシュートの増殖および再生
ハイグロマイシン耐性コロニーを、２〜３週間のインキュベーション後にＢ１培地（ＳＡ法とＳＰ法の両方に由来するマイクロカルス）から選抜し、Ｂ２培地（ＭＳ／ＭＳ ビタミン＋３．０％スクロース＋５００ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ＋５００ｍｇ／Ｌ ＰＶＰ＋５ｍｇ／Ｌ硝酸銀＋５ｍｇ／Ｌ ２ｉＰ＋ＮＡＡ（０．５μｍ）＋ＧＡ−３（０．３μｍ）＋１．５ｍｇ／Ｌハイグロマイシン＋０．７％アガロースＩ型（ｐＨ５．８）および１００ｘ２０ｍｍ滅菌ＰＥＴＲＩ（商標）皿に注ぎ込んだ）に移した。１プレート当たり約２５〜３０個のカルスを配置し、Ｐａｒａｆｉｌｍ（商標）を用いてプレートを密閉し、１６時間／日の光（３０μｍｏｌｍ−２ｓ−１）下２２℃でインキュベートした。その後、５〜６ラウンドのＢ２培地中２週間間隔での継代培養後に、ハイグロマイシン耐性コロニーを回収した。第３ラウンドの継代培養後に、１プレート当たりのカルスの数を１２〜１５に減少させた。１０〜１２週間後に現れるシュート原基を残りのカルスと一緒に慎重に回収し、シュート伸長培地（ＭＳ／Ｂ５ビタミン＋２％スクロース＋５００ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ＋ＢＡＰ（２μｍ）＋ＧＡ−３（０．１μｍ）＋３００ｍｇ／Ｌチメンチン＋１．５ｍｇ／Ｌハイグロマイシン＋０．８％寒天（ｐＨ５．８）および２５０ｍＬ培養容器に注ぎ込んだ）に移した。２〜３ラウンドのハイグロマイシン選択後に生存しているシュートを、発根培地（１／２濃度のＭＳ／Ｂ５ビタミン＋１％スクロース＋５００ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ＋ＩＢＡ（２．５μｍ）＋１．５ｍｇ／Ｌハイグロマイシン＋０．６％寒天（ｐＨ５．８）および７００ｍＬ培養容器に注ぎ込んだ）に移した。
葉肉プロトプラストからのゲノムＤＮＡの単離
トランスフェクトプロトプラストを３ｃｍＰＥＴＲＩ（商標）皿から２ｍＬマイクロチューブに移した。７０ｇでの遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を除去した。トランスフェクトプロトプラストの回収を最大化するために、ＰＥＴＲＩ（商標）皿を洗浄バッファ１ｍＬで３回すすいだ。各すすぎは、ＰＥＴＲＩ（商標）皿中の洗浄バッファを１分間旋回し、引き続いて、液体を同じ２ｍＬのマイクロチューブに移すことによって行った。各すすぎの最後に、７０ｇでの遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を除去した。ペレット化プロトプラストを、−４０℃および１３３ｘ１０−３ｍＢａｒ圧力でＬａｂｃｏｎｃｏ Ｆｒｅｅｚｏｎｅ ４．５（登録商標）（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）中２４時間凍結乾燥する前に、液体窒素中で瞬間凍結した。凍結乾燥細胞を、組織破壊を要さず、プロトプラスト細胞を溶解バッファに直接添加したことを除いて、製造業者の指示にしたがってＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたＤＮＡ抽出に供した。
カルス組織からのゲノムＤＮＡの単離
個々のカルスを、−４０℃および１３３ｘ１０−３ｍＢａｒ圧力でＬａｂｃｏｎｃｏ Ｆｒｅｅｚｏｎｅ ４．５（登録商標）（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）中２４時間凍結乾燥する前に、液体窒素中で瞬間凍結した。凍結乾燥カルスを、製造業者の指示にしたがってＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を用いたＤＮＡ抽出に供した。
葉組織からのゲノムＤＮＡの単離
再生植物からの若葉組織３０ｍｇを、−４０℃および１３３ｘ１０−３ｍＢａｒ圧力でＬａｂｃｏｎｃｏ Ｆｒｅｅｚｏｎｅ ４．５（登録商標）（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）中２４時間凍結乾燥する前に、液体窒素中で瞬間凍結した。凍結乾燥カルスを、製造業者の指示にしたがってＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を用いたＤＮＡ抽出に供した。
ＦＡＤ３ＣのＮＨＥＪ媒介スプライシングおよび編集のためのゲノムＤＮＡのＰＣＲアッセイ
セイヨウアブラナのＦａｄ３Ｃ遺伝子へのドナーＤＮＡの組込みの検出を一連のＰＣＲで行い、ここでは少なくとも１つのプライマーがＦａｄ３Ｃ座と特異的であり（表１０）、第２のプライマーがｇｆｐカセットのプロモーターまたはターミネーターのいずれかと特異的であった（表１０および図１９（Ａ））。最後の塩基対が、Ｆａｄ３Ｃゲノム配列をＦａｄ３遺伝子の他のコピーと区別し、アステリスク［＊］によって示されるこの塩基対の前にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むＳＮＰに整列したオリゴヌクレオチドを設計することによって、特異性を得た。この設計は、プルーフリーティング活性を有するポリメラーゼと組み合わせて使用すると、各Ｆａｄ３ＣまたはＦａｄ３Ａ対立遺伝子の特異的増幅を指示し、注記される他のＦａｄ３コピーを除外した。各プライマーセットを、野生型セイヨウアブラナから得られたＰＣＲ増幅産物のＳａｎｇｅｒシーケンシングを通した正しい遺伝子コピーの増幅について経験的に試験した。
プロトプラストにおける非相同末端結合によるＦＡＤ３Ｃへの遺伝子付加の検出
機能的ｔＧＦＰレポーターカセットをコードするドナーＤＮＡ（ｐＤＡＳ０００３４１またはｐＤＡＳ０００３４３）、ＺＦＮ ＤＮＡ（ｐＤＡＢ１０７８２７またはｐＤＡＢ１０７８２８）またはドナーとＺＦＮ ＤＮＡの混合物が２４時間前に送達されたプロトプラストプール（１プール当たり１００万個のプロトプラスト）からゲノムＤＮＡを抽出した。形質転換のために送達されたＤＮＡの量は上に記載される。ＰＣＲ産物をプラスミドベクターにクローニングした。プラスミドベクターにクローニングすることによって、ゲノム編集が各細胞で独立に起こり、種々の異なる挿入イベントをもたらし、各ゲノム編集を曖昧さなしにシーケンシングすることができる。いくつかのクローンをＡＢＩ３７３０ＸＬ（登録商標）自動化キャピラリー電気泳動プラットホームでシーケンシングした。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ＳＯＦＴＷＡＲＥ ｖ５．０（商標）（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて遺伝子配列の解析を行った。
編集またはスプライシングによるＦａｄ３Ｃ座への遺伝子付加の証拠は、表１０に記載されるプライマーを用いた、プロトプラストから抽出したゲノムＤＮＡからの５’と３’の両方のＦａｄ３Ｃカセットジャンクションの増幅によって提供された。プライマー「ＦＡＤ３ＣＮＨＥＪ−Ｌ４−Ｆ２」および「ＡｔＵｂｉＮＨＥＪ−Ｒ１」を用いたＰＣＲ増幅の産物を完成させてｔＧＦＰカセットおよびＦａｄ３Ｃの５’ジャンクションを増幅した。プライマー「ＦＡＤ３ＣＮＨＥＪ−Ｌ４−Ｒ２」および「ＡｔＯＲＦｔ２３ＮＨＥＪ−Ｆ１」を用いたＰＣＲ増幅を完成させてｔＧＦＰカセットおよびＦａｄ３Ｃの３’ジャンクションを増幅した。プライマー「ＦＡＤ３ＣＮＨＥＪ−Ｌ４−Ｆ２」および「ＦＡＤ３ＣＮＨＥＪ−Ｌ４−Ｒ２」を用いたＰＣＲ増幅を完成させてＺＦＮ２８０５１−２Ａ−２８０５２によって誘導される二本鎖切断を増幅した。ＺＦＮプラスミドまたはドナープラスミドのみ送達されたプロトプラストからは増幅が観察されなかった。全てのジャンクション配列は、ＮＨＥＪ媒介修復経路を介したＦａｄ３Ｃ座におけるｔＧＦＰカセットの挿入を示した。ゲノムおよびカセットのいずれかまたは両方からの種々の長さの欠失、ならびにゲノムとカセットとの間に挿入されているベクター骨格に由来する配列（ドナーまたはＺＦＮからのいずれか）の付加が観察された（図２０Ａおよび図２０Ｂ）。
プロトプラストから再生したカルス組織中の非相同末端結合によるＦＡＤ３Ｃへの遺伝子付加の検出
Ｆａｄ３Ｃ座のスプライシングおよび編集のさらなる証拠を、ｈｐｈカセットをコードするドナーＤＮＡ（ｐＤＡＳ０００３４０またはｐＤＡＳ０００３４２）、ＺＦＮ ＤＮＡのみ（ｐＤＡＢ１０７８２７またはｐＤＡＢ１０７８２８）、またはドナーとＺＦＮ ＤＮＡが送達された（送達されたＤＮＡの量は表９に示されている）選択した（上記のように１．５ｍｇ／Ｌハイグロマイシン）プロトプラストから再生されたカルス組織から得た。１：１：１の編集を除いて（これについてはプロトプラストトランスフェクション４週間後に生存したカルスがなかった）、各比について約８０個のカルスからＤＮＡを抽出した。
ｈｐｈカセットのセイヨウアブラナゲノムへの組込み（ｆｗａｔ Ｆａｄ３Ｃまたはランダム）を、ｈｐｈ遺伝子に特異的なプライマー（配列番号２９４；Ｆ−５’ＣＴＴＡＣＡＴＧＣＴＴＡＧＧＡＴＣＧＧＡＣＴＴＧ３’、配列番号２９５；Ｒ−５’ＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴＡＡＣＧ３’）およびプローブ（配列番号２９６；５’ＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧ３’）を用いたＴａｑｍａｎ（商標）ｑＰＣＲによって確認した。これらのプライマー−プローブ対を、Ａゲノム上に単一コピーとして存在する（Weng et al., 2004, Plant Molecular Biology Reporter）、セイヨウアブラナ高移動群タンパク質Ｉ／Ｉ（ＨＭＧ Ｉ／Ｙ）に特異的なプライマー（配列番号２９７；Ｆ−５’ＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＧＴＧＧＡＡＧＧ３’、配列番号２９８；Ｒ−５’ＴＴＣＧＡＴＴＴＧＣＴＡＣＡＧＣＧＴＣＡＡＣ３’）およびプローブ（配列番号２９９；５’ＡＧＧＣＡＣＣＡＴＣＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＣＴ３’）との二重反応に使用した。ＣＦＸ９６またはＣＦ３８４リアルタイムＰＣＲ検出システム（商標）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によりＣ１０００サーマルサイクラーで増幅を行った。ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ（商標）（ＢｉｏＲａｄ）ソフトウェアパッケージを用いて結果を解析した。ゲノムに挿入されたｈｐｈカセットのコピー数の推定を提供する２−ΔΔＣｔ法（Livak and Schmittgen, 2001）にしたがって、相対的定量化を計算した。
Ｆａｄ３ＣのＮＨＥＪ媒介スプライシングおよび編集の証拠を、Ｆａｄ３Ｃに特異的な１プライマー、およびｈｐｈカセットのプロモーターまたはターミネーターのいずれかに特異的な第２のプライマーを用いてＰＣＲアッセイを行うことによって得た（表９および図１９（Ｂ））。カルス組織から得られたＤＮＡの量が限定されているために、センス配向の組込みのみをアッセイした。ＰＣＲ産物を、ＱｉａＱｕｉｃｋ ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製し、直接Ｓａｎｇｅｒシーケンシング法を用いてシーケンシングした。シーケンシング産物を、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ｖ３．１プロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にしたがってエタノール、酢酸ナトリウムおよびＥＤＴＡを用いて精製し、上記のようにシーケンシングおよび解析した。
各実験においてドナーカセットを含むカルスの数を表１１に示す。編集および／またはスプライシングによるＦａｄ３Ｃ座へのドナー遺伝子付加の証拠は、ＺＦＮ切断部位および５’と３’の両方のＦａｄ３Ｃ−ｈｐｈカセットジャンクションにわたるＰＣＲ増幅（表１０に示されるプライマーを用いる）によって提供された。ｈｐｈプラスミドのみ（ｐＤＡＳ０００３４０およびｐＤＡＳ０００３４２）またはＺＦＮプラスミドのみ（ｐＤＡＢ１０７８２７およびｐＤＡＢ１０７８２８）を用いて形質転換されたコントロールプロトプラストから回収したカルス組織から単離したゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ増幅産物の産生をもたらさなかった。
５’および３’Ｆａｄ３Ｃ−ｈｐｈカセットジャンクションの増幅から産生されたＰＣＲアンプリコンを、アガロースゲルから精製し、シーケンシングしてＦａｄ３Ｃゲノム座への組込みの特異性を確認した。ＰＣＲ産物のシーケンシング解析の結果は、個々の形質転換されたプロトプラストから産生された各単離カルスが単一ＰＣＲ増幅産物のみを産生し、混合遺伝子型の細胞を含まないことを示した。
Ｆａｄ３Ｃゲノム座へのドナー配列のＮＨＥＪ媒介組込み実験では、（標的座から増幅されているドナーＤＮＡベクターのいずれかの部分によって定義される）標的座への付加の頻度は、１：１、５：１および１０：１（ドナーＤＮＡ：ＺＦＮ ＤＮＡ）のＤＮＡ濃度についてそれぞれ４２％、４６％および３２％であった。表１２を参照されたい。両カセットジャンクションが増幅可能であるかどうかアッセイすることによって、またＰＣＲ産物のシーケンシングからオンターゲットスプライシングの頻度を決定した。これらの結果は、カセットが正しい配向で標的部位において挿入されていることを証明した。組込みの頻度は、１：１、５：１および１０：１のドナープラスミドＤＮＡ：ＺＦＮプラスミドＤＮＡ濃度についてそれぞれ４％、３％および３％と計算された。遺伝子編集実験では、標的座から増幅されているドナーＤＮＡベクターのいずれかの部分によって定義される標的座への付加の頻度は、５：１：１および１０：１：１のドナープラスミドＤＮＡ：ＺＦＮプラスミドＤＮＡ濃度についてそれぞれ６６％および６５％であった。表１３を参照されたい。増幅可能である両カセットジャンクションおよびＰＣＲ産物の配列を産生することによってオンターゲット編集の頻度を決定した。これらの結果は、カセットが、５：１：１および１０：１：１のドナープラスミドＤＮＡ：ＺＦＮプラスミドＤＮＡ濃度についてそれぞれ３％および６％の頻度で、正しい配向で標的座において挿入されていることを証明した。プロトプラストアッセイで観察されるように、ＺＦＮによるゲノム座の切断の結果として、ゲノムとカセットとの間で塩基対が欠失した、または追加の塩基が挿入された（図２１〜２２）。
特定の例では、ＰＣＲ産物が、標的座へのヌクレオチド配列の付加、無ＰＣＲ産物、または野生型サンプルで観察されるより大きなＰＣＲ産物をもたらした。切断部位に隣接するプライマーを用いたＰＣＲ増幅から産生されたこれらの結果は、染色体の両対で座が破壊されたことを示した（図２１〜２２）。例のいくつかでは、２つ以上のバンドがスプライスジャンクションで増幅され（図２１〜２２）、ゲノムの各コピーで独立して異なる挿入が起こったことを示している。
プロトプラストから再生し、ポッティング培地（上記）に移した植物からＤＮＡを抽出した。回収した植物の大多数が、ドナーＤＮＡにコードされているｈｐｈカセットの１〜２コピーしか含まないと推定された。植物を、カルス組織について記載したのと同じ組のアッセイおよびカセットがＦａｄ３Ａ座においてアンチセンス配向でまたはドナー組込みで挿入されたかどうかを決定するためのアッセイによって分析した。
ｈｐｈカセットがいずれかの方向でＦａｄ３Ｃに挿入された線状ドナー設計構築物についてのオンターゲットスプライシングの頻度は、１：１、５：１および１０：１のドナーＤＮＡ：ＺＦＮ ＤＮＡについてそれぞれ５１％、３２％および５６％であった（表１５）。これらの結果うち、３５％、３２％および５０％（１：１、５：１および１０：１）が順方向配向に挿入された（表１５）。
４座から６座に領域を置換する、ｈｐｈカセットがいずれかの方向でＦａｄ３Ｃに挿入されたオンターゲット編集の頻度は、５：１：１および１０：１：１のドナーＤＮＡ：ＺＦＮ ＤＮＡ：ＺＦＮ ＤＮＡについてそれぞれ２％および０％であった（表１６）。さらに、両ＺＦＮを５：１：１で送達した場合、２％が４座にスプライシングされ、１０％が６座にスプライシングされ、また両ＺＦＮを１０：１：１で送達した場合、１０％が４座にスプライシングされ、１５％が６座にスプライシングされた。ＰＣＲアンプリコンを得て、シーケンシングしてインサートジャンクション配列を決定した。特異的に標識された植物について得られた配列を表１７に記載する。
ｈｐｈカセットが環状ドナーについていずれかの方向でＦａｄ３Ｃに挿入されたオンターゲットスプライシングの頻度は、１：１、５：１および１０：１についてそれぞれ５１％、３２％および５６％であった（表１８；図２３）。これらのうち、３５％、３２％および５０％（１：１、５：１および１０：１）が順方向配向に挿入された（表１８）。
４座から６座に領域を置換する、ｈｐｈカセットがいずれかの方向でＦａｄ３Ｃに挿入されたオンターゲット編集の頻度は、５：１：および１０：１：１についてそれぞれ２％および０％であった（表１９；図２４）。さらに、両ＺＦＮを５：１：１で送達した場合、２％が４座にスプライシングされ、１０％が６座にスプライシングされ、また両ＺＦＮを１０：１：１で送達した場合、１０％が４座にスプライシングされ、１５％が６座にスプライシングされた。
ｔＧＦＰおよびＨＰＨカセットを含むドナーベクターを、１ｋｂのＦＡＤ３上流および下流ドナー配列を含むように改変する。ＦＡＤ３上流および下流ドナー配列は野生のＦＡＤ３配列配列と１００％同一であり、ＦＡＤ３ジンクフィンガー結合部位から得られる；ＧｃｃｃａａｇｇａａｃＣＣＴＴＴＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴｃｔｔｃｇＴＡＣＴＣＧＧＣＣＡＣＧａｃｔｇｇｔａａｔｔｔａａｔ（配列番号２５５）またはａｇｃｇａｇａｇａａＡＧＣＴＴＡｔＴＧＣＡＡＣＴＴＣａａｃｔａｃＴＴＧＣＴＧＧＴＣＧＡＴＣＧＴＧＴＴｇｇｃｃａｃｔｃ（配列番号２５６）。得られた４つの「ドナー」ベクターは、ｐＤＡＳ０００３４０（ハイグロマイシン耐性遺伝子スプライシングドナー）、ｐＤＡＳ０００３４１（ｔＧＦＰレポーター遺伝子スプライシングドナー）、ｐＤＡＳ００３４２（ハイグロマイシン耐性遺伝子編集ドナー）およびｐＤＡＳ０００３４３（ｔＧＦＰレポーター遺伝子編集ドナー）に類似であり、わずかな改変は、１ＫｂのＦＡＤ３ゲノム上流および下流配列の包含である。ＮＨＥＪ媒介組込みについて前記のジンクフィンガーヌクレアーゼプラスミド（ｐＤＡＢ１０７８２７およびｐＤＡＢ１０７８２８）をＨＤＲ媒介組込みに使用する。
セイヨウアブラナの形質転換
葉肉由来プロトプラストを上記のようにセイヨウアブラナ（ＤＨ１０２７５）植物から単離および調製する。プロトプラストを、精製プラスミドＤＮＡを用いて形質転換する。ドナーおよびＺＦＮプラスミドＤＮＡのアリコートを３つのモル比で調製する：１：１（各プラスミド３０μｇ）、５：１（プラスミドＤＮＡ計３０μｇに対するドナープラスミド：ＺＦＮプラスミド）および１０：１（プラスミドＤＮＡ計３０μｇに対するドナープラスミド：ＺＦＮプラスミド）。さらに、ドナーのみおよびＺＦＮのみのアリコート（３０μｇ）をコントロールとして調製する。ＰＥＧ４０００媒介形質転換を介してセイヨウアブラナプロトプラストに送達されたＤＮＡの量を表２０に要約する。形質転換プロトプラスト細胞を前記のように培養し、ここでは選択培地はグルホシネート選択培地とし、推定形質転換体を導入遺伝子挿入についてｑＰＣＲ解析を介してアッセイする。
プロトプラストにおけるＨＤＲによるＦＡＤ３への遺伝子付加の検出
機能的レポーターカセットもしくは選択可能なマーカーカセットをコードするドナーＤＮＡ、ＺＦＮ ＤＮＡまたはドナーとＺＦＮ ＤＮＡの混合物が２４時間前に送達されたプロトプラストプール（１プール当たり１００万個のプロトプラスト）からゲノムＤＮＡを抽出する。形質転換のために送達されたＤＮＡの量は上に記載される。ＰＣＲ産物をプラスミドベクターにクローニングする。プラスミドベクターにクローニングすることによって、ゲノム編集が各細胞で独立に起こり、種々の異なる挿入イベントをもたらし、各ゲノム編集を曖昧さなしにシーケンシングすることができる。いくつかのクローンをＡＢＩ３７３０ＸＬ（登録商標）自動化キャピラリー電気泳動プラットホームでシーケンシングする。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ＳＯＦＴＷＡＲＥ ｖ５．０（商標）（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて遺伝子配列の解析を行う。
編集またはスプライシングによるＦａｄ３座への遺伝子付加の証拠は、プロトプラストから抽出したゲノムＤＮＡからの５’と３’の両方のＦａｄ３カセットジャンクションの増幅によって提供される。ＺＦＮプラスミドまたはドナープラスミドのみ送達されたプロトプラストからは増幅が観察されない。全てのジャンクション配列は、ＨＤＲ媒介修復経路を介したＦＡＤ３座におけるカセットの挿入を示している。ゲノムおよびカセットのいずれかまたは両方からの種々の長さの欠失、ならびにゲノムとカセットとの間に挿入されているベクター骨格に由来する配列（ドナーまたはＺＦＮからのいずれか）の付加が観察される。
プロトプラストから再生したカルス組織中のＨＤＲによるＦＡＤ３への遺伝子付加の検出
ＦＡＤ３座のスプライシングおよび編集のさらなる証拠を、カセットをコードするドナーＤＮＡ、ＺＦＮ ＤＮＡのみ、またはドナーとＺＦＮ ＤＮＡが送達されたプロトプラストから再生されたカルス組織から得た。各比について約８０個のカルスからＤＮＡを抽出する。
セイヨウアブラナゲノムへのカセットの組込みを、ドナーインサートおよびゲノム隣接配列に特異的なプライマーおよびプローブを用いたＴａｑｍａｎ（商標）ｑＰＣＲによって確認する。ゲノムに挿入されたカセットのコピー数の推定を提供する２−ΔΔＣｔ法（Livak and Schmittgen, 2001）にしたがって、相対的定量化を計算する。ＦＡＤ３のＮＨＥＪ媒介スプライシングおよび編集の証拠を、ＦＡＤ３に特異的な１プライマー、およびカセットのプロモーターまたはターミネーターのいずれかに特異的な第２のプライマーを用いてＰＣＲアッセイを行うことによって得る。ＰＣＲ産物を、ＱｉａＱｕｉｃｋ ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製し、直接Ｓａｎｇｅｒシーケンシング法を用いて配列決定する。シーケンシング産物を、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ｖ３．１プロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にしたがってエタノール、酢酸ナトリウムおよびＥＤＴＡを用いて精製し、上記のように配列決定および解析する。
各実験においてドナーカセットを含むカルスの数を決定する。編集および／またはスプライシングによるＦＡＤ３座へのドナー遺伝子付加の証拠は、ＺＦＮ切断部位および５’と３’の両方のＦＡＤ３−カセットジャンクションにわたるＰＣＲ増幅によって提供される。プラスミドのみまたはＺＦＮプラスミドのみを用いて形質転換されたコントロールプロトプラストから回収したカルス組織から単離したゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ増幅産物の産生をもたらさない。
５’および３’ＦＡＤ３−カセットジャンクションの増幅から産生されたＰＣＲアンプリコンを、アガロースゲルから精製し、シーケンシングしてＦＡＤ３ゲノム座への組込みの特異性を確認する。ＰＣＲ産物のシーケンシング解析の結果は、個々の形質転換されたプロトプラストから産生される各単離カルスが単一ＰＣＲ増幅産物のみを産生し、混合遺伝子型の細胞を含まないことを示す。
植物におけるＨＤＲによるＦＡＤ３への遺伝子付加の検出
プロトプラストから再生し、ポッティング培地に移した植物からＤＮＡを抽出する。回収した植物の大多数が、ドナーＤＮＡにコードされているカセットの１〜２コピーしか含まないと推定される。植物を、カルス組織について記載したのと同じ組のアッセイおよびカセットがＦＡＤ３座に挿入されたかどうかを決定するためのアッセイによって分析する。
カセットがＦＡＤ３座に挿入されているオンターゲットスプライシングの頻度を、上記ＰＣＲアッセイを用いて決定する。得られたアンプリコンバンドをシーケンシングして隣接配列を決定する。さらに、植物をオフターゲット挿入についてスクリーニングして、ＦＡＤ３以外の部位におけるカセットの組込みの頻度を決定する。
実施例９：農学的に重要な遺伝子を用いたセイヨウアブラナω３脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ３）の標的化組込み
除草剤グリホサートに対する耐性を与えるＤＧＴ−２８導入遺伝子（参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第２０１３／１１６７００号パンフレット）を含む構築物を、セイヨウアブラナのＦＡＤ３ゲノム座への組込みのために設計および構築する。構築物および関連するジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物（例えば、（ｐＤＡＢ１０７８２７およびｐＤＡＢ１０７８２８））を、前記のようにセイヨウアブラナ細胞に形質転換する。形質転換体を、前記のように分子確認アッセイを介して同定および確認する。組込みｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むＦＡＤ３染色体組み込み体を単離する。ｄｇｔ−２８導入遺伝子のＦＡＤ３座への組み込みは、ＮＨＥＪ媒介組込みおよびＨＤＲ媒介組込みを介して示される。ＦＡＤ３座への組込みは、ＦＡＤ３内因性配列またはＦＡＤ３座に安定的に組み込まれる前記ＥＴＩＰ（ｐＤＡＳ０００２７１〜ｐＤＡＳ０００２７５）に向けられ得る。ＮＨＥＪ媒介機構を介したＦＡＤ３座への組込みは、線状ドナーまたは環状ドナーＤＮＡ設計を用いて行われ得る。形質転換ＤＧＴ−２８セイヨウアブラナイベントを得て、ＤＧＴ−２８の堅牢な発現およびその後の除草剤グリホサートに対する耐性について試験する。
特定の代表的な実施形態が本明細書において記載されてきたが、当業者であれば、代表
的な実施形態への多くの付加、欠失および修正が以下の請求項の範囲から逸脱することな
く行われ得ることを認知および認識するだろう。さらに、一実施形態からの特徴が別の実
施形態の特徴と組み合わされてもよい。
上記の開示によって提供される発明として、以下が挙げられる。
[１] 細胞のゲノムを改変する方法であって
細胞中のＦＡＤ３遺伝子中の標的部位を部位特異的様式で切断して、それによって前記ＦＡＤ３遺伝子中の切れ目を生成する工程を含み、
前記ＦＡＤ３遺伝子は切断後に改変される、方法。
[２] 対象となる核酸配列を前記切れ目に組み込む工程をさらに含む[１]に記載の方法。
[３] 前記ＦＡＤ３遺伝子は、ＦＡＤ３Ａ遺伝子、ＦＡＤ３Ａ’遺伝子、ＦＡＤ３Ａ’’遺伝子、ＦＡＤ３Ｃ遺伝子、ＦＡＤ３Ｃ’’遺伝子および／またはＦＡＤ３Ｃ’遺伝子である、[１]または[２]に記載の方法。
[４] 前記部位特異的様式で切断することが、ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン若しくは切断ハーフドメインを含む融合タンパク質、又は前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程を含み、
前記融合タンパク質は、前記標的部位に対する特異性によって結合し、前記標的部位またはその近くを切断して、それによって前記切れ目を生成する、[１]から[３]のいずれか１項に記載の方法。
[５] 前記ＤＮＡ結合ドメインは、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化物質様（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、リコンビナーゼ、ジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、およびこれらのいずれかのキメラ組み合わせからなる群から選択される、[４]に記載の方法。
[６] 前記切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＳｔｓＩエンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、およびホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、[４]または[５]に記載の方法。
[７] 前記融合タンパク質はジンクフィンガーヌクレアーゼである、[４]から[６]のいずれか１項に記載の方法。
[８] 前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは３〜６個のジンクフィンガードメインを含み、各ジンクフィンガードメインがヘリックス認識領域を含み、前記ジンクフィンガータンパク質は表３の一列中に整列され示される前記ヘリックス認識領域を含む、[７]に記載の方法。
[９] 前記部位特異的様式で切断することは、ＦＡＤ３Ａ、ＦＡＤ３Ａ’、ＦＡＤ３Ａ’’、ＦＡＤ３Ｃ、ＦＡＤ３Ｃ’’および／またはＦＡＤ３Ｃ’のいくつかであるが全てではないコピーに特異的である、[１]から[８]のいずれか１項に記載の方法。
[１０] 前記標的部位は、配列番号２０〜２３、配列番号２５〜３８、配列番号４０〜４５、配列番号４７および配列番号４９からなる群から選択される、[１]から[９]のいずれか１項に記載の方法。
[１１] 前記細胞は植物、真菌、細菌または藻類細胞である、[１]から[１０]のいずれか１項に記載の方法。
[１２] 前記植物細胞は単子葉植物細胞または双子葉植物細胞である、[１１]に記載の方法。
[１３] 前記植物細胞は、アブラナ属の種、セイヨウアブラナ；ブラッシカ・ラパ；カラシナ（Brassica juencea）；ブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）；クロガラシ（Brassica nigra）；トウモロコシ属の種；トウモロコシ；ダイズ属の種；ダイズ（Glycine max）；コムギ属の種；コムギ（Triticum aestivum）；イネ属の種；イネ（Oryza sativa）；トリティカエ属（Triticae）の種；トリティカエ・トリティクム（Triticae triticum）；ヘリアンテアエ属（Heliantheae）の種；ヘリアンテアエ・ヘリアンサス（Heliantheae helianthus）；ワタ属の種；ワタ（Gossypium hirsutum）；およびオオムギ（Hordeum vulgare）からなる群から選択される、[１２]に記載の方法。
[１４] 前記対象となる核酸配列は、標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む配列、１つまたはそれ以上の殺虫剤耐性遺伝子、１つまたはそれ以上の除草剤耐性遺伝子、１つまたはそれ以上の窒素利用効率遺伝子、１つまたはそれ以上の水利用効率遺伝子、１つまたはそれ以上の栄養価遺伝子、１つまたはそれ以上のＤＮＡ結合遺伝子、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、[２]から[１３]のいずれか１項に記載の方法。
[１５] [１]から[１４]のいずれか１項に記載の方法によって改変された細胞を含む細胞、種子または植物。
[１６] ＦＡＤ３Ａ遺伝子、ＦＡＤ３Ａ’遺伝子、ＦＡＤ３Ａ’’遺伝子、ＦＡＤ３Ｃ遺伝子、ＦＡＤ３Ｃ’’遺伝子および／またはＦＡＤ３Ｃ’遺伝子の１つ以上のコピーに組み込まれた対象となるヌクレオチド配列を含むトランスジェニック細胞、種子または植物である[１５]に記載の細胞、種子または植物。
[１７] 前記ヌクレオチド配列は前記細胞と異種性または相同性である、[１６]に記載の細胞、種子または植物。
[１８] 前記相同性配列は少なくとも１つの一塩基多型を含む、[１４]に記載の細胞、種子または植物。
[１９] 前記核酸配列は、配列番号２０〜２３、配列番号２５〜３８、配列番号４０〜４５、配列番号４７および配列番号４９からなる群から選択される標的部位またはその近くで組み込まれた、[１６]から[１８]のいずれか１項に記載の細胞、種子または植物。
[２０] 配列番号２０〜２３、配列番号２５〜３８、配列番号４０〜４５、配列番号４７および配列番号４９からなる群から選択される核酸標的部位またはその近くを切断する部位特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ。
[２１] 前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは３〜６個のジンクフィンガードメインを含み、各ジンクフィンガードメインがヘリックス認識領域を含み、前記ジンクフィンガータンパク質は表３の一列に整列され示される前記ヘリックス認識領域を含む、[２０]に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。

Claims (15)

  1. 植物細胞のゲノムを改変する方法であって、
    ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン若しくは切断ハーフドメインを含む１以上のヌクレアーゼ、または前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程であって、前記ヌクレアーゼが前記細胞内のＦＡＤ３遺伝子中の標的部位に特異性によって結合する工程、
    前記１以上のヌクレアーゼが前記標的部位に結合して前記細胞中のＦＡＤ３遺伝子を切断し、それによって前記ＦＡＤ３遺伝子中に切れ目を生成する工程、ならびに
    対象となる核酸配列を前記細胞に提供して、前記対象となる核酸配列が前記切れ目に組み込まれる工程
    を含み、
    前記標的部位が、配列番号２０〜２３、配列番号２５〜３８、配列番号４０〜４５、配列番号４７および配列番号４９によって表される配列からなる群から選択される、方法。
  2. 前記ＦＡＤ３遺伝子は、ＦＡＤ３Ａ遺伝子（配列番号７）、ＦＡＤ３Ａ’遺伝子（配列番号８）、ＦＡＤ３Ａ’’遺伝子（配列番号９）、ＦＡＤ３Ｃ遺伝子（配列番号１０）、ＦＡＤ３Ｃ’’遺伝子（配列番号１１）および／またはＦＡＤ３Ｃ’遺伝子（配列番号１２）である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＤＮＡ結合ドメインは、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化物質様（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡガイド化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、リコンビナーゼ、ジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、およびこれらのいずれかのキメラ組み合わせからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、ＳｔｓＩエンドヌクレアーゼからの切断ハーフドメイン、およびホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項３または４に記載の方法。
  6. 前記標的部位が、配列番号２０〜２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３０〜３８、配列番号４０〜４５、配列番号４７および配列番号４９によって表される配列からなる群から選択され、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）はジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）の組を含むものであり、各ジンクフィンガータンパク質は４〜６個のジンクフィンガードメインを含み、前記４〜６個のジンクフィンガードメインは以下の表に示される１行内のＦ１〜Ｆ４の順、Ｆ１〜Ｆ５の順またはＦ１〜Ｆ６の順の認識ヘリックス領域を含むものであり：


    ここで、配列番号２０で表される配列はＺＦＰ２７９６１とＺＦＰ２７９６２とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号２１で表される配列はＺＦＰ２８０２５とＺＦＰ２８０２６とを含むＺＦＰの組、またはＺＦＰ２７９６１とＺＦＰ２７９６２とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号２２で表される配列はＺＦＰ２７９７３とＺＦＰ２７９７４とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号２５で表される配列はＺＦＰ２７９７３とＺＦＰ２７９７４とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号２８で表される配列はＺＦＰ２８０５３とＺＦＰ２８０５４とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号３０で表される配列はＺＦＰ２８０５５とＺＦＰ２８０５６とを含むＺＦＰの組、またはＺＦＰ２７９９１とＺＦＰ２７９９２とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号３１で表される配列はＺＦＰ２７９９１とＺＦＰ２７９９２とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号３２および配列番号３３で表される配列はＺＦＰ２８００４とＺＦＰ２８００５とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号３４および配列番号３５で表される配列はＺＦＰ２８０２１とＺＦＰ２８０２２とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号３６および配列番号３７で表される配列はＺＦＰ２８０２３とＺＦＰ２８０２４とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号３８で表される配列はＺＦＰ２８０２５とＺＦＰ２８０２６とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号４０および配列番号４１で表される配列はＺＦＰ２８０３５とＺＦＰ２８０３６とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号４２および配列番号４３で表される配列はＺＦＰ２８０３９とＺＦＰ２８０４０とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号４４および配列番号４５で表される配列はＺＦＰ２８０５１とＺＦＰ２８０５２とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号４７で表される配列はＺＦＰ２８０５３とＺＦＰ２８０５４とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号４９で表される配列はＺＦＰ２８０５５とＺＦＰ２８０５６とを含むＺＦＰの組によって標的化される、
    請求項５に記載の方法。
  7. 前記部位特異的様式で切断することは、ＦＡＤ３Ａ遺伝子（配列番号７）、ＦＡＤ３Ａ’ 遺伝子（配列番号８）、ＦＡＤ３Ａ’’遺伝子（配列番号９）、ＦＡＤ３Ｃ遺伝子（配列番号１０）、ＦＡＤ３Ｃ’’遺伝子（配列番号１１）および／またはＦＡＤ３Ｃ’遺伝子（配列番号１２）のいくつかであるが全てではないコピーに特異的である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記植物細胞は単子葉植物細胞または双子葉植物細胞である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記植物細胞は、アブラナ属の種、セイヨウアブラナ；ブラッシカ・ラパ；カラシナ（Brassica juencea）；ブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）；クロガラシ（Brassica nigra）；トウモロコシ属の種；トウモロコシ；ダイズ属の種；ダイズ（Glycine max）；コムギ属の種；コムギ（Triticum aestivum）；イネ属の種；イネ（Oryza sativa）；トリティカエ属（Triticae）の種；トリティカエ・トリティクム（Triticae triticum）；ヘリアンテアエ属（Heliantheae）の種；ヘリアンテアエ・ヘリアンサス（Heliantheae helianthus）；ワタ属の種；ワタ（Gossypium hirsutum）；およびオオムギ（Hordeum vulgare）からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 前記対象となる核酸配列は、標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む配列、１つまたはそれ以上の殺虫剤耐性遺伝子、１つまたはそれ以上の除草剤耐性遺伝子、１つまたはそれ以上の窒素利用効率遺伝子、１つまたはそれ以上の水利用効率遺伝子、１つまたはそれ以上の栄養価遺伝子、１つまたはそれ以上のＤＮＡ結合遺伝子、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法によって改変された細胞を含む細胞、種子または植物。
  12. ＦＡＤ３Ａ遺伝子（配列番号７）、ＦＡＤ３Ａ’遺伝子（配列番号８）、ＦＡＤ３Ａ’’遺伝子（配列番号９）、ＦＡＤ３Ｃ遺伝子（配列番号１０）、ＦＡＤ３Ｃ’’遺伝子（配列番号１１）および／またはＦＡＤ３Ｃ’遺伝子（配列番号１２）の１つ以上のコピーに組み込まれた前記対象となる核酸配列を含むトランスジェニック細胞、種子または植物である請求項１１に記載の細胞、種子または植物。
  13. 前記ヌクレオチド配列は前記細胞と異種性または相同性である、請求項１２に記載の細胞、種子または植物。
  14. 前記相同性配列は少なくとも１つの一塩基多型を含む、請求項１３に記載の細胞、種子または植物。
  15. 配列番号２０〜２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３０〜３８、配列番号４０〜４５、配列番号４７および配列番号４９で表される配列からなる群から選択される、ＦＡＤ３遺伝子中の核酸標的部位に結合し、さらに、結合して前記ＦＡＤ３遺伝子を切断する、部位特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼであって、さらに
    前記ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）はジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）の組を含むものであり、各ジンクフィンガータンパク質は４〜６個のジンクフィンガードメインを含み、前記４〜６個のジンクフィンガードメインは、以下の表に示される１行内のＦ１〜Ｆ４の順、Ｆ１〜Ｆ５の順またはＦ１〜Ｆ６の順の認識ヘリックス領域を含むものであり：


    ここで、配列番号２０で表される配列はＺＦＰ２７９６１とＺＦＰ２７９６２とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号２１で表される配列はＺＦＰ２８０２５とＺＦＰ２８０２６とを含むＺＦＰの組、またはＺＦＰ２７９６１とＺＦＰ２７９６２とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号２２で表される配列はＺＦＰ２７９７３とＺＦＰ２７９７４とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号２５で表される配列はＺＦＰ２７９７３とＺＦＰ２７９７４とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号２８で表される配列はＺＦＰ２８０５３とＺＦＰ２８０５４とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号３０で表される配列はＺＦＰ２８０５５とＺＦＰ２８０５６とを含むＺＦＰの組、またはＺＦＰ２７９９１とＺＦＰ２７９９２とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号３１で表される配列はＺＦＰ２７９９１とＺＦＰ２７９９２とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号３２および配列番号３３で表される配列はＺＦＰ２８００４とＺＦＰ２８００５とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号３４および配列番号３５で表される配列はＺＦＰ２８０２１とＺＦＰ２８０２２とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号３６および配列番号３７で表される配列はＺＦＰ２８０２３とＺＦＰ２８０２４とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号３８で表される配列はＺＦＰ２８０２５とＺＦＰ２８０２６とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号４０および配列番号４１で表される配列はＺＦＰ２８０３５とＺＦＰ２８０３６とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号４２および配列番号４３で表される配列はＺＦＰ２８０３９とＺＦＰ２８０４０とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号４４および配列番号４５で表される配列はＺＦＰ２８０５１とＺＦＰ２８０５２とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号４７で表される配列はＺＦＰ２８０５３とＺＦＰ２８０５４とを含むＺＦＰの組によって標的化され、
    配列番号４９で表される配列はＺＦＰ２８０５５とＺＦＰ２８０５６とを含むＺＦＰの組によって標的化される、
    部位特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ。
JP2015531197A 2012-09-07 2013-09-05 Ｆａｄ３性能座および標的化切断を誘導可能である対応する標的部位特異的結合タンパク質 Active JP6775953B2 (ja)

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