ES2315859T3

ES2315859T3 - Metodos y composiciones para tratar afecciones neuropaticas y neurodegenerativas.

Info

Publication number: ES2315859T3
Application number: ES05732726T
Authority: ES
Inventors: J. Tyler Martin
Original assignee: Sangamo Biosciences Inc
Current assignee: Sangamo Therapeutics Inc
Priority date: 2004-04-08
Filing date: 2005-04-07
Publication date: 2009-04-01
Anticipated expiration: 2025-04-07
Also published as: CA2561714A1; ATE418346T1; JP2007532567A; AU2010212293B2; AU2005232665A1; DE602005011943D1; HK1095761A1; EP1732614A2; WO2005099771A3; JP4903689B2; US20050267061A1; AU2005232665B2; US20100256221A1; AU2010212293A1; EP1732614B1; US20110281937A1; WO2005099771A2

Abstract

Uso de un ácido nucleico, en el que el ácido nucleico codifica un polipéptido, en el que el polipéptido comprende: (i) un dominio de unión del ADN de dedos de cinc, que se modifica para que se una a un sitio diana en el gen del factor A de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A); y (ii) un dominio de activación transcripcional; en el que el ácido nucleico se puede expresar en una o más células de un sujeto a tratar, con lo que el polipéptido es capaz de unirse al sitio diana y activar la transcripción del gen del VEGF-A para la fabricación de una composición para tratar un estado neuropático o neurodegenerativo en un sujeto.

Description

Métodos y composiciones para tratar afecciones neuropáticas y neurodegenerativas.

Antecedentes

Las neuropatías diabéticas son una familia de trastornos nerviosos provocados por diabetes. Las personas con diabetes pueden, a lo largo del tiempo, experimentar daño en los nervios por todo el cuerpo. Las neuropatías conducen a entumecimiento y algunas veces a dolor y debilidad en las manos, brazos, pies y piernas. Estos problemas neurológicos también pueden ocurrir en cualquier sistema orgánico, incluyendo el tubo digestivo, el corazón, y los órganos sexuales. Las personas con diabetes pueden desarrollar problemas nerviosos en cualquier momento, pero cuanto más tiempo tenga diabetes una persona, mayor es el riesgo.

El tipo más habitual de neuropatía diabética es la neuropatía periférica, también denominada neuropatía simétrica distal, que afecta a las extremidades (por ejemplo, brazos, manos, piernas, pies). Además de la neuropatía periférica, las neuropatías diabéticas pueden producirse en los sistemas nerviosos autónomos, proximal (dolor en los muslos, caderas o nalgas, conduciendo a debilidad en la pierna) y focal. La neuropatía neurovegetativa puede provocar cambios en la digestión, en la función del intestino y de la vejiga, en la respuesta sexual, y en la transpiración. También puede afectar a los nervios que sirven al corazón y que controlan la tensión sanguínea. La neuropatía diabética neurovegetativa también puede provocar hipoglucemia (bajo contenido de azúcar en la sangre) inadvertida, un estado en el que las personas ya no experimentan los signos de advertencia de la hipoglucemia.

Aunque alrededor de la mitad de los pacientes con diabetes experimentan alguna forma de neuropatía, actualmente no hay tratamientos para la neuropatía distintos de los de controlar el proceso diabético per se. Se sabe desde hace tiempo que los pacientes diabéticos no convierten el ácido graso esencial (EFA) ácido linoleico en ácido gamma-linoleico (GLA), debido a una deficiencia en la producción de la enzima delta-6-desaturasa y/o de la enzima delta-5-desaturasa. Véase, por ejemplo, Keen et al. (1993) Diabetes Care. 16(1):8-15. En consecuencia, algunos tratamientos de las neuropatías diabéticas se han centrado en alentar el crecimiento nervioso cambiando la ingesta nutricional del paciente.

Muchas otras enfermedades resultan de la neuropatía o degeneración neuronal, es decir, la muerte de neuronas o el fracaso de las neuronas dañadas para regenerarse. Aquellas incluyen, por ejemplo, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA, también conocida como enfermedad de Lou Gehrig), que resulta de la degeneración de las neuronas motoras. Además, el trauma del tejido neuronal, tal como el aplastamiento de los nervios y las lesiones de la médula espinal, pueden dar como resultado neuropatía, en cuyo caso serían ventajosos los tratamientos que estimulen la regeneración neuronal.

Recientemente, varios grupos han dado a conocer que la administración de moléculas neurotróficas per se puede ayudar a mejorar la degeneración nerviosa, característica de la neuropatía diabética. Por ejemplo, Schratzberger et al. J. Clin. Invención. (2001) 107, 1083-1092, demostraron que la transferencia génica del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) podría invertir la neuropatía diabética caracterizada por una pérdida de axones y desmielinización en el modelo experimental de rata. Véase, también, Isner et al. (2001) Hum Gene Ther. 10; 12(12):1593-4; Sondell et al. (2000) European J. Neurosciences 12:4243-4254; Sondell (1999) J. Neurosciences 19(14):5731-5740. Además, se han dado a conocer mejoras neurológicas anecdóticas en pacientes con diabetes en un ensayo de aumento de la dosis, de fase I/II, de terapia génica con VEGF_{165}, para la isquemia crítica de las extremidades. Simovic et al. Arch Neurol. (2001) 58:761-788.

Sin embargo, la modulación de la expresión de proteínas neurotróficas implicadas en el crecimiento de los nervios, para tratar neuropatías y afecciones neurodegenerativas, diabéticas y otras cualesquiera, no se ha descrito previamente. La capacidad para estimular el crecimiento de los nervios en una célula o grupo de células, usando una o más moléculas exógenas, tendría utilidad para tratar y/o prevenir todos los tipos de neuropatías y neurodegeneración, y para aliviar el dolor asociado con algunas de estas afecciones.

Sumario

Para uso en el tratamiento de neuropatías, se proporciona una variedad de proteínas de dedos de cinc (ZFP), y métodos que utilizan tales proteínas. Estos incluyen proteínas de dedos de cinc modificadas, es decir, proteínas de origen no natural que se unen a una secuencia diana de ácidos nucleicos predeterminada, que se obtienen, mediante diseño racional o mediante selección a partir de una librería que comprende una pluralidad de proteínas de dedos de cinc de diferente secuencia. Tales librerías pueden ser librerías de polipéptidos, o librerías de polinucleótidos que codifican una pluralidad de polipéptidos de dedos de cinc de diferente secuencia, a partir de las cuales se puede expresar una pluralidad de proteínas.

Las ZFP se pueden enlazar de forma operativa con un dominio regulador (o dominio funcional), como parte de una proteína de fusión. Seleccionando un dominio de activación o un dominio de represión para la fusión con la ZFP, tales proteínas de fusión se pueden usar para activar o reprimir la expresión génica. De este modo, mediante la elección apropiada del dominio regulador fusionado a la ZFP, se puede modular selectivamente la expresión de un gen y, por tanto, modular diversos procesos fisiológicos correlacionados con uno o más genes. En el caso de ciertas neuropatías, por ejemplo, uniendo un dominio de activación a una ZFP que se une a una secuencia diana dentro de un gen que codifica un producto neurotrófico, e introduciendo tal proteína de fusión (o un ácido nucleico que codifica tal proteína de fusión) en una célula o tejido, se pueden potenciar ciertos aspectos beneficiosos asociados con las propiedades neurotróficas del gen o genes diana. Por el contrario, para las neuropatías que están asociadas con la sobreexpresión de un gen, se puede reducir la expresión del gen usando las ZFP que están fusionadas a un dominio de represión.

Seleccionando ciertas ZFP, es posible adaptar el grado en el que un proceso fisiológico (por ejemplo, crecimiento y/o función de los nervios) se puede modular, y es posible confeccionar un tratamiento. Esto se puede lograr debido a que, mediante las ZFP proporcionadas aquí, se puede actuar sobre sitios diana (por ejemplo, secuencias diana de 9, 12, 15 ó 18 pares de bases) en cualquier gen dado, y debido a que una única ZFP se puede unir a un sitio diana localizado en una pluralidad de genes. De este modo, en algunos métodos se administra una pluralidad de ZFP, que entonces se pueden unir a diferentes sitios diana localizados en el mismo gen. Tales ZFP pueden en algunos casos tener un efecto sinérgico. En ciertos métodos, la pluralidad de proteínas de fusión incluye diferentes dominios reguladores. Por el contrario, con algunas de las ZFP proporcionadas aquí, la administración de una única ZFP puede modular la expresión de múltiples genes, debido a que cada gen incluye el sitio diana (por ejemplo, dentro de una región de conservación de secuencia entre los diferentes genes).

También se proporcionan aquí polinucleótidos y ácidos nucleicos que codifican las ZFP descritas aquí. Adicionalmente, también se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen los ácidos nucleicos y/o las ZFP. Por ejemplo, ciertas composiciones incluyen un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una de las ZFP descritas aquí, operablemente enlazada a una secuencia reguladora, combinadas con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, en las que la secuencia reguladora permite la expresión del ácido nucleico en una célula. Las composiciones a base de proteínas incluyen una ZFP como se describe aquí, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

También se proporcionan métodos para prevenir la degeneración neuronal, así como métodos para estimular la regeneración neuronal, usando las composiciones descritas aquí.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de un vector adenovírico.

La Figura 2 muestra un diagrama esquemático de un vector adenovírico que codifica la proteína de fusión NLS-VOP32E-p65-Flag bajo el control transcripcional de un promotor de CMV inducible por tetraciclina y de una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino. Véase el Ejemplo 4 para detalles.

Las Figuras 3A y B muestran el porcentaje de contacto de la placa terminal nerviosa, determinado mediante identificación histológica de placas terminales y fibras nerviosas, en criosecciones de músculo laríngeo procedente de ratas en las que se trituró el nervio laríngeo recurrente, y después se trató con AdVOP32Ep65 (barras en negro) o con un vector adenovírico de control (barras en blanco). Las mediciones se realizaron a los 3 días después del tratamiento (A) y a los 7 días después del tratamiento (B).

La Figura 4 es un diagrama esquemático del plásmido pV-32Ep65 que codifica una proteína de fusión de dedos de cinc que activa VEGF. Las abreviaturas son las siguientes. pUC: cadena principal del vector; canamicina R: gen de resistencia a la canamicina; p/e temprano del CMV: secuencias del promotor/potenciador temprano del citomegalovirus; T7: promotor del bacteriófago T7; NLS: secuencia de localización nuclear; 32E: dominio de unión del dedo de cinc de VOP32E (Tabla 1); dominio de act. de p65: dominio de activación transcripcional de p65; BGH polyA: señal de poliadenilación del gen de la hormona del crecimiento bovina. También se muestran los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción EcoRI, KpnI, BamHI y XhoI.

Descripción detallada

La práctica de los métodos, así como la preparación y uso de las composiciones descritas aquí emplean, excepto que se indique de otro modo, técnicas convencionales en biología molecular, bioquímica, estructura y análisis de cromatina, química computacional, cultivo celular, ADN recombinante y campos relacionados, como los que están dentro de la pericia de la técnica. Estas técnicas se explican de forma muy detallada en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y Tercera edición, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 actualizaciones periódicas; la serie METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Tercera edición, Academic Press, San Diego, 1998, METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarmand y A.P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; y METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

I. Definiciones

La expresión "proteína de dedos de cinc" o "ZFP" se refiere a una proteína que tiene dominios de unión de ADN que están estabilizados por cinc. Los dominios de unión de ADN individuales se denominan típicamente como "dedos". Una ZFP tiene al menos un dedo, típicamente dos, tres, cuatro, cinco, seis o más dedos. Cada dedo se une desde dos a cuatro pares de bases de ADN, típicamente tres o cuatro pares de bases de ADN. Una ZFP se une a una secuencia de ácido nucleico denominada un sitio diana o un segmento diana. Cada dedo comprende típicamente un subdominio de unión del ADN, que forma un quelato con cinc, de aproximadamente 30 aminoácidos. Un motivo ejemplar que caracteriza a una clase de estas proteínas (la clase C_{2}H_{2}) es -Cys-(X)_{2-4}-Cys-(X)_{12}-His-(X)_{3-5}-His (en el que X es cualquier aminoácido (SEQ ID NO:147). Se conocen clases adicionales de proteínas de dedos de cinc, y son útiles en la práctica de los métodos y en la fabricación y uso de las composiciones descritas aquí (véase, por ejemplo, Rhodes et al. (1993) Scientific American 268:56-65 y la Publicación de Solicitud de Patente US nº 2003/0108880). Los estudios han demostrado que un único dedo de cinc de esta clase consiste en una hélice alfa que contiene los dos restos de histidina invariantes coordinados con el cinc junto con los dos restos de cisteína de un único giro beta (véase, por ejemplo, Berg y Shi, Science 271:1081-1085 (1996)).

Un "sitio diana" es la secuencia de ácido nucleico reconocida por una ZFP. Un único sitio diana tiene típicamente alrededor de cuatro hasta alrededor de diez pares de bases. Típicamente, una ZFP de dos dedos reconoce un sitio diana de cuatro a siete pares de bases, una ZFP de tres dedos reconoce un sitio diana de seis a diez pares de bases, una ZFP de cuatro dedos reconoce una secuencia diana de 12-14 pb, y una ZFP de seis dedos reconoce una secuencia diana de 18-21 pb, que puede comprender dos sitios diana de nueve a diez pares de bases adyacentes, o tres sitios diana de 6-7 pb adyacentes.

Un "subsitio diana" o "subsitio" es la porción de un sitio diana de ADN que está unida mediante un único dedo de cinc, excluyendo las interacciones de cruzamiento de hebras. De este modo, en ausencia de interacciones de cruzamiento de hebras, un subsitio tiene generalmente tres nucleótidos de longitud. En los casos en los que se produce la interacción de cruzamiento de hebras (es decir, un "subsitio D-able", véase el documento WO 00/42219 en propiedad junto con la presente), un subsitio tiene cuatro nucleótidos de longitud, y solapa con otro subsitio de 3 ó 4
nucleótidos.

"Kd" se refiere a la constante de disociación para una molécula de unión, es decir, la concentración de un compuesto (por ejemplo, una proteína de dedos de cinc) que da la unión semimáxima del compuesto a su diana (es decir, la mitad de las moléculas del compuesto se unen a la diana) en unas condiciones dadas (es decir, cuando [diana] « Kd), según se mide usando un sistema de conjuntos dado (véase, por ejemplo, la patente U.S. nº 5.789.538). El sistema de conjuntos usado para medir la Kd se debería de escoger de forma que dé la medida más exacta de la Kd real de la ZFP. Se puede usar cualquier sistema de conjuntos, en tanto que dé una medida exacta de la Kd real de la ZFP. En una realización, la Kd para una ZFP se mide usando un ensayo de cambio de la movilidad electroforética ("EMSA"). Excepto que se realice un ajuste para la pureza o actividad de la ZFP, los cálculos de Kd pueden dar como resultado una sobreestimación de la Kd verdadera de una ZFP dada. Preferiblemente, la Kd de una ZFP usada para modular la transcripción de un gen es menor que alrededor de 100 nM, más preferiblemente menor que alrededor de 75 nM, más preferiblemente menor que alrededor de 50 nM, lo más preferible menor que alrededor de
25 nM.

Un "gen", para los fines de la presente descripción, incluye una región de ADN que codifica un producto génico, así como todas las regiones de ADN que regulan la producción del producto génico, tanto si tales secuencias reguladoras son adyacentes o no a secuencias codificantes y/o transcritas. En consecuencia, un gen incluye, pero no está limitado necesariamente a, secuencias promotoras, terminadores, secuencias reguladoras traduccionales tales como sitios de unión de ribosomas y sitios de entrada a ribosomas internos, potenciadores, silenciadores, aisladores, elementos frontera, orígenes de replicación, sitios de unión de matriz, y regiones de control de locus. Se pueden seleccionar como dianas una amplia variedad de genes para tratar neuropatía diabética usando las ZFP y métodos descritos aquí, incluyendo diversos factores de crecimiento, enzimas, etc. Por ejemplo, se ha demostrado que VEGF tiene efectos neurotróficos. Los genes de VEGF se definen y se describen con detalle en la Solicitud de Patente U.S. nº 20030021776A1, incorporada como referencia en su totalidad aquí.

El término "gen" incluye ácidos nucleicos que son sustancialmente idénticos a un gen nativo. Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o tienen un porcentaje específico de oligonucleótidos o restos de aminoácidos que son los mismos, cuando se comparan y se alinean para correspondencia máxima, según se mide usando un algoritmo de comparación de secuencias tal como los descritos por ejemplo más abajo, o mediante inspección visual.

La frase "sustancialmente idénticos", en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos 75%, preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, 95% o superior, o cualquier valor entero entre ellos, de identidad de nucleótidos o de restos de aminoácidos, cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima, según se mide usando un algoritmo de comparación de secuencias tal como los descritos por ejemplo más abajo, o mediante inspección visual. Preferiblemente, la identidad sustancial existe a lo largo de una región de las secuencias que tiene al menos alrededor de 10, preferiblemente alrededor de 20, más preferible alrededor de 40-60 restos de longitud, o cualquier valor de número entero entre medias, preferiblemente a lo largo de una región más larga que 60-80 restos, más preferiblemente al menos alrededor de 90-100 restos, y lo más preferible las secuencias son sustancialmente idénticas a lo largo de toda la longitud de las secuencias que se comparan, tal como por ejemplo la región codificante de una secuencia nucleotídica.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, a la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se diseñan coordenadas de subsecuencias, si es necesario, y se diseñan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidad de secuencias para la secuencia o secuencias de ensayo, con relación a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros diseñados del programa.

El alineamiento óptimo de las secuencias para comparación se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de busca de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección visual [véase generalmente, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M. et al., eds.) John Wiley & Sons, Inc. New York (1987-1999), incluyendo suplementos tales como el suplemento 46 (abril de 1999)]. El uso de estos programas para realizar las comparaciones de secuencias se lleva a cabo típicamente usando los parámetros por defecto específicos para cada
programa.

Otro ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y la similitud de las secuencias es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El programa de ordenador para realizar análisis con BLAST está disponible al público a través de National Center for Biotechnology Information. ESte algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia pregunta, que concuerdan o satisfacen cierta puntuación umbral T de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de una base de datos. Esto se denomina como el umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul et al., más arriba). Estos resultados iniciales de palabras vecinas actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largas que los contienen. Los resultados de palabras se extienden entonces en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia, tanto como se pueda incrementar la puntuación de alineamiento acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias nucleotídicas, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos concordantes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para restos que no concuerdan; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los resultados de la palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa cae en la cantidad X desde su valor máximo logrado; la puntuación acumulativa llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos que puntúan negativamente; o se alcanza el extremo de cada secuencia. Para determinar la similitud de secuencias, son adecuados los parámetros por defecto de los programas BLAST. El programa BLASTN (para secuencias nucleotídicas) usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas letras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una esperanza (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62. El programa TBLATN (que usa secuencia proteínica por secuencia nucleotídica) usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una esperanza (E) de 10, y una matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)). Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencias, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad mediante la cual ocurriría por casualidad una concordancia entre dos secuencias nucleotídicas o de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña, en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia, es menor que alrededor de 0,5, más preferiblemente menor que alrededor de 0,01, y lo más preferible menor que alrededor de 0,001.

Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones restrictivas. "Se hibrida sustancialmente" se refiere a la hibridación complementaria entre un ácido nucleico sonda y un ácido nucleico diana, y abarca desemparejamientos minoritarios que se pueden adaptar reduciendo la restricción del medio de hibridación para lograr la detección deseada de la secuencia polinucleotídica diana. La frase "se hibrida específicamente a" se refiere a la unión, formación de dúplex, o hibridación de una molécula sólo a una secuencia nucleotídica particular en condiciones restrictivas, cuando esa secuencia está presente en un ADN o ARN de mezcla compleja (por ejemplo, celular total).

Una indicación adicional de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico reacciona inmunológicamente de forma cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe más abajo.

"Variaciones modificadas de forma conservativa" de una secuencia polinucleotídica particular se refiere a aquellos polinucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o, cuando el polinucleótido no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier polipéptido dado. Por ejemplo, los codones CGU, CGC, CGA, CGG, AGA y AGG codifican todos el aminoácido arginina. De este modo, en cada posición en la que se especifica una arginina mediante un codón, el codón puede estar alterado por cualquiera de los codones correspondientes descritos, sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas", que son una especie de "variaciones modificadas de forma conservativa". Cada secuencia polinucleotídica descrita aquí que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa, excepto que se señale de otro modo. El experto reconocerá que se puede modificar cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para metionina) para producir una molécula funcionalmente idéntica mediante técnicas estándar. En consecuencia, cada "variación silenciosa" de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

Un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren sólo en sustituciones conservativas. Una "sustitución conservativa", cuando se describe una proteína, se refiere a un cambio en la composición de aminoácidos de la proteína, que no altera sustancialmente la actividad de la proteína. De este modo, "variaciones modificadas de forma conservativa" de una secuencia de aminoácidos particular se refiere a sustituciones de aminoácidos de aquellos aminoácidos que no son críticos para la actividad de la proteína, o a la sustitución de aminoácidos con otros aminoácidos que tienen propiedades similares (por ejemplo, ácidos básicos, cargados positiva o negativamente, polares o no polares, etc.), de forma que las sustituciones de aminoácidos incluso críticos no alteran sustancialmente la actividad. En la técnica son bien conocidas las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Véase, por ejemplo, Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman and Company. Además, las sustituciones individuales, supresiones o adiciones que alteran, añaden o suprimen un aminoácido individual o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada también son "variaciones modificadas de forma conservativa".

Un "fragmento funcional" o "equivalente funcional" de una proteína, polipéptido o ácido nucleico es una proteína, polipéptido o ácido nucleico cuya secuencia no es idéntica a la de la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa, aunque retiene la misma función que la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa. Un fragmento funcional puede tener más, menos o igual número de restos que la molécula nativa correspondiente, y/o puede contener una o más sustituciones de aminoácidos o nucleotídicas. Los métodos para determinar la función de un ácido nucleico (por ejemplo, función codificante, capacidad para hibridarse a otro ácido nucleico, unión a una molécula reguladora) son bien conocidos en la técnica. De forma similar, los métodos para determinar la función de las proteínas son bien conocidos. Por ejemplo, la función de un polipéptido para unirse a ADN se puede determinar, por ejemplo, mediante unión al filtro, cambio de la movilidad electroforética, o ensayos de inmunoprecipitación. Véase Ausubel et al., más arriba. La capacidad de una proteína para interactuar con otra proteína se puede determinar, por ejemplo, mediante coinmunoprecipitación, ensayos de dos híbridos o complementación, tanto genética como bioquímica. Véase, por ejemplo, Fields et al. (1989) Nature 340:245-246; la patente U.S. nº 5.585.245 y el documento PCT WO 98/44350.

Las expresiones "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se usan de forma intercambiable, y se refieren a un polímero desoxirribonucleotídico o ribonucleotídico en forma de una sola hebra o de una hebra doble. Para los fines de la presente invención, estos términos no se deben de interpretar como limitantes con respecto a la longitud de un polímero. Los términos pueden englobar análogos conocidos de nucleótidos naturales, así como nucleótidos que están modificados en los restos de las bases, de los azúcares y/o del fosfato. En general, un análogo de un nucleótido particular tiene la misma especificidad de emparejamiento de bases, es decir, un análogo de A emparejará su base con T. De este modo, la expresión secuencia polinucleotídica es la representación alfabética de una molécula polinucleotídica. Esta representación alfabética se puede introducir en bases de datos en un ordenador que tenga una unidad de procesamiento central, y se puede usar para aplicaciones bioinformáticas tales como la genómica funcional y la búsqueda de homologías. Las expresiones engloban adicionalmente ácidos nucleicos que contienen análogos nucleótidos conocidos o restos o enlaces de cadenas principales modificados, que son de origen sintético, natural y no natural, que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia, y que son metabolizados de una manera similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de tales análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirales, 2-O-metilrribonucleótidos, y ácidos nucleicos peptídicos (PNA). Las secuencias nucleotídicas se presentan aquí en la orientación 5'-3'
convencional.

"Cromatina" es la estructura nucleoproteínica que comprende el genoma celular. "Cromatina celular" comprende ácido nucleico, principalmente ADN, y proteína, incluyendo histonas y proteínas cromosómicas no histónicas. La mayoría de la cromatina celular de los eucariotas existe en forma de nucleosomas, en los que un núcleo de nucleosoma comprende aproximadamente 150 pares de bases de ADN asociadas con un octámero que comprende dos de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4; y un ADN ligador (de longitud variable, dependiendo del organismo), que se extiende entre los núcleos nucleosómicos. Una molécula de histona HI generalmente está asociada con el ADN ligador. Para los fines de la presente descripción, el término "cromatina" engloba todos los tipos de nucleoproteína celular, tanto procariota como eucariota. La cromatina celular incluye tanto cromatina cromosómica como
episómica.

Un "cromosoma" es un complejo de cromatina que comprende todo o una porción del genoma de una célula. El genoma de una célula a menudo se caracteriza por su cariotipo, que es la colección de todos los cromosomas que comprenden el genoma de la célula. El genoma de una célula puede comprender uno o más cromosomas.

\newpage

Un "episoma" es un ácido nucleico replicante, complejo nucleoproteínico u otra estructura que comprende un ácido nucleico que no es parte del cariotipo cromosómico de una célula. Los ejemplos de episomas incluyen plásmidos y ciertos genomas víricos.

Una "molécula exógena" es una molécula que normalmente no está presente en una célula, pero se puede introducir en una célula mediante uno o más métodos genéticos, bioquímicos u otros métodos. La presencia normal en la célula está determinada con respecto a la etapa de desarrollo particular y a las condiciones medioambientales de la célula. De este modo, por ejemplo, una molécula que está presente sólo durante el desarrollo embriónico del músculo es una molécula exógena con respecto a una célula muscular de adulto. Una molécula exógena puede comprender, por ejemplo, una versión que funciona de una molécula endógena que funciona mal, o una versión que funciona mal de una molécula endógena que funciona normalmente.

Una molécula exógena puede ser, entre otras cosas, una pequeña molécula, tal como se genera mediante un proceso de química combinatoria, o una molécula tal como una proteína, ácido nucleico, nitrato de carbono, lípido, glucoproteína, lipoproteína, polisacárido, cualquier derivado modificado de las moléculas anteriores, o cualquier complejo que comprenda una o más de las moléculas anteriores. Los ácidos nucleicos incluyen ADN y ARN, pueden ser monocatenarios o bicatenarios, pueden ser lineales, ramificados o circulares, y pueden tener cualquier longitud. Los ácidos nucleicos incluyen aquellos capaces de formar dúplex, así como ácidos nucleicos que forman tríplex. Por ejemplo, véanse las patentes U.S. n^{os} 5.176.996 y 5.422.251. Las proteínas incluyen, pero no se limitan a, proteínas que se unen al ADN, factores de transcripción, factores que remodelan la cromatina, proteínas que se unen al ADN metilado, polimerasas, metilasas, desmetilasas, acetilasas, desacetilasas, quinasas, fosfatasas, integrasas, recombinasas, ligasas, topoisomerasas, girasas y helicasas.

Una molécula exógena puede ser el mismo tipo de molécula que una molécula endógena, por ejemplo proteína o ácido nucleico (es decir, un gen exógeno), con tal de que tenga una secuencia que sea diferente de una molécula endógena. Los métodos para la introducción de moléculas exógenas en células son conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, transferencia mediada por lípidos (es decir, liposomas, incluyendo lípidos neutros y catiónicos), electroporación, inyección directa, fusión celular, bombardeo con partículas, coprecipitación con fosfato de calcio, transferencia mediada por DEAE-dextrano, y transferencia mediada por un vector
vírico.

Por el contrario, una "molécula endógena" es aquella que está presente normalmente en una célula particular en una etapa particular del desarrollo, en condiciones medioambientales particulares.

Un "gen endógeno" es un gen que está presente en su contexto genómico y cromatínico normal. Un gen endógeno puede estar presente, por ejemplo, en un cromosoma, un episoma, un genoma bacteriano o un genoma vírico.

La frase "adyacente a un sitio de iniciación de la transcripción" se refiere a un sitio diana que está dentro de alrededor de 50 bases en dirección 5' o en dirección 3' de un sitio de iniciación de la transcripción. "En dirección 5'" de un sitio de iniciación de la transcripción se refiere a un sitio diana que está más de alrededor de 50 bases del extremo 5' del sitio de iniciación de la transcripción (es decir, en la región no transcrita del gen). "En dirección 3'" de un sitio de iniciación de la transcripción se refiere a un sitio diana que está más de alrededor de 50 bases del extremo 3' del sitio de iniciación de la transcripción.

Una "molécula de fusión" es una molécula en la que están enlazadas, típicamente de forma covalente, dos o más moléculas subunitarias. Las moléculas subunitarias pueden ser el mismo tipo químico de molécula, o pueden ser tipos químicos diferentes de moléculas. Los ejemplos del primer tipo de molécula de fusión incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos de fusión (por ejemplo, una fusión entre un dominio de unión del ADN de ZFP y un dominio de activación transcripcional) y ácidos nucleicos de fusión (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión descrito más arriba). Los ejemplos del segundo tipo de molécula de fusión incluyen, pero no se limitan a, una fusión entre un ácido nucleico que forma tríplex y un polipéptido, y una fusión entre un ligando de unión al surco menor y un ácido nucleico.

"Expresión génica" se refiere a la conversión de la información, contenida en un gen, en un producto génico. Un producto génico puede ser el producto transcripcional directo de un gen (por ejemplo, ARNm, ARNt, ARNr, ARN antisentido, ribozima, ARN estructural, o cualquier otro tipo de ARN), o una proteína producida por traducción de un ARNm. Los productos génicos también incluyen los ARN que están modificados mediante procesos tales como protección de los terminales con grupos, poliadenilación, metilación, y edición, y proteínas modificadas, por ejemplo, mediante metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, ribosilación con ADP, miristilación, y
glucosilación.

"Activación génica" se refiere a cualquier proceso que da como resultado un incremento en la producción de un producto génico. Un producto génico puede ser ARN (incluyendo, pero sin limitarse a, ARNm, ARNr, ARNt, y ARN estructural) o una proteína. En consecuencia, la activación génica incluye aquellos procesos que incrementan la transcripción de un gen y/o la traducción de un ARNm. Los ejemplos de procesos de activación génica que incrementan la transcripción incluyen, pero no se limitan a, aquellos que facilitan la formación de un complejo de iniciación de la transcripción, aquellos que incrementan la velocidad de iniciación de la transcripción, aquellos que incrementan la velocidad de alargamiento de la transcripción, aquellos que incrementan la procesabilidad de la transcripción, y aquellos que alivian la represión transcripcional (por ejemplo bloqueando la unión de un represor transcripcional). La activación génica puede constituir, por ejemplo, la inhibición de la represión, así como la estimulación de la expresión por encima de un nivel existente. Los ejemplos de procesos de activación génica que incrementan la traducción incluyen aquellos que incrementan la iniciación traduccional, aquellos que incrementan el alargamiento traduccional, y aquellos que incrementan la estabilidad del ARNm. En general, la activación génica comprende cualquier incremento detectable en la producción de un producto génico, en algunos casos un incremento en la producción de un producto génico en alrededor de 2 veces, en otros casos de alrededor de 2 hasta alrededor de 5 veces, o cualquier número entero entre medias de ellos, y aún en otros casos entre alrededor de 5 y alrededor de 10 veces o cualquier número entero entre medias de ellos, y aún en otros casos entre alrededor de 10 y alrededor de 20 veces o cualquier número entero entre medias de ellos, algunas veces entre alrededor de 20 y alrededor de 50 veces o cualquier número entero entre medias de ellos, y en otros casos entre alrededor de 50 y alrededor de 100 veces o cualquier número entero entre medias de ellos, y aún en otros casos entre 100 veces o
más.

"Represión génica" e "inhibición de la expresión génica" se refieren a cualquier proceso que dé como resultado una disminución de la producción de un producto génico. Un producto génico puede ser ARN (incluyendo, pero sin limitarse a, ARNm, ARNr, ARNt, y ARN estructural) o una proteína. En consecuencia, la represión génica incluye aquellos procesos que disminuyen la transcripción de un gen, y/o la traducción de un ARNm. Los ejemplos de procesos de represión génica que disminuye la transcripción incluyen, pero no se limitan a, aquellos que inhiben la formación de un complejo de iniciación de la transcripción, aquellos que disminuyen la velocidad de iniciación de la transcripción, aquellos que disminuyen la velocidad de alargamiento de la transcripción, aquellos que disminuyen la procesabilidad de la transcripción, y aquellos que antagonizan la activación transcripcional (por ejemplo, bloqueando la unión de un activador transcripcional). La represión génica puede constituir, por ejemplo, una prevención de la activación, así como una inhibición de la expresión por debajo de un nivel existente. Los ejemplos de procesos de represión génica que disminuye la traducción incluyen aquellos que disminuyen la iniciación traduccional, aquellos que disminuyen el alargamiento traduccional, y aquellos que disminuyen la estabilidad del ARNm. La represión transcripcional incluye la inactivación tanto reversible como irreversible de la transcripción génica. En general, la represión génica comprende cualquier disminución detectable en la producción de un producto génico, en algunos casos una disminución en la producción de un producto génico de alrededor de 2 veces, en otros casos de alrededor de 2 hasta alrededor de 5 veces o cualquier número entero entre medias de ellos, y aún en otros casos entre alrededor de 5 y alrededor de 10 veces o cualquier número entre medias de ellos, y todavía en otros casos entre alrededor de 10 y alrededor de 20 veces o cualquier número entero entre medias de ellos, algunas veces entre alrededor de 20 y alrededor de 50 veces o cualquier número entero entre medias de ellos, y en otros casos entre alrededor de 50 y alrededor de 100 veces o cualquier número entero entre medias de ellos, y aún en otros casos 100 veces o más. En aún otros casos, la represión génica da como resultado la inhibición completa de la expresión génica, de forma que el producto génico no es
detectable.

"Modulación" se refiere a un cambio en el nivel o magnitud de una actividad o proceso. El cambio puede ser un incremento o una disminución. Por ejemplo, la modulación de la expresión génica incluye tanto la activación génica como la represión génica. La modulación se puede evaluar determinando cualquier parámetro que se vea afectado indirecta o directamente por la expresión del gen diana. Tales parámetros incluyen, por ejemplo, cambios en los niveles de ARN o de proteínas, cambios en la actividad proteínica, cambios en los niveles del producto, cambios en la expresión génica aguas abajo, cambios en la transcripción del gen informador (luciferasa, CAT, \beta-galactosidasa, \beta-glucuronidasa, proteína verde fluorescente (véase, por ejemplo, Mistili y Spector, Nature Biotechnology 15:961-964 (1997)); cambios en la transducción de señales, fosforilación y desfosforilación, interacciones de ligando con receptor, concentraciones del segundo mensajero (por ejemplo, cGMP, cAMP, IP3, y Ca2+), crecimiento celular, y vascularización. Estos ensayos pueden ser in vitro, in vivo, y ex vivo. Tales efectos funcionales se pueden medir por cualquier medio conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo la medición de los niveles de ARN o proteínicos, la medición de la estabilidad del ARN, la identificación de la expresión génica aguas abajo o del gen informador, por ejemplo vía quimioluminiscencia, fluorescencia, reacciones colorimétricas, unión a anticuerpos, marcadores inducibles, ensayos de unión de ligandos; cambios en segundos mensajeros intracelulares, tales como cGMP y trifosfato de inositol (IP3); cambios en los niveles de calcio intracelulares; liberación de citoquinas; y
similares.

Un "dominio regulador" o "dominio funcional" se refiere a una proteína o a un dominio proteínico que tiene actividad de modulación transcripcional cuando se ata a un dominio de unión del ADN, es decir, una ZFP. Típicamente, un dominio regulador está enlazado covalente o no covalentemente a una ZFP (por ejemplo, para formar una molécula de fusión) para efectuar la modulación de la transcripción. Los dominios reguladores pueden ser dominios de activación o dominios de represión. Los dominios de activación incluyen, pero no se limitan a, VP16, VP64 y la subunidad p65 del factor nuclear Kappa-B. Los dominios de represión incluyen, pero no se limitan a, KOX, KRAB, MBD2B y v-ErbA. Dominios reguladores adicionales incluyen, por ejemplo, factores y cofactores de transcripción (por ejemplo, MAD, ERD, SID, el factor I de respuesta temprana al crecimiento, y los receptores de hormonas nucleares), endonucleasas, integrasas, recombinasas, metiltransferasas, histona acetiltransferasas, histona desacetilasas, etc. Los activadores y represores incluyen coactivadores y correpresores (véase, por ejemplo, Utley et al., Nature 394:498-502 (1998)). Como alternativa, una ZFP puede actuar sola, sin un dominio regulador, para efectuar la modulación de la
transcripción.

\newpage

La expresión "ligados operablemente" o "ligados operativamente" se usa con referencia a una yuxtaposición de dos o más componentes (tales como elementos de secuencias), en la que los componentes se disponen de forma que ambos componentes funcionan normalmente y permiten la posibilidad de que al menos uno de los componentes pueda mediar una función que se ejerce sobre al menos uno de los otros componentes. A título ilustrativo, una secuencia reguladora transcripcional, tal como un promotor, está ligada operativamente a una secuencia codificante si la secuencia reguladora transcripcional controla el nivel de transcripción de la secuencia codificante en respuesta a la presencia o ausencia de uno o más factores reguladores transcripcionales. Una secuencia reguladora transcripcional ligada operativamente está generalmente unida en cis con una secuencia codificante, pero no necesita estar directamente adyacente a ella. Por ejemplo, un potenciador puede constituir una secuencia reguladora transcripcional que está ligada operativamente a una secuencia codificante, incluso aunque no sean contiguas.

Con respecto a polipéptidos de fusión, la expresión "ligado operablemente" o "ligado operativamente" se puede referir al hecho de que cada uno de los componentes realiza la misma función en ligación con el otro componente como lo haría si no estuviese ligado. Por ejemplo, con respecto a un polipéptido de fusión en el que un dominio de unión del ADN de ZFP se fusiona a un dominio de activación transcripcional (o un fragmento funcional del mismo), el dominio de unión del ADN de ZFP y el dominio de activación transcripcional (o un fragmento funcional del mismo) están ligados operativamente si, en el polipéptido de fusión, la porción del dominio de unión del ADN de ZFP es capaz de unirse a su sitio diana y/o a su sitio de unión, mientras que el dominio de activación transcripcional (o un fragmento funcional del mismo) es capaz de activar la transcripción.

El término "recombinante", cuando se usa con referencia a una célula, indica que la célula replica un ácido nucleico exógeno, o expresa un péptido o proteína codificado por un ácido nucleico exógeno. Las células recombinantes pueden contener genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula. Las células recombinantes también pueden contener genes encontrados en la forma nativa de la célula, en la que los genes están modificados y son reintroducidos en la célula por medios artificiales. El término también engloba células que contienen un ácido nucleico endógeno a la célula que se ha modificado sin retirar el ácido nucleico de la célula; tales modificaciones incluyen las obtenidas mediante sustitución génica, mutación específica del sitio, y técnicas
relacionadas.

Un "casete de expresión recombinante", "casete de expresión" o "constructo de expresión" es un constructo de ácido nucleico, generado recombinante o sintéticamente, que tiene elementos de control que son capaces de efectuar la expresión de un gen estructural que está ligado operativamente a los elementos de control en hospedantes compatibles con tales secuencias. Los casetes de expresión incluyen al menos promotores y opcionalmente señales de terminación de la transcripción. Típicamente, el casete de expresión recombinante incluye al menos un ácido nucleico para ser transcrito (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido deseado), y un promotor. También se pueden usar, como se describe aquí, factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión. Por ejemplo, un casete de expresión puede incluir también secuencias nucleotídicas que codifican una secuencia señal que dirige la secreción de una proteína expresada a partir de la célula hospedante. También se pueden incluir en un casete de expresión las señales de terminación de la transcripción, los potenciadores, y otras secuencias de ácidos nucleicos que influyan en la expresión génica.

Un "promotor" se define como un conjunto de secuencias de control de ácidos nucleicos que dirigen la transcripción. Como se usa aquí, un promotor incluye típicamente secuencias de ácidos nucleicos necesarias próximas al sitio de partida de la transcripción, tales como en el caso de ciertos promotores de tipo ARN polimerasa II, un elemento TATA, una caja CCAAT, un sitio SP-1, etc. Como se usa aquí, un promotor también incluye opcionalmente elementos potenciadores o represores distantes, que pueden estar localizados varios miles de pares de bases desde el sitio de comienzo de la transcripción. Los promotores tienen a menudo un elemento que es sensible a la transactivación mediante un resto de unión del ADN tal como un polipéptido, por ejemplo un receptor nuclear, Gal4, el represor lac, y
similares.

Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de las condiciones medioambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que es activo en ciertas condiciones medioambientales o de desarrollo.

Un "promotor débil" se refiere a un promotor que tiene aproximadamente la misma actividad que un promotor que la timidina quinasa ("tk") del virus del herpes simple ("HSV") de tipo salvaje, o un promotor de HSV tk mutado, como se describe en Eisenberg y McKnight, Mol. Cell. Biol. 5:1940-1947 (1985).

Un "vector de expresión" es un constructo de ácido nucleico, generado recombinante o sintéticamente, con una serie de elementos de ácidos nucleicos específicos que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula hospedante, y opcionalmente la integración o replicación del vector de expresión en una célula hospedante. El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus, o fragmento de ácido nucleico, de origen vírico o no vírico. Típicamente, el vector de expresión incluye un "casete de expresión" que comprende un ácido nucleico para ser transcrito, ligado operablemente a un promotor. La expresión vector de expresión también engloba ADN desnudo ligado operablemente a un promotor.

Por "célula hospedante" se quiere decir una célula que contiene un vector de expresión o ácido nucleico, cualquiera de los cuales codifica opcionalmente una ZFP o una proteína de fusión de ZFP. La célula hospedante típicamente mantiene la replicación o expresión del vector de expresión. Las células hospedantes pueden ser células procariotas, tales como, por ejemplo, E. coli, o células eucariotas, tales como células de levadura, fúngicas, protozoicas, de plantas superiores, de insectos, o de anfibios, o células de mamíferos tales como CHO, HeLa, 293, COS-1, y similares, por ejemplo células cultivadas (in vitro), explantes y cultivos primarios (in vitro y ex vivo) y células in vivo.

La expresión "de origen natural", según se aplica a un objeto, significa que el objeto se puede encontrar en la naturaleza, distinto de ser artificialmente producido por seres humanos.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de forma intercambiable aquí para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos es un análogo o mimético de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural. Los polipéptidos se pueden modificar, por ejemplo, mediante la adición de restos de hidratos de carbono, para formar glucoproteínas. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" incluyen glucoproteínas, así como también no glucoproteínas. Las secuencias polipeptídicas se presentan aquí en la orientación N-terminal a C-terminal convencional.

Una "subsecuencia" o "segmento", cuando se usa en referencia a un ácido nucleico o polipéptido, se refiere a una secuencia de nucleótidos o aminoácidos que comprende una parte de una secuencia más larga de nucleótidos o aminoácidos (por ejemplo, un polipéptido), respectivamente.

"Neuropatía" se refiere a un estado clínico caracterizado por la muerte de neuronas y/o gliocitos, o por fallo de la regeneración neuronal tras un daño a los nervios. "Neuropatía diabética" se refiere de forma amplia a daño nervioso progresivo asociado con diabetes. Las neuropatías incluyen neuropatías periféricas, neuropatías autónomas y neuropatías focales.

Los términos "tratar" y "tratamiento", como se usan aquí, se refieren a la reducción en la gravedad y/o frecuencia de los síntomas, eliminación de los síntomas y/o causa subyacente, prevención de la aparición de síntomas y/o su causa subyacente, y mejora o remedio del daño.

Mediante una cantidad "eficaz" (o cantidad "terapéuticamente eficaz") de una composición farmacéutica se quiere decir una cantidad no tóxica del agente que es suficiente para proporcionar el efecto deseado. El término se refiere a una cantidad suficiente para tratar a un sujeto. De este modo, la expresión cantidad terapéutica se refiere a una cantidad suficiente para remediar un estado mórbido o los síntomas, previniendo, impidiendo, retardando o invirtiendo la progresión de la enfermedad o cualesquiera otros síntomas indeseables. La expresión cantidad profilácticamente eficaz se refiere a una cantidad dada a un sujeto que todavía no tiene la enfermedad, y de este modo es una cantidad para prevenir, impedir o retardar el comienzo de una enfermedad.

\vskip1.000000\baselineskip

II. Resumen

Se proporciona aquí una variedad de métodos para tratar neuropatías y estados neurodegenerativos. En particular, los métodos descritos aquí implican la modulación de la expresión de genes cuyos productos están implicados en diversos estados neuropáticos o neurodegenerativos (por ejemplo, neuropatía diabética, ALS). Tales genes incluyen, pero no se limitan a, aquellos que codifican factores de crecimiento neurotróficos, tales como, por ejemplo, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de crecimiento de nervios (NGF), el factor 2 de crecimiento similar a insulina (IGF-2), y similares, así como otros genes implicados en el metabolismo, por ejemplo aquellos que codifican productos implicados en el metabolismo de ácidos grasos para producir ácido gamma-linolénico (GLA), tales como los genes que codifican la enzima delta-6-desaturasa y delta-5-desaturasa.

En algunos casos, tales métodos implican poner en contacto una célula o población de células, tal como en un organismo, con una o más proteínas de dedos de cinc (ZFP) que se unen a secuencias específicas en uno o más de los genes descritos anteriormente (por ejemplo, VEGF, IGF-2). En ciertos métodos, se administra una ZFP y ésta es capaz de unirse a un sitio diana en diferentes genes (por ejemplo, un sitio diana en VEGF-A, VEGF-B y VEGF-C, o un sitio diana en VEGF-A e IGF-2). Otros métodos implican administrar una pluralidad de diferentes ZFP que se unen a múltiples sitios diana dentro de un gen particular. Como alternativa, una célula o población de células se puede poner en contacto con uno o más polinucleótidos que codifican una ZFP, de forma que el polinucleótido entra en una o más células, la ZFP codificada se expresa, y la proteína se une a su secuencia diana, modulando de ese modo la expresión del gen (o genes) en el que está localizada la secuencia diana.

De este modo, también se proporciona aquí una variedad de proteínas de dedos de cinc (y/o ácidos nucleicos que codifican tales proteínas de dedos de cinc) que son modificadas para que reconozcan específicamente y se unan a segmentos de ácidos nucleicos particulares (sitios diana o secuencias diana), en uno o más genes implicados en estados neuropáticos (por ejemplo, VEGF, IGF-2), modular la expresión de ese gen (o de esos genes), y de ese modo tratar neuropatías. El tratamiento de la neuropatía incluye tanto la prevención de la degeneración neuronal como la estimulación de la regeneración neuronal.

\newpage

En una realización, las ZFP están ligadas a dominios reguladores para crear factores de transcripción quiméricos para activar o reprimir la transcripción de genes diana.

Con ciertas ZFP, se puede potenciar la expresión de genes; con otras ciertas ZFP, se puede reprimir la expresión. En general, los sitios diana a los que se unen las ZFP son sitios a partir de los cuales la unión da como resultado la activación o represión de la expresión de un gen diana (por ejemplo, VEGF). El sitio diana puede estar adyacente a, en dirección 5' de, y/o en dirección 3' del sitio del comienzo de la transcripción (definido como nucleótido +1). Como se ha indicado anteriormente, algunas de las ZFP presentes modulan la expresión de un único gen. Otras ZFP modulan la expresión de una pluralidad de genes. De este modo, dependiendo de la ZFP o las ZFP particulares utilizadas, se puede individualizar el nivel en el que se expresa uno o más genes. Además, se pueden usar múltiples ZFP o moléculas de fusión de ZFP, que tienen distintos sitios diana, para regular un único gen.

En virtud de la capacidad de las ZFP para unirse a sitios diana e influir la expresión de genes seleccionados, las AFP proporcionadas aquí se pueden usar para tratar un amplio intervalo de neuropatías, tanto mediante la prevención de la degeneración nerviosa como mediante la estimulación de la regeneración nerviosa. En ciertas aplicaciones, las ZFP se pueden usar para activar la expresión de ciertos genes para iniciar el crecimiento beneficioso de nervios en poblaciones celulares, tanto in vitro como in vivo. Tal activación se puede utilizar, por ejemplo, para promover la formación de tejido nervioso y, en consecuencia, como tratamiento para las neuropatías.

Otros métodos implican la represión de genes que están sobreexpresados en neuropatías, o cuya expresión contribuye a una patología asociada con una neuropatía. Por ejemplo, en personas diabéticas, el exceso de glucosa se convierte en sorbitol mediante aldosa reductasa (AR). Las células no son permeables al sorbitol; en consecuencia, hay una tendencia a que el sorbitol se acumule en las células de los diabéticos. Por lo tanto, se espera que la represión de la expresión de la AR reduzca la gravedad de ciertos síntomas diabéticos que resultan de la acumulación de sorbitol. En consecuencia, se puede usar para el tratamiento una ZFP modificada para que se una a un sitio diana en el gen de la AR, que también comprende un dominio de represión transcripcional.

\vskip1.000000\baselineskip

III. Proteínas de dedos de cinc para regular una expresión génica A. General

Las proteínas de dedos de cinc (ZFP) descritas aquí son proteínas que se pueden unir a ADN de una manera específica de la secuencia. Como se ha indicado anteriormente, estas ZFP se pueden usar para tratar un número de estados neuropáticos. Un motivo ejemplar que caracteriza una clase de estas proteínas, la clase C_{2}H_{2}, es -Cys-
(X)_{2-4}-Cys-(X)_{12}-His-(X)_{3-5}-His (en el que X es cualquier aminoácido) (SEQ ID. NO:1). Varios estudios estructurales han demostrado que el dominio de dedos de cinc contiene una hélice alfa que contiene los dos restos de histidina invariantes, y un giro beta que contiene los dos restos de cisteína invariantes, en el que los dos restos de histidina invariantes y los dos restos de cisteína invariantes están coordinados a través de un ion de cinc. Sin embargo, las ZFP proporcionadas aquí no están limitadas a esta clase particular. Se conocen clases adicionales de proteínas de dedos de cinc, y también se pueden usar en los métodos y composiciones descritos aquí (véase, por ejemplo, Rhodes, et al. (1993) Scientific American 268:56-65 y la Publicación de Solicitud de Patente US nº 2003/0108880). En ciertas ZFP, un único dominio de dedos de cinc tiene alrededor de 30 aminoácidos de longitud. Los dominios de dedos de cinc están implicados no sólo en el reconocimiento del ADN, sino también en la unión del ARN y en la unión de proteína-proteína.

Se ha resuelto mediante rayos X la estructura cristalina de Zif268, un dominio de tres dedos procedente de un factor de transcripción murino, en complejo con una secuencia de ADN cognada, y se muestra que cada dedo se pude superponer sobre el siguiente mediante una rotación periódica. La estructura sugiere que cada dedo interaccione independientemente con ADN a lo largo de intervalos de 3 pares de bases, con cadenas laterales en las posiciones -1, 2, 3 y 6 en cada hélice de reconocimiento, formando contactos con nucleótidos en sus subsitios de tripletes de ADN respectivos. El término amino de Zif268 está situado en el extremo 3' de la hebra de ADN, con la cual forma la mayoría de los contactos. Algunos dedos de cinc se pueden unir a una cuarta base en un segmento diana. Si la hebra con la que una proteína de dedos de cinc forma la mayoría de los contactos se denomina la hebra diana, algunas proteínas de dedos de cinc se unen a un triplete de tres bases en la hebra diana, y a una cuarta base en la hebra no diana. La cuarta base es complementaria a la base inmediatamente en 3' del subsitio de las tres bases.

\vskip1.000000\baselineskip

B. ZFP ejemplares

Se describen aquí ZFP que han sido modificadas para que se unan a sitios diana en la secuencia de un gen implicado en un estado neuropático. La modificación de las ZFP se puede lograr, por ejemplo, mediante diseño racional o a través de selección empírica a partir de librerías aleatorizadas. Véanse, por ejemplo, las patentes US 6.453.242 y 6.534.261, en propiedad junto con la presente. Los ejemplos no limitantes de genes que codifican productos que pueden estar implicados en neuropatías incluyen factores de crecimiento neurotrópicos, tales como VEGF, IGF-2, así como enzimas (por ejemplo, enzimas implicadas en la síntesis de GLA). De este modo, las ZFP pueden incluir una variedad de dedos con diferentes componentes de composición variable de aminoácidos, con la condición de que la ZFP se una a un sitio diana en el gen o genes de interés.

Los sitios diana pueden estar localizados en dirección 5' o en dirección 3' del sitio de comienzo de la transcripción (definido como nucleótido +1). Algunos de los sitios diana incluyen 9 nucleótidos, algunos pueden incluir 12 nucleótidos, mientras que otros sitios incluyen 18 nucleótidos. Una característica de estos sitios diana es que la unión de una ZFP, o de una proteína de fusión que incluye una ZFP y uno o más dominios reguladores, al sitio diana pude afectar al nivel de expresión de uno o más genes. Los genes de VEGF ejemplares que se pueden regular mediante las ZFP proporcionadas aquí incluyen, pero no se limitan a, VEGF-A (incluyendo isoformas VEGF-A121, VEGF-A145, VEGF-A165, VEGF-A189, y VEGF-A206), VEGF B (incluyendo las isoformas VEGF-B167, y VEGF-B186), VEGF C, VEGF D, las proteínas similares a VEGF vírico (VEGF-E vírico) y VEGF-E de mamífero, VEGF-H, VEGF-R, VEGF-X, VEGF-138 y P1GF (incluyendo P1GF-1 y P1GF-2). Véase, también, la Solicitud de Patente US nº 20030021776A1.

Los sitios diana pueden estar localizados adyacentes al sitio de comienzo de la transcripción, o pueden estar localizados significativamente en dirección 5' o en dirección 3' del sitio de comienzo de la transcripción. Algunos sitios diana están localizados dentro de un único gen, de forma que la unión de una ZFP a la diana afecta a la expresión de un único gen. Otros sitios diana están localizados dentro de múltiples genes, de forma que la unión de una única ZFP puede modular la expresión de múltiples genes. Todavía en otros casos, se pueden usar múltiples AFP, reconociendo cada una dianas en el mismo gen o en genes diferentes.

Las ZFP que se unen a estos sitios diana incluyen típicamente al menos un dedo de cinc, pero pueden incluir una pluralidad de dedos de cinc (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o más dedos). Habitualmente, las ZFP incluyen al menos tres dedos. Algunas de las ZFP incluyen cuatro o seis dedos. Las ZFP que incluyen tres dedos reconocen típicamente un sitio diana que incluye 9 ó 10 nucleótidos; las ZFP que incluyen cuatro dedos reconocen típicamente un sitio diana que incluye 12 a 14 nucleótidos; mientras que las ZFP que tienen seis dedos pueden reconocer sitios diana que incluyen 18 a 21 nucleótidos. Las ZFP también pueden ser proteínas de fusión que incluyen uno o más dominios reguladores, dominios los cuales pueden ser dominios de activación o de represión transcripcionales.

En consecuencia, en las Tablas 1 y 2 se describen ejemplos específicos de tales ZFP. Las secuencias de VEGF examinadas para sitios diana incluyen las secuencias para los genes de VEGF-A (véase número de acceso GenBank AF095785), VEGF-B (véase número de acceso GenBank U80601 - - desde -0,4 kb hasta +0,32 kb), VEGF-C (véase número de acceso GenBank AF020393) y VEGF-D (véase, HSU69570 y HSY12864), así como también las secuencias para P1GF (véase número de acceso GenBank AC015837) y los genes de VEGF-E vírico (véase número de acceso GenBank AF106020 y Meyer, M., et al. (1999) EMBO J. 18:363-74; número de acceso GenBank S67520 y Lyttle, D. J. et al. (1994) J. Virol. 68:84-92; y número de acceso GenBank AF091434). De este modo, por ejemplo, la secuencia nucleotídica del gen de VEGF-A examinado para sitios diana se extiende desde 2,3 kb en dirección 5' del sitio de comienzo transcripcional hasta 1,1 kb en dirección 3' del sitio de comienzo
transcripcional.

En ciertas realizaciones, la neuropatía o neuropatías diabéticas y otros estados neuropáticos (por ejemplo, trauma nervioso, lesión de la médula espinal) son tratados usando una o más ZFP que se unen a un sitio diana en un gen de VEGF. La localización o localizaciones del sitio o sitios diana para las ZFP ejemplares descritas en las Tablas 1 y 2 en los diversos genes de VEGF se resume o resumen en la Tabla 3. La primera columna en esta tabla es un nombre de referencia interno para una ZFP, y corresponde al mismo nombre en la columna 1 de las Tablas 1 y 2. En las restantes columnas se enumera la localización del extremo 5' del sitio diana en diversas secuencias génicas de VEGF. Los números negativos en la Tabla 3 se refieren al número de nucleótidos en dirección 5' del sitio de comienzo transcripcional (definido como nucleótido +1), mientras que los números positivos indican el número de nucleótidos en dirección 3' del sitio de comienzo transcripcional.

De este modo, como se indica aquí, ciertas ZFP descritas aquí se pueden utilizar para tratar neuropatías diabéticas modulando la actividad de genes individuales, mientras que otras ZFP se pueden utilizar para regular la expresión de una pluralidad de genes. Mediante la selección juiciosa de las diversas ZFP proporcionadas aquí y/o sus combinaciones, se puede personalizar qué genes son modulados y, en consecuencia, qué neuropatía o neuropatías son
tratadas.

1

2

3

TABLA 3 Localizaciones del sitio diana en las secuencias del VEGF

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

IV. Características de las ZFP

Las proteínas de dedos de cinc están formadas por componentes de dedos de cinc. Por ejemplo, las proteínas de dedos de cinc pueden tener uno a treinta y siete dedos, habitualmente tienen 2, 3, 4, 5 ó 6 dedos. Una proteína de dedos de cinc reconoce y se une a un sitio diana (algunas veces denominado como un segmento diana) que representa una subsecuencia relativamente pequeña dentro de un gen diana. Cada dedo componente de una proteína de dedos de cinc se puede unir a un subsitio dentro del sitio diana. El subsitio incluye un triplete de tres bases contiguas, todas ellas en la misma hebra (algunas veces denominada como la hebra diana). El subsitio puede incluir también o no una cuarta base en la hebra opuesta, que es la complementaria de la base inmediatamente en 3' de las tres bases contiguas en la hebra diana. En muchas proteínas de dedos de cinc, un dedo de cinc se une a su subsitio de triplete sustancialmente de forma independiente de los otros dedos en la misma proteína de dedos de cinc. En consecuencia, la especificidad de unión de la proteína de dedos de cinc que contiene múltiples dedos habitualmente es aproximadamente el conjunto de las especificidades de sus dedos componentes. Por ejemplo, si una proteína de dedos de cinc está formada por un primer, un segundo y un tercer dedos que se unen individualmente a los tripletes XXX, YYY, y ZZZ, la especificidad de unión de la proteína de dedos de cinc es 3'XXX YYY ZZZ5'.

El orden relativo de los dedos en una proteína de dedos de cinc desde N-terminal hasta C-terminal determina el orden relativo de tripletes en la dirección de 3' a 5' en la diana. Por ejemplo, si una proteína de dedos de cinc comprende desde N-terminal hasta C-terminal los dedos primero, segundo y tercero que se unen individualmente, respectivamente, a los tripletes 5'GAC3', 5'GTA3' y 5'GGC3', entonces la proteína de dedos de cinc se une al segmento diana 3'CAGATGCGG5' (SEQ ID NO:148). Si la proteína de dedos de cinc comprende los dedos en otro orden, por ejemplo el segundo dedo, el primer dedo y el tercer dedo, entonces la proteína de dedos de cinc se une a un segmento diana que comprende una permutación diferente de los tripletes, en este ejemplo 3'ATGCAGCGG5' (SEQ ID NO:149). Véase Berg y Shi, Science 271, 1081-1086 (1996). La evaluación de las propiedades de unión de una proteína de dedos de cinc como el conjunto de sus dedos componentes puede, en algunos casos, estar influida por interacciones, dependientes del contexto, de múltiples dedos que se unen en la misma proteína.

Se pueden ligar dos o más proteínas de dedos de fin para que tengan una especificidad por la diana que es el conjunto de aquella de las proteínas de dedos de cinc componentes (véase, por ejemplo, Kim y Pabo, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2812-2817 (1998)). Por ejemplo, una primera proteína de dedos de cinc, que tenga los dedos componentes primero, segundo y tercero que se unan respectivamente a XXX, YYY y ZZZ, se puede ligar a una segunda proteína de dedos de cinc, que tenga los dedos componentes primero, segundo y tercero con especificidades de unión, AAA, BBB y CCC. La especificidad de unión de las proteínas primera y segunda combinadas es de este modo 3'XXXYYYZZZ_AAABBBCCC5', en la que el guión bajo indica una región interventora corta (típicamente 0-5 bases de cualquier tipo). En esta situación, el sitio diana se puede contemplar como aquél que comprende dos segmentos diana separados por un segmento interventor.

La ligazón se puede lograr mediante cualquiera de los siguientes ligadores peptídicos:

\quad: T G E K P: (SEQ ID NO:150) (Liu et al., 1997, más arriba); (G_{4}S)_{n} (SEQ ID NO:151) (Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:1156-1160 (1996.); GGRRGGGS; (SEQ ID NO:152) LRQRDGERP; (SEQ ID NO:153) LRQKDGGGSERP; (SEQ ID NO:154) LRQKD(G_{3}S)_{2}ERP (SEQ ID NO:155).

Como alternativa, se pueden diseñar racionalmente ligadores flexibles usando programas de ordenador capaces de modelar tanto sitios de unión del ADN como los propios péptidos, o mediante métodos de presentación de fagos. En una variación adicional, la ligazón no covalente se puede lograr fusionando dos proteínas de dedos de cinc con dominios que promuevan la formación heterodímera de las dos proteínas de dedos de cinc. Por ejemplo, una proteína de dedos de cinc se puede fusionar con fos, y la otra con jun (véase Barbas et al., documento WO 95/119431).

La ligazón de dos o más proteínas de dedos de cinc es ventajosa para conferir una especificidad de unión única dentro de un genoma de mamífero. Un genoma diploide de mamífero típico consta de 3 x 10e9 pb. Suponiendo que los cuatro nucleótidos A, C, G y T están distribuidos al azar, una secuencia dada de 9 pb está presente aproximadamente 23.000 veces. De este modo, una ZFP que reconozca una diana de 9 pb con especificidad absoluta tendría el potencial para unirse a alrededor de 23.000 sitios dentro del genoma. Una secuencia de 18 pb está presente alrededor de una vez en una secuencia de ADN al azar, cuya complejidad es diez veces la de un genoma de mamífero.

Un dedo componente de la proteína de dedos de cinc contiene típicamente alrededor de 30 aminoácidos, y, en una realización, tiene el siguiente motivo (N-C):

(SEQ ID NO:156)Cys-(X)_{2-4}-Cys-X.X.X.X.X.X.X.X.X.X.X.X-His-(X)_{3-5}-His \hskip2cm

Los dos restos de histidina invariantes y los dos restos de cisteína invariantes, en un único giro beta, están coordinados a través de un átomo de cinc (véase, por ejemplo, Berg y Shi, Science 271, 1081-1085 (1996)). El motivo anterior muestra una convención de numeración que es estándar en el campo para la región de un dedo de cinc que confiera especificidad de unión (la "región de reconocimiento"). Al aminoácido a la izquierda (lado N-terminal) del primer resto de His invariante se le asigna el número +6, y a los otros aminoácidos más allá a la izquierda se les asigna sucesivamente números decrecientes. La hélice alfa comienza en el resto 1 y se extiende al resto tras la segunda histidina conservada. Por lo tanto, toda la hélice tiene una longitud variable entre 11 y 13 restos.

\vskip1.000000\baselineskip

V. Diseño de las ZFP

Las ZFP proporcionadas aquí son modificadas para que reconozcan un sitio diana selecto en un gen asociado con una o más neuropatías diabéticas (por ejemplo, uno o más genes de VEGF).

El proceso de diseñar o seleccionar una ZFP comienza típicamente con una ZFP natural como fuente de los restos del armazón. El proceso de diseño o selección sirve para definir posiciones no conservadas (es decir, posiciones -1 hasta +6) para conferir una especificidad de unión deseada. Una ZFP adecuada es el dominio de unión del ADN del factor de transcripción de ratón Zif268. El dominio de unión del ADN de esta proteína tiene la secuencia de aminoácidos:

(SEQ ID NO:157)YACPVESCDRRFSRSDELTRHIRIHTGQKP (F1)

(SEQ ID NO:158)FQCRICMRNFSRSDHLTTHIRTHTGEKP (F2) {}\hskip0,25cm

(SEQ ID NO:159)FACDICGRKFARSDERKRHTKIHLRQK (F3) {}\hskip0,34cm

y se une a una diana 5' GCG TGG GCG 3' (SEQ ID NO:160).

Otra proteína de dedos de cinc natural adecuada como fuente de restos del armazón es Sp-1. La secuencia de Sp-1 usada para la construcción de proteínas de dedos de cinc corresponde a los aminoácidos 531 a 624 en el factor de transcripción de Sp-1. Esta secuencia tiene una longitud de 94 aminoácidos. Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente U.S. nº 20030021776 para la secuencia de Sp1 y una forma alternativa de Sp-1, denominada como una secuencia de consenso de Sp-1.

Sp-1 se une a un sitio diana 5'GGG GCG GGG3' (SEQ ID NO:161).

Hay un número de reglas de sustitución que ayudan al diseño racional de algunas proteínas de dedos de cinc. Por ejemplo, los dominios de unión del ADN de la ZFP se pueden diseñar y/o seleccionar para que reconozcan un sitio diana particular, como se describe en las patentes US 6.453.242 y 6.534.261 y en la Publicación de Solicitud de Patente US 2003/0068675, en propiedad junto con la presente; así como en las patentes U.S. n^{os} 5.789.538, 6.007.408, 6.013.453, 6.140.081 y 6.140.466, y en las publicaciones PCT WO 95/19431. WO 98/53057, WO 98/53058, WO 98/53059, WO 98/53060, WO 98/54311, WO 00/23464 y WO 00/27878. En una realización, un sitio diana para un dominio de unión del ADN de los dedos de cinc se identifica según reglas de selección de sitios descritas en la patente US 6.453.242, en propiedad junto con la presente. En ciertas realizaciones, una ZFP se puede seleccionar como se describe en el documento WO 02/077227, en propiedad junto con el presente. Véanse también el documento WO 96/06166; Desjarlais y Berg, PNAS 90, 2256-2260 (1993); Choo y Klug, PNAS 91, 11163-11167 (1994); Desjarlais y Berg, PNAS 89, 7345-7349 (1992); y Jamieson et al., Biochemistry 33:5689-5695 (1994).

Muchas de estas reglas están apoyadas por mutagénesis dirigida al sitio del dominio de tres dedos del factor de transcripción ubicuo, Sp-1 (Desjarlais y Berg, 1992; 1993). Una de estas reglas es que una 5'G en un triplete de ADN se puede unir mediante un dedo de cinc que incorpora arginina en la posición 6 de la hélice de reconocimiento. Otra regla de sustitución es que una G en mitad de un subsitio se puede reconocer mediante la inclusión de un resto de histidina en la posición 3 de un dedo de cinc. Una regla de sustitución adicional es que se puede incorporar asparagina para que reconozca A en medio de un triplete, y se puede incorporar ácido aspártico, ácido glutámico, serina o treonina para que reconozcan C en medio de un triplete, y se pueden incorporar aminoácidos con cadenas laterales pequeñas, tales como alanina, para que reconozcan T en medio de un triplete. Una regla de sustitución adicional es que la base en 3' de un subsitio de triplete se puede reconocer incorporando los siguientes aminoácidos en la posición -1 de la hélice de reconocimiento: arginina para que reconozca G, glutamina para que reconozca A, ácido glutámico (o ácido aspártico) para que reconozca C, y treonina para que reconozca T. Aunque estas reglas de sustitución son útiles para diseñar proteínas de dedos de cinc, no tienen en cuenta todos los posibles sitios diana. Además, la suposición que subyace a las reglas, a saber, que un aminoácido particular en un dedo de cinc es responsable de la unión a una base particular en un subsitio, es sólo aproximada. Las interacciones dependientes del contexto entre aminoácidos próximos en un dedo, o la unión de múltiples aminoácidos a una sola base o viceversa, pueden provocar una variación de las especificidades de unión predichas por las reglas de sustitución existentes. En consecuencia, en ciertas realizaciones, un dominio de unión del ADN de ZFP, de especificidad predeterminada, se obtiene según los métodos descritos en el documento WO 02/077227 y/o en la

\hbox{Publicación de
Solicitud de patente US 2003/0068675, en propiedad junto con la
presente.}

Se puede usar cualquier método adecuado conocido en la técnica para diseñar y construir ácidos nucleicos que codifican las ZFP, por ejemplo presentación de fagos, mutagénesis al azar, librerías combinatorias, diseño por ordenador/racional, selección por afinidad, PCR, clonación a partir de librerías de ADNc o genómicas, construcción sintética, y similares (véase, por ejemplo, la patente U.S. nº 5.786.538; Wu et al., PNAS 92:344-348 (1995); Jamieson et al., Biochemistry 33:5689-5695 (1994); Rebar y Pabo, Science 263:671-673 (1994); Choo y Klug, PNAS 91:11163-11167 (1994); Choo y Klug, PNAS 91: 11168-11172 (1994); Desjarlais y Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993); Desjarlais y Berg, PNAS 89:7345-7349 (1992); Pomerantz et al., Science 267:93-96 (1995); Pomerantz et al., PNAS 92:9752-9756 (1995); y Liu et al., PNAS 94:5525-5530 (1997); Griesman y Pabo, Science 275:657-661 (1997); Desjarlais y Berg, PNAS 91:11-99-11103 (1994)).

En ciertas realizaciones preferidas, la especificidad de unión de un dominio de unión del ADN (por ejemplo, un dominio de unión del ADN de ZFP) se determina identificando regiones accesibles en la secuencia en cuestión (por ejemplo, en la cromatina celular). Las regiones accesibles se pueden determinar como se describe en el documento WO 01/83732, en propiedad junto con la presente. Véase, también, la Solicitud de Patente U.S. nº 20030021776A1. Después, se diseña y/o selecciona un dominio de unión del ADN como se describe aquí para que se una a un sitio diana dentro de la región accesible.

\vskip1.000000\baselineskip

VI. Proteínas de dedos de cinc ejemplares y equivalentes

Se describen aquí composiciones y métodos para la regulación de la transcripción, que son útiles, por ejemplo, para el tratamiento de estados neurodegenerativos y neuropatías. Aquellos incluyen proteínas de fusión que comprenden una proteína de dedos de cinc modificada y un dominio funcional tal como, por ejemplo, un dominio de activación transcripcional. Los dominios funcionales adecuados son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, dominios de activación transcripcional tal como, por ejemplo, VP16, VP64 y p65. Además, en una proteína de fusión dada puede estar presente uno o más de los mismos o diferentes dominios funcionales (por ejemplo, dominios de activación transcripcional). Véase la Publicación de Solicitud de Patente U.S. 2002/0160940, en propiedad junto con la presente, incorporada aquí como referencia, para una descripción de dominios de activación y de represión transcripcional ejemplares.

En ciertas realizaciones, una proteína de dedos de cinc se modifica para que se una a la secuencia diana GGGGGTGAC (SEQ ID NO:26), que está presente en el gen de VEGF-A. Se ha modificado así una proteína de dedos de cinc de tres dedos ejemplar, VOP32E. Las regiones de reconocimiento de los tres dedos de cinc de VOP32E tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

(SEQ ID NO:55)F1: DRSNLTR

(SEQ ID NO:141)F2: TSGHLSR

(SEQ ID NO:68).F3: RSDHLSR

Estas secuencias de aminoácidos corresponden a restos -1 a +6 con respecto al comienzo de la porción helicoidal de un dedo de cinc, y se denominan "regiones de reconocimiento" debido a que uno o más de estos restos participan en la especificidad de secuencia de la unión a ácidos nucleicos. En consecuencia, las proteínas que comprenden las mismas tres regiones de reconocimiento en una secuencia de cadena principal polipeptídica diferente se consideran equivalentes a la proteína VOP32E, puesto que tendrán la misma especificidad de unión del ADN.

De este modo, en ciertas realizaciones, las tres regiones de reconocimiento (SEQ ID NOS:55, 141 y 68) se pueden colocar en cualquier cadena principal de los dedos de cinc (véanse, por ejemplo, las patentes U.S. 6.453.242 y 6.534.261), y la proteína resultante se puede usar para regular la transcripción de VEGF, por ejemplo, para promover la regeneración neuronal. En consecuencia, las proteínas de dedos de cinc modificadas, que comprenden la siguiente secuencia, se pueden usar en los métodos descritos:

C-X_{2-4}-C-X_{5}-D-R-S-N-L-T-R-H-X_{3-5}-H-X_{7}-C-X_{2-4}-C-X_{5}-T-S-G-H-L-S-R-H-X_{3-5}-H-X_{7}-C-X_{2-4}-C-X_{5}-R-S-D-H-L-S-R-H-X_{3-5}-H: \\[2.1mm]{}\hskip1,5cm (SEQ ID NO:162).

Dentro de la región de reconocimiento, los restos -1, +3 y +6 son responsables principalmente de los contactos de proteína-nucleótido. En consecuencia, los ejemplos no limitantes de equivalentes adicionales incluyen proteínas que comprenden tres dedos de cinc, en las que el primer dedo contiene un resto D en -1, un resto N en +3 y un resto R en +6 (DXXNXXR, SEQ ID NO:163); el segundo dedo contiene un resto T en -1, un resto H en +3 y un resto R en +6 (TXXHXXR, SEQ ID NO:164); y el tercer dedo contiene un resto R en -1, un resto H en +3 y un resto R en +6 (RXXHXXR, SEQ ID NO:165). De este modo, por ejemplo, las proteínas que comprenden la SEQ ID NO:166 se consideran equivalentes para uso en los métodos descritos.

C-X_{2-4}-C-X_{5}-D-X-X-N-X-X-R-H-X_{3-5}-H-X_{7}-C-X_{2-4}-C-X_{5}-T-X-X-H-X-X-R-H-X_{3-5}-H-X_{7}-C-X_{2-4}-C-X_{5}-R-X-X-H-X-X-R-H-X_{3-5}-H: \\[2.1mm]{}\hskip1,5cm (SEQ ID NO:166)

Equivalentes adicionales comprenden cualquier ZFP que se une a una secuencia que comprende la secuencia diana GGGGGTGAC (SEQ ID NO:26).

Se han descrito las correspondencias entre aminoácidos en los restos del contacto -1, +3 y +6 de la región de reconocimiento de un dedo de cinc, y los nucleótidos en un sitio diana. Véanse, por ejemplo, las patentes U.S. n^{os} 6.007.988, 6.013.453, 6.746.838 y 6.866.997, así como también las Publicaciones PCT WO 96/06166, WO 98/53058, WO 98/53059 y WO 98/53060. En consecuencia, también se han de considerar equivalentes las proteínas de dedos de cinc de tres dedos en las que el primer dedo contiene D o H en -1; N en +3 y R, K, S o T en +6 (y si contiene S o T, también contiene D en la posición +2 del dedo de cinc C-terminal adyacente); el segundo dedo contiene H, T, N o Q en -1; H en +3 y R, K, S o T en +6 (y si contiene S o T, también contiene D en la posición +2 del dedo de cinc C-terminal adyacente); y el tercer dedo contiene R en -1; H en +3, y R, K, S o T en +6 (y si contiene S o T, también contiene D en la posición +2 del dedo de cinc C-terminal adyacente).

VII. Producción de proteínas de dedos de cinc A. Síntesis y clonación

Los polipéptidos de ZFP y ácidos nucleicos que codifican a los mismos se pueden obtener usando técnicas normales en el campo de la genética recombinante. Los textos básicos que describen métodos generales incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)). Además, los ácidos nucleicos menores que alrededor de 100 bases se pueden ordenar de cualquiera de una variedad de fuentes comerciales, tales como The Midland Certified Reagent Company (mcrc@oligos.com), The Great American Gene Company (http://www.genco.com), ExpressGen Inc. (www.expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, Calif.). De forma similar, los péptidos se pueden ordenar de cualquiera de una variedad de fuentes, tales como PeptidoGenic (pkim@ccnet.com), HTI Bio-products, Inc. (http://www.htibio.com), BMA Biomedicals Ltd. (U.K.), Bio. Synthesis, Inc.

Los oligonucleótidos se pueden sintetizar químicamente según el método del triéster de fosforamidito en fase sólida, descrito en primer lugar por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letts. 22:1859-1862 (1981), usando un sintetizador automatizado, como se describe en Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984). La purificación de los oligonucleótidos se realiza mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante, o mediante HPLC de fase inversa. La secuencia de los genes clonados y de los oligonucleótidos sintéticos se puede verificar tras la clonación usando, por ejemplo, el método de la terminación de cadena para la secuenciación de moldes bicatenarios de Wallace et al., Gene 16:21-26 (1981).

Típicamente se usan dos métodos alternativos para crear las secuencias codificantes requeridas para expresar péptidos que se unen a ADN recientemente diseñados. Un protocolo es un procedimiento de ensamblaje a base de PCR, que utiliza seis oligonucleótidos que se solapan. Tres oligonucleótidos corresponden a secuencias "universales", que codifican porciones del dominio de unión del ADN entre las hélices de reconocimiento. Estos oligonucleótidos permanecen típicamente constantes para todos los constructos de dedos de cinc. Los otros tres oligonucleótidos "específicos" se diseñan para codificar las hélices de reconocimiento. Estos oligonucleótidos contienen sustituciones principalmente en las posiciones -1, 2, 3 y 6 en las hélices de reconocimiento, haciéndolos específicos para cada uno de los diferentes dominios de unión del ADN.

La síntesis mediante PCR se lleva a cabo en dos etapas. En primer lugar, se crea un molde de ADN bicatenario combinando los seis oligonucleótidos (tres universales, tres específicos) en una reacción de PCR de cuatro ciclos, con una etapa de hibridación a baja temperatura, hibridando de ese modo los oligonucleótidos para formar un "andamiaje" de ADN. Los espacios en el andamiaje se rellenan mediante polimerasa termoestable de alta fidelidad, aunque también es suficiente la combinación de Taq y Pfu polimerasas. En la segunda fase de la construcción, el molde de dedos de cinc se amplifica mediante cebadores externos diseñados para incorporar sitios de restricción en cada extremo para la clonación en un vector lanzadera, o directamente en un vector de expresión.

Un método alternativo para clonar las proteínas de unión del ADN recientemente diseñadas reside en la hibridación de oligonucleótidos complementarios que codifican las regiones específicas de la ZFP deseada. Esta aplicación particular requiere que los oligonucleótidos sean fosforilados antes de la etapa final de ligación. Esto se realiza habitualmente antes de montar las reacciones de hibridación. De forma breve, los oligonucleótidos "universales" que codifican las regiones constantes de las proteínas (oligos 1, 2 y 3 de los anteriores) se hibridan con sus oligonucleótidos complementarios. Adicionalmente, los oligonucleótidos "específicos" que codifican las hélices de reconocimiento de los dedos se hibridan con sus oligonucleótidos complementarios respectivos. Estos oligos complementarios se diseñan para rellenar la región que se rellenó previamente por la polimerasa en el protocolo mencionado anteriormente. Los oligonucleótidos complementarios a los oligos 1 y 6 se modifican para dejar secuencias que sobresalen específicas para los sitios de restricción usados en la clonación en el vector de elección en la siguiente etapa. El segundo protocolo de ensamblaje difiere del protocolo inicial en los siguientes aspectos: el "andamiaje" que codifica la ZFP recientemente diseñada está compuesto enteramente de ADN sintético, eliminando de ese modo la etapa de llenado con la polimerasa, y adicionalmente el fragmento a clonar en el vector no requiere amplificación. Finalmente, el diseño de proyecciones específicas de secuencias salientes elimina la necesidad de digestiones con enzimas de restricción del fragmento que se inserta. Como alternativa, se pueden crear cambios en las hélices de reconocimiento de la ZFP, usando métodos convencionales de mutagénesis dirigida al sitio.

Ambos métodos de ensamblaje requieren que el fragmento resultante que codifica la ZFP recientemente diseñada esté ligado en un vector. Finalmente, la secuencia que codifica la ZFP se clona en un vector de expresión. Los vectores de expresión que se utilizan habitualmente incluyen, pero no se limitan a, un vector de expresión bacteriano pMAL-c2 (New England BioLabs, Beverly, Mass.) o un vector de expresión eucariota, pcDNA (Promega, Madison, Wis.). Los constructos finales se verifican mediante análisis de secuencia.

Se puede usar cualquier método adecuado de purificación de proteínas, conocido por los expertos en la técnica, para purificar las ZFP (véase Ausubel, más arriba, y Sambrook, más arriba). Además, se puede usar cualquier hospedante adecuado para la expresión, por ejemplo células bacterianas, células de insectos, células de levadura, células de mamífero, y similares.

La expresión de una proteína de dedos de cinc fusionada a una proteína de unión de maltosa (MBP-ZFP), en la cepa bacteriana JM109, permite la purificación directa a través de una columna de amilosa (New England BioLabs, Beverly, Mass.). Se pueden obtener niveles elevados de expresión de la proteína quimérica de dedos de cinc mediante inducción con IPTG, puesto que la fusión de MBP-ZFP en el plásmido de expresión pMal-C2 está bajo el control del promotor tac (New England BioLabs, Beverly, Mass.). Las bacterias que contienen los plásmidos de fusión de MBP-ZFP se inoculan en medio YT (2x) que contiene 10 \muM de ZnCl_{2}, 0,02% de glucosa, más 50 \mug/ml de ampicilina, y se agitan a 37ºC. En el momento del crecimiento semiexponencial, se añade IPTG a 0,3 mM, y los cultivos se dejan agitar. Después de 3 horas, las bacterias se recogen mediante centrifugación, se destruyen mediante tratamiento con ultrasonidos o haciéndolas pasar a través de una célula a presión o a través del uso de lisozima, y el material insoluble se elimina mediante centrifugación. Las proteínas de MBP-ZFP se capturan en una resina unida a amilosa, se lavan profusamente con tampón que contiene 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM de NaCl, 5 mM de DTT y 50 \muM de ZnCl_{2}, después se eluyen con maltosa en esencialmente el mismo tampón (la purificación se basa en un protocolo estándar de New England BioLabs). Las proteínas purificadas se cuantifican y se almacenan para el análisis bioquímico.

La constante de disociación de una proteína purificada, por ejemplo Kd, se caracteriza típicamente vía ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA) (Buratowski y Chodosh, en Current Protocols in Molecular Biology p. 12.2.1-12.2.7 (Ausubel ed., 1996)). La afinidad se mide valorando la proteína purificada frente a una cantidad fija de diana oligonucleotídica bicatenaria marcada. La diana comprende típicamente la secuencia del sitio de unión natural flanqueada por las 3 pb encontradas en la secuencia natural y secuencias de flanqueo constantes, adicionales. El sitio de unión natural tiene típicamente 9 pb para una proteína de tres dedos y 2 X 9 pb + bases interventoras para una ZFP de seis dedos. Las dianas oligonucleotídicas hibridadas poseen una protuberancia saliente de 1 base en 5' que permite el marcado eficaz de la diana con la polinucleotidoquinasa del fago T4. Para el ensayo, la diana se añade a una concentración de 1 nM o inferior (la concentración real se mantiene al menos 10 veces menor que la constante de disociación esperada), las ZFP purificadas se añaden a diversas concentraciones, y se deja que la reacción se equilibre durante al menos 45 minutos. Además, la mezcla de reacción también contiene 10 mM de Tris (pH 7.5), 100 mM de KCl, 1 mM de MgCl_{2}, 0,1 mM de ZnCl_{2}, 5 mM de DTT, 10% de glicerina, y 0,02% de BSA.

Las reacciones equilibradas se cargan sobre un gel de poliacrilamida al 10%, que previamente se ha hecho pasar durante 45 minutos en un tampón de Tris/glicina, y después la diana marcada unida y no unida se resuelve mediante electroforesis a 150 V. Como alternativa, se pueden usar geles de Tris-HCl de gradiente de 10-20%, que contienen un gel pegajoso de poliacrilamida al 4%. Los geles secos se visualizan mediante autorradiografía o formación de fosforoimágenes, y la Kd aparente se determina calculando la concentración de proteína que produce la unión semimáxima.

El ensayo también puede incluir una determinación de la fracción activa en las preparaciones proteínicas. La fracción activa se determina mediante desplazamientos estequiométricos del gel, en el que la proteína se valora frente a una concentración elevada de ADN diana. Las valoraciones se realizan a 100, 50 y 25% de la diana (habitualmente a niveles micromolares).

\vskip1.000000\baselineskip

B. Presentación de fagos

La técnica de presentación de fagos proporciona un medio enormemente empírico para generar proteínas de dedos de cinc con una especificidad deseada por la diana (véase, por ejemplo, Rebar, patente US 5.789.538; Choo et al., documento WO 96/06166; Barbas et al., documentos WO 95/19431 y WO 98/543111; Jamieson et al., más arriba). El método se puede usar conjuntamente con, o como alternativa a, el diseño racional. El método implica la generación de diversas librerías de proteínas de dedos de cinc mutagenizadas, seguido del aislamiento de las proteínas con las propiedades de unión del ADN deseadas, usando métodos de selección mediante afinidad. Para usar este método, el experimentador procede típicamente según lo siguiente. En primer lugar, se muta un gen para una proteína de dedos de cinc para introducir diversidad en regiones importantes para la especificidad y/o afinidad de unión. En una aplicación típica, esto se logra vía la aleatorización de un único dedo en las posiciones -1, +2, +3 y +6, y algunas veces en posiciones accesorias tales como +1, +5, +8 y +10. Después, el gen mutado se clona en un fago o vector fagémido como una fusión con el gen III de un fago filamentoso, que codifica la proteína de revestimiento pIII. El gen de dedo de cinc se inserta entre segmentos del gen III que codifica el péptido de la señal exportadora de membrana y el resto de pIII, de forma que la proteína de dedos de cinc se expresa como una fusión aminoterminal con pIII en la proteína procesada, madura.

Cuando se usan vectores fagémidos, el gen de dedo de cinc mutado también se puede fusionar a una versión truncada del gen III que codifica, como mínimo, la región C-terminal requerida para el ensamblaje de pIII en la partícula fágica. La librería del vector resultante se transforma en E. coli, y se usa para producir un fago filamentoso que expresa proteínas de dedos de cinc variantes sobre su superficie como fusiones con la proteína de revestimiento pIII. Si se usa un vector fagémido, entonces esta etapa requiere la superinfección con el fago auxiliar. La librería fágica se incuba entonces con un sitio de ADN diana, y se usan métodos de selección mediante afinidad para aislar el fago que se une a la diana con afinidad elevada desde el fago en su conjunto. Típicamente, la diana de ADN se inmoviliza sobre un soporte sólido, que entonces se lava en condiciones suficientes para eliminar todo menos el fago de unión más fuerte. Después del lavado, cualquier fago que quede sobre el soporte se recupera vía elución en condiciones que destruyen la unión de los dedos de cinc con el ADN. El fago recuperado se usa para infectar E. coli nueva, que entonces se amplifica y se usa para producir un nuevo lote de partículas fágicas. Entonces se repiten la selección y la amplificación tantas veces como sean necesarias para enriquecer el conjunto fágico de aglutinantes potentes, de forma que estos se puedan identificar usando métodos de secuenciación y/o de cribado. Aunque el método se ilustra para pIII, se pueden usar principios análogos para identificar variantes de ZFP como fusiones de pVIII.

En ciertas realizaciones, la secuencia unida mediante una proteína de dedos de cinc particular se determina llevando a cabo reacciones de unión (véase, por ejemplo, las condiciones para la determinación de Kd, más arriba) entre la proteína y un conjunto de secuencias oligonucleotídicas bicatenarias, distribuidas al azar. La reacción de unión se analiza mediante un ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA), en el que los complejos de proteína-ADN sufren una migración retardada en un gel, y se pueden separar del ácido nucleico no unido. Los oligonucleótidos que se han unido al dedo se purifican del gel y se amplifican, por ejemplo mediante una reacción en cadena de la polimerasa. La selección (es decir, la reacción de unión y el análisis mediante EMSA) se repite entonces tantas veces como se desee, con las secuencias oligonucleotídicas seleccionadas. De esta manera, se determina la especificidad de unión de una proteína de dedos de cinc que tiene una secuencia de aminoácidos particular.

\vskip1.000000\baselineskip

C. Dominios reguladores

Las proteínas de dedos de cinc se expresan a menudo con un dominio exógeno (o un fragmento funcional del mismo) como proteínas de fusión. Los dominios habituales para la adición a la ZFP incluyen, por ejemplo, dominios de factores de transcripción (activadores, represores, coactivadores, correpresores), silenciadores, oncogenes (por ejemplo, miembros de la familia de myc, jun, fos, myb, max, mad, rel, ets, bcl, myb, mos, etc.); enzimas de reparación del ADN y sus factores asociados y modificadores; enzimas de transposición del ADN y sus factores y modificadores asociados; proteínas asociadas a cromatina y sus modificadores (por ejemplo, quinasas, acetilasas y desacetilasas); y enzimas que modifican el ADN (por ejemplo, metiltransferasas, topoisomerasas, helicasas, ligasas, quinasas, fosfatasas, polimerasas, endonucleasas) y sus factores y modificadores asociados. Un dominio preferido para la fusión con una ZFP cuando la ZFP se va a usar para la expresión represora de un gen diana es un dominio de represión de KRAB procedente de la proteína KOX-1 humana (Thiesen et al., New Biologist 2, 363-374 (1990); Margolin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4509-4513 (1994); Pengue et al., Nucl. Acids Res. 22:2908-2914 (1994); Witzgall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4514-4518 (1994)). Los dominios preferidos para lograr la activación incluyen el dominio de activación de VP16 del HSV (véase, por ejemplo, Hagmann et al., J. Virol. 71, 5952-5962 (1997)); receptores de hormonas nucleares (véase, por ejemplo, Torchia et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383 (1998)); la subunidad p65 del factor nuclear kappa B (Bitko y Barik, J. Virol. 72:5610-5618 (1998) y Doyle y Hunt, Neuroreport 8:2937-2942 (1997)); Liu et al., Cancer Gene Ther. 5:3-28 (1998)), o dominios funcionales quiméricos artificiales tales como VP64 (Seifpal et al., EMBO J. 11, 4961-4968 (1992)).

La identificación de nuevas secuencias y regiones accesibles (por ejemplo, sitios hipersensibles a DNasa I) en genes asociados con neuropatía diabética (por ejemplo, VEGF) permite el diseño de moléculas de fusión para el tratamiento de neuropatía diabética. De este modo, en ciertas realizaciones, las composiciones y métodos descritos aquí implican fusiones entre un dominio de unión del ADN, específicamente dirigido a una o más regiones reguladoras de un gen de VEGF, y un dominio (o un polinucleótido que codifica tal fusión) funcional (por ejemplo, de represión o de activación). De esta manera, el dominio de represión o de activación se coloca próximo a una secuencia en el gen que está unido por el dominio de unión del ADN. La función reguladora transcripcional del dominio funcional es capaz entonces de actuar sobre las secuencias reguladoras seleccionadas. Véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente US nº 2002-0064802.

En realizaciones adicionales, se puede usar el remodelado de cromatina dirigido a una diana, como se describe en el documento WO 01/83793, en propiedad junto con la presente, para generar uno o más sitios en la cromatina celular que sean accesibles a la unión de una molécula que se une a ADN.

Las moléculas de fusión se construyen mediante métodos de clonación y conjugación bioquímica, que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las moléculas de fusión comprenden un dominio de unión del ADN y un dominio funcional (por ejemplo, un dominio de activación o de represión transcripcional). Las moléculas de fusión también comprenden opcionalmente señales de localización nuclear (tales como, por ejemplo, las del antígeno T medio del SV40) y etiquetas de epítopos (tales como, por ejemplo, FLAG y hemaglutinina). Las proteínas de fusión (y los ácidos nucleicos que las codifican) se diseñan de forma que el marco de lectura traduccional se conserva entre los componentes de la fusión.

Las fusiones entre un componente polipeptídico de un dominio funcional (o un fragmento funcional del mismo), por un lado, y un dominio de unión del ADN no proteínico (por ejemplo, antibiótico, intercalador, ligando de unión al surco menor, ácido nucleico), por otro lado, se construyen mediante métodos de conjugación bioquímica conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, el catálogo de Pierce Chemical Company (Rockford, IL). Se han descrito los métodos y composiciones para obtener fusiones entre un ligando de unión al surco menor y un polipéptido. Mapp et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3930-3935.

En ciertas realizaciones, el sitio diana unido mediante la proteína de dedos de cinc está presente en una región accesible de la cromatina celular. Las regiones accesibles se pueden determinar como se describe, por ejemplo, en la Publicación Internacional WO 01/83732, en propiedad junto con la presente. Si el sitio diana no está presente en una región accesible de la cromatina celular, se pueden generar una o más regiones accesibles como se describe en el documento WO 01/83793, en propiedad junto con la presente. En realizaciones adicionales, el dominio de unión del ADN de una molécula de fusión es capaz de unirse a la cromatina celular independientemente de que su sitio diana esté o no en una región accesible. Por ejemplo, tales dominios de unión del ADN son capaces de unirse a ADN ligador y/o a ADN nucleosómico. Los ejemplos de este tipo de dominio de unión del ADN "pionero" se encuentran en ciertos receptores de esteroides y en el factor nuclear 3 hepatocítico (HNF3). Cordingley et al. (1987) Cell 48:261-270; Pina et al. (1990) Cell 60:719-731; y Cirillo et al. (1998) EMBO J. 17:244-254.

Para tales aplicaciones, la molécula de fusión se formula típicamente con un vehículo farmacéuticamente aceptable, como es conocido por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed., 1985; y el documento WO 00/42219, en propiedad junto con la presente.

El componente/dominio funcional de una molécula de fusión se puede seleccionar de una variedad de diferentes componentes capaces de influir en la transcripción de un gen una vez que la molécula de fusión se une a una secuencia diana vía su dominio de unión del ADN. Por tanto, el componente funcional puede incluir, pero no se limita a, diversos dominios de factores de transcripción, tales como activadores, represores, coactivadores, correpresores, y silenciadores.

Los dominios funcionales ejemplares para fusionarlos con un dominio de unión del ADN, tal como, por ejemplo, una ZFP, para usarlos para reprimir la expresión de un gen, son el dominio de represión de KOX y el dominio de represión de KRAB procedente de la proteína KOX-1 humana (véase, por ejemplo, Thiesen et al., New Biologist 2, 363-374 (1990); Margolin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4509-4513 (1994); Pengue et al., Nucl. Acids Res. 22:2908-2914 (1994); Witzgall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4514-4518 (1994)). Otro dominio de represión adecuado es la proteína 2B del dominio de unión a metilo(MBD-2B) (véase, también Hendrich et al. (1999) Mamm Genome 10:906-912 para una descripción de las proteínas de MBD). Otro dominio de represión útil es el asociado con la proteína de v-ErbA protein. Véase, por ejemplo, Damm, et al. (1989) Nature 339:593-597; Evans (1989) Int. J. Cancer Suppl. 4:26-28; Pain et al. (1990) New Biol. 2:284-294; Sap et al. (1989) Nature 340:242244; Zenke et al. (1988) Cell 52:107-119; y Zenke et al. (1990) Cell 61:1035-1049.

Los dominios adecuados para lograr la activación incluyen el dominio de activación de VP16 del HSV (véase, por ejemplo, Hagmann et al., J. Virol. 71, 5952-5962 (1997)) receptores hormonales nucleares (véase, por ejemplo, Torchia et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383 (1998)); la subunidad p65 del factor nuclear kappa B (Bitko y Barik, J. Virol. 72:5610-5618 (1998) y Doyle y Hunt, Neuroreport 8:2937-2942 (1997)); Liu et al., Cancer Gene Ther. 5:3-28 (1998)), o dominios funcionales quiméricos artificiales, tales como VP64 (Seifpal et al., EMBO J. 11, 4961-4968 (1992)). Dominios de activación ejemplares adicionales incluyen, pero no se limitan a, VP16, VP64, p300, CBP, PCAF, SRC1 PvALF, AtHD2A y ERF-2. Véase, por ejemplo, Robyr et al. (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347; Collingwood et al. (1999) J. Mol. Endocrinol. 23:255-275; Leo et al. (2000) Gene 245:1-11; Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol. 46:77-89; McKenna et al. (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12; Malik et al. (2000) Trends Biochem. Sci. 25:277-283; y Lemon et al. (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:499-504. Dominios de activación ejemplares adicionales incluyen, pero no se limitan a, OsGAI, HALF-1, C1, AP1, ARF-5, -6, -7 y -8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP, y TRAB1. Véase, por ejemplo, Ogawa et al. (2000) Gene 245:21-29; Okanami et al. (1996) Genes Cells 1:87-99; Goff et al. (1991) Genes Dev. 5:298-309; Cho et al. (1999) Plant Mol. Biol. 40:419-429; Ulmason et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5844-5849; Sprenger-Haussels et al. (2000) Plant J. 22:1-8; Gong et al. (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44; y Hobo et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15.348-15.353.

Los dominios de represión ejemplares adicionales incluyen, pero no se limitan a, KRAB, KOX, SID, MBD2, MBD3, miembros de la familia de DNMT (por ejemplo, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B), Rb, y MeCP2. Véase, por ejemplo, Bird et al. (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450; y Robertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342. Los dominios de represión ejemplares adicionales incluyen, pero no se limitan a, ROM2 y AtHD2A. Véase, por ejemplo, Chem et al. (1996) Plant Cell 8:305-321; y Wu et al. (2000) Plant J. 22:19-27.

Dominios funcionales ejemplares adicionales se describen, por ejemplo, en la patente US nº 6.534.261 y en la Publicación de Solicitud de Patente US nº 2002/0160940, en propiedad junto con la presente.

\vskip1.000000\baselineskip

D. Vectores de expresión

El ácido nucleico que codifica la ZFP de elección se clona típicamente en vectores intermedios para la transformación en células procariotas o eucariotas para la replicación y/o expresión, por ejemplo para la determinación de K_{d}. Los vectores intermedios son típicamente vectores procariotas, por ejemplo plásmidos, o vectores lanzadera, o vectores de insectos, para el almacenamiento o manipulación del ácido nucleico que codifica la ZFP, o para la producción de proteína. El ácido nucleico que codifica una ZFP también se clona típicamente en un vector de expresión, para administración a una célula vegetal, una célula animal, preferiblemente una célula de mamífero o una célula de un ser humano, una célula fúngica, una célula bacteriana, o una célula de un protozoo.

Para obtener la expresión de un gen o ácido nucleico clonado, se subclona típicamente una ZFP en un vector de expresión que contiene un promotor para dirigir la transcripción. Los promotores bacterianos y eucariotas adecuados son bien conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994). Los sistemas de expresión bacterianos, para expresar la ZFP, están disponibles en, por ejemplo, E. coli, Bacillus sp., y Salmonella (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983)). Existen comercialmente kits para tales sistemas de expresión. Los sistemas de expresión eucariotas para células de mamífero, levadura, y células de insecto, son bien conocidos en la técnica, y también están comercialmente disponibles.

El promotor usado para dirigir la expresión de un ácido nucleico de una ZFP depende de la aplicación particular. Por ejemplo, típicamente se usa un promotor constitutivo fuerte para la expresión y purificación de ZFP. Por el contrario, cuando se administra una ZFP in vivo para la regulación génica, se usa un promotor constitutivo o un promotor inducible, dependiendo del uso particular de la ZFP. Además, un promotor preferido para la administración de una ZFP puede ser un promotor débil, tal como HSV TK, o un promotor que tenga una actividad similar. El promotor típicamente puede incluir también elementos que son sensibles a la transactivación, por ejemplo elementos de respuesta a la hipoxia, elementos de respuesta a Gal4, elementos de respuesta a represores de lac, y sistemas de control de moléculas pequeñas tales como los sistemas regulados por tet y el sistema RU-486 (véase, por ejemplo, Gossen y Bujard, PNAS 89:5547 (1992); Oligino et al., Gene Ther. 5:491-496 (1998); Wang et al., Gene Ther. 4:432-441 (1997); Neering et al., Blood 88:1147-1155 (1996); y Rendahl et al., Nat. Biotechnol. 16:757-761 (1998)).

Además del promotor, el vector de expresión contiene típicamente una unidad de transcripción o casete de expresión que contiene todos los elementos adicionales requeridos para la expresión del ácido nucleico en células hospedantes, ya sean procariotas o eucariotas. De este modo, un casete de expresión típico contiene un promotor operablemente ligado a, por ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la ZFP, y señales requeridas, por ejemplo para la poliadenilación eficaz del transcrito, la terminación transcripcional, sitios de unión de ribosomas, o la terminación de la traducción. Los elementos adicionales del casete pueden incluir, por ejemplo, potenciadores, y señales intrónicas divididas exógenas.

El vector de expresión particular usado para transportar la información genética en la célula se selecciona con respecto al uso pretendido de la ZFP. Los vectores de expresión bacterianos estándar incluyen plásmidos tales como los plásmidos a base de pBR322, pSKF, pET23D, y sistemas de expresión de fusión comercialmente disponibles, tales como GST y LacZ. Una proteína de fusión preferida es la proteína de unión de maltosa, "MBP". Tales proteínas de fusión se usan para la purificación de la ZFP. También se pueden añadir etiquetas epitópicas a las proteínas recombinantes para proporcionar métodos convenientes de aislamiento, para la monitorización de la expresión, y para la monitorización de la localización celular y subcelular, por ejemplo c-myc o FLAG.

Los vectores de expresión que contienen elementos reguladores procedentes de virus eucariotas se usan a menudo en vectores de expresión eucariotas, por ejemplo vectores de SV40, vectores del virus del papiloma, y vectores derivados del virus de Epstein-Barr. Otros vectores eucariotas ejemplares incluyen pMSG, pAV009/A+, pMT010/A+, pMAMneo-5, baculovirus pDSVE, y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano del SV40, el promotor tardío del SV40, el promotor de la metalotioneína, el promotor del virus de tumor mamario murino, el promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor de la polihedrina, y otros promotores que se han demostrado que son eficaces para la expresión en células eucariotas.

Algunos sistemas de expresión tienen marcadores para la selección de estirpes celulares establemente transfectadas, tales como timidina quinasa, higromicina B fosfotransferasa, y dihidrofolato reductasa. También son adecuados sistemas de expresión de alto rendimiento, tal como el uso de un vector de baculovirus en células de insectos, con una secuencia codificante de ZFP bajo la dirección del promotor de la polihedrina, u otros promotores baculovíricos potentes.

Los elementos que se incluyen típicamente en vectores de expresión también incluyen un replicón que funciona en E. coli, un gen que codifica resistencia a antibióticos, para permitir la selección de bacterias que cosechan plásmidos recombinantes, y sitios de restricción únicos en regiones no esenciales del plásmido, para permitir una inserción de secuencias recombinantes.

Los métodos de transfección estándar se usan para producir estirpes celulares bacterianas, de mamíferos, de levaduras o de insectos, que expresan grandes cantidades de proteína, que entonces se purifican usando técnicas estándar (véase, por ejemplo, Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). La transformación de células eucariotas y procariotas se realiza según técnicas estándar (véase, por ejemplo, Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss y Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983).

Se puede usar cualquiera de los procedimientos bien conocidos para introducir secuencias nucleotídicas foráneas en células hospedantes. Estos incluyen el uso de transfección con fosfato de calcio, polibreno, fusión protoplástica, electroporación, liposomas, microinyección, ADN desnudo, vectores plasmídicos, vectores víricos, tanto episómicos como integradores, y cualquiera de los otros métodos bien conocidos para introducir en una célula hospedante ADN genómico, ADNc, ADN sintético u otro material genético foráneo clonado (véase, por ejemplo, Sambrook et al., más arriba). Sólo es necesario que el procedimiento de modificación particular usado sea capaz de introducir con éxito al menos un gen en la célula hospedante capaz de expresar la proteína de elección.

VIII. Ensayos

Una vez que una ZFP se ha diseñado y preparado según los procedimientos expuestos inmediatamente antes, se lleva a cabo una evaluación inicial de la actividad de la ZFP diseñada. Las proteínas de ZFP que muestran la capacidad para modular la expresión de un gen de interés se pueden ensayar entonces adicionalmente en busca de actividades más específicas, dependiendo de la aplicación particular para la cual se han diseñado las ZFP. De este modo, por ejemplo, las ZFP proporcionadas aquí se pueden evaluar inicialmente en busca de su capacidad para modular la expresión de VEGF. Después, se llevan a cabo típicamente ensayos más específicos de la capacidad de la ZFP para modular la expresión del gen diana, para tratar neuropatía diabética. En la sección IX, más abajo, se expone una descripción de estos ensayos más específicos.

La actividad de una ZFP particular se puede evaluar usando una variedad de ensayos in vitro e in vivo, midiendo, por ejemplo, los niveles de proteína o de ARNm, los niveles de producto, la actividad enzimática, el crecimiento tumoral; la activación o represión transcripcional de un gen informador; los niveles de los segundos mensajeros (por ejemplo, cGMP, cAMP, IP3, DAG, Ca2+); los niveles de producción de citoquinas y de hormonas; y la neovascularización, usando, por ejemplo, inmunoensayos (por ejemplo, ELISA y ensayos inmunohistoquímicos con anticuerpos), ensayos de hibridación (por ejemplo, protección con NRasa, transferencias de ARN ("Northerns"), hibridación in situ, estudios con conjuntos de oligonucleótidos), ensayos colorimétricos, ensayos de amplificación, ensayos de la actividad enzimática, ensayos de crecimiento tumoral, ensayos fenotípicos, y similares.

Las ZFP se ensayan típicamente en primer lugar para determinar la actividad in vitro usando células cultivadas, por ejemplo células 293, células de CHO, células de VERO, células de BHK, células de HeLa, células de COS, y similares. Preferiblemente, se usan células humanas. A menudo, la ZFP se ensaya primero usando un sistema de expresión transitorio con un gen informador, y después se ensaya la regulación del gen endógeno diana en células y en mamíferos, tanto in vivo como ex vivo. La ZFP se puede expresar recombinantemente en una célula, se puede expresar recombinantemente en células transplantadas en un animal, o se puede expresar recombinantemente en un animal transgénico, así como se puede administrar como una proteína a un animal o célula usando vehículos de suministro descritos más abajo. Las células se pueden inmovilizar, pueden estar en disolución, se pueden inyectar en un animal, o pueden ser de origen natural en un animal transgénico o no transgénico.

La modulación de la expresión génica se ensaya usando uno de los ensayos in vitro o in vivo descritos aquí. Las muestras o ensayos se tratan con una ZFP y se comparan con muestras de control no tratadas, para examinar el grado de modulación. Como se describe anteriormente, para la regulación de la expresión de un gen endógeno, la ZFP tiene típicamente una Kd de 200 nM o menos, más preferiblemente 100 nM o menos, más preferiblemente 50 nM, lo más preferible 25 nM o menos.

Los efectos de las ZFP se pueden medir examinando cualquiera de los parámetros descritos anteriormente. Se puede usar cualquier expresión génica adecuada, fenotípica, o cambio fisiológico, para evaluar la influencia de una ZFP. Cuando las consecuencias funcionales se determinan usando células o animales intactos, también se puede medir una variedad de efectos tales como neurotropismo, cambios transcripcionales tanto en marcadores genéticos conocidos como no caracterizados (por ejemplo, transferencias Northern o estudios con conjuntos de oligonucleótidos), cambios en el metabolismo celular, tales como cambios en el crecimiento celular o en el pH, y cambios en segundos mensajeros intracelulares, tales como cAMP o cGMP.

Los ensayos preferidos para la regulación de ZFP de la expresión de un gen endógeno se pueden realizar in vitro. En un formato de ensayo in vitro preferido, la regulación de la ZFP de la expresión del gen endógeno en células cultivadas se mide examinando la producción de proteína usando un ensayo de ELISA. La muestra de ensayo se compara con células de control tratadas con un vector que carece de secuencias que codifican ZFP, o con un vector que codifica una ZFP no relacionada, que está dirigida a otro gen.

En otra realización, la regulación de la ZFP de la expresión de un gen endógeno se determina in vitro midiendo el nivel de la expresión de ARNm del gen diana. El nivel de expresión génica se mide usando la amplificación, por ejemplo usando PCR, LCR, o ensayos de hibridación, por ejemplo hibridación Northern, transferencia de puntos y protección con NRasa. También se pueden utilizar técnicas de RT-PCR cuantitativas (es decir, los denominados ensayos TaqMan), para cuantificar el nivel de transcripto. El nivel de proteína o de ARNm se detecta usando agentes de detección marcados directa o indirectamente, por ejemplo ácidos nucleicos marcados fluorescentemente o radiactivamente, anticuerpos marcados radiactiva o enzimáticamente, y similares, como se describe aquí. Tales métodos también se describen en las patentes U.S. n^{os} 5.210.015 de Gelfand, patente U.S. nº 5.538.848 de Livak, et al., y la patente U.S. nº 5.863.736 de Haaland, así como en Heid, C. A., et al., Genome Research, 6:986-994 (1996); Gibson, U. E. M, et al., Genome Research 6:995-1001 (1996); Holland, P. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280, (1991); y Livak, K. J., et al., PCR Methods and Applications 357-362 (1995), cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad.

Como alternativa, un sistema de gen informador se puede idear usando un promotor génico procedente del gen diana seleccionado (por ejemplo, VEGF), ligado operablemente a un gen informador, tal como luciferasa, proteína verde fluorescente, CATALIZADOR, o \beta-gal. El constructo informador se cotransfecta típicamente en una célula cultivada. Después del tratamiento con la ZFP de elección, se mide la cantidad de transcripción, traducción o actividad del gen informador, según técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica.

Otro ejemplo de un formato de ensayo preferido, útil para monitorizar la regulación de la ZFP de la expresión de un gen endógeno, se realiza in vivo. Este ensayo es particularmente útil para examinar genes implicados en la función nerviosa. En este ensayo, la ZFP de elección se administra (por ejemplo, inyección intramuscular) a un animal que muestra neuropatía diabética. Después de un tiempo adecuado, por ejemplo 4-8 semanas, se comparan las velocidades de conducción nerviosas motoras y sensitivas con animales de control que también son diabéticos. Las velocidades nerviosas que muestran diferencias significativas entre el control y el diabético (usando, por ejemplo, el ensayo de la t de Student) se afirma que han sido afectadas por la ZFP. Como alternativa, se pueden usar inmunoensayos que usan anticuerpos específicos contra células nerviosas, inmunoensayos los cuales se usan para teñir para determinar el crecimiento del tejido nervioso.

\vskip1.000000\baselineskip

IX. Composiciones farmacéuticas

Las ZFP proporcionadas aquí, y más típicamente los ácidos nucleicos que las codifican, se pueden formular opcionalmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable como una composición farmacéutica.

\vskip1.000000\baselineskip

A. Composiciones a base de ácidos nucleicos

Se pueden usar métodos convencionales de transferencia génica víricos y no víricos para introducir en células de mamífero o en tejidos diana ácidos nucleicos que codifican las presentes ZFP. Tales métodos se pueden usar para administrar a las células in vitro ácidos nucleicos que codifican las ZFP. En algunos casos, los ácidos nucleicos que codifican las ZFP se administran para usos en terapia génica in vivo o ex vivo. Los sistemas de suministro de vectores no víricos incluyen plásmidos de ADN, ácido nucleico desnudo, y ácido nucleico complejado con un vehículo de suministro, tal como un poloxámero o una liposoma. Los sistemas de suministro de vectores víricos incluyen virus de ADN y de ARN, que tienen genomas episómicos o integrados tras el suministro a la célula. Para un repaso de los procedimientos de terapia génica, véase Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel y Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani y Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer y Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., en Current Topics in

\hbox{Microbiology and Immunology,
Doerfler y Bohm (eds) (1995); y Yu  et al .,  Gene Therapy
1:13-26 (1994).}

Los métodos de suministro no vírico de ácidos nucleicos que codifican las ZFP proporcionadas aquí incluyen lipofección, electroporación, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, policatión o conjugados de lípidos:ácidos nucleicos, ADN desnudo, viriones artificiales, y la captación de ADN potenciada por agentes. La lipofección se describe en, por ejemplo, las patentes U.S. nº 5.049.386. 4.946.787; y 4.897.355, y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Transfectam^{TM} y Lipofectin^{TM}). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección eficaz de polinucleótidos mediante reconocimiento de receptores incluyen aquellos de Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024. El suministro se puede realizar a células (administración ex vivo) o a tejidos diana (administración in vivo).

La preparación de complejos de lípidos: ácidos nucleicos, incluyendo liposomas seleccionados como dianas, tales como complejos inmunolipídicos, es bien conocida por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); patentes U.S. n^{os} 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028, y 4.946.787).

El uso de sistemas a base de ARN o ADN vírico para el suministro de ácidos nucleicos que codifican ZFP modificada aprovecha los procesos enormemente desarrollados para dirigir un virus a células específicas en el cuerpo y llevar la carga útil vírica al núcleo. Los vectores víricos se pueden administrar directamente a los pacientes (in vivo), o se pueden usar para tratar células in vitro, y las células modificadas se administran a los pacientes (ex vivo). Los sistemas víricos convencionales para el suministro de las ZFP pueden incluir vectores retrovíricos, lentivíricos, adenovíricos, virus adenoasociados y vectores del virus del herpes simple, para la transferencia génica. Los vectores víricos actualmente son el método más eficaz y versátil de transferencia génica en células y tejidos diana. La integración en el genoma del hospedante es posible con los métodos de transferencia génica mediante retrovirus, lentivirus, y virus adenoasociados, dando como resultado a menudo la expresión a largo plazo del transgén insertado. Adicionalmente, se han observado elevadas eficacias de la transducción en muchos tipos de células y tejidos diana diferentes.

El tropismo de un retrovirus se puede alterar incorporando proteínas de cubierta foráneas, expandiendo la población diana potencial de células diana. Los vectores lentivíricos son vectores retrovíricos que son capaces de transducir o infectar células que no se dividen, y producen típicamente títulos víricos elevados. Por lo tanto, la selección de un sistema de transferencia génica retrovírico puede depender del tejido diana. Los vectores retrovíricos comprenden repeticiones terminales largas que actúan en cis, con una capacidad de encapsidación de hasta 6-10 kb de secuencia foránea. Las LTR que actúan en cis mínimas son suficientes para la replicación y encapsidación de receptores, que entonces se usan para integrar el gen terapéutico en la célula diana para proporcionar una expresión transgénica permanente. Los vectores retrovíricos ampliamente usados incluyen aquellos basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia del chimpancé gibón (GaLV), el virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), y sus combinaciones (véase, por ejemplo, Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); documento PCT/US94/05700).

En aplicaciones en las que se prefiere la expresión transitoria de la ZFP, se usan típicamente sistemas a base de adenovirus. Los vectores a base de adenovirus son capaces de una eficacia de la transducción muy elevada en muchos tipos celulares, y no requieren la división celular. Con tales vectores, se han obtenido elevados títulos y niveles de expresión. Este vector se puede producir en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. Los vectores de virus adenoasociados ("AAV") también se usan para transducir células con ácidos nucleicos diana, por ejemplo en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos, y para procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo (véase, por ejemplo, West et al., Virology 160:38-47 (1987); la patente U.S. nº 4.797.368; el documento WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)). La construcción de vectores AAV recombinantes se describe en un número de publicaciones, incluyendo la patente U.S. nº 5.173.414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat y Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); y Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989).

En particular, actualmente hay disponibles al menos seis enfoques con vectores víricos para la transferencia génica en ensayos clínicos, siendo de lejos los vectores retrovíricos el sistema usado más frecuentemente. Todos estos vectores víricos utilizan enfoques que implican la complementación de vectores defectuosos mediante genes insertados en estirpes celulares auxiliares, para generar el agente transductor.

pLASN y MFG-S son ejemplos de vectores retrovíricos que se han usado en ensayos víricos (Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN fue el primer vector terapéutico usado en un ensayo de terapia génica (Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). Se han observado eficacias de la transducción de 50% o mayores para vectores encapsidados MFG-S (Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997).

Los vectores víricos adenoasociados recombinantes (rAAV) son otros sistemas de suministro génico alternativos, basados en el virus de tipo 2 adenoasociado del parvovirus defectuoso y no patógeno. Todos los vectores derivan de un plásmido que retiene sólo las repeticiones terminales invertidas de 145 pb de AAV que flanquean el casete de expresión transgénico. La transferencia génica eficaz y el suministro transgénico estable debido a la integración en los genomas de la célula transducida son características claves de este sistema vectorial (Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)).

Los vectores adenovíricos (Ad) recombinantes, deficientes en la replicación, se usan predominantemente para la terapia génica del cáncer de colon, debido a que se pueden producir con títulos elevados, e infectan fácilmente un número de diferentes tipos celulares. La mayoría de los vectores adenovíricos se modifican de forma que un transgén sustituye los genes E1a, E1b y E3 del Ad; subsiguientemente, el vector defectuoso en la replicación se propaga en células 293 humanas que suministran la función génica suprimida en trans. Los vectores Ad pueden transducir múltiples tipos de tejidos in vivo, incluyendo células diferenciadas, que no se dividen, tales como las encontradas en los tejidos del sistema hepático, renal y muscular. Los vectores de AD convencionales tienen una gran capacidad portadora. Un ejemplo del uso de un vector Ad en un ensayo clínico implicó la terapia con polinucleótidos para la inmunización antitumoral con inyección intramuscular (Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). Ejemplos adicionales del uso de vectores adenovíricos para la transferencia génica en ensayos clínicos incluyen Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998).

Las células productoras de cápsides se usan para formar partículas víricas que son capaces de infectar una célula hospedante. Tales células incluyen células 293, que encapsidan adenovirus, y las células Psi-2 o las células PA317, que encapsidan retrovirus. Los vectores víricos usados en terapia génica se generan habitualmente mediante una estirpe celular productora que encapsida un vector de ácido nucleico en una partícula vírica. Los vectores contienen típicamente las secuencias víricas mínimas requeridas para el encapsidamiento y subsiguiente integración en un hospedante, siendo sustituidas otras secuencias víricas por un casete de expresión para la proteína que se va a expresar. Las funciones víricas perdidas se suplen en trans mediante la estirpe celular productora de cápsides. Por ejemplo, los vectores de AAV usados en terapia génica típicamente sólo poseen secuencias de ITR procedentes del genoma del AAV que se requieren para el encapsidamiento e integración en el genoma del hospedante. El ADN vírico se encapsida en una estirpe celular, que contiene un plásmido auxiliar que codifica los otros genes del AAV, principalmente rep y cap, pero que carece de las secuencias de ITR. La estirpe celular también se infecta con adenovirus como un auxiliar. El virus auxiliar promueve la replicación del vector de AAV y la expresión de los genes de AAV procedentes del plásmido auxiliar. El plásmido auxiliar no está encapsidado en cantidades significativas, debido a la falta de secuencias de ITR. La contaminación con adenovirus se puede reducir, por ejemplo, mediante tratamiento térmico, al cual el adenovirus es más sensible que el AAV.

Como se explica anteriormente, se pueden usar diversos vehículos de suministro vírico, según se conocen en la técnica, para introducir un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una proteína de dedos de cinc) en una célula. La elección del vehículo de suministro depende de un número de factores, incluyendo pero sin limitarse al tamaño del ácido nucleico a ser suministrado y la célula diana deseada.

En ciertas realizaciones, los adenovirus se usan como vehículos de suministro. Los vehículos adenovíricos ejemplares incluyen los tipos de adenovirus 2, 5, 12 y 35. Por ejemplo, los vehículos útiles para la introducción de transgenes de células madre hematopoyéticas, por ejemplo, células CD34^{+}, incluyen el adenovirus de tipo 35. Otros vehículos adenovíricos incluyen los denominados adenovirus "gutless" (adenovirus cuyo genoma ha sido parcialmente eliminado). Véase, por ejemplo, Kochanek et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5.731-5.736.

Los vehículos de virus adenoasociados incluyen los serotipos 1, 2, 5, 6, 7, 8 y 9 de AAV, así como los serotipos quiméricos de AAV, por ejemplo, AAV 2/1 y AAV 2/5. Se pueden usar vectores de AAV tanto monocatenarios como bicatenarios.

Los vehículos de suministro de lentivirus se han descrito, por ejemplo, en las patentes U.S. 6.312.682 y 6.669.936, y en la Publicación de Solicitud de Patente U.S. nº 2002/0173030, y se pueden usar, por ejemplo, para introducir transgenes en células inmunitarias (por ejemplo, células T). Los lentivirus son capaces de integrar una copia de ADN de su genoma de ARN en el genoma de una célula hospedante. Véase, por ejemplo, Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Miyoshi et al. (1998) J. Virology 72:8150-8157; Dull et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222 y Delenda (2004) J. Gene Medicine 6:S125-S138. En ciertos vehículos lentivíricos, esta función de integración se ha inutilizado para generar vehículos lentivíricos no integrantes. Véase, por ejemplo, Poon et al. (2003) J. Virology 77:3962-3972 y Vargas et al. (2004) Human Gene Therapy 15:361-372. El uso de vectores lentivíricos tanto integrantes como no integrantes para la introducción de células madre hematopoyéticas se ha descrito por Haas et al. (2000) Mol. Therapy 2:71-80. La transducción de células T CD4^{+} con vectores lentivíricos integrantes se ha descrito por Humeau et al. (2004) Mol. Therapy 9:902-913.

Se han descrito vehículos del virus del herpes simple, que son capaces de la expresión a largo plazo en neuronas y ganglios. Véase, por ejemplo, Krisky et al. (1998) Gene Therapy 5(11):1517-1530; Krisky et al. (1998) Gene Therapy 5(12):1593-1603; Burton et al. (2001) Stem Cells 19:358-377; Lilley et al. (2001) J. Virology 75(9):4343-4356.

Los vectores del virus del herpes simple (HSV) pueden ser particularmente adecuados para el suministro a tejido neuronal. Véase, por ejemplo, Coffin et al. (1996) en: Genetic Manipulation of the Nervous System (DS Latchman, Ed.) p. 99-114: Academic Press, London; Fink et al. (1996) Ann. Rev. Neurosci. 19:265-287. En particular, se han descrito vectores del HSV defectuosos en replicación. Véanse, por ejemplo, las patentes U.S. 5.849.571; 5.849.572; 6.248.320; 6.261.552; 6.344.445; 6.613.892; 6.719.982; y 6,821,753. Véanse también las Publicaciones de Solicitud de Patente U.S. 2002/0192802; 2003/0040500; 2003/0082142; 2003/0091537; 2003/0113348; 2003/0219409; y 2004/0063094. Véase también Krisky et al. (1998) Gene Therapy 5:1517-1530; Palmer et al. (2000) J. Virol. 74:5604-5618; Lilley et al. (2001) J. Virol. 75:4343-4356; Burton et al. (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13:424-428; y Goins et al. (2002) Methods Mol. Med. 69:481-507.

Los métodos para mejorar la eficacia de la transducción retrovírica de células madre hematopoyéticas se describen, por ejemplo, en la patente U.S. nº 5.928.638.

El tropismo de los vehículos de suministro retrovíricos y lentivíricos se puede alterar mediante el proceso de pseudotipado, permitiendo de ese modo el suministro vírico de un ácido nucleico a un tipo celular particular. Véase, por ejemplo, la patente U.S. nº 5.817.491.

En muchas aplicaciones de terapia génica, es deseable que el vector de terapia génica sea suministrado con un alto grado de especificidad para un tipo particular de tejido. Un vector vírico se modifica típicamente para que tenga especificidad por un tipo celular dado, expresando un ligando como una proteína de fusión con una proteína de revestimiento vírica sobre la superficie exterior de los virus. El ligando se escoge para que tenga afinidad por un receptor que se sabe que está presente sobre el tipo celular de interés. Por ejemplo, Han et al., PNAS 92:9747-9751 (1995) dieron a conocer que se puede modificar el virus de la leucemia murina de Moloney para expresar heregulina humana fusionada a gp70, y el virus recombinante infecta ciertas células de cáncer de mama humanas que expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano. Este principio se puede extender a otros pares de virus que expresan una proteína de fusión de ligando y una célula que expresa un receptor. Por ejemplo, se puede modificar un fago filamentoso para que presente fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, FAb o Fv) que tienen afinidad de unión específica para virtualmente cualquier receptor celular escogido. Aunque la descripción anterior se aplica principalmente a vectores víricos, se pueden aplicar los mismos principios a vectores no víricos. Tales vectores se pueden modificar para que contengan secuencias de captación específicas pensadas para que favorezcan la captación por células diana específicas.

Los vectores para la terapia génica se pueden suministrar in vivo mediante administración a un paciente individual, típicamente mediante administración sistémica (por ejemplo, infusión intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica, o intracraneal) o mediante aplicación tópica, como se describe más abajo. Como alternativa, los vectores se pueden suministrar a células ex vivo, tales como células explantadas de un paciente individual (por ejemplo, linfocitos, aspirados de médula ósea, biopsia tisular), o células madre hematopoyéticas de donantes universales, seguido de la reimplantación de las células en un paciente, habitualmente tras la selección de las células que han incorporado el vector.

La transfección celular ex vivo para el diagnóstico, investigación o para terapia génica (por ejemplo, vía reinfusión de las células transfectadas en el organismo hospedante) es bien conocida por los expertos en la técnica. En algunos casos, las células se aíslan del organismo sujeto, se transfectan con un ácido nucleico de ZFP (génico o ADNc), y se reinfunden nuevamente en el organismo sujeto (por ejemplo, un paciente). Diversos tipos celulares, adecuados para la transfección ex vivo, son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3ª ed. 1994)) y las referencias citadas allí, para una discusión de cómo aislar y cultivar células procedentes de pacientes).

En una realización, las células madre se usan en procedimientos ex vivo para la transfección celular y la terapia génica. La ventaja de usar células madre es que se pueden diferenciar in vitro en otros tipos celulares, o se pueden introducir en un mamífero (tal como el donante de las células) en el que se injertarán en la médula ósea. Se conocen métodos para diferenciar células CD34+ in vitro en tipos de células inmunitarias clínicamente importantes, usando citoquinas tales como GM-CSF, IFN-Y y TNF-\alpha (véase Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)).

Las células madre se aíslan para la transducción y diferenciación usando métodos conocidos. Por ejemplo, las células madre se aíslan de células de la médula ósea extrayendo las células de la médula ósea con anticuerpos que se unen a células indeseadas, tales como CD4+ y CD8+ (células T), CD45+ (células panB), GR-1 (granulocitos), y lad (células diferenciadas que presentan antígenos) (véase Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)).

Los vectores (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, virus del herpes, liposomas, etc.), que contienen ácidos nucleicos de ZFP terapéuticos, también se pueden administrar directamente al organismo, para la transducción de células in vivo. Como alternativa, se puede administrar ADN desnudo. La administración se realiza mediante cualquiera de las rutas usadas normalmente para introducir una molécula en contacto final con células de la sangre o de los tejidos. Existen métodos adecuados para administrar tales ácidos nucleicos, y son bien conocidos por los expertos en la técnica, y, aunque se puede usar más de una ruta para administrar una composición particular, una ruta particular puede proporcionar a menudo una reacción más inmediata y más eficaz que otra ruta.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que es administrada, así como por el método particular usado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas, según se describe más abajo (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed., 1989).

\vskip1.000000\baselineskip

B. Composiciones proteínicas

Un factor importante en la administración de compuestos polipeptídicos, tales como las presentes ZFP, es asegurar que el polipéptido tenga la capacidad para atravesar la membrana plasmática de una célula, o la membrana de un compartimiento intracelular, tal como el núcleo. Las membranas celulares están compuestas de bicapas de lípidos-proteínas que son libremente permeables a compuestos lipófilos no iónicos pequeños, y son inherentemente impermeables a compuestos polares, macromoléculas, y agentes terapéuticos o de diagnóstico. Sin embargo, se han descrito proteínas y otros compuestos, tales como liposomas, que tienen la capacidad para trasladar polipéptidos, tales como las ZFP, a través de una membrana celular.

Por ejemplo, los "polipéptidos de desplazamiento a través de la membrana" tienen subsecuencias de aminoácidos anfifílicos o hidrófobos, que tienen la capacidad para actuar como vehículos que desplazan a través de la membrana. En una realización, las proteínas con homeodominio tienen la capacidad para desplazarse a través de las membranas celulares. Se encontró que el péptido internable más corto de una proteína con homeodominio, Antennapedia, era la tercera hélice de la proteína, desde la posición 43 a 58 de los aminoácidos (véase, por ejemplo, Prochiantz, Current Opinion in Neurobiology 6:629-634 (1996)). Se encontró que otra subsecuencia, el dominio h (hidrófobo) de péptidos señal, tienen características similares de desplazamiento a través de la membrana celular (véase, por ejemplo, Lin et al., J. Biol. Chem. 270:14255-14258 (1995)).

Los ejemplos de secuencias peptídicas que se pueden ligar a una ZFP, para facilitar la captación de la ZFP en las células, incluyen, pero no se limitan a, un péptido de 11 aminoácidos de la proteína tat del VIH; una secuencia peptídica de 20 restos, que corresponde a los aminoácidos 84-103 de la proteína p16 (véase Fahraeus et al., Current Biology 6:84 (1996)); la tercera hélice del homeodominio de 60 aminoácidos de longitud de Antennapedia (Derossi et al., J. Biol. Chem. 269:10444 (1994)); la región h de un péptido señal, tal como la región h del factor de crecimiento de fibroblastos de Kaposi (K-FGF) (Lin et al., más arriba); o el dominio de desplazamiento de VP22 procedente de HSV (Elliot y O'Hare, Cell 88:223-233 (1997)). Otros restos químicos adecuados que proporcionan una captación celular potenciada también se pueden ligar químicamente a las ZFP. También se pueden seleccionar dominios de desplazamiento a través de membranas (es decir, dominios de internamiento) procedentes de librerías de secuencias peptídicas aleatorizadas. Véase, por ejemplo, Yeh et al. (2003) Molecular Therapy 7(5):S461, Abstract #1191.

Las moléculas de toxinas también tienen la capacidad para transportar polipéptidos a través de las membranas celulares. A menudo, tales moléculas están compuestas de al menos dos partes (denominadas "toxinas binarias"): un dominio o polipéptido de desplazamiento o de unión, y un dominio o polipéptido de toxina separado. Típicamente, el dominio o polipéptido de desplazamiento se une a un receptor celular, y entonces la toxina se transporta hacia el interior de la célula. Se han usado varias toxinas bacterianas, incluyendo la toxina iota de Clostridium perfringens, la toxina de la difteria (DT), la hexotoxina A de Pseudomonas (PE), la toxina pertussis (PT), la toxina de Bacillus anthracis, y la pertussis adenilatociclasa (CYA), en intentos por suministrar péptidos al citosol celular como fusiones internas o aminoterminales (Arora et al., J. Biol. Chem., 268:3334-3341 (1993); Perelle et al., Infect. Immun., 61:5147-5156 (1993); Stemnark et al., J. Cell Biol. 113:1025-1032 (1991); Donnelly et al., PNAS 90:3530-3534 (1993); Carbonetti et al., Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 95:295 (1995); Sebo et al., Infect. Immun. 63:3851-3857 (1995); Klimpel et al., PNAS U.S.A. 89:10277-10281 (1992); y Novak et al., J. Biol. Chem. 267:17186-17193 (1992)).

Tales subsecuencias se pueden usar para desplazar las ZFP a través de una membrana celular. Las ZFP se pueden fusionar convenientemente o derivatizar con tales secuencias. Típicamente, las secuencias de desplazamiento se proporcionan como parte de una proteína de fusión. Opcionalmente, se puede usar un ligador para ligar la ZFP y la secuencia de desplazamiento. Se puede usar cualquier ligador adecuado, por ejemplo un ligador peptídico.

La ZFP también se puede introducir en una célula animal, preferiblemente una célula de mamífero, vía un liposoma o derivados de liposomas tales como inmunoliposomas. El término "liposoma" se refiere a vesículas compuestas de una o más bicapas lipídicas ordenadas concéntricamente, que encapsulan una fase acuosa. La fase acuosa contiene típicamente el compuesto a suministrar a la célula, es decir, una ZFP. El liposoma se fusiona con la membrana plasmática, liberando de ese modo el fármaco en el citosol. Como alternativa, el liposoma es fagocitado o recogido por la célula en un vehículo de transporte. Una vez en el endosoma o fagosoma, el liposoma se degrada o se fusiona con la membrana de la vesícula de transporte, y libera sus contenidos.

En los métodos actuales de suministro de fármacos vía liposomas, el liposoma en último lugar se hace permeable y libera el compuesto encapsulado (en este caso, una ZFP) en el tejido o célula diana. Para el suministro sistémico o específico a tejidos, esto se puede lograr, por ejemplo, de manera pasiva, en la que la bicapa liposómica se degrada a lo largo del tiempo a través de la acción de diversos agentes en el cuerpo. Como alternativa, la liberación del fármaco activo implica usar un agente para inducir un cambio de la permeabilidad en la vesícula liposómica. Se pueden construir membranas liposómicas de forma que se desestabilicen cuando el entorno sea ácido próximo a la membrana liposómica (véase, por ejemplo, PNAS 84:7851 (1987); Biochemistry 28:908 (1989)). Por ejemplo, cuando los liposomas sufren endocitosis por una célula diana, se desestabilizan y liberan sus contenidos. Esta desestabilización se denomina fusogénesis. La dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) es la base de muchos sistemas "fusogénicos".

Tales liposomas comprenden típicamente una ZFP y un componente lipídico, por ejemplo un lípido neutro y/o catiónico, incluyendo opcionalmente una molécula de reconocimiento de receptor, tal como un anticuerpo que se une a un receptor o ligando predeterminado de la superficie celular (por ejemplo, un antígeno). Existe una variedad de métodos para preparar liposomas, como se describe en, por ejemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), patentes U.S. n^{os} 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028, 4.946.787, Publicación de PCT nº WO 91/17424, Deamer y Bangham, Biochim. Biophys. Acta 443:629-634 (1976); Fraley, et al., PNAS 76:3348-3352 (1979); Hope et al., Biochim. Biophys. Acta 812:55-65 (1985); Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta 858:161-168 (1986); Williams et al., PNAS 85:242-246 (1988); Liposomes (Ostro (ed.), 1983, Capítulo 1); Hope et al., Chem. Phys. Lip. 40:89 (1986); Gregoriadis, Liposome Technology (1984) y Lasic, Liposomes: from Physics to Applications (1993)). Los métodos adecuados incluyen, por ejemplo, tratamiento con ultrasonidos, extrusión, alta presión, homogeneización, microfluidización, diálisis con detergentes, fusión inducida por calcio de pequeñas vesículas liposómicas, y métodos de fusión con éteres, todos los cuales son bien conocidos en la técnica.

En algunos casos, los liposomas son seleccionados como dianas usando restos de selección de dianas que son específicos para un tipo celular, tejido, y similar, particular. Se ha descrito previamente (véanse, por ejemplo, las patentes U.S. nº 4.957.773 y 4.603.044) la selección de liposomas como dianas, usando una variedad de restos de selección de dianas (por ejemplo, ligandos, receptores, y anticuerpos monoclonales).

Se pueden usar métodos estándar para acoplar agentes de selección de dianas a liposomas. Estos métodos implican generalmente la incorporación en componentes lipídicos de liposomas, por ejemplo fosfatidiletanolamina, que se pueden activar para la unión de agentes de selección de dianas, o compuestos lipófilos derivatizados, tales como bleomicina derivatizada con lípidos. Se pueden construir liposomas seleccionadas como dianas por anticuerpos, usando, por ejemplo, liposomas que incorporan la proteína A (véase Renneisen et al., J. Biol. Chem., 265:16337-16342 (1990) y Leonetti et al., PNAS 87:2448-2451 (1990)).

\vskip1.000000\baselineskip

C. Dosificación

Para aplicaciones terapéuticas de las ZFP, la dosis administrada a un paciente debería de ser suficiente para efectuar una respuesta terapéutica beneficiosa en el paciente a lo largo del tiempo. La dosis se determinará mediante la eficacia y la Kd de la ZFP particular empleada, el volumen nuclear de la célula diana, y el estado del paciente, así como el peso corporal o área superficial del paciente a tratar. El tamaño de la dosis también se determinará por la existencia, naturaleza y grado de cualesquiera efectos secundarios adversos que acompañen a la administración de un compuesto o vector particular en un paciente particular.

A la hora de determinar la cantidad eficaz de la ZFP a administrar en el tratamiento o profilaxis de la neuropatía diabética, el médico evalúa los niveles plasmáticos circulantes de la ZFP o ácido nucleico que codifica la ZFP, las toxicidades potenciales de la ZFP, la progresión de la enfermedad, y la producción de anticuerpos anti-ZFP. La administración se puede lograr vía una única dosis, o dosis divididas.

D. Composiciones y modos de administración 1. General

Las ZFP y los ácidos nucleicos que codifican las ZFP se pueden administrar directamente a un paciente para la modulación de la expresión génica y para aplicaciones terapéuticas o profilácticas. En general, y a la vista de la discusión aquí, las frases que se refieren a la introducción de una ZFP en un animal o paciente pueden significar que se introduce una ZFP o una proteína de fusión de ZFP, y/o que se introduce un ácido nucleico, que codifica una ZFP de una proteína de fusión de ZFP en una forma que se puede expresar en el animal. Por ejemplo, como se describe con mayor detalle en la siguiente sección, las ZFP y/o ácidos nucleicos se pueden usar en el tratamiento de una o más neuropatías.

La administración de cantidades terapéuticamente eficaces mediante cualquiera de las rutas usadas normalmente para introducir ZFP en contacto final con el tejido a tratar. Las ZFP o ácidos nucleicos que codifican ZFP se administran de cualquier manera adecuada, por ejemplo con vehículos farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, poloxámeros y/o tampones). Existen métodos adecuados para administrar tales moduladores, y son bien conocidos por los expertos en la técnica, y, aunque se puede usar más de una ruta para administrar una composición particular, a menudo una ruta particular puede proporcionar una reacción más inmediata y más eficaz que otra ruta.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular usado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed. (1985).

Las ZFP, solas o en combinación con otros componentes adecuados, se pueden obtener en formulaciones de aerosoles (es decir, se pueden "nebulizar"), para ser administradas vía inhalación. Las formulaciones de aerosoles se pueden colocar en propelentes a presión aceptables, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno, y similares.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral, tales como, por ejemplo, las rutas intravenosa, intramuscular, intradérmica y subcutánea, incluyen disoluciones acuosas y no acuosas, para inyección estéril, isotónicas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, y solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del receptor pretendido, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes, y conservantes. En la práctica de los métodos descritos, las composiciones se pueden administrar, por ejemplo, mediante infusión intravenosa, oralmente, tópicamente, intraperitonealmente, intravesicularmente, o intratecalmente. Las formulaciones de compuestos se pueden presentar en recipientes cerrados herméticamente de una dosis unitaria o de múltiples dosis, tales como ampollas y viales. Las disoluciones y suspensiones para inyección se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos, y comprimidos de los tipos descritos previamente.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Opciones de suministro ejemplares

Existe una variedad de opciones de suministro para el suministro de las composiciones farmacéuticas proporcionadas aquí, para tratar neuropatías diabéticas y de otros tipos. Dependiendo de la indicación particular, las composiciones se pueden dirigir a áreas o tejidos específicos de un sujeto. Por ejemplo, en algunos métodos, las composiciones se suministran mediante inyección en las extremidades, para tratar neuropatías diabéticas. Por el contrario, otros tratamientos implican administrar la composición de manera general, sin buscar el suministro diana a regiones
específicas.

Se puede utilizar un número de enfoques para localizar el suministro de agentes a regiones particulares. Algunos de estos métodos implican el suministro a la luz del cuerpo, o a un tejido (véanse, por ejemplo, las patentes U.S. Pat. n^{os} 5.941.868; 6.067.988; 6.050.986; y 5.997.509; así como las Publicaciones PCT WO 00/25850; WO 00/04928; 99/59666; y 99/38559). El suministro también se puede efectuar mediante inyección o administración intramuscular o intramiocárdica. Los ejemplos de tales enfoques incluyen los discutidos en las patentes U.S. n^{os} 6.086.582; 6.045.565; 6.056.969; y 5.997.525; y en las Publicaciones PCT WO 00/16848; WO 00/18462; WO 00/24452; WO 99/49773 y WO 99/49926. Otras opciones para el suministro local incluyen la inyección intrapericárdica (véanse, por ejemplo, las patentes U.S. n^{os} 5.931.810; 5.968.010; y 5.972.013), y el suministro perivascular. Igualmente se pueden utilizar diversos enfoques de suministro a través de canales revasculares transmiocárdicos (TMR). Muchos de estos métodos utilizan un láser para llevar a cabo la revascularización. Por ejemplo, en las patentes U.S. n^{os} 5.925.012; 5.976.164; 5.993.443; y 5.999.678, se expone una discusión de tales enfoques. Otras opciones incluyen el suministro intraarterial y/o intracoronario, por ejemplo la inyección en la arteria coronaria (véase, por ejemplo, el documento WO 99/29251) y la administración endovascular (véanse, por ejemplo, las patentes U.S. n^{os} 6.001.350; 6.066.123; y 6.048.332; y las Publicaciones PCT WO 99/31982; WO 99/33500; y WO 00/15285).

Opciones adicionales para el suministro de composiciones para tratar neuropatías incluyen la administración sistémica usando la administración intravenosa o subcutánea, el acceso mediante cámaras cardíacas (véase, por ejemplo, la patente U.S. nº 5.924.424) y la modificación de tejidos (patente U.S. nº 5.944.754).

Otros métodos de suministro conocidos por los expertos en la técnica incluyen los métodos descritos en las patentes U.S. n^{os} 5.698.531; 5.893.839; 5.797.870; 5.693.622; 5.674.722; 5.328.470; y 5.707.969.

\vskip1.000000\baselineskip

X. Aplicaciones A. General

Las ZFP que se unen a sitios diana en un gen de VEGF (y en otros genes), y los ácidos nucleicos que las codifican, se pueden utilizar para tratar una amplia variedad de neuropatías y estados neurodegenerativos. Tales métodos implican generalmente poner en contacto un sitio diana de un ácido nucleico dentro de una célula o población de células con una ZFP que se ha modificado para que reconozca y se una al sitio diana. Los métodos se pueden realizar in vitro con cultivos celulares, por ejemplo, o in vivo. Algunos métodos se realizan de forma que las neuropatías se tratan activando uno o más genes de VEGF.

\vskip1.000000\baselineskip

B. Aplicaciones terapéuticas

Las ZFP proporcionadas aquí, y los ácidos nucleicos que las codifican, tales como en las composiciones farmacéuticas descritas aquí, se pueden utilizar para modular (por ejemplo, activar o reprimir) la expresión de genes implicados en mejorar o eliminar la neuropatía y/o neurodegeneración. Por ejemplo, el gen o genes del VEGF se pueden activar, de forma que la proteína o proteínas del VEGF resultantes pueden actuar como factores neurotróficos, facilitando de ese modo la función nerviosa y/o de crecimiento de nervios, y/o previniendo la degeneración nerviosa, tanto en cultivos celulares (es decir, en aplicaciones in vitro) como in vivo.

Por tanto, ciertos métodos para tratar diversos tipos de neuropatía (incluyendo neuropatía diabética) y estados neurodegenerativos incluyen introducir una ZFP en un sujeto. La unión de la ZFP, que contiene un dominio de activación, a un gen, cuya expresión mejora la neuropatía, se puede usar para tratar la neuropatía. Ciertos métodos implican el uso de las ZFP tales como se describen aquí, para unirlas a sitios diana en los genes del VEGF. Un dominio de activación fusionado a la ZFP activa la expresión de uno o más genes del VEGF.

Se conoce una variedad de ensayos para evaluar la neurotrofia, ya que está relacionada con la neuropatía (por ejemplo, función nerviosa). Por ejemplo, los ensayos de proliferación celular endotelial se discuten en Ferrara y Henzel (1989) Nature 380:439-443; Gospodarowicz et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 7311-7315; y Claffey et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta. 1246:1-9. La capacidad de las ZFP y/o ácidos nucleicos para promover la neurotrofia se puede evaluar, por ejemplo, en la membrana corioalantoica del pollo, como se discute en Leung et al. (1989) Science 246:1306-1309. Otra opción es realizar ensayos con córneas de rata, como se discute en Rastinejad et al. (1989) Cell 56:345-355. Otros ensayos se describen en la patente U.S. nº 5.840.693. Los ensayos para la regeneración nerviosa incluyen la evaluación del contacto de la placa terminal nerviosa tras la lesión por machacamiento del nervio laríngeo recurrente en ratas. Rubin et al. (2001) Laryngoscope 111:2041-2045; Rubin et al. (2003) Laryngoscope 113:985-989. Además, se puede usar el examen microscópico de secciones de tejidos para evaluar el estado de los nervios. También se puede evaluar el torrente sanguíneo de los nervios, por ejemplo mediante formación de imágenes Doppler mediante láser, o mediante detección directa de un análogo de lectina fluorescente administrado localmente, como se describe por ejemplo en Schratzberger (2001) J Clin Invest. 107(9):1083-92. Además, se pueden evaluar las velocidades de conducción nerviosa motora y/o sensitiva, como se describe en Schratzberger, más arriba. Cada uno de estos métodos son ensayos aceptados, y los resultados también se pueden extrapolar a otros sistemas.

Las composiciones proporcionadas aquí también se pueden utilizar para reprimir la expresión de genes en una variedad de aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, se pueden reprimir los genes cuyos productos sirven para limitar el crecimiento nervioso en circunstancias normales, para estimular así el crecimiento nervioso en diversos estados neuropáticos tales como la neuropatía diabética.

Los siguientes ejemplos se proporcionan solamente para ilustrar con más detalle aspectos particulares de los métodos y composiciones descritos, y no se deben de interpretar como limitantes de ninguna manera.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1

Tratamiento de neuropatía periférica con proteínas de dedos de cinc diseñadas

El potencial terapéutico de una proteína de dedos de cinc diseñada para reconocer un sitio diana dentro de un gen del VEGF y activar la expresión de VEGF se evaluó en ratas tratadas con estreptozotocina, un modelo experimental homologado de neuropatía diabética. En este modelo, se induce diabetes en rata tras un ayuno durante toda la noche, mediante una única inyección intraperitoneal de estreptozotocina. El tratamiento con estreptozotocina (STZ) provoca la destrucción parcial de las células \beta pancreáticas, y se indujo la diabetes en una semana. Se desarrolla una grave neuropatía periférica en el modelo, y se caracteriza por una ralentización significativa de las velocidades de conducción nerviosa motora y sensitiva.

Se diseñó como se describe anteriormente una proteína de dedos de cinc de 3 dedos, que reconoce un sitio diana en VEGF-A. La ZFP diseñada, denominada VOP32E, se une al sitio diana GGGGGTGAC, e incluye las siguientes secuencias de aminoácidos en la hélice de reconocimiento de cada dedo: DRSNLTR (dedo 1 o F1); TSGHLSR (dedo 2 o F2); y RSDHLSR (dedo 3 o F3). Véase, también, la Tabla 1. Se fusionó un dominio de activación transcripcional de p65 a la ZFP VOP32E.

Se indujo la diabetes en ratas macho Wistar tras un ayuno durante toda la noche, mediante una única inyección intraperitoneal de estreptozotocina. Como controles, se usaron ratas no tratadas, que tenían la misma edad y peso. Se midió la glucemia sérica una semana después del tratamiento con estreptozotocina, y los animales tratados con STZ que se identificaron como diabéticos se distribuyeron al azar en 3 grupos de tratamiento (n = 12).

Los tratamientos se iniciaron 30 días después de la inducción de la diabetes. Se proporcionó un plásmido, que codifica la VOP32E-p65, en una única dosis de tres inyecciones en los grupos musculares gastrocnemio y soleus de la pata derecha, a dosis de 125 ó 500 \mug. Inyecciones similares con un plásmido vector vacío, VAX-1, sirvieron como controles. Los plásmidos VOP32E y pVAX-1 se formularon en poloxámero 407 al 1%, 150 mM de NaCl, 2 mM de Tris, pH 8,0.

La extremidad contralateral sirvió como el control no inyectado. Se midieron las velocidades de conducción nerviosa (MNCV y SNCV) en la extremidad contralateral tratada y no tratada, cuatro semanas tras el suministro del gen, esencialmente como se describe en Schratzberger, más arriba. Los resultados se muestran en la Tabla 4:

6

Tras las medidas de SNCV y MNCV, los animales se sacrificaron y se diseccionaron y recolectaron los músculos inyectados, para aislar el ARN. Las preparaciones de ARN se analizaron subsiguientemente para determinar la expresión del transgén 32Ep65 mediante PCR de tiempo real.

El suministro de VOP32E a músculos esqueléticos de ratas diabéticas condujo a un incremento en la velocidad de conducción de nervios sensoriales, sin afectar a la velocidad de conducción motora (Fig. 1). La mejora de la SNCV en el grupo de tratamiento con VOP32E a dosis baja (125 \mug) fue estadísticamente significativa cuando se comparó con animales tratados con pVAX-1 (vector vacío) (p < 0,005). La SNCV, en el grupo de tratamiento a baja dosis, se restauró hasta niveles normales en cuatro semanas tras la transferencia génica (Tabla 1, Fig. 1). Se observó una tendencia de la mejora de SNCV en el grupo de dosis baja, cuando se compara con la extremidad contralateral no inyectada (p = 0,054). Otros autores han dado a conocer también una mejora en SNCV sin afectar a la MNCV (Sayers, NM et al. Diabetes (2003) 52, 2372-2380).

De este modo, VOP32E de ZFP, modificado, es capaz de mejorar significativamente las velocidades de conducción nerviosa sensitiva en un modelo de animal de neuropatía diabética.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Respuesta a la dosis

Para evaluar la respuesta a la dosis de VOP32E en el modelo de neuropatía diabética periférica descrito anteriormente, se añadieron a este estudio tres grupos de tratamiento con VOP32E adicionales, y recibieron dosis que fueron 4 veces menor y 2 veces mayor que la dosis eficaz de 125 \mug (Ejemplo 1). La diabetes se indujo como se describe anteriormente. Como controles, se usaron ratas con igual edad y peso. Se midió la glucemia sérica una semana después, y los animales que eran diabéticos se distribuyeron entonces al azar en 3 grupos de tratamiento (n = 12).

Los tratamientos se iniciaron 27 días tras la inducción de la diabetes. A los animales se les dio VOP32E a dosis de 31,25, 62,5, 125 ó 250 \mug en el músculo del gastrocnemio izquierdo. La extremidad contralateral sirvió como control no inyectado. El ADN plasmídico de VOP32E o pVAX-1 se formuló en poloxámero 188 al 5%, 150 mM de NaCl, y 2 mM de Tris pH 8,0. Se midieron SNCV y MNCV cuatro semanas tras el suministro génico. Las medidas de las velocidades de conducción nerviosa (SNCV y MNCV) se realizaron como se describe anteriormente. El ARN se procesó y se analizó para determinar la expresión transgénica, como se describe anteriormente.

En este estudio, los valores de MNCV y SNCV mostraron una clara eficacia para las tres dosis superiores del plásmido VOP32E.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Medio acondicionado

Como fuente de medio acondicionado, se usaron células HEK 293 humanas en las que se activó la expresión de VEGF usando un activador de ZFP dirigido al gen del VEGF. Tal medio acondicionado fue capaz de rescatar la dependencia del suero de dos estirpes celulares de neuroblastoma humano (SK-N-MC y SHEP-1) y de rata
(ND8).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Construcción de un vector adenovírico que codifica un factor de transcripción de proteína de dedos de cinc dirigida a VEGF

Este ejemplo describe la construcción de un vector adenovírico recombinante, Ad-VOP32Ep65Flag que contiene secuencias que codifican una proteína de fusión que contiene una secuencia de localización nuclear (NLS), el dominio de unión del ADN de dedos de cinc de VOP32E dirigido al VEGF (Tabla 1), un dominio de activación transcripcional de p65, y una etiqueta del epítopo Flag.

Las secuencias que codifican la proteína de fusión se ensamblaron como se describe, por ejemplo, en las patentes U.S. 6.453.242 y 6.534.261, en propiedad junto con la presente, y se clonaron entre los sitios Eco RI y Xho I del vector pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA). El plásmido resultante se digirió con Xho I, seguido del tratamiento con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I, en presencia de dNTPs, para convertir los extremos Xho I en extremos romos. Este ADN se digirió entonces con Afl II (sitio presente en el inserto en dirección 5' de las secuencias que codifican NLS), y se purificó el más pequeño de los dos fragmentos usando un kit de extracción en gel de Qiagen (Qiagen, Valencia, CA).

Se obtuvo un fragmento de ADN que contiene el promotor/potenciador temprano inmediato del citomegalovirus humano (CNV) y dos secuencias del operador de tetraciclina (TetO_{2}) digiriendo el plásmido pcDNA4/TO (Invitrogen, Carlsbad, CA) con MluI y AflI, y purificando el más pequeño de los dos fragmentos usando un kit de extracción en gel de Qiagen (Qiagen, Valencia, CA).

El plásmido pShuttle (Clontech, Palo Alto, CA) se digirió con Xba I, seguido del tratamiento con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I, en presencia de dNTPs, para convertir los extremos de Xba I en extremos romos. El fragmento de ADN resultante se digirió con Mlu I, y se purificó el más grande de los dos fragmentos usando un kit de extracción en gel de Qiagen (Qiagen, Valencia, CA).

Se realizó una ligación en tres sentidos, usando el fragmento Mlu I/Afl II que contiene el promotor/potenciador del CMV inducible por tetraciclina, el fragmento Afl II/Xho I que codifica la proteína de fusión, y el fragmento Xba I/Mlu I de pShuttle (que contiene una señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina, y un marcador de resistencia a canamicina), para generar un plásmido que tiene una cadena principal del vector pShuttle que contiene una unidad de transcripción que codifica la proteína de fusión bajo el control transcripcional del promotor/potenciador del CMV inducible por tetraciclina y de la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento
bovina.

El plásmido resultante a base de pShuttle se digirió con I-Ceu I y PI-Sce I. La mezcla de digestión se extrajo con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1), y se precipitó con 0,3 M de NaOAc/etanol. El ADN precipitado se resuspendió en tampón de TE, y se ligó al vector pAdeno-X digerido doblemente con I-Ceu I y PI-Sce I (Clontech, Palo Alto, CA). Se seleccionaron clones que contienen un fragmento de I-Ceu I/PI-Sce I insertado, que codifica la proteína de fusión en los sitios I-Ceu I y PI-Sce I de pAdeno-X.

El vector adenovírico recombinante se encapsidó en viriones tras la infección en células T-Rex^{TM}-293 (Invitrogen), y los adenovirus se recogieron a partir de células T-Rex^{TM}-293 transfectadas que se habían lisado con tres ciclos consecutivos de congelación-descongelación. Los adenovirus recombinantes se amplificaron posteriormente en células T-Rex^{TM}-293, y se purificaron mediante dos rondas de centrifugación con gradiente de cloruro de cesio. Los adenovirus recombinantes purificados (AdVOP32Ep65) se dializaron frente a tres cambios de 10 mM de Tris pH 8,0, 2 mM de MgCl_{2}, sacarosa al 4%, y se almacenaron en alícuotas a -80ºC. Los números de partículas adenovíricas se determinaron mediante absorbancia a 260 nm, y los títulos infecciosos se determinaron usando el kit de titulación rápida Adeno-X (Clontech, Palo Alto, CA).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Regeneración neuronal mediada por un activador transcripcional de ZFP dirigida a VEGF, tras una lesión de machacamiento del nervio

Se ensayó la capacidad del activador transcripcional de VOP32E para potenciar la regeneración neuronal en un sistema de modelo de nervio laríngeo recurrente machacado. Rubin et al. (2003) The Laryngoscope 113:985-989. Previamente se había demostrado que el suministro de un vector adenovírico vacío (es decir, un vector que carece de un transgén insertado) al nervio laríngeo recurrente (RLN) machacado no provocó lesión neuronal adicional significativa. Rubin et al. (2003), más arriba.

Para este experimento, se asignaron al azar ratas a 2 grupos. En el Grupo I, se machacó el RLN, y el nervio se inyectó con un vector adenovírico vacío (control, n = 10). En el Grupo II, se machacó el nervio, y se inyectó con AdVOP32Ep65 (n = 10). La regeneración se evaluó contando el número de contactos de la placa terminal nerviosa en los músculos laríngeos. Se sacrificaron cinco ratas de cada grupo en el 3^{er} día, y las 5 ratas restantes de cada grupo en el 7º día. Se procesaron criosecciones laríngeas para histoquímica con acetilcolina (para identificar placas terminales motoras), seguido de la inmunoperoxidasa de los neurofilamentos (para identificar fibras nerviosas). Se determinó el porcentaje de contacto de placas terminales nerviosas, un indicador muy aceptado de la regeneración nerviosa, y se comparó entre los grupos en el 3^{34} día (C) y en el 7º día (D), según protocolos publicados. Rubin et al. (2001) Laryngoscope 111:2041-2045; Rubin et al. (2003), más arriba.

Los resultados de estos análisis indican que, 3 días después del machacamiento del RLN, no hubo incremento significativo en el porcentaje del contacto de placa terminal nerviosa entre animales inyectados con el control e inyectados con Adp65. Sin embargo, en el 7º día, hubo un incremento sustancial en el contacto de la placa terminal nerviosa en animales que habían sido inyectados con Adp65, en comparación con animales que habían sido inyectados con el vector vacío. Los estudios histológicos confirmaron los informes previos (Rubin et al., más arriba) de que el suministro génico de VEGF a neuronas no produce formación aberrante de vasos sanguíneos. Estos resultados muestran que el suministro de un vector adenovírico que codifica un activador transcripcional de ZFP dirigido a VEGF, al tejido neuronal dañado, estimula la regeneración neuronal.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Construcción y producción de un vehículo de suministro de AAV que codifica una proteína de dedos de cinc dirigida a VEGF (AAV-VOP32Ep65Flag)

Se creó un vector de AAV recombinante, pAAV-VOP32Ep65Flag, según lo siguiente: 1) se digirió el pcDNA3-VOP32Ep65Flag plasmídico con Pme I y Xho I. El fragmento que contiene una secuencia de localización nuclear (NLS), el dominio de unión del ADN de dedos de cinc de VOP32E, un dominio de activación transcripcional de p65 y una etiqueta del epítopo flag se purificó usando un kit de extracción en gel de Qiagen. 2) El pAAV-MCS plasmídico (Stratagene) se digirió con Hinc II y Xho I. El fragmento más grande de la digestión se purificó usando un kit de extracción en gel de Qiagen. 3) Los fragmentos procedentes de 1) y 2) se ligaron para generar el plásmido pAAV-VOP32Ep65Flag.

Se cotransfectaron pAAV-VOP32Ep65Flag, pAAV-RC (Stratagene) y pHelper (Stratagene) en células HEK293 (ATCC) mediante fosfato de calcio, y el AAV recombinante se recolectó de las células HEK293 transfectadas lisadas con dos ciclos consecutivos de congelación-descongelación. El AAV recombinante se purificó usando una suspensión de heparina-agarosa (Sigma), y se concentró usando filtros de centrífuga Ultra-15 y Ultra-4 de Amicon (Millipore). El AAV recombinante purificado y concentrado se dializó frente a tres cambios de 10 mM de Tris pH 7,5-115 mM de NaCl-1 mM de MgCl_{2}, y se almacenó en alícuotas a -80ºC. El título genómico del vector de AAV se determinó mediante Taqman.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7

Tratamiento de neuropatía diabética mediante inyección intramuscular de ADN plasmídico que codifica una proteína de dedos de cinc dirigida a VEGF Formulación

pV-32Ep65 es un plásmido que codifica una proteína de fusión que contiene, en el orden desde N- hasta C-terminal, una señal de localización nuclear, el dominio de unión de dedos de cinc de VOP32E dirigido al gen de VEGF, y un dominio de activación transcripcional de p65 (Figura 4).

Se formula como una disolución estéril inyectable, para administración intramuscular, en viales de 3 ml (Tabla 5). La formulación consta de ADN plasmídico de pV-32Ep65 (2 mg/ml), poloxámero 188 (5% p/v), NaCl (150 mM), 2 mM de Tris-HCl, pH 8,0, y agua estéril para inyección.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5 Composición cuantitativa de la formulación para inyección

7

El producto farmacéutico final se ensayó para determinar el aspecto, la identidad y concentración del plásmido, la identidad y concentración del poloxámero, el contenido de humedad, el pH, la conductividad, la endotoxina, y la esterilidad. Como placebo, se proporciona disolución salina normal (0,9% de NaCl) en viales de 3 ml. La formulación se almacena a -20ºC. Inmediatamente antes del uso, se deja que el vial se equilibre a la temperatura ambiente durante 10 minutos. Una vez descongelados, los viales no se reutilizarán en los días posteriores.

\vskip1.000000\baselineskip

Administración

La dosificación implica ambas extremidades inferiores, comenzando distalmente y moviéndose proximalmente. De una manera enmascarada, se dosifica una pata con la formulación de pV-32Ep65, y la otra con placebo. Las dosis son las siguientes: Cohorte 1: 1 mg, Cohorte 2: 5 mg, Cohorte 3: 15 mg, Cohorte 4: 30 mg, y Cohorte 5: 60 mg. El fármaco se suministra en viales de 3 ml, y se inyecta en el pie, pantorrilla y muslo, respectivamente, en volúmenes de 0,5, 1 ó 1,5 ml. Sólo se dará una inyección en el pie, y se inyectará en el dorso del pie en el extensor digitorum brevis. Se pueden dar hasta diez inyecciones de 1 ml en la pata inferior en el músculo cerca de sitios nerviosos diana para los nervios safeno externo, safeno interno, y ciático poplíteo interno. Se dan las inyecciones restantes en el muslo, en alícuotas de 1,5 ml (hasta 13 inyecciones en el músculo anterior y posterior, a la dosis máxima de 60 mg).

\vskip1.000000\baselineskip

Procedimiento de inyección

El sitio de inyección en el músculo permite el depósito de entre 1 y 3 dosis individuales de 0,5 ml de la formulación insertando una aguja a lo largo del eje largo de la fibra muscular (es decir, paralela a la arteria femoral) hasta su centro (el punto de inserción completa de la aguja), y depositando dosis de 0,5 ml a intervalos de 1,27 centímetros a medida que se retira la aguja. La aguja apunta hacia el pie, y se inserta en un ángulo aproximado de 30 grados a la superficie de la piel, excepto en el pie. En el pie, la aguja debe formar un ángulo pequeño hacia los dedos.

\vskip1.000000\baselineskip

Agujas de inyección y volúmenes para cada sitio de inyección

Se han de usar agujas (calibre 25) con jeringuillas de 3 cc, según lo siguiente: una aguja de 2,54 centímetros para el pie, una aguja de 3,81 centímetros para la pantorrilla, y una aguja de 7,62 centímetros para el muslo. Los sitios de inyección se describen más abajo. Se debe tener cuidado de evitar la inyección en cualquier área que tenga una úlcera en la piel.

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción del sitio de inyección para cada nivel de dosis

Para cada pata, los sujetos en la Cohorte 1 recibieron una inyección IM de 0,5 ml (1,0 mg de plásmido) o placebo. La aguja forma un ángulo hacia los dedos, y se inyecta la inyección en el dorso del pie en el extensor digitorum brevis (nervio musculocutáneo de la pierna).

Para cada pata, los sujetos en la Cohorte 2 recibieron un total de tres inyecciones IM o placebo. Se administra una inyección de 0,5 ml (1 mg de plásmido) en el pie, como se describe anteriormente. Se administran dos inyecciones adicionales de 1 ml (2,0 mg de plásmido por inyección) en la pata inferior. Se administra una inyección en los músculos de la pantorrilla inferior medial (porción medial del soleus, flexor digitorum longus próximo al túnel tarsal [nervio ciático poplíteo interno]), y se administra otra en el gastrocnemio lateral, próximo al tendón de Aquiles (nervio safeno externo).

Para cada pata, los sujetos en la Cohorte 3 recibieron un total de ocho inyecciones IM. Se administró una inyección de 0,5 ml (1,0 mg de plásmido o placebo) en el pie, como se describe para la Cohorte 1. Se administran siete inyecciones IM adicionales de 1 ml (2,0 mg de plásmido cada una, o placebo) en la pata inferior. Se administra una inyección próxima al túnel tarsal (nervio ciático poplíteo interno), y la segunda inyección se administra en el gastrocnemio lateral, próximo al tendón de Aquiles (nervio safeno externo), como se describe para la Cohorte 2. Se administra una inyección de 1 ml en el músculo gastrocnemio lateral, próximo a la cabeza fibular (nervio peroneal), y se administra otra inyección de 1 ml a través de la pata en el músculo soleus, justo debajo de la fosa popliteal (nervio ciático poplíteo interno). Se administra una inyección adicional de 1 ml en la porción medial del músculo gastrocnemio, aproximadamente 5 cm proximal al tendón de Aquiles. Se administra otra inyección IM de 1 ml en la porción central de la tibia anterior.

Para cada pata, los sujetos en la Cohorte 4 recibieron un total de 14 inyecciones IM de plásmido o de placebo. Las inyecciones en el pie y en la pata inferior se dan como se describe para la Cohorte 3. Se administraron tres inyecciones IM adicionales de 1 ml en la pata inferior. Se administra una inyección IM adicional de 1 ml en la porción superior de la tibia anterior, y se administran dos inyecciones IM de 1 ml en el gastrocnemio medial (la primera de éstas se administra 5 cm por encima de la inyección en el gastrocnemio medial, justo antes del tendón de Aquiles descrita para la Cohorte 3, y se administra una segunda inyección IM 5 cm más arriba). Se administran tres inyecciones IM de 1,5 ml (3 mg de plásmido cada una, o placebo) en el muslo. La primera de estas inyecciones se administra en la porción medial más distal del músculo medial, en el vastus medialis. La segunda de estas inyecciones se administra en la porción más distal lateral del muslo en el vastus lateralis. La tercera de estas inyecciones se suministra en el cuádriceps femoral, justo al lado del tendón del rectus femoris.

Para cada pata, los sujetos en la Cohorte 5 recibieron un total de 24 inyecciones IM de plásmido o placebo. Las inyecciones en el pie, pata inferior, y muslo distal se dan como se describe para los sujetos en la Cohorte 4. Se administran diez inyecciones IM adicionales de 1,5 ml (3,0 mg de plásmido cada una, o placebo) en dos anillos de cinco en el muslo. Cada anillo de inyecciones se coloca en una línea horizontal aproximadamente 5 cm entre sí. El anillo más inferior se coloca aproximadamente 5 cm por encima de la inyección del cuádriceps femoral descrita para la Cohorte 4. Las inyecciones dentro de cada anillo están separadas aproximadamente 5 cm.

\vskip1.000000\baselineskip

Evaluación clínica

Los sujetos se evaluarán para determinar el grado de neuropatía periférica diabética, usando las siguientes modalidades:

\vskip1.000000\baselineskip

NSS

La modalidad NSS incluye 17 apartados separados, que se refieren a los síntomas de la DN. Ocho apartados se centran en la debilidad muscular, cinco se centran en las perturbaciones sensitivas, y 4 se centran en los síntomas autonómicos. Cada apartado se puntúa en una escala binaria (0 = ausente, 1 = presente), siendo la puntuación máxima 17.

\vskip1.000000\baselineskip

NIS-LL

La modalidad NIS-LL valora la resistencia muscular, modalidades sensitivas, y reflejos de los tendones profundos de las extremidades inferiores. Se evaluarán ambas patas. La resistencia muscular se gradúa en la escala de 0-4. Las modalidades sensitivas y los reflejos se puntúan en una escala de 0 a 2. Es posible una puntuación máxima de 64.

\vskip1.000000\baselineskip

TNS

La modalidad TNS evalúa los síntomas, signos, QST para vibración, y atributos de la conducción nerviosa de la DN. Se evaluaron diez modalidades, y cada una se puntuó en una escala de 0-4. Es posible una puntuación máxima de 40.

\vskip1.000000\baselineskip

Estudios de conducción nerviosa

Se realizarán estudios de conducción nerviosa estándar de los nervios peroneales bilaterales, de los nervios safeno externo, y de los nervios ciático poplíteo interno, en todos los sujetos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ensayo sensitivo cuantitativo (QST)

El QST, incluyendo la medida de VPT, se medirá en los dedos grandes, bilateralmente, usando un instrumento CASE IV (WR Medical Electronics, Stillwater, MN).

\vskip1.000000\baselineskip

Biopsias de piel

Se realizarán biopsias de piel en las piernas inferiores bilaterales, 10 cm próximas al maléolo lateral, en los días 0 y 180, para determinar la densidad de las fibras nerviosas intraepidérmicas.

Claims

1. Uso de un ácido nucleico, en el que el ácido nucleico codifica un polipéptido, en el que el polipéptido comprende:

(i): un dominio de unión del ADN de dedos de cinc, que se modifica para que se una a un sitio diana en el gen del factor A de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A); y

(ii): un dominio de activación transcripcional;

en el que el ácido nucleico se puede expresar en una o más células de un sujeto a tratar, con lo que el polipéptido es capaz de unirse al sitio diana y activar la transcripción del gen del VEGF-A para la fabricación de una composición para tratar un estado neuropático o neurodegenerativo en un sujeto.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que el dominio de unión del ADN de dedos de cinc comprende tres dedos de cinc, y la secuencia de aminoácidos de las regiones de reconocimiento de los dedos de cinc es la siguiente:

(SEQ ID NO:55)F1: DRSNLTR

(SEQ ID NO:141)F2: TSGHLSR

(SEQ ID NO:68).F3: RSDHLSR

3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el dominio de activación transcripcional es un dominio de activación de p65.

4. Uso de un polipéptido, en el que el polipéptido comprende:

(i): un dominio de unión del ADN de dedos de cinc, modificado para que se una a un sitio diana en el gen del factor A de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A); y

(ii): un dominio de activación transcripcional;

en el que el polipéptido es capaz de unirse al sitio diana y activar la transcripción del gen del VEGF-A para la fabricación de una composición para tratar un estado neuropático o neurodegenerativo en un sujeto.

5. El uso según la reivindicación 4, en el que el dominio de unión del ADN de dedos de cinc comprende tres dedos de cinc, y la secuencia de aminoácidos de las regiones de reconocimiento de los dedos de cinc es la siguiente:

(SEQ ID NO:55)F1: DRSNLTR

(SEQ ID NO:141)F2: TSGHLSR

(SEQ ID NO:68).F3: RSDHLSR

6. El uso según la reivindicación 4 ó 5, en el que el dominio de activación transcripcional es un dominio de activación de p65.