RS62559B1

RS62559B1 - Nukleazom posredovana regulacija eksprimiranja gena

Info

Publication number: RS62559B1
Application number: RS20211358A
Authority: RS
Inventors: Stuart H Orkin; Andreas Reik; Fyodor Urnov
Original assignee: Childrens Medical Center; Sangamo Therapeutics Inc
Priority date: 2013-11-13
Filing date: 2014-11-13
Publication date: 2021-12-31
Also published as: HRP20211706T1; EP3068881A2; DK3068881T3; PT3068881T; US11021696B2; HRP20190825T1; PT3492593T; HUE056436T2; ES2895069T3; PL3068881T3; EP3068881A4; EP3492593B1; SI3068881T1; CY1121630T1; WO2015073683A3; EP3960856A1; HUE044540T2; US20210348143A1; WO2015073683A2; EP3492593A1

Description

Opis

OBLAST

[0001] Predmetno obelodanjenje se odnosi na oblast inženjeringa genoma, posebno ciljanu modifikaciju genoma ćelije hematopoeze.

STANJE TEHNIKE

[0002] Kada se uzme u obzir da su napori za sekvenciranje genoma otkrili da ljudski genom sadrži između 20.000 i 25.000 gena, ali manje od 2000 transkripcionih regulatora, postaje jasno da brojni faktori moraju imati interakciju kako bi kontrolisali eksprimiranje gena u svim njegovim vremenskim, razvojnim i tkivnim specifičnim manifestacijama. Eksprimiranje gena kontroliše veoma složena mešavina opštih i specifičnih transkripcionih regulatora, i eksprimiranje takođe mogu kontrolisati cis-delujući DNK elementi. Ovi DNK elementi sadrže i lokalne DNK elemente, kao što je jezgro promotera i sa njima povezana mesta vezivanja faktora transkripcije, kao i distalne elemente kao što su pojačivači, prigušivači, izolatori i regioni za kontrolu lokusa (LCR) (pogledati Matson et al (2006) Ann Rev Genome Hum Genet 7: 29-50).

[0003] Elementi za pojačavanje su prvo identifikovani u virusnom genomu SV40, i zatim su pronađeni u lokusu teškog lanca ljudskog imunoglobulina. Sada kada je poznato da imaju regulatornu ulogu u eksprimiranju mnogih gena, čini se da pojačivači uglavnom utiču na vremenske i prostorne obrasce eksprimiranja gena. Takođe je obelodanjeno da pojačivači funkcionišu na način koji ne zavisi od udaljenosti od jezgra promotera gena, i ne zavisi od bilo koje specifične orijentacije sekvence u odnosu na promoter. Pojačivači mogu biti locirani nekoliko stotina kilobaza uzvodno ili nizvodno od regiona promotera jezgra, gde se mogu nalaziti u intronskoj sekvenci, ili čak izvan 3' kraja gena.

[0004] Opisani su različiti postupci i sastavi za usmereno razdvajanje genomske DNK. Takvi ciljani događaji razdvajanja mogu se koristiti, na primer, za indukciju ciljane mutageneze, indukovanje ciljanih brisanja sekvenci ćelijske DNK i olakšavanje ciljane rekombinacije na unapred određenom hromozomskom lokusu. Pogledati, npr. SAD patente br.8,623,618; 8,034,598; 8,586,526; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,067,317; 7,262,054; 7,888,121; 7,972,854; 7,914,796; 7,951,925; 8,110,379; 8,409,861; SAD patentne publikacije 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983 i 20130177960 i SAD prijavu br.14/278,903. Ovi postupci često uključuju upotrebu sintetičkih sistema razdvajanja kako bi se izazvao dvolančani prekid (DSB) ili zarez u sekvenci ciljane DNK, tako da popravljanje prekida putem procesa nastalog greškom, poput nehomolognog spajanja krajeva (NHEJ) ili popravljanje upotrebom šablona za popravljanje (popravljanje usmereno na homologiju ili HDR) može dovesti do izbacivanja gena ili umetanja sekvence od interesa (ciljana integracija). Ova tehnika se takođe može koristiti za uvođenje promena u sekvenci genoma specifičnih za mesto primenom donorskog oligonukleotida, uključujući uvođenje specifičnih brisanja genomskih regiona, ili specifičnih tačkastih mutacija ili lokalizovanih promena (poznate i kao korekcija gena). Do razdvajanja može doći upotrebom specifičnih nukleaza, kao što su konstruisane cinkov prst nukleaza (CPN), efektorske nukleaze poput aktivatora transkripcije (TALEN), ili korišćenjem CRISPR/Cas sistema sa sintetičkom crRNK/tracr RNK ('RNK sa jednim vodičem') da usmerava specifično razdvajanje. Dalje, ciljane nukleaze se razvijaju na osnovu Argonaute sistema(npr., od T. thermophilus, poznat kao 'TtAgo', pogledati Swarts et al (2014) Nature 507(7491): 258-261), koji takođe mogu imati potencijal za upotrebu u uređivanju genoma i genskoj terapiji.

[0005] Crvena krvna zrnca (CKZ) ili eritrociti su glavna ćelijska komponenta krvi. U stvari, eritrociti čine jednu četvrtinu ćelija čoveka. Zrelim eritrocitima nedostaje jezgro i mnoge druge organele kod ljudi, i puni su hemoglobina, metaloproteina koji funkcioniše tako da prenosi kiseonik u tkiva, kao i da prenosi ugljen-dioksid iz tkiva i nazad u pluća radi uklanjanja. Ovaj protein čini približno 97% suve težine eritrocita i povećava sposobnost prenošenja kiseonika u krvi za oko sedamdeset puta. Hemoglobin je heterotetramer koji se sastoji od dva alfa (a)-slična lanca globina i dva beta (β)-slična lanca globina i 4 heme grupe. Kod odraslih se α2β2 tetramer naziva hemoglobin A (HbA) ili hemoglobin za odrasle.

Obično se alfa i beta lanci globina sintetišu u približnom odnosu 1:1 i čini se da je ovaj odnos kritičan u smislu stabilizacije hemoglobina i eritrocita. U fetusu u razvoju proizvodi se drugačiji oblik hemoglobina, fetalni hemoglobin (HbF), koji ima veći afinitet vezivanja za kiseonik od hemoglobina A, tako da se kiseonik može dopremiti u sistem bebe putem krvotoka majke. Fetalni hemoglobin takođe sadrži dva α-lanca globina, ali umesto odraslih βlanaca globina, ima dva fetalna gama (y)-lanca globina (tj. fetalni hemoglobin je α2γ2).

Nakon približno 30 nedelja trudnoće, sinteza gama globina u fetusu počinje da opada, dok se proizvodnja beta globina povećava. Do uzrasta od približno 10 meseca, hemoglobin novorođenčeta je skoro ceo α2β2, iako neki HbF opstaju i u odraslom uzrastu (približno 1-3% ukupnog hemoglobina). Regulacija prelaska sa proizvodnje gama- do beta-globina je prilično složena i prvenstveno uključuje smanjenje regulacije transkripcije gama-globina uz istovremenu regulaciju na gore transkripcije beta-globina.

[0006] Genetski nedostaci u sekvencama koje kodiraju lance hemoglobina mogu biti odgovorni za brojne bolesti poznate kao hemoglobinopatije, uključujući anemiju srpastih ćelija i talasemije. Kod većine pacijenata sa hemoglobinopatijama geni koji kodiraju gama globin ostaju prisutni, ali je eksprimiranje relativno nisko zbog normalne represije gena koja se javlja oko porođaja, kao što je opisano iznad.

[0007] Procenjuje se da 1 od 5000 ljudi u SAD ima bolest srpastih ćelija (SCD), uglavnom kod ljudi podsaharsko afričkog porekla. Čini se da heterozigotni nosioci mutacije srpastih ćelija imaju koristi za zaštitu od malarije, pa je ova osobina vremenom mogla biti pozitivno odabrana, pa se procenjuje da u podsaharskoj Africi jedna trećina populacije ima svojstvo srpastih ćelijsko. Bolest srpastih ćelija uzrokovana je mutacijom u genu β globina, usled čega je valin zamenjen glutaminskom kiselinom na aminokiselini #6 (GAG do GTG na nivou DNK), gde se rezultujući hemoglobin naziva „hemoglobinS“ ili „HbS“. U uslovima nižeg kiseonika, konformacioni pomak u dezoksi obliku HbS izlaže hidrofobnu mrlju na proteinu između E i F spirala. Hidrofobni ostaci valina na položaju 6 beta lanca u hemoglobinu mogu da se povežu sa hidrofobnim zakrpom, uzrokujući agregaciju HbS molekula i formiranje vlaknastih taloga. Ovi agregati zauzvrat izazivaju abnormalnost ili „srpastost“ eritrocita, što dovodi do gubitka fleksibilnosti ćelija. Srpasti eritrociti više nisu u stanju da se uguraju u kapilarne krevete i mogu dovesti do vazookluzivne krize kod pacijenata sa srpastim ćelijama. Osim toga, srpasti eritrociti su krhkiji od normalnih eritrocita i teže ka hemolizi, što na kraju dovodi do anemije kod pacijenata.

[0008] Tretman i upravljanje pacijentima sa srpastim ćelijama su doživotni, i uključuju tretman antibioticima, ublažavanje bolova i transfuziju tokom akutnih epizoda. Jedan pristup je upotreba hidroksiuree, koja delimično ispoljava svoje efekte povećanjem proizvodnje gama globina. Međutim, dugoročni neželjeni efekti hronične terapije hidroksiuree još uvek nisu poznati, a tretman ima nuspojave i može imati promenljivu efikasnost od pacijenta do pacijenta. Uprkos povećanju efikasnosti tretmana srpastih ćelija, očekivani životni vek pacijenata je tek u srednjim do kasnim 50-im godinama, a srodni morbiditeti bolesti imaju dubok uticaj na kvalitet života pacijenata.

[0009] Talasemije su takođe bolesti povezane sa hemoglobinom i tipično uključuju smanjeno eksprimiranje lanaca globina. To se može dogoditi kroz mutacije u regulatornim regionima gena ili iz mutacije u sekvenci koja kodira globin koja rezultuje smanjenim eksprimiranjem ili smanjenim nivoima ili funkcionalnim globinskim proteinom. Alfa talasemije se uglavnom povezuju sa ljudima zapadnoafričkog i južnoazijskog porekla, i mogu pružati otpornost na malariju. Beta talasemija se uglavnom povezuje sa ljudima mediteranskog porekla, tipično iz Grčke i priobalnih regiona Turske i Italije. Tretman talasemije obično uključuje transfuziju krvi i terapiju helacije gvožđa. Transplantacija koštane srži se takođe koristi za tretman ljudi sa teškom talasemijom ako se može identifikovati odgovarajući donor, ali ova procedura može imati značajne rizike.

[0010] Jedan pristup koji je predložen za tretman i SCD i beta talasemije je povećanje eksprimiranja gama globina sa ciljem da HbF funkcionalno zameni aberantni odrasli hemoglobin. Kao što je gore pomenuto, smatra se da je tretman pacijenata sa SCD hidroksiureom delimično uspešan zbog svog efekta na povećanje eksprimiranja gama globina. Prva grupa jedinjenja za koja je otkriveno da utiču na reaktivaciju gama globina bili su citotoksični lekovi. Sposobnost izazivanja de novo sinteze gama-globina farmakološkim manipulacijama prvi put je pokazana upotrebom 5-azacitidina kod eksperimentalnih životinja (DeSimone (1982) Proc Nat'l Acad Sci USA 79(14):4428-31). Naknadne studije potvrdile su sposobnost 5-azacitidina da poveća HbF kod pacijenata sa β-talasemijom i bolesti srpastih ćelija (Ley, et al., (1982) N. Engl. J. Medicine, 307: 1469-1475, i Ley, et al., (1983) Blood 62: 370-380). Osim toga, masne kiseline kratkog lanca (npr. butirat i derivati) pokazale su u eksperimentalnim sistemima da povećavaju HbF (Constantoulakis et al., (1988) Blood 72(6):1961-1967). Takođe, postoji deo ljudske populacije sa stanjem poznatim kao „nasledna perzistencija fetalnog hemoglobina“ (HPFH) gde povišene količine HbF traju i u odrasloj dobi (10-40% u HPFH heterozigotima (pogledati Thein et al (2009) Hum. Mol. Genet 18 (R2): R216-R223). Ovo je retko stanje, ali u odsustvu bilo kakvih abnormalnosti beta globina, nije povezano sa nekim značajnijim kliničkim manifestacijama, čak i kada 100% hemoglobina pojedinca jeste HbF. Kada pojedinci koji imaju beta talasemiju takođe imaju istovremeni HPFH, eksprimiranje HbF može smanjiti težinu bolesti. Dalje, ozbiljnost prirodnog toka bolesti srpastih ćelija može značajno da varira od pacijenta do pacijenta, i ova varijabilnost, delimično, može se pratiti do činjenice da neke osobe sa blažom bolesti eksprimiraju više nivoe HbF.

[0011] Jedan pristup povećanju eksprimiranja HbF uključuje identifikaciju gena čiji proizvodi imaju ulogu u regulaciji eksprimiranja gama globina. Jedan takav gen je BCL11A, prvi put identifikovan zbog svoje uloge u razvoju limfocita. BCL11A kodira protein cinkovog prsta za koji se smatra da je uključen u regulaciju eksprimiranja gama globina specifičan za razvojnu fazu. BCL11A se eksprimira u ćelijama prekursora eritroida odraslih i smanjeno eksprimiranje dovodi do povećanja eksprimiranja gama globina. Osim toga, čini se da je spajanje BCL11A mRNK razvojno regulisano. U embrionalnim ćelijama čini se da su kraće varijante BCL11A mRNK, poznate kao BCL11A-S i BCL11A-XS, primarno eksprimirane, dok su u odraslim ćelijama pretežno izražene duže varijante BCL11A-L i BCL11A-XL. Pogledati, Sankaran et al (2008) Science 322 p.1839. Čini se da protein BCL11A stupa u interakciju sa lokusom beta globina kako bi promenio njegovu konformaciju, i time i njegovu eksprimiranje u različitim razvojnim fazama. Predložena je upotreba inhibitorne RNK ciljane na gen BCL11A (pogledati, npr. SAD patentnu publikaciju 20110182867), ali ova tehnologija ima nekoliko potencijalnih nedostataka, naime to što se ne može postići potpuno obaranje, isporuka takvih RNK može biti problematična i RNK moraju biti prisutne neprestano, što zahteva višestruke tretmane tokom celog života.

[0012] Ciljanje sekvenci BCL11A pojačivača može pružiti mehanizam za povećanje HbF. Na primer, studije o asocijaciji širom genoma identifikovale su skup genetskih varijacija na BCL11A koje su povezane sa povećanjem nivoa HbF. Ove varijacije su zbirka SNP koji se nalaze u nekodirajućim regionima BCL11A i koji funkcionišu kao region pojačivača specifičan za fazu, ograničen na liniju. Dalje istraživanje otkrilo je da je ovaj BCL11A pojačivač potreban u eritroidnim ćelijama za eksprimiranje BCL11A, ali nije potreban za njegovo eksprimiranje u B ćelijama (pogledati Bauer et al, (2013) Science 343:253-257).

Region pojačivača pronađen je unutar introna 2 od BCL11A gena, i identifikovane su tri oblasti preosetljivosti na DNKseI (često indikativne za stanje hromatina koje je povezano sa regulatornim potencijalom) u intronu 2. Ove tri oblasti su identifikovane kao „+62“, „+58“ i „+55“ u skladu sa udaljenošću u kilobazama od mesta početka transkripcije BCL11A. Ovi regioni pojačivača su otprilike 350 (+55); 550 (+58); i 350 (+62) nukleotida dužine (Bauer 2013, ibid).

[0013] Prema tome, ostaje potreba za dodatnim postupcima i sastavima koji mogu koristiti ove studije o širokoj asocijaciji genoma za uređivanje genoma i promenu eksprimiranja gena, na primer za tretman hemoglobinopatija, poput bolesti srpastih ćelija i beta talasemije.

SAŽETAK

[0014] Predmetni pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Konkretno, opisani postupci i sastavi se odnose na inaktiviranje (npr., potpuno ili delimično ukidanje njegovog eksprimiranja) gena, na primer gena koji deluje kao regulator jednog ili više dodatnih gena. Konkretno, predmetno obelodanjenje se odnosi na postupke i sastavi za ometanje funkcije pojačivača u BCL11A genu kako bi se smanjila ili isključila njegova aktivnost u specifičnim ćelijskim linijama. Dodatno, obelodanjenje se odnosi na postupke i sastave za ometanje funkcija BCL11A pojačivača gde se sekvence pojačivača ne nalaze unutar BCL11A gena. Rezultujuća regulacija na dole BCL11A gena u ovim okolnostima dovodi do povećanog eksprimiranja gama globina.

Pronalazak pruža genetski modifikovanu ćeliju koja sadrži brisanja i/ili umetanja u endogenoj sekvenci BCL11A pojačivača napravljenoj od nukleaze koja sadrži domen razdvajanja i DNK-vezujući domen koji se vezuje za ciljano mesto koje sadrži najmanje 9 baznih parova od SEQ ID NO: 71 do 74.

Pronalazak takođe pruža genetski modifikovanu diferenciranu ćeliju koja potiče od matične ćelije prema pronalasku.

Pronalazak dalje pruža farmaceutski sastav koji sadrži genetski modifikovanu ćeliju pronalaska i upotrebu farmaceutskog sastava.

Pronalazak pruža farmaceutski sastav pronalaska za upotrebu u tretmanu ili prevenciji hemoglobinopatije.

Pronalazak takođe pruža farmaceutski sastav prema pronalasku za upotrebu u postupku tretmana ili prevencije hemoglobinopatije kod pacijenata kojima je potrebno povećanje eksprimiranja gena globina, gde se postupak sastoji od primene pacijentu farmaceutskog sastava u količini dovoljnoj za povećanje eksprimiranje gena globina kod pacijenata.

[0015] U nekim aspektima, najmanje jedna nukleaza (tj. nukleaza koja se vezuje za sekvencu BCL11A pojačivača) se isporučuje u ljudsku matičnu ćeliju ili prekursor ćeliju (HSC/PC) u svrhu inženjeringa genoma. U određenim aspektima obelodanjenja, nukleaza prepoznaje ciljanu sekvencu koja sadrži najmanje 9 (npr., 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ili čak i više) susednih baznih parova od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO : 3). Ciljane sekvence su prikazane u Tabelama 1, 2, 3, 4 i 6. U određenim aspektima predmetnog obelodanjenja, nukleaza sadrži DNK-vezujući protein, koji sadrži protein cinkovog prsta, koji sadrži 4, 5 ili 6 domena cinkovog prsta, koji sadrže region prepoznavanja spirale, gde proteini cinkovog prsta sadrže regione prepoznavanja spirale po redosledu prikazanom u jednom redu Tabele 3 ili Tabele 6. U drugim aspektima obelodanjenja, nukleaza sadrži TALE protein koji sadrži mnoštvo TALE jedinica ponavljanja, gde svaka jedinica ponavljanja sadrži hipervarijabilni region ostataka (RVD), na primer, RVD od TALE jedinica ponavljanja prikazane su u jednom redu Tabele 1, Tabele 2 ili Tabele 4. Nukleaze kako su ovde opisane mogu dalje sadržati veznik (npr., između DNK vezujućeg domena i domena razdvajanja), na primer veznik kao što je prikazano na Slikama 14 i 17.

[0016] U nekim otelotvorenjima, nukleaza se isporučuje kao peptid, dok se u drugim isporučuje kao nukleinska kiselina koja kodira najmanje jednu nukleazu. U nekim otelotvorenjima, koristi se više od jedne nukleaze. U nekim poželjnim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira nukleazu je mRNK, a u nekim slučajevima, mRNK je zaštićena. U nekim aspektima, mRNK može biti hemijski modifikovana (pogledati npr.

Kormann et al, (2011) Nature Biotechnology 29(2):154-157). U drugim aspektima, mRNK može sadržati ARCA kapu (pogledati SAD patente 7,074,596 i 8,153,773). U daljim otelotvorenjima, mRNK može sadržati mešavinu nemodifikovanih i modifikovanih nukleotida (pogledati SAD patentnu publikaciju 2012-0195936). Nukleaza može sadržati cinkov prst nukleazu (CPN), TALE-nukleazu (TALEN) ili CRISPR/Cas sistem nukleaze ili njihovu kombinaciju. U poželjnom otelotvorenju, nukleinska kiselina koja kodira nukleazu isporučuje se u HSC/PC putem elektroporacije. U nekim otelotvorenjima, nukleaza se razdvaja na ili blizu mesta vezivanja faktora transkripcije. U nekim aspektima, faktor transkripcije je GATA-1.

[0017] U nekim otelotvorenjima koja sadrže sistem nukleaze koji koristi vodič nukleinske kiseline (npr. CRISPR/Cas; TtAgo), ćelija može biti u dodiru sa vodičem nukleinske kiseline u isto vreme kada je u dodiru sa nukleazom, pre dodira sa nukleazom ili nakon dodira sa nukleazom. Ćelija se može dovesti u dodir kada je nukleaza pružena kao polipeptid, mRNK ili vektor (uključujući virusni vektor) sposoban za eksprimiranje gena koji kodira nukleazu. Vodeća nukleinska kiselina može biti pružena kao oligonukleotid (za TtAgo) ili RNK (CRISPR/Cas). Dalje, vodeća RNK se može pružiti preko sistema eksprimiranja za eksprimiranje vodeće RNK u ćeliji. U nekim aspektima postoji više od jedne vodeće RNK (pogledati Mandal et al (2014) Cell Stem Cell 15:643). U nekim otelotvorenjima, pružene su dve vodeće RNK, dok u drugima više od dve (npr. tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset ili više od deset). U nekim aspektima, skraćene vodeće RNK se koriste za povećanje specifičnosti (Fu et al (2014) Nature Biotechnol 32(3): 279). Takođe pogledati SAD patentnu prijavu 14/278,903.

[0018] Mogu se koristiti mutirane Cas nukleaze specifične za BCL11A pojačivač. U nekim otelotvorenjima, ove mutirane Cas nukleaze su Cas9 nukleaze i imaju izmenjenu funkcionalnost. U nekim otelotvorenjima, Cas9 protein je mutiran u HNH domenu, čineći ga nesposobnim za razdvajanje DNK lanca koji je komplementaran sa vodećom RNK. U drugim otelotvorenjima, Cas9 je mutiran u Rvu domenu, što ga čini nesposobnim za razdvajanje nepotpunog lanca DNK. Ove mutacije mogu rezultovati stvaranjem Cas9 nikaza. U nekim otelotvorenjima, dve Cas nikaze se koriste sa dve odvojene vodeće RNK za ciljanje DNK, što rezultuje sa dva zareza u ciljanoj DNK na određenoj udaljenosti. U drugim otelotvorenjima, i HNH i Rvu domeni endonukleaze su promenjeni kako bi se dobio Cas9 protein koji nije u stanju da razdvoji ciljanu DNK BCL11A pojačivača.

[0019] Može se koristiti skraćivanje Cas9 proteina. U jednom otelotvorenju, Cas9 protein je skraćen tako da se jedan ili više funkcionalnih domena Cas9 uklanja. U jednom otelotvorenju, uklanjanje dela ili jednog od domena nukleaze čini nukleazu Cas nikazom. U jednom aspektu, Cas9 sadrži samo domen odgovoran za interakciju sa crRNK ili sgRNK i ciljanom DNK.

[0020] Mogu se koristiti fuzioni proteini u kojima su Cas9 protein, ili njegovo skraćivanje, spojeni sa funkcionalnim domenom. U nekim aspektima, funkcionalni domen je domen aktivacije ili represije. U drugim aspektima, funkcionalni domen je domen nukleaze. U nekim otelotvorenjima, domen nukleaze je a FokI domen endonukleaze (npr. Tsai (2014) Nature Biotech doi:10.1038/nbt.2908). U nekim otelotvorenjima, FokI domen sadrži mutacije u domenu dimerizacije.

[0021] U drugim aspektima, pronalazak se odnosi na ćeliju ili ćelijsku liniju u kojoj je endogena sekvenca BCL11A pojačivača modifikovana, na primer u poređenju sa sekvencom ćelije divljeg tipa. Ćelije ili ćelijske linije mogu biti heterozigotne ili homozigotne za modifikaciju. Modifikacije obuhvataju umetanja, brisanja i/ili njihove kombinacije. U nekim poželjnim otelotvorenjima, njihova umetanja, brisanja i/ili njihove kombinacije dovode do uništenja mesta vezivanja za faktor transkripcije. Sekvenca BCL11A pojačivača je modifikovana nukleazom (npr., CPN, TALEN, CRISPR/Cas sistem, Ttago sistem itd.). U nekim otelotvorenjima, BCL11A pojačivač je modifikovan bilo gde između egzona 2 i egzona 3. U drugim otelotvorenjima, BCL11A pojačivač je modifikovan u regionima prikazanim u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 3 (Slika 11). U nekim otelotvorenjima, modifikacija je na ili blizu mesta vezivanja i/ili razdvajanja nukleaze, na primer, unutar 1-300 (ili bilo koje druge vrednosti između njih) baznih parova uzvodno ili nizvodno od mesta razdvajanja, poželjnije unutar 1-100 baznih parova (ili bilo koja vrednosti između njih) sa bilo koje strane mesta vezivanja i/ili razdvajanja, još poželjnije unutar 1 do 50 baznih parova (ili bilo koja vrednosti između njih) sa obe strane mesta vezivanja i/ili razdvajanja. Modifikacija može biti na ili blizu „+58“ regiona BCL11A pojačivača, na primer, na ili blizu mesta vezivanja nukleaze prikazanog u bilo kojoj od SEQ ID NO: 4 do 80 i 362. Modifikacija može biti na ili blizu „+55“ regiona BCL11A pojačivača, na primer, na ili blizu mesta nukleaze prikazanog u bilo kojoj od SEQ ID NO: 143 do 184 i 232-251. Do modifikacije može doći kod drugih sekvenci BCL11A pojačivača. Bilo koja ćelija ili ćelijska linija mogu biti modifikovani, na primer matična ćelija (matična ćelija hematopoeze). Takođe su obelodanjene delimično ili potpuno diferencirane ćelije koje potiču od modifikovanih matičnih ćelija kako je ovde opisano (npr., eritrociti ili ćelije prekursora eritrocita). Bilo koja od ovde modifikovanih ćelija ili ćelijskih linija može pokazati povećano eksprimiranje gama globina. Takođe su obelodanjeni sastavi kao što su farmaceutski sastavi koji sadrže genetski modifikovane ćelije kao što je ovde opisano.

[0022] U drugim aspektima, donorska nukleinska kiselina može biti isporučena u ciljanu ćeliju. Donor se može isporučiti pre, posle ili zajedno sa nukleinskom kiselinom koja kodira nukleazu. Donorska nukleinska kiselina može sadržati egzogenu sekvencu (transgen) koja se integriše u genom ćelije, na primer, endogeni lokus. U nekim otelotvorenjima, donor može sadržati gen cele dužine ili njegov fragment sa bočnim regionima homologije sa ciljanim

1

mestom razdvajanja. U nekim otelotvorenjima, donoru nedostaju regioni homologije i integrisan je u ciljani lokus putem mehanizma nezavisnog od homologije (tj. NHEJ). Donor može sadržati bilo koju sekvencu nukleinske kiseline, na primer nukleinsku kiselinu koja, kada se koristi kao supstrat za homološki usmereno popravljanje dvolančanog prekida izazvanog nukleazom, dovodi do brisanja specifičnog za donora koji se generiše na endogenom hromozomskom lokusu (npr., region BCL11A pojačivača) ili, alternativno (ili pored toga), novim alelnim oblicima (npr., tačkaste mutacije koje abliraju mesto vezivanja faktora transkripcije) endogenog lokusa koji će se stvoriti. U nekim aspektima, donorska nukleinska kiselina je oligonukleotid gde integracija dovodi do događaja korekcije gena ili ciljanog brisanja.

[0023] U drugim aspektima, nukleaza i/ili donor se (isporučuju) virusnim i/ili nevirusnim postupcima prenošenja gena. U poželjnim otelotvorenjima, donor se isporučuje u ćeliju putem adeno-povezanog virusa (AAV). U nekim slučajevima, AAV sadrži LTR koji su heterolognog serotipa u poređenju sa kapsidnim serotipom.

[0024] U nekim aspektima, sastavi pronalaska koriste jednu ili više nukleaza (npr., CPN i/ili TALEN) ciljani na određene regione u regionu BCL11A pojačivača. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više parova nukleaza ciljaju sekvence koje rezultuju modifikacijom pojačivača regiona brisanjem u celini, dok se u drugim otelotvorenjima, podsekcije pojačivača brišu. U nekim otelotvorenjima, brisanje obuhvata jedan ili više od 55, 58 i/ili 62 regiona DNKseI hipersenzitivnosti regiona pojačivača. U drugim otelotvorenjima, obrisan je podskup (manje od svih) regiona hipersenzitivnosti. U nekim otelotvorenjima, briše se samo 55, samo 58 ili samo 62 region. U drugim otelotvorenjima, dva regiona su izbrisana (npr., 55 i 58; 58 i 62; ili 55 i 62).

[0025] U nekim aspektima, izvršena su brisanja koja obuhvataju regione unutar DNKseI regiona hipersenzitivnosti od pojačivača. Ova brisanja može da sadrži od oko 1 nukleotida do oko 551 nukleotida. Prema tome, brisanja mogu sadržati, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 nukleotida ili bilo koju vrednost između njih. U nekim otelotvorenjima, brisanja obuhvataju vezujuće regione za jedan ili više transkripcionih faktora. U nekim poželjnim otelotvorenjima, brisanja sadrže GATA-1 mesto vezivanja, ili mesto vezivanja za GATA-1 u kombinaciji sa drugim faktorima.

[0026] Neki aspekti obelodanjenja se odnose na sintetičke (neprirodne) DNK-vezujuće proteine koji se vezuju za sekvence BCL11A pojačivača, ali ga ne razdvajaju. Na primer, domen nukleaze Cas9 u sistemu CRISPR/Cas može se posebno konstruisati tako da izgubi aktivnost razdvajanja DNK („dCAS“), i fuzionisati se za funkcionalni domen sposoban za moduliranje eksprimiranja gena (pogledati Perez-Pimera (2013) Nat Method 10(10):973-976) za kreiranje CRISPR/dCas-TF. U nekim slučajevima, konstruisani domeni za vezivanje DNK blokiraju interakciju transkripcionih faktora aktivnih u aktivnosti pojačivača od vezivanja za njihove srodne sekvence pojačivača.

[0027] DNK-vezujući domeni mogu biti fuzionisani sa funkcionalnim domenom, kao što je fuzija domena za vezivanje DNK sa domenima sposobnim da regulišu eksprimiranje gena. Fuzioni proteini mogu sadržati vezujući domen DNK spojen sa modulacionim domenom eksprimiranja gena gde modulator potiskuje eksprimiranje gena.

[0028] U nekim otelotvorenjima, HSC/PC ćelije su u dodiru sa nukleazama i/ili proteinima koji vezuju DNK, kao što je ovde opisano. U nekim otelotvorenjima, nukleaze i/ili proteini koji se vezuju za DNK isporučuju se kao nukleinske kiseline, a u drugim otelotvorenjima, isporučuju se kao proteini. U nekim otelotvorenjima, nukleinske kiseline su mRNK koje kodiraju nukleaze i/ili proteine koji vezuju DNK, a u daljim otelotvorenjima, mRNK mogu biti zaštićene. U nekim otelotvorenjima, mRNK može biti hemijski modifikovana, može sadržati ARCA kapu i/ili može sadržati smešu nemodifikovanih i modifikovanih nukleotida.

[0029] U nekim aspektima, HSC/PC su u dodiru sa nukleazama i/ili proteinima koji vezuju DNK, kao što je ovde opisano ex vivo, nakon afereze HSC/PC od pacijenta ili prečišćavanja iz prikupljene koštane srži. Nukleaze mogu izazvati modifikacije unutar regiona BCL11A pojačivača. HSC/PC koji sadrži modifikacije regiona BCL11A pojačivača može se ponovo uvesti u pacijenta. U nekim slučajevima, HSC/PC koji sadrži modifikacije regiona BCL11A pojačivača se proširuje pre uvođenja. U drugim aspektima, genetski modifikovani HSC/PC se primenjuje pacijentu u transplantaciji koštane srži gde se HSC/PC presađuje, diferencira i sazreva in vivo. HSC/PC može biti izolovan od pacijenta nakon mobilizacije izazvane sa G-CSF i/ili pleriksaforom, ili ćelije mogu biti izolovane iz ljudske koštane srži ili ljudskih pupčanih vrpci. U nekim aspektima, pacijent se tretira blagom mijeloablativnom procedurom pre uvođenja transplantata koji sadrži modifikovani HSC/PC, dok se u drugim aspektima pacijent tretira snažnim režimom mijeloablacije. U nekim otelotvorenjima, sastavi pronalaska se koriste za tretman ili sprečavanje hemoglobinopatije. U nekim aspektima, hemoglobinopatija je beta talasemija, dok je u drugim aspektima hemoglobinopatija bolest srpastih ćelija.

[0030] U nekim otelotvorenjima, HSC/PC su dalje u dodiru sa donorskim molekulom. U nekim otelotvorenjima, donorski molekul se isporučuje putem virusnog vektora. donorski molekul može sadržati jednu ili više sekvenci koje kodiraju funkcionalni polipeptid (npr., cDNK ili njen fragment), sa ili bez promotera. Dodatne sekvence (kodirajuće ili nekodirajuće sekvence) mogu biti uključene kada se donorski molekul koristi za inaktivaciju, uključujući, ali bez ograničenja, sekvence koje kodiraju 2A peptid, SA mesto, IRES, itd.

[0031] U jednom aspektu, postupci i sastavi sadrže postupke za dovođenje u dodir HSC/PC in vivo. Nukleaze i/ili proteini koji se vezuju za DNK isporučuju se u HSC/PC in situ postupcima poznatim u struci. Nukleaze i/ili DNK-vezujući proteini mogu sadržati virusnu česticu koja se primenjuje pacijentu koji ima potrebu za tim, ili nukleaze i/ili DNK-vezujući proteini mogu sadržati nanočesticu (npr. lipozom). Virusne čestice i/ili nanočestice mogu se isporučiti u organ (npr. koštana srž) u kom se nalaze HSC/PC.

[0032] U drugom aspektu, ovde opisani su postupci integracije donorske nukleinske kiseline u genom ćelije putem homološki nezavisnih mehanizama. Postupci obuhvataju stvaranje dvolančanog prekida (DSB) u genomu ćelije i razdvajanje donorskog molekula pomoću nukleaze, tako da je donorska nukleinska kiselina integrisana na mestu DSB. Donorska nukleinska kiselina se može integrisati postupcima koji ne zavise od homologije (npr., NHEJ). Kao što je gore navedeno, nakon in vivo razdvajanja, donorske sekvence mogu biti ciljano integrisane u genom ćelije na mestu DSB. Donorska sekvenca može uključivati jedno ili više istih ciljanih mesta za jednu ili više nukleaza koje se koriste za stvaranje DSB. Tako se donorska sekvenca može razdvojiti od strane jedne ili više istih nukleaza koje se koriste za razdvajanje endogenog gena u koji se želi integracija. Donorska sekvenca može uključivati različita ciljana mesta nukleaze od nukleaza koje se koriste za indukciju DSB. DSB u genomu ciljane ćelije mogu se stvoriti bilo kojim mehanizmom. DSB može biti kreiran od jedne ili više cinkov prst nukleaza (CPN), fuzionih proteina koji sadrže domen vezivanja cinkovog prsta, koji je dizajniran da vezuje sekvencu unutar regiona od interesa, i domen razdvajanja ili polu-domen razdvajanja. DSB može biti kreiran od jednog ili više TALE DNK-vezujućih domena (koji se javljaju u prirodi ili se ne javljaju u prirodi) spojenih sa

1

domenom nukleaze (TALEN). DSB se može stvoriti korišćenjem sistema nukleaze CRISPR/Cas gde se konstruisana pojedinačna vodeća RNK ili njen funkcionalni ekvivalent koriste za vođenje nukleaze do ciljanog mesta u genomu.

[0033] U jednom aspektu, donor može kodirati regulatorni protein od interesa (npr. PCP TF, TALE TF ili CRISPR/Cas TF) koji se vezuje za i/ili modulira eksprimiranje gena od interesa. U jednom aspektu, regulatorni proteini se vezuju za DNK sekvencu i sprečavaju vezivanje drugih regulatornih faktora. U drugom otelotvorenju, vezivanje regulatornog proteina može modulirati (tj. indukovati ili potisnuti) eksprimiranje ciljane DNK.

[0034] Opisana je transgena HSC/PC ćelija i/ili životinja koja uključuje transgen koji kodira ljudski gen. Transgena životinja može sadržati izbacivanje endogenog lokusa koje odgovara egzogenom transgenu, omogućavajući tako razvoj in vivo sistema gde se ljudski protein može proučavati izolovano. Takvi transgeni modeli mogu se koristiti u svrhe skrininga za identifikaciju malih molekula ili velikih biomolekula ili drugih entiteta koji mogu da stupe u interakciju sa ili modifikuju ljudski protein od interesa. U nekim aspektima obelodanjenja, transgen je integrisan u izabrani lokus (npr., sigurna luka) u matičnoj ćeliji (npr., embrionalna matična ćelija, indukovana pluripotentna matična ćelija, matična ćelija hematopoeze itd.) ili životinjskom embrionu dobijenom bilo kojim od ovde opisanih postupaka, i zatim se embrion implantira tako da se rodi živa životinja. Životinja se zatim uzgaja do polne zrelosti i dozvoljava joj se da proizvede potomstvo gde najmanje deo potomaka sadrži uređenu endogenu gensku sekvencu ili integrisani transgen.

[0035] Ovde je opisan postupak promene eksprimiranja gena (npr., BCL11a i/ili gen globina) u ćeliji, gde postupak obuhvata: uvođenje u ćeliju jedne ili više nukleaza kako je ovde opisano, pod uslovima tako da se jedan ili više proteina eksprimira, i da se eksprimiranje gena promeni. Eksprimiranje gena globina (npr., gama globin ili beta globin) može se promeniti (npr., povećati). Bilo koji od ovde opisanih postupaka može dalje uključivati integrisanje donorske sekvence (npr., transgen ili njegov fragment pod kontrolom egzogenog ili endogenog promotera) u genom ćelije, na primer integrisanjem donora na ili blizu mesta razdvajanja nukleaze u BCL11A genu. Donorska sekvenca se uvodi u ćeliju pomoću virusnog vektora, kao oligonukleotid i/ili na plazmidu. Ćelija u kojoj se menja eksprimiranje gena može biti, na primer, ćelija prekursor crvenih krvnih zrnaca (RBC) i/ili matična ćelija hematopoeze (npr., CD34+ ćelija).

[0036] Ovde je opisan postupak proizvodnje genetski modifikovane ćelije koji sadrži genomsku modifikaciju unutar endogene sekvence BCL11A pojačivača, i postupak obuhvata korake: a) dovođenja ćelije u dodir sa polinukleotidom (npr. DNK ili mRNK) koji kodira cinkov prst nukleazu koja sadrži 4, 5 ili 6 domena cinkovog prsta, gde svaki od domena cinkovog prsta sadrži region za prepoznavanje spirale u redosledu prikazanom u jednom redu Tabele 3 ili Tabele 6; b) izlaganje ćelije uslovima koji pogoduju eksprimiranju proteina cinkovog prsta iz polinukleotida; i c) modifikovanje endogene sekvence BCL11A pojačivača sa eksprimiranim proteinom cinkovog prsta dovoljnim za proizvodnju genetski modifikovane ćelije. Ćelije se mogu stimulisati sa najmanje jednim citokinom (npr., pre koraka (a)).

Polinukleotid može biti doveden u dodir sa ćelijom bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući, ali bez ograničenja, transfekciju, upotrebu nevirusnog vektora, upotrebu virusnog vektora, hemijski put ili izlaganje električnom polju (npr., elektroporacija).

[0037] Takođe je obelodanjen postupak tretmana pacijenta koji ima potrebu za povećanjem eksprimiranja gena globina, gde se postupak sastoji od primene pacijentu ovde opisanog farmaceutskog preparata u količini dovoljnoj za povećanje eksprimiranja gena globina kod pacijenta. Može se znati da pacijent ima, može se sumnjati da ima ili može biti pod rizikom od razvoja talasemije ili bolesti srpastih ćelija.

[0038] Takođe je obelodanjen komplet koji sadrži nukleinske kiseline, proteine i/ili ćelije pronalaska. Komplet može da sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju nukleaze, (npr. RNK molekuli ili CPN, TALEN ili CRISPR/Cas sistem koji kodiraju gene sadržane u odgovarajućem vektoru eksprimiranja), ili alikvote proteina nukleaze, donorske molekule, odgovarajuće modifikatore matičnosti, ćelije, pufere i/ili uputstva (npr., za izvođenje ovde opisanih postupaka) i slično.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0039]

Slika 1 prikazuje dijagram kodirajućeg regiona BCL11A, koji ukazuje na položaj introna i regiona pojačivača. Navedeni su i izvodi različitih proizvoda spajanja (pogledati Liu et al. (2006) Molecular Cancer 5:18).

Slika 2 prikazuje genomski region koji kodira različite Bcl11a izoforme (University of California Santa Cruz pretraživač genoma, koordinate navedene u hg19 sklopu ljudskog genoma), region pojačivač u BCL11A intronu 2 (koordinate navedene u hg19 sklopu

1

ljudskog genoma), i definiše tri podregiona regiona pojačivača kako je predstavljeno DNKse I mestima hipersenzitivnosti (navedeno u kb prema približnoj udaljenosti od mesta početka transkripcije): 55, 58 i 62. Ciljane lokacije nukleaze unutar tri podregiona su označene na naredni način: nukleaze su dizajnirane za razdvajanje na levom kraju svakog podregione („L“ mesta), na sredini svakog („M“ mesta) i na desnom kraju („R“ mesta). Razdvajanje lokusa in vivo sa parom nukleaza dovodi do brisanja intervenišućeg regiona u značajnom delu ćelija.

Slika 3 prikazuje rezultate razdvajanja u ćeliji pomoću setova TALEN parova (naznačenih u tabeli na gornjem panelu slike) u regionu BCL11A pojačivača kako je izmereno testom zasnovanim na PCR za brisanje različitih regiona pojačivača. Parovi korišćenih TALEN dizajnirani su za stvaranje brisanja u ljudskim HSPC bilo u regionu 55 („55L-R“), unutar regiona 62 („62L-R), ili unutar regiona 58 (“ 58L-R“, „58M-R“). Gel prikazuje PCR proizvode proizvedene izolacijom genomske DNK iz ljudskih HSPC transficiranih konstruktima eksprimiranja koji kodiraju naznačene TALEN i pojačavaju region koji okružuje ciljani region. Ovi podaci pokazuju generisanje brisanja (raspon označen simbolom Δ) u ciljanom regionu nakon razdvajanja prema navedenim setova TALEN parova.

Slika 4 je grafikon koji prikazuje rezultate RT-qPCR („Taqman®“) analize u realnom vremenu dizajnirane za detektovanje promene u eksprimiranju fetalne gama-globinske mRNK nakon ciljanog uređivanja BCL11A pojačivača. Nakon elektroporacije CD34 ćelija od zdravih ljudskih dobrovoljaca sa mRNK koje kodiraju označene nukleaze (pogledati Sliku 3), generisani su eritrociti in vitro, nakon čega je prikupljena ukupna RNK. Relativni nivoi mRNK alfa globina i gama globina za svaki uzorak određeni su RT-PCR Taqman® analizom i iscrtan je relativni mRNK gama globin/mRNK alfa globin odBr. Prema tome, povećanje eksprimiranja gama globina u uzorcima tretiranim nukleazom dovodi do povećanja normalizovanog gama/alfa odnosa u poređenju sa kontrolom. Na slici su prikazani rezultati tretiranja ćelija CD34 pojedinačnim TALEN parovima i za setove TALEN parova opisanih na Slikama 2 i 3. Gama/alfa nivo je povećan za 58L-R i 58M-R setove parova. Treba imati na umu da je odnos u kontroli transfekcije GFP iznosio 3,4 u ovom eksperimentu.

Slika 5 je grafikon koji prikazuje rezultate RT-qPCR („Taqman®“) analize u realnom vremenu dizajnirane za detektovanje promene u eksprimiranju fetalne gama-globinske mRNK nakon ciljanog uređivanja BCL11A pojačivača. Nakon elektroporacije CD34 ćelija od zdravih ljudskih dobrovoljaca sa mRNK koje kodiraju označene nukleaze (pogledati Sliku 3), generisani su eritrociti in vitro, nakon čega je prikupljena ukupna RNK. Relativni nivoi mRNK beta globina i gama globina za svaki uzorak određeni su RT-PCR Taqman® analizom i iscrtan je relativni odnos mRNK gama globina/mRNK beta globina. Rezultati pokazuju da,

1

iako specifični pojedinačni TALEN parovi korišćeni u ovim eksperimentima nisu bili u stanju da izazovu promenu u eksprimiranju gama globina, stvaranje brisanja korišćenjem setova parova izazvalo je povećanje relativnog eksprimiranja gama, korigovano eksprimiranjem beta globina u odraslih osoba ovom slučaju. Konkretno, brisanje DNK sekvence obuhvaćene 55 ili 58 DNKse I hipersenzitivno je povećalo gama globin, dok takva povećanje nakon brisanja sekvence obuhvaćene 62 DNKse I hipersenzitivnim mestom nije detektovano u ovom eksperimentu. Treba imati na umu da je odnos u kontroli transfekcije GFP iznosio 0,5 u ovom eksperimentu.

Slika 6 prikazuje rezultate Taqman® analize za nivoe fetalnog globina opisane na Slici 4. U ovom skupu eksperimenata izmereni su nivoi beta globina i gama globina mRNK, pa su prikazani podaci gama i beta odnosa i upoređeni sa istim gama/beta odnosom u kontrolno tretiranim ćelijama. Niz pojedinačnih TALEN parova je korišćen za „hodanje“ po 58 regionu BCL11A pojačivača. Za razliku od ranijih eksperimenata u kojima je bilo potrebno brisanje 400-900 baznih parova kako bi se videlo povećanje gama eksprimiranja, rezultati prikazani u ovom eksperimentu pokazali su jedno mesto (označeno strelicom) koje je prilikom razdvajanja izazvalo to relativno povećanje. Rezultati brisanja parova su uključeni u ovaj grafikon radi poređenja. Pogledati Sliku 7 za lokaciju mesta razdvajanja TALEN parova širom regiona od interesa.

Slika 7 prikazuje rezultate Taqman® analize opisane na Slici 4 koristeći CPN parove usmerene na 58 pojačivač. Nivoi beta globina i gama globina su okarakterisani i korišćeni za izražavanje odnosa gama prema beta-globinu u poređenju sa istim odnosom u kontrolno tretiranim ćelijama. Podaci pokazuju da je CPN-izazvan poremećaj istih regiona identifikovan na TALEN ispitivanju (Slika 6 i pogledati Sliku 8 u nastavku)) rezultovao povećanom eksprimiranjem gama globina. Treba imati na umu da je odnos u kontroli transfekcije GFP iznosio 2,6 u ovom eksperimentu.

Slika 8 prikazuje prikaz mesta vezivanja (SEQ ID NO: 264 i SEQ ID NO: 265) TALEN specifičnih za region pojačivača 58 (102852 i 102853) i CPN (45843 i 45844), čija upotreba u ljudskim HSPC povećava relativne vrednosti eksprimiranje gama globina nakon in vitro eritropoeze. Prikazana sekvenca je dvolančani oblik DNK sekvence koji obuhvata 58 region BCL11A pojačivača (SEQ ID NO: 363), i sistem numerisanja se odnosi na sam 58. Na slici je takođe naznačeno mesto podudaranja sa mestom vezivanja GATA-1-faktora transkripcije (sekvenca lokusa, gtGATAAag, konsenzus GATA-1 mesto - swGATAAvv). Dodatno, mesta razdvajanja TALEN parova koja su korišćena u 58 „hodanju“ su naznačena gde brojevi odgovaraju uzorcima korišćenim u skupovima podataka predstavljenim na Slici 6.

1

Slika 9 prikazuje rezultate Taqman® analize opisane na Slici 4 gde je napravljen niz TALEN koji ciljaju na 55 region BCL11A pojačivača. U ovom skupu eksperimenata, okarakterisani su nivoi beta globina i gama globina, pa su prikazani podaci gama i beta odnosa u poređenju sa istim odnosom u kontrolno tretiranim ćelijama (koji je u ovom eksperimentu iznosio 0,8). Podaci potvrđuju da mutacije generisane na određenim položajima unutar 55 regiona mogu povećati relativno eksprimiranje gama globina (pogledati strelice).

Slika 10 je prikaz mesta razdvajanja TALEN specifičnih za region pojačivača 55 kao što je prikazano na Slici 9. Prikazana sekvenca je dvolančani oblik DNK sekvence koji obuhvata 55 region BCL11A pojačivača (SEQ ID NO: 254). Brojevi koji označavaju kratke regione nukleotida ukazuju na verovatna mesta razdvajanja izazvana TALEN uzorcima navedenim na Slici 10. Takođe su na Slici 10 prikazana dva podudaranja sa konsenzus mestom vezivanja za GATA-1 faktor transkripcije.

Slike 11A do 11C prikazuju DNK sekvencu tri hipersenzitivna mesta DNKse I unutar sekvence BCL11A pojačivača. Pošto je njihova identifikacija izvršena sondiranjem regiona dostupnog hromatina u ćelijama (pogledati Bauer et al, (2013) ibid), tačne granice regiona nisu poznate i prikazane su približne granice. Slika 11A prikazuje sekvencu 55 regione (SEQ ID NO: 1), Slika 11B prikazuje sekvencu 58 regiona (SEQ ID NO: 2), a Slika 11C prikazuje sekvencu 62 regiona (SEQ ID NO : 3).

Slike 12A do 12C pokazuju da CPN-izazvano razdvajanje u ćelijama bliže jezgru GATA-1 konsenzusa podiže nivoe fetalnog globina u još većoj meri nego razdvajanje bliže 3' kraju motiva. Slika 12A prikazuje dijagram koji prikazuje mesta vezivanja CPN parova specifičnih za Bcl11A u odnosu na konsenzus sekvencu GATA-1 (Slika 12A) i prikazuje sekvencu DNK unutar 58 regiona koja sadrži konsenzus sekvencu GATA-1 (SEQ ID NO : 255). Stubići iznad i ispod DNK sekvence označavaju mesta vezivanja CPN. Slika 12B prikazuje relativno eksprimiranje gama globina i beta globina mereno eksprimiranjem mRNK nakon ljudskih HSPC sa mRNK koja kodira naznačene CPN (pogledati Sliku 12A), nakon čega sledi in vitro eritropoeza i merenje nivoa fetalnog globina (pogledati Sliku 4). Odnos primećen kada je GFP koji eksprimira mRNK transficiran u CD34+ ćelije iznosio je 0,97. Slika 12C predstavlja u „strukturnom krugu“ alelne oblike BCL11A pojačivača (konkretno, region razdvojen sa CPN prikazanim na Slici 12A) koji se nalaze u ljudskim HSPC nakon elektroporacije sa naznačenim CPN. Dok se kod dva uzorka primećuju uporedivi nivoi nemodifikovanih (divlji tip) hromatida, uzorak tretiran sa CPN koji seku bliže GATA-1 motivu sadrži veći broj hromatida koji eliminišu GATA-1 konsenzus (npr. „-15“ alel, koji predstavlja brisanje 15 baznih parova). Podaci pokazuju da je razdvajanje pomoću dva para

1

CPN koji su bliže centru GATA-1 konsenzus sekvence (parovi 46801/46880 i 46923/46999) povezano sa povećanim eksprimiranjem gama globina.

Slika 13 pokazuje da promena veznika između cinkovog prsta i FokI dela u CPN koji se koriste za uređivanje genoma BCL11A pojačivača utiče na nivoe fetalnog globina nakon in vitro eritropoeze uprkos uporedivim nivoima poremećenim hromatidama. Ljudski HSPC su elektroporisani sa naznačenim CPN (veznik koji se koristi u svakom CPN monomeru naveden je u zagradama), a neposredno pre i posle in vitro eritroidne diferencijacije meren je % poremećenih alela (prikazan ispod svakog uzorka u „X/Y“ obliku, gde prvi broj odgovara % indela ne-divljeg tipa nakon elektroporacije, a drugi broj pokazuje rezultate nakon 14 dana in vitro diferencijacije eritroida). Sakupljena je cela mRNK i mereni su nivoi fetalnog globina (normalizovan na alfa globin).

Slika 14 prikazuje aminokiselinske i DNK sekvence za četiri veznika (L0 (SEQ ID NO: 256 i 257), L7a (SEQ ID NO: 258 i 259), L7c5 (SEQ ID NO: 260 i 261) i L8c5 (SEQ ID NO: 262 i 263) koji se koriste u dizajnu PCP. Sekvence poduvučene punom linijom ukazuju na karboksi terminalni region PCP DNK vezujućeg domena, dok sekvence označene isprekidanom crtom označavaju amino terminalni region Fok I domena nukleaze. Podebljane sekvence označavaju nove sekvence dodate standardnom L0 vezniku.

Slike 15A i 15B prikazuju procenat ćelija ljudskog porekla i ciljanu genetsku modifikaciju na ciljanom mestu nukleaze u ovim ljudskim ćelijama, respektivno pronađene u perifernoj krvi miševa nakon transplantacije uređenih ljudskih CD34+ ćelija. Slika 15A je grafikon koji prikazuje procenat ljudskih ćelija na periferiji miša nakon transplantacije ljudskih CD34+ ćelija koje su uređene sa dva različita seta CPN 4 nedelje nakon transplantacije. Slika 15B prikazuje nivo indela otkrivenih u tim ljudskim ćelijama. Svaki simbol predstavlja podatke dobijene od pojedinačnog miša.

Slike 16A do 16D, prikazuju procenat indela indukovanog nukleazama u ljudskim ćelijama koji se razlikovao od prvobitno transplantiranih CD34+ ćelija 16 nedelja nakon transplantacije. Slika 16A prikazuje nivo aktivnosti indela u pan-mijeloidnim ćelijama, identifikovan prisustvom CD33 markera. Slika 16B prikazuje aktivnost u CD19+ B ćelijama. Slika 16C prikazuje aktivnost u glyA+ ili eritroidnim ćelijama, dok Slika 16D prikazuje aktivnost u matičnim ćelijama. Svaki simbol predstavlja podatke dobijene od pojedinačnog miša.

Slika 17 prikazuje niz vezničkih sekvenci (SEQ ID NO: 265-275). Ovi veznici mogu poslužiti za povezivanje DNK vezujućeg domena cinkovog prsta sa Fok1 domenom nukleaze.

1

DETALJAN OPIS

[0040] Ovde su obelodanjeni sastavi i postupci za inženjering genoma za modulaciju eksprimiranja BCL11A i/ili gama globina i za tretman i/ili prevenciju hemoglobinopatija. Konkretno, nukleazom posredovano (tj. CPN, TALEN ili CRISPR/Cas ili TtAgo sistem) ciljano brisanje specifičnih mesta u regionu BCL11A pojačivača efikasno se postiže u HSC/PC i rezultuje promenom relativnog eksprimiranja gama globina tokom kasnije eritropoeze. Ova modulacija eksprimiranja BCL11A i gama globina posebno je korisna za tretman hemoglobinopatija (npr., beta talasemija, bolest srpastih ćelija) gde nema dovoljnog eksprimiranja beta globina ili se dešava eksprimiranje mutiranog oblika beta-globina.

Upotrebom sastava prema pronalasku, komplikacije i posledice vezane za bolest izazvane aberantnim beta globinom mogu se prevazići promenom eksprimiranja gama globina u ćelijama prekursora eritrocita.

Uopšteno

[0041] Izvođenje postupaka, kao i priprema i upotreba ovde opisanih sastava koriste, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike u molekularnoj biologiji, biohemiji, strukturi i analizi hromatina, računarskoj hemiji, ćelijskoj kulturi, rekombinantnoj DNK i srodnim poljima koja se nalaze u okviru znanja stručnjaka. Ove tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Pogledati, na primer, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 i Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 i periodična ažuriranja; serijal METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol.304, „Chromatin“ (P.M. Wassarman i A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; i METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119, „Chromatin Protocols“ (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

Definicije

[0042] Izrazi „nukleinska kiselina“, „polinukleotid“ i „oligonukleotid“ se koriste naizmenično i odnose se na dezoksiribonukleotidni ili ribonukleotidni polimer, u linearnoj ili kružnoj konformaciji, ili u jednolančanom ili dvolančanom obliku. Za potrebe predmetnog obelodanjenja, ovi izrazi se ne smeju tumačiti kao ograničavajući u odnosu na dužinu polimera. Izrazi mogu obuhvatiti poznate analoge prirodnih nukleotida, kao i nukleotide koji su modifikovani u bazi, šećernim i/ili fosfatnim delovima (npr., fosforotioatne kičme).

2

Generalno, analog određenog nukleotida ima istu specifičnost uparivanja baza; tj. analog A će se upariti sa bazom T.

[0043] Izrazi „polipeptid“, „peptid“ i „protein“ koriste se naizmenično za označavanje polimera aminokiselinskih ostataka. Izraz se takođe odnosi na polimere aminokiselina u kojima su jedna ili više aminokiselina hemijski analozi ili modifikovani derivati odgovarajućih prirodnih aminokiselina.

[0044] „Vezivanje“ se odnosi na nekovalentnu interakciju specifičnu za sekvencu između makromolekula (npr., između proteina i nukleinske kiseline). Ne moraju sve komponente vezane interakcije biti specifične za sekvencu (npr., dodiri sa fosfatnim ostacima u DNK kičmi), sve dok je interakcija u celini specifična za sekvencu. Takve interakcije generalno karakteriše konstanta disocijacije (Kd) od 10<-6>M<-1>ili niže. „Afinitet“ se odnosi na snagu vezivanja: povećan afinitet vezivanja je u korelaciji sa nižim Kd.

[0045] „Vezujući protein“ je protein koji se može vezati za drugi molekul. Vezujući protein se može vezati, na primer, za DNK molekul (DNK-vezujući protein), RNK molekul (RNK-vezujući protein) i/ili molekul proteina (protein-vezujući protein). U slučaju proteinvezujućeg proteina, on se može vezati za sebe (kako bi formirao homodimere, homotrimere, itd.) i/ili se može vezati za jedan ili više molekula različitog ili različitih proteina. Vezujući protein može imati više od jedne vrste aktivnosti vezivanja. Na primer, proteini cinkovog prsta imaju aktivnost vezivanja za DNK, vezivanja za RNK i vezivanje za proteine.

[0046] „DNK-vezujući protein cinkovog prsta“ (ili vezujući domen) je protein ili domen unutar većeg proteina, koji vezuje DNK na specifičan način za jednu sekvencu kroz jedan ili više cinkovih prstiju, koji su regioni aminokiselinske sekvence unutar vezujućeg domena čija se struktura stabilizuje koordinacijom jona cinka. Izraz DNK-vezujući protein cinkovog prsta često se skraćuje kao protein cinkovog prsta ili PCP.

[0047] „TALE DNK vezujući domen“ ili „TALE“ je polipeptid koji sadrži jedan ili više TALE ponovljenih domena/jedinica. Ponovljeni domeni su uključeni u vezivanje TALE za njegovu srodnu ciljanu DNK sekvencu. Pojedinačna „ponavljajuća jedinica“ (koja se takođe naziva i „ponavljanje“) je tipično duga 33-35 aminokiselina i pokazuje bar neku homologiju sekvence sa drugim TALE ponavljajućim sekvencama unutar TALE proteina koji se prirodno javlja.

[0048] Domeni vezanja cinkovog prsta i TALE mogu se „konstruisati“ da se vežu za unapred određenu nukleotidnu sekvencu, na primer putem inženjeringa (menjanjem jedne ili više aminokiselina) regiona prepoznavanja spirale prirodno prisutnog proteina cinkovog prsta ili TALE proteina. Zbog toga su konstruisani DNK-vezujući proteini (cinkovog prsta ili TALE) proteini koji se ne javljaju prirodno. Neograničavajući primeri postupaka za inženjering DNK-vezujućih proteina su dizajn i odadbir. Dizajnirani DNK-vezujući protein je protein koji se ne javlja prirodi čiji dizajn/sastav potiče uglavnom iz racionalnih kriterijuma.

Racionalni kriterijumi za dizajn uključuju primenu pravila supstitucije i kompjuterizovanih algoritama za obradu informacija u bazi podataka u kojoj se čuvaju informacije o postojećim PCP i/ili TALE dizajnima i obavezujući podaci. Pogledati, na primer, SAD patente 6,140,081; 6,453,242; 6,534,261 i 8,585,526; takođe pogledati WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 i WO 03/016496.

[0049] „Odabrani“ protein cinkovog prsta ili TALE je protein koji se ne javlja prirodi, čija je proizvodnja prvenstveno rezultat empirijskog procesa kao što je prikaz faga, zamka interakcije ili hibridna selekcija. Pogledati npr., SAD patente br.5,789,538; 5,925,523;

6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; 8,586,526; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197, WO 02/099084.

[0050] „TtAgo“ je prokariotski Argonaute protein za koji se smatra da je uključen u utišavanje gena. TtAgo je izveden iz bakterije Thermus thermophilus. Pogledati, npr., Swarts et al, ibid, G. Sheng et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.111, 652). „TtAgo sistem“ su sve potrebne komponente uključujući, na primer, DNK vodič za razdvajanje pomoću enzima TtAgo.

[0051] „Rekombinacija“ se odnosi na proces razmene genetskih informacija između dva polinukleotida, uključujući, ali bez ograničenja, hvatanje donora nehomolognim spajanjem krajeva (NHEJ) i homolognu rekombinaciju. Za potrebe predmetnog obelodanjenja, „homologna rekombinacija (HR)“ se odnosi na specijalizovani oblik takve razmene koja se odvija, na primer, tokom popravljanja dvolančanih prekida u ćelijama pomoću mehanizama za popravljanje usmerenih na homologiju. Ovaj proces zahteva homologiju sekvence nukleotida, koristi „donorski“ molekul da predloži popravljanje „ciljanog“ molekula (tj. onaj koji je doživeo dvolančani prekid), i različito je poznat kao „ne-crossover konverzija gena“ ili „konverzija gena kratkog trakta“, jer dovodi do prenosa genetskih informacija od donora do cilja. Bez želje da se veže za bilo koju određenu teoriju, takav transfer može uključivati korekciju neusklađenosti heterodupleksne DNK koja nastaje između slomljene cilja i donora i/ili „kalemljenja zavisnog od sinteze“, pri kom se donor koristi za ponovnu sintezu genetskih informacija koje će postati deo cilja i/ili srodnih procesa. Takav specijalizovani HR često dovodi do promene sekvence ciljanog molekula tako da se deo ili cela sekvenca donorskog polinukleotida inkorporira u ciljani polinukleotid.

[0052] U postupcima obelodanjenja, jedna ili više ciljanih nukleaza kako je ovde opisano stvaraju dvolančani prekid (DSB) u ciljanoj sekvenci (npr., ćelijski hromatin) na unapred određenom mestu. DSB može dovesti do brisanja i/ili umetanja popravljanjem usmerenim na homologiju ili nehomološki usmerenim mehanizmima popravljanja. Brisanja mogu uključivati bilo koji broj baznih parova. Slično, umetanja mogu uključivati bilo koji broj baznih parova uključujući, na primer, integraciju „donorskog“ polinukleotida, po izboru koji ima homologiju sa nukleotidnom sekvencom u regionu prekida. Donorska sekvenca može biti fizički integrisana ili se, alternativno, donorski polinukleotid koristi kao šablon za popravljanje loma homolognom rekombinacijom, što rezultuje uvođenjem cele ili dela nukleotidne sekvence kao donora u ćelijski hromatin. Prema tome, prva sekvenca u ćelijskom hromatinu može biti promenjena i, u nekim otelotvorenjima, može biti pretvorena u sekvencu prisutnu u donorskom polinukleotidu. Prema tome, upotreba izraza „zameniti“ ili „zamena“ može se shvatiti da predstavlja zamenu jedne nukleotidne sekvence drugom, (tj. zamena sekvence u informativnom smislu), i ne zahteva nužno fizičku ili hemijsku zamenu jednog polinukleotida drugim.

[0053] U bilo kom od ovde opisanih postupaka, dodatni parovi proteina cinkovog prsta ili TALEN proteina mogu se koristiti za dodatno dvolančano razdvajanje dodatnih ciljanih mesta unutar ćelije.

[0054] Bilo koji od ovde opisanih postupaka može se koristiti za umetanje donora bilo koje veličine i/ili delimičnu ili potpunu inaktivaciju jedne ili više ciljanih sekvenci u ćeliji ciljanom integracijom donorske sekvence koja ometa eksprimiranje gena od interesa. Takođe su obelodanjene ćelijske linije sa delimično ili potpuno inaktiviranim genima.

2

[0055] U bilo kom od ovde opisanih postupaka, egzogena nukleotidna sekvenca („donorska sekvenca“ ili „transgen“) može sadržati sekvence koje su homologne, ali nisu identične, genomskim sekvencama u regionu od interesa, čime se stimuliše homologna rekombinacija kako bi se umetnula neidentična sekvenca u region od interesa. Tako, u nekim otelotvorenjima, delovi donorske sekvence koji su homologni sa sekvencama u regionu od interesa pokazuju između oko 80 do 99% (ili bilo koji ceo broj između njih) identičnosti sekvence sa genomskom sekvencom koja je zamenjena. U drugim otelotvorenjima, homologija između donorske i genomske sekvence je veća od 99%, na primer ako se samo 1 nukleotid razlikuje u odnosu na donorske i genomske sekvence od preko 100 susednih baznih parova. U određenim slučajevima, nehomologan deo donorske sekvence može sadržati sekvence koje nisu prisutne u regionu od interesa, tako da se nove sekvence unose u region od interesa. U ovim slučajevima, nehomologna sekvenca je uglavnom okružena sekvencama od 50-1.000 baznih parova (ili bilo kojom njihovom integralnom vrednošću) ili bilo kojim brojem baznih parova većim od 1.000, koji su homologni ili identični sekvencama u regionu od interesa. U drugim otelotvorenjima, donorska sekvenca je homologna prvoj sekvenci i umetnuta je u genom pomoću nehomolognih mehanizama rekombinacije.

[0056] „Razdvajanje“ se odnosi na prekid kovalentne okosnice DNK molekula. Razdvajanje se može započeti različitim postupcima uključujući, ali bez ograničavanja na, enzimsku ili hemijsku hidrolizu fosfodiesterske veze. Moguće je i jednolančano i dvolančano razdvajanje, a dvolančano razdvajanje može nastati kao rezultat dva različita jednolančana razdvajanja. Razdvajanje DNK može dovesti do stvaranja bilo tupih krajeva ili zaostalih krajeva. U nekim otelotvorenjima, fuzioni polipeptidi se koriste za ciljano dvolančano razdvajanje DNK.

[0057] „Polu-domen razdvajanja“ je polipeptidna sekvenca koja zajedno sa drugim polipeptidom (identičnim ili različitim) formira kompleks koji ima aktivnost razdvajanja (poželjno aktivnost dvostrukog razdvajanja). Izrazi „prvi i drugi polu-domen razdvajanja;“ „+ i – polu-domeni razdvajanja“ i „polu-domeni razdvajanja desne i leve strane“ koriste se naizmenično za upućivanje na parove polu-domena razdvajanja koji dimerizuju.

[0058] „Sintetički polu-domen razdvajanja“ je polu-domen razdvajanja koji je modifikovan tako da formira obligatne heterodimere sa drugim polu-domenom razdvajanja. (npr., drugi sintetički polu-domen razdvajanja). Takođe pogledati, SAD patentnu publikaciju br.

2005/0064474, 20070218528, 20080131962 i 20110201055.

[0059] Izraz „sekvenca“ se odnosi na nukleotidnu sekvencu bilo koje dužine, koja može biti DNK ili RNK; mogu biti linearne, kružne ili razgranate i mogu biti jednolančane ili dvolančane. Izraz „donorska sekvenca“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja je umetnuta u genom. Donorska sekvenca može biti bilo koje dužine, na primer između 2 i 100.000.000 nukleotida dužine (ili bilo koje druge celobrojne vrednosti između ili iznad), poželjno između 100 i 100.000 nukleotida dužine (ili bilo koji ceo broj između njih), poželjnije između 2000 i 20.000 nukleotida dužine (ili bilo koja vrednosti između njih) i još poželjnije, između oko 5 i 15 kb (ili bilo koja vrednosti između njih).

[0060] „Hromatin“ je nukleoproteinska struktura koja se sastoji od ćelijskog genoma. Ćelijski hromatin sadrži nukleinsku kiselinu, prvenstveno DNK, i protein, uključujući histone i nehistonske hromozomske proteine. Većina eukariotskih ćelijskih hromatina postoji u obliku nukleozoma, gde jezgro nukleozoma sadrži približno 150 baznih parova DNK povezanih sa oktamerom koji sadrži po dva histona H2A, H2B, H3 i H4; i veznička DNK (promenljive dužine u zavisnosti od organizma) proteže se između jezgara nukleozoma. Molekul histona H1 je generalno povezan sa vezničkom DNK. Za potrebe predmetnog obelodanjenja, izraz „hromatin“ treba da obuhvati sve vrste ćelijskog nukleoproteina, i prokariotske i eukariotske. Ćelijski hromatin uključuje i hromozomski i epizomalni hromatin.

[0061] „Hromozom“ je kompleks hromatina koji obuhvata ceo ili deo genoma ćelije. Genom ćelije često se odlikuje kariotipom, koji je zbirka svih hromozoma koji čine genom ćelije. Genom ćelije može sadržati jedan ili više hromozoma.

[0062] „Epizom“ je replicirajuća nukleinska kiselina, kompleks nukleoproteina ili druga struktura koja sadrži nukleinsku kiselinu koja nije deo hromozomskog kariotipa ćelije.

Primeri epizoma uključuju plazmide i određene virusne genome.

[0063] „Pristupačni region“ je mesto u ćelijskom hromatinu u kom ciljano mesto prisutno u nukleinskoj kiselini može biti vezano egzogenim molekulom koji prepoznaje ciljano mesto. Bez želje da se vezuje za neku posebnu teoriju, veruje se da je pristupačni region onaj koji nije upakovana u nukleozomalnu strukturu. Različita struktura pristupačnog regiona često se može otkriti njegovom osetljivošću na hemijske i enzimske sonde, na primer, nukleaze.

2

[0064] „Ciljano mesto“ ili „ciljana sekvenca“ je sekvenca nukleinske kiseline koja definiše deo nukleinske kiseline za koji će se vezujući molekul vezati, pod uslovom da postoje dovoljni uslovi za vezivanje.

[0065] „Egzogeni“ molekul je molekul koji normalno nije prisutan u ćeliji, ali se može uneti u ćeliju jednom ili više genetskih, biohemijskih ili drugih postupaka. „Normalno prisustvo u ćeliji“ određuje se s obzirom na određenu fazu razvoja i uslove okruženja u ćeliji. Tako je, na primer, molekul koji je prisutan samo tokom embrionalnog razvoja mišića egzogeni molekul u odnosu na odraslu mišićnu ćeliju. Slično, molekul indukovan toplotnim šokom je egzogeni molekul u odnosu na ćeliju koja nije šokirana toplotom. Egzogeni molekul može da sadrži, na primer, funkcionalnu verziju endogenog molekula koji ne funkcioniše ispravno ili verziju normalno funkcionišućeg endogenog molekula.

[0066] Egzogeni molekul može biti, između ostalog, mali molekul, kao što je nastao kombinovanim hemijskim procesom, ili makromolekul poput proteina, nukleinske kiseline, ugljenih hidrata, lipida, glikoproteina, lipoproteina, polisaharida, bilo kog modifikovanog derivata iznad molekula, ili bilo koji kompleks koji sadrži jedan ili više gore navedenih molekula. Nukleinske kiseline uključuju DNK i RNK, mogu biti jednolančane ili dvolančane; mogu biti linearne, razgranate ili kružne; i mogu biti bilo koje dužine. Nukleinske kiseline uključuju one koje mogu da formiraju duplekse, kao i nukleinske kiseline koje stvaraju tripleks. Pogledati, na primer, SAD patente br.5,176,996 i 5,422,251. Proteini uključuju, ali nisu ograničeni na, DNK-vezujuće proteine, transkripcione faktore, faktore remodeliranja hromatina, proteine koji vezuju metiliranu DNK, polimeraze, metilaze, demetilaze, acetilaze, deacetilaze, kinaze, fosfataze, integraze, rekombinaze, ligaze, topoizomeraze, giraze i helikase.

[0067] Egzogeni molekul može biti isti tip molekula kao endogeni molekul, npr., egzogeni protein ili nukleinska kiselina. Na primer, egzogena nukleinska kiselina može sadržati virusni genom koji inficira, plazmid ili epizom uveden u ćeliju ili hromozom koji normalno nije prisutan u ćeliji. Postupci za uvođenje egzogenih molekula u ćelije poznati su stručnjacima i uključuju, ali nisu ograničeni na, lipidno posredovani transfer (tj. lipozomi, uključujući neutralne i katjonske lipide), elektroporaciju, direktnu injekciju, ćelijsku fuziju, bombardovanje česticama, ko-taloženje kalcijum fosfata, transfer posredovan DEAE-dekstranom i transfer posredovan virusnim vektorima. Egzogeni molekul takođe može biti

2

isti tip molekula kao endogeni molekul, ali potiče od druge vrste od koje je izvedena ćelija. Na primer, sekvenca ljudske nukleinske kiseline može se uvesti u ćelijsku liniju koja je originalno izvedena od miša ili hrčka. Postupci za uvođenje egzogenih molekula u ćelije biljaka poznati su stručnjacima i uključuju, ali nisu ograničeni na, transformaciju protoplasta, silicijum karbid (npr., WHISKERS™), transformacija posredovan agrobakterijama, lipidno posredovani transfer (tj. lipozomi, uključujući neutralne i katjonske lipide), elektroporacija, direktnu injekciju, fuzija ćelija, bombardovanje česticama (npr., korišćenjem „genskog pištolja“), ko-taloženje kalcijum fosfata, transfer posredovan DEAE-dekstranom i transfer posredovan virusnim vektorima.

[0068] Nasuprot tome, „endogeni“ molekul je onaj koji je normalno prisutan u određenoj ćeliji u određenoj razvojnoj fazi pod određenim uslovima okruženja. Na primer, endogena nukleinska kiselina može sadržati hromozom, genom mitohondrije, hloroplast ili neku drugu organelu ili epizomalnu nukleinsku kiselinu koja se javlja u prirodi. Dodatni endogeni molekuli mogu uključivati proteine, na primer, transkripcione faktore i enzime.

[0069] Kako se ovde koristi, izraz „proizvod egzogene nukleinske kiseline“ uključuje i polinukleotidne i polipeptidne proizvode, na primer, transkripcione proizvode (polinukleotidi kao što je RNK) i translacione proizvode (polipeptidi).

[0070] „Fuzioni“ molekul je molekul u kom su dve ili više molekula podjedinice povezana, poželjno kovalentno. Molekuli podjedinice mogu biti iste hemijske vrste molekula, ili mogu biti različite hemijske vrste molekula. Primeri prvog tipa fuzionog molekula uključuju, ali nisu ograničeni na, fuzione proteine (na primer, fuziju između PCP ili TALE DNK-vezujućeg domena i jednog ili više aktivacionih domena) i fuzione nukleinske kiseline (na primer, nukleinska kiselina koja kodira opisani fuzioni protein supra). Primeri drugog tipa fuzionog molekula uključuju, ali nisu ograničeni na, fuziju između nukleinske kiseline koja formira tripleks i polipeptida, i fuziju između veznika manjeg žleba i nukleinske kiseline.

[0071] Eksprimiranje fuzionog proteina u ćeliji može nastati isporukom fuzionog proteina u ćeliju ili isporukom polinukleotida koji kodira fuzioni protein u ćeliju, gde se polinukleotid transkribuje, i transkript prevodi kako bi se generisao fuzioni protein. Trans-splajsovanje, razdvajanje polipeptida i vezivanje polipeptida takođe mogu biti uključeni u eksprimiranje proteina u ćeliji. Postupci za isporuku polinukleotida i polipeptida u ćelije su predstavljeni na

2

drugom mestu u predmetnom obelodanjenju.

[0072] „Gen“, za potrebe predmetnog obelodanjenja, uključuje region DNK koji kodira genski proizvod (pogledati infra), kao i sve regione DNK koji regulišu proizvodnju genskog proizvoda, bez obzira da li su takve regulatorne sekvence u blizini kodirajućih i/ili transkribovanih sekvenci. Shodno tome, gen uključuje, ali nije nužno ograničen na, promoterske sekvence, terminatore, translacione regulatorne sekvence kao što su mesta vezivanja ribozoma i unutrašnja mesta ulaska u ribozom, pojačivače, prigušivače, izolatore, granične elemente, poreklo replikacije, mesta vezivanja matrice i regione kontrole lokusa.

[0073] „Eksprimiranje gena“ se odnosi na pretvaranje informacija sadržanih u genu u genski proizvod. Genski proizvod može biti direktan transkripcioni proizvod gena (npr., mRNK, tRNK, rRNK, antisens RNK, ribozim, strukturna RNK ili bilo koja druga vrsta RNK) ili protein proizveden translacijom mRNK. Genski proizvodi takođe uključuju RNK koje su modifikovane procesima kao što su zatvaranje, poliadenilacija, metilacija i uređivanje, i proteine modifikovane, na primer, metilacijom, acetilacijom, fosforilacijom, sveprisutnom upotrebom, ADP-ribozilacijom, miristilacijom i glikozilacijom.

[0074] „Modulacija“ eksprimiranja gena odnosi se na promenu aktivnosti gena. Modulacija eksprimiranja može uključivati, ali nije ograničena na, aktivaciju gena i represiju gena.

Uređivanje genoma (npr., razdvajanje, promena, inaktivacija, nasumična mutacija) mogu se koristiti za moduliranje eksprimiranja. Genska inaktivacija se odnosi na svako smanjenje eksprimiranja gena u poređenju sa ćelijom koja ne uključuje PCP, TALE ili CRISPR/Cas sistem kao što je ovde opisano. Dakle, inaktivacija gena može biti delimična ili potpuna.

[0075] „Zaštićena“ mRNK je ona u kojoj je mRNK izmenjena na neki način kako bi se povećala stabilnost ili translacija mRNK. Primeri zaštite uključuju upotrebu zamene do 25% ostataka citodina i uridina sa 2-tiouridinom (s2U) i 5-metilcitidinom (m5C). Dobijena mRNK pokazuje manju imunogenost i veću stabilnost u poređenju sa svojim nemodifikovanim pandanom. (pogledati Karikó et al. ((2012), Molecular Therapy, Vol.16, No.11, stranice 1833 - 1844). Druge promene uključuju dodavanje takozvanu ARCA kapu, koja povećava translabilnost in vitro proizvodene mRNK (pogledati SAD patent US7074596).

[0076] „Region od interesa“ je bilo koji region ćelijskog hromatina, kao što je, na primer, gen

2

ili nekodirajuća sekvenca unutar gena ili uz njega, u kojoj je poželjno da se vezuje egzogeni molekul. Vezivanje može biti u svrhu ciljanog razdvajanja DNK i/ili ciljane rekombinacije. Region od interesa može biti prisutan u hromozomu, epizomu, organelarnom genomu (npr., mitohondrijski, hloroplast) ili inficirajućem virusnom genomu, na primer. Region od interesa može biti unutar kodirajućeg regiona gena, unutar transkribovanih nekodirajućih regiona kao što su, na primer, vodeće sekvence, trejler sekvence ili introni, ili unutar ne-transkribovanih regiona, uzvodno ili nizvodno od kodirajućeg regiona. region od interesa može biti mali kao jedan par nukleotida ili do 2.000 parova nukleotida dužine, ili bilo koja celobrojna vrednost parova nukleotida.

[0077] „Eukariotske“ ćelije uključuju, ali nisu ograničene na, ćelije gljiva (poput kvasca), biljne ćelije, ćelije životinja, ćelije sisara i ljudske ćelije (npr., T-ćelije).

[0078] Izrazi „operativno povezivanje“ i „operativno povezani“ (ili „operativno vezani“) koriste se naizmenično u odnosu na poređenje dve ili više komponenti (kao što su elementi sekvence), u kojima su komponente raspoređene tako da obe komponente normalno funkcionišu i dopuštaju mogućnost da barem jedna od komponenti posreduje u funkciji koja se vrši na barem jednu od drugih komponenti. Ilustracije radi, transkripciona regulatorna sekvenca, poput promotera, operativno je povezana sa kodirajućom sekvencom ako transkripciona regulatorna sekvenca kontroliše nivo transkripcije kodirajuće sekvence kao odgovor na prisustvo ili odsustvo jednog ili više transkripcionih regulatornih faktora.

Transkripciona regulatorna sekvenca je generalno operativno povezana cis sa kodirajućom sekvencom, ali ne mora biti neposredno uz nju. Na primer, pojačivač je transkripciona regulatorna sekvenca koja je operativno povezana sa kodirajućom sekvencom, iako nisu susedne.

[0079] U smislu fuzionih polipeptida, izraz „operativno povezan“ može se odnositi na činjenicu da svaka od komponenti obavlja istu funkciju u vezi sa drugom komponentom kao što bi to učinila da nije tako povezana. Na primer, u odnosu na fuzioni polipeptid u kom je PCP, TALE ili Cas DNK-vezujući domen spojen sa aktivacionim domenom, PCP, TALE ili Cas DNK-vezujući domen i aktivacioni domen su u operativnoj vezi ako u fuzionom polipeptidu, deo PCP, TALE od Cas DNK-vezujućeg domena može da veže svoje ciljano mesto i/ili svoje mesto vezivanja, dok je aktivacioni domen sposoban da pojača eksprimiranje gena. Kada je fuzioni polipeptid u kom je PCP, TALE ili Cas DNK-vezujući domen spojen sa

2

domenom razdvajanja, PCP, TALE ili Cas DNK-vezujući domen i domen razdvajanja su u operativnoj vezi ako u fuzionom polipeptidu, deo PCP, TALE od Cas DNK-vezujućeg domena može da veže svoje ciljano mesto i/ili svoje mesto vezivanja, dok domen razdvajanja može da razdvoji DNK u blizini ciljanog mesta.

[0080] „Funkcionalni fragment“ proteina, polipeptida ili nukleinske kiseline je protein, polipeptid ili nukleinska kiselina čija sekvenca nije identična proteinu, polipeptidu ili nukleinskoj kiselini pune dužine, ali ipak zadržava istu funkciju kao protein pune dužine, polipeptid ili nukleinska kiselina. Funkcionalni fragment može imati veći, manji ili isti broj ostataka kao i odgovarajući nativni molekul, i/ili može sadržati jednu ili više aminokiselinskih ili nukleotidnih supstitucija. Postupci za određivanje funkcije nukleinske kiseline (npr., kodirajuća funkcija, sposobnost hibridizacije sa drugom nukleinskom kiselinom) su dobro poznati u struci. Slično, postupci za određivanje funkcije proteina su dobro poznati. Na primer, DNK-vezujuća funkcija polipeptida može se odrediti, na primer, pomoću vezivanja filtera, elektroforetske promene pokretljivosti ili imunoprecipitacionih testova. Razdvajanje DNK može se ispitati gel elektroforezom. Pogledati Ausubel et al., iznad. Sposobnost proteina da stupi u interakciju sa drugim proteinom može se odrediti, na primer, koimunoprecipitacijom, dvo-hibridnim testovima ili komplementacijom, genetskom i biohemijskom. Pogledati, na primer, Fields et al. (1989) Nature340:245-246; SAD patent br.

5,585,245 i PCT WO 98/44350.

[0081] „Vektor“ je sposoban da prenese genske sekvence u ciljane ćelije. Tipično, „vektorski konstrukt“, „vektor eksprimiranja“ i „vektor transfera gena“ označavaju bilo koji konstrukt nukleinske kiseline sposoban da usmeri eksprimiranje gena od interesa i koja može preneti genske sekvence u ciljane ćelije. Dakle, izraz uključuje kloniranje i nosače eksprimiranja, kao i integrišuće vektore.

[0082] Izrazi „pacijent“ i „pojedinac“ se koriste naizmenično i odnose se na sisare kao što su pacijenti ljudi i primati koji nisu ljudi, kao i na eksperimentalne životinje kao što su zečevi, psi, mačke, pacovi, miševi i druge životinje. Shodno tome, izraz „pacijent“ ili „pojedinac“, kako se ovde koristi, označava svakog pacijenta ili pojedinca sisara kome se mogu primeniti matične ćelije pronalaska. Pacijenti predmetnog pronalaska uključuju one koji su bili izloženi jednom ili više hemijskih toksina, uključujući, na primer, nervni toksin.

[0083] „Matičnost“ se odnosi na relativnu sposobnost bilo koje ćelije da deluje na način sličan matičnim ćelijama, tj. stepen toti-, pluri- ili oligopotentnosti i proširene ili neodređene samoobnove koji može imati određena matična ćelija.

Nukleaze

[0084] Ovde su opisani sastavi, posebno nukleaze, koje su korisne za in vivo razdvajanje donorskog molekula koji nosi transgen i nukleaze za razdvajanje genoma ćelije tako da se transgen integriše u genom na ciljani način. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više nukleaza se javljaju prirodno. U drugim otelotvorenjima, jedna ili više nukleaza se ne javljaju prirodno, tj. konstruisane su u DNK-vezujućem domenu i/ili domenu razdvajanja. Na primer, DNK-vezujući domen prirodno prisutne nukleaze može se promeniti da se vezuje za izabrano ciljano mesto (npr., meganukleaza koja je konstruisana da se vezuje za mesto različito od srodnog mesta vezivanja). U drugim otelotvorenjima, nukleaza sadrži heterologne DNK-vezujuće domene i domene razdvajanja (npr., cinkov prst nukleaza; DNK-vezujući proteini TAL-efektorskog domena; meganukleazne DNK-vezujućih domena sa domenima heterolognog razdvajanja).

A. DNK-vezujući domeni

[0085] U nekim otelotvorenjima, ovde opisani sastav i postupci koriste DNK-vezujući domen meganukleaze (homing endonukleaza) za vezivanje za donorski molekul i/ili vezivanje za region od interesa u genomu ćelije. Prirodne meganukleaze prepoznaju 15-40 baznih parova mesta razdvajanja i obično su grupisane u četiri porodice: LAGLIDADG porodica, GIY-YIG porodica, His-Cyst box porodica i HNH porodica. Primeri homing endonukleaza uključuju I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII i I-TevIII. Njihove sekvence prepoznavanja su poznate. Pogledati takođe SAD patent br.5,420,032; SAD patent br.6,833,252; Belfort et al.(1997) Nucleic Acids Res.

25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al.(1994) Nucleic Acids Res.

22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet.12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol.

Biol.263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol.280:345-353 i New England Biolabs katalog.

[0086] U nekim otelotvorenjima, ovde opisani postupci i sastavi koriste nukleazu koja sadrži sintetičku (koja se ne javlja u prirodi) homing endonukleazu (meganukleazu). Poznate su sekvence prepoznavanja homing endonukleaza i meganukleaza poput I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII i I-TevIII. Pogledati takođe SAD patent br.5,420,032; SAD patent br.6,833,252; Belfort et al.(1997)

1

Nucleic Acids Res.25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al.(1994) Nucleic Acids Res.22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol.263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol.280:345-353 i New England Biolabs katalog. Osim toga, DNK-vezujuća specifičnost homing endonukleaza i meganukleaza može se konstruisati tako da vezuje neprirodna ciljana mesta. Pogledati, na primer, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al.(2003) Nucleic Acids Res.31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy7:49-66; SAD patentnu publikaciju br.20070117128. DNK-vezujući domeni homing endonukleaza i meganukleaza mogu se promeniti u kontekstu nukleaze u celini (tj. tako da nukleaza uključuje srodan domen razdvajanja) ili mogu biti fuzionisani sa heterolognim domenom razdvajanja.

[0087] U drugim otelotvorenjima, DNK-vezujući domen jedne ili više nukleaza korišćenih u ovde opisanim postupcima i sastavima sadrži prirodno nastao ili sintetički (ne javlja se u prirodi) DNK vezujući domen TAL efektora. Pogledati, npr. SAD patent br.8,586,526. Biljne patogene bakterije roda Xanthomonas poznate su da izazivaju mnoge bolesti kod važnih biljnih kultura. Patogenost Xanthomonas zavisi od očuvanog sistema sekrecije tipa III (T3S) koji ubrizgava više od 25 različitih efektorskih proteina u biljnu ćeliju. Među ovim ubrizganim proteinima su efektori slični aktivatorima transkripcije (TAL) koji oponašaju biljne transkripcione aktivatore i manipulišu biljnim transkriptom (pogledati Kay et al (2007) Science 318:648-651). Ovi proteini sadrže DNK-vezujući domen i domen za aktivaciju transkripcije. Jedan od najbolje okarakterisanih TAL-efektora je AvrBs3 iz Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria (pogledati Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 i WO2010079430). TAL-efektori sadrže centralizovan domen tandem ponavljanja, od kojih svaki ponavlja približno 34 aminokiseline, koje su ključne za DNK-vezujuću specifičnost ovih proteina. Osim toga, oni sadrže jezgarnu lokalizacionu sekvencu i kiseli transkripcioni aktivacioni domen (za pregled pogledati Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272). Osim toga, u fitopatogenim bakterijama Ralstonia solanacearum pronađena su dva gena, označena brg11 i hpx17 koji su homologni AvrBs3 porodici u Xanthomonas u R. solanacearum biovar 1 soju GMI1000 i u biovar 4 soju RS1000 (pogledati Heuer et al (2007) Appl i Envir Micro 73(13): 4379-4384). Ovi geni su 98,9% identični po nukleotidnoj sekvenci jedni s drugima, ali se razlikuju brisanjem 1.575 baznih parova u ponovljenom domenu od hpx17. Međutim, oba genska proizvoda imaju manje od 40% identičnosti sekvence sa proteinima AvrBs3 porodice od Xanthomonas. Pogledati, npr. SAD patent br.

2

8,586,526.

[0088] Specifičnost ovih TAL efektora zavisi od sekvenci koje se nalaze u tandemskim ponavljanjima. Ponovljeni niz sadrži približno 102 bazna para (bp), i ponavljanja su tipično 91-100% homologna jedno sa drugim (Bonas et al, ibid). Polimorfizam ponavljanja obično se nalazi na položajima 12 i 13 i čini se da postoji međusobna korespondencija između identičnosti hipervarijabilnih diostataka (RVD) na položajima 12 i 13 sa identitetom susednih nukleotida u ciljanoj sekvenci TAL-efektora (pogledati Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501 i Boch et al (2009) Science 326:1509-1512). Eksperimentalno, prirodni kod za DNK prepoznavanje ovih TAL-efektora je određen tako da HD sekvenca na položajima 12 i 13 dovodi do vezivanja za citozin (C), NG se vezuje za T, NI za A, C, G ili T, NN se vezuje za A ili G, a ING za T. Ova ponavljanja DNK vezivanja su sastavljena u proteine sa novim kombinacijama i brojem ponavljanja, kako bi se napravili veštački faktori transkripcije koji su u stanju da stupe u interakciju sa novim sekvencama i aktiviraju eksprimiranje ne-endogenog reporterskog gena u biljnim ćelijama (Boch et al, ibid).

Sintetički TAL proteini su povezani sa a FokI polu-domenom razdvajanja kako bi se dobila fuzija domena nukleaze TAL efektora (TALEN) koja pokazuje aktivnost u testu kvasca (cilj zasnovana na plazmidima). Pogledati, npr. SAD patent br.8,586,526; Christian et al ((2010)<Genetics epub 10.1534/genetics.110.120717). U nekim otelotvorenjima, TALE domen sadrži N-kapu i/ili C-kapu kako je opisano u SAD patentu br.8,586,526.

[0089] U nekim otelotvorenjima, DNK vezujući domen jedne ili više nukleaza koje se koriste za in vivo razdvajanje i/ili usmereno razdvajanje genoma ćelije sadrži protein cinkovog prsta. Poželjno je da se protein cinkovog prsta ne javlja prirodno jer je konstruisan da se vezuje za ciljano mesto po izboru. Pogledati, na primer, Pogledati, na primer, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol.20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem.70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol.19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol.12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol.10:411-416; SAD patente br.6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; i SAD patentnu publikaciju br.2005/0064474;

2007/0218528; 2005/0267061.

[0090] Konstruisani domen vezivanja cinkovih prstiju može imati novu specifičnost vezivanja, u poređenju sa prirodnim proteinom cinkovog prsta. Postupci inženjeringa uključuju, ali nisu ograničene na, racionalni dizajn i različite vrste odabira. Racionalni dizajn uključuje, na primer, korišćenje baza podataka koje sadrže trostruke (ili četvorostruke) nukleotidne sekvence i pojedinačne aminokiselinske sekvence cinkovog prsta, u kojima je svaka trostruka ili četvorostruka nukleotidna sekvenca povezana sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci cinkovog prsta koje vezuju određenu trostruku ili četvorostruku sekvencu. Pogledati, na primer, SAD patente 6,453,242 i 6,534,261 koji su u suvlasništvu.

[0091] Primeri postupaka odabira, uključujući prikaz faga i dva hibridna sistema, opisani su u SAD patentima 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466;

6,200,759; i 6,242,568; kao i WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 i GB 2,338,237. Dodatno, opisano je poboljšanje specifičnosti vezivanja za domene vezivanja cinkovog prsta, na primer, u WO 02/077227 koji je u suvlasništvu.

[0092] Osim toga, kako je obelodanjeno u ovim i drugim referencama, domeni cinkovog prsta i/ili proteini cinkovog prsta sa više prstiju mogu biti povezani zajedno pomoću bilo koje pogodne vezničke sekvence, uključujući, na primer, veznike dužine 5 ili više aminokiselina. Takođe pogledati, SAD patente br.6,479,626; 6,903,185; i 7,153,949 za primere vezničkih sekvenci dužine 6 ili više aminokiselina. Ovde opisani proteini mogu uključivati bilo koju kombinaciju odgovarajućih veznika između pojedinačnih cinkovih prstiju proteina.

[0093] Izbor ciljanih lokacija; PCP i postupci za projektovanje i konstrukciju fuzionih proteina (i polinukleotidi koji ih kodiraju) poznati su stručnjacima i detaljno su opisani u SAD patentima br.6,140,081; 5,789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988;

6,013,453; 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 i WO 03/016496.

[0094] Skoro svaki veznik (odstojnik) može se koristiti između jedne ili više komponenti DNK vezujućeg domena (npr., cinkovi prsti), između jednog ili više DNK vezujućeg domena i/ili između DNK vezujućeg domena i funkcionalnog domena (npr. nukleaze).

Neograničavajući primeri pogodnih vezničkih sekvenci uključuju SAD patente br.8,772,453; 7,888,121; 6,479,626; 6,903,185; i 7,153,949; SAD publikaciju br.20090305419) i SAD prijavu br.14/471,782. Prema tome, ovde opisani proteini mogu uključivati bilo koju kombinaciju odgovarajućih veznika između pojedinačnih DNK vezujućih komponenti i/ili

4

između DNK vezujućeg domena i funkcionalnog domena ovde opisanih sastava.

[0095] CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) lokus koji kodira RNK komponente sistema i cas (povezan sa CRISPR) lokus koji kodira proteine (Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol.43: 1565-1575; Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60) čine genske sekvence CRISPR/Cas sistema nukleaze. CRISPR lokusi u mikrobnim domaćinima sadrže kombinaciju CRISPR-povezanih (Cas) gena, kao i nekodirajuće RNK elemente sposobne da programiraju specifičnost CRISPR-posredovanog razdvajanja nukleinske kiseline.

[0096] CRISPR tipa II jedan je od najbolje okarakterisanih sistema i sprovodi ciljani dvolančani prekid DNK u četiri uzastopna koraka. Prvo, dve nekodirajuće RNK, pre-crRNK niz i tracrRNK, su transkribovane iz CRISPR lokusa. Drugo, tracrRNK se hibridizuje sa ponavljajućim regionima od pre-crRNK i posreduje u preradi pre-crRNK u zrele crRNK koje sadrže pojedinačne odstojne sekvence. Treće, zreli crRNK:tracrRNK kompleks usmerava Cas9 do ciljane DNK putem Watson-Crick baznog uparivanja između odstojnika na crRNK i protoodstojnika na ciljanoj DNK pored susednog motiva protoodstojnika (PAM), što je dodatni zahtev za prepoznavanje cilja. Konačno, Cas9 posreduje u razdvajanju ciljane DNK kako bi se stvorio dvolančani prekid unutar protoodstojnika. Aktivnosti CRISPR/Cas sistema se sastoje od tri koraka: (i) umetanje stranih DNK sekvenci u CRISPR niz radi sprečavanja budućih napada, u procesu koji se naziva 'adaptacija', (ii) eksprimiranje relevantnih proteina, kao i eksprimiranje i obrada niza, praćeno (iii) RNK posredovanom interferencijom sa stranom nukleinskom kiselinom. Tako je u bakterijskoj ćeliji nekoliko takozvanih 'Cas' proteina uključeno u prirodnu funkciju CRISPR/Cas sistema i služi u funkcijama kao što je umetanje strane DNK itd.

[0097] U nekim otelotvorenjima, Cas protein može biti „funkcionalni derivat“ prirodno prisutnog Cas proteina. „Funkcionalni derivat“ polipeptida nativne sekvence je jedinjenje koje ima kvalitativno biološko svojstvo zajedničko sa polipeptidom nativne sekvence.

„Funkcionalni derivati“ uključuju, ali nisu ograničeni na, fragmente nativne sekvence i derivate polipeptida nativne sekvence i njegove fragmente, pod uslovom da imaju biološku aktivnost zajedničku sa odgovarajućim polipeptidom nativne sekvence. Biološka aktivnost koja se ovde razmatra je sposobnost funkcionalnog derivata da hidrolizuje DNK supstrat u fragmente. Izraz „derivat“ obuhvata obe varijante aminokiselinske sekvence polipeptida, kovalentne modifikacije i njihove fuzije. Pogodni derivati Cas polipeptida ili njegovog fragmenta uključuju, ali nisu ograničeni na, mutante, fuzije, kovalentne modifikacije Cas proteina ili njegovog fragmenta. Cas protein, koji uključuje Cas protein ili njegov fragment, kao i derivati Cas proteina ili njegovog fragmenta, mogu se dobiti iz ćelije ili sintetisati hemijski ili kombinacijom ova dva postupka. Ćelija može biti ćelija koja prirodno proizvodi Cas protein, ili ćelija koja prirodno proizvodi Cas protein i genetskim inženjeringom je napravljena za proizvodnju endogenog Cas proteina na višem nivou eksprimiranja ili za proizvodnju Cas proteina iz egzogeno unete nukleinske kiseline, gde ta nukleinska kiselina kodira Cas koji je isti ili različit od endogenog Cas. U nekim slučajevima, ćelija prirodno ne proizvodi Cas protein i genetskim inženjeringom je napravljena za proizvodnju Cas proteina.

[0098] U nekim otelotvorenjima, DNK-vezujući domen je deo TtAgo sistema (pogledati Swarts et al, ibid; Sheng et al, ibid). Kod eukariota, utišavanje gena posreduje porodica Argonaute proteina (Ago). U ovoj paradigmi, Ago je vezan za male (19-31 nt) RNK. Ovaj kompleks za protein-RNK utišavanje prepoznaje ciljane RNK pomoću Watson-Crick baznog uparivanja između male RNK i mete i endonukleolitički razdvaja ciljanu RNK (Vogel (2014) Science 344:972-973). Nasuprot tome, prokariotski Ago proteini se vezuju za male jednolančane fragmente DNK i verovatno funkcionišu za detektovanje i uklanjanje strane (često virusne) DNK (Yuan et al., (2005) Mol. Cell 19, 405; Olovnikov, et al. (2013) Mol. Cell 51, 594; Swarts et al., ibid). Primeri prokariotskih Ago proteina uključuju one iz Aquifex aeolicus, Rhodobacter sphaeroides, i Thermus thermophilus.

[0099] Jedan od najkarakterističnijih prokariotskih Ago proteina je onaj iz T. thermophilus (TtAgo; Swarts et al. ibid). TtAgo se povezuje sa 15 nt ili 13-25 nt jednolančanih fragmenata DNK sa 5' fosfatnim grupama. Ovaj „DNK vodič“ vezan za TtAgo služi za usmeravanje protein-DNK kompleksa da vezuje Watson-Crick komplementarnu DNK sekvencu u trećem DNK molekulu. Kada informacije o sekvenci u ovim DNK vodičem dozvole identifikaciju ciljane DNK, TtAgo-DNK vodič kompleks razdvaja ciljanu DNK. Takav mehanizam takođe podržava strukturu TtAgo-DNK vodič kompleksa dok je vezan za svoju ciljanu DNK (G. Sheng et al., ibid). Ago od Rhodobacter sphaeroides (RsAgo) ima slična svojstva (Olivnikov et al. ibid).

[0100] Egzogene DNK vodiče proizvoljne DNK sekvence mogu se staviti na TtAgo protein (Swarts et al. ibid.). Budući da je specifičnost TtAgo razdvajanja usmerena pomoću DNK vodiča, TtAgo-DNK kompleks formiran sa egzogenom, DNK vodič određen od strane istraživača će stoga usmeriti razdvajanje TtAgo ciljane DNK na komplementarnu ciljanu DNK koju je odredio istraživač. Na ovaj način se može stvoriti ciljani dvolančani prekid u DNK. Upotreba TtAgo-DNK vodič sistema (ili ortolognih Ago-DNK vodič sistema od drugih organizama) omogućava usmereno razdvajanje genomske DNK unutar ćelija. Takvo razdvajanje može biti jednolančano ili dvolančano. Za razdvajanje genomske DNK sisara, bilo bi poželjnije koristiti verziju TtAgo kodona optimizovanu za eksprimiranje u ćelijama sisara. Dalje, možda bi bilo poželjnije tretirati ćelije sa formiranim TtAgo-DNK kompleksom in vitro gde je TtAgo protein spojen sa peptidom koji prodire u ćelije. Dalje, možda bi bilo poželjnije koristiti verziju proteina TtAgo koja je promenjena mutagenezom kako bi se poboljšala aktivnost na 37 stepeni celzijusa. Ago-RNK-posredovano razdvajanje DNK moglo bi se koristiti da utiče na mnoštvo ishoda, uključujući izbacivanje gena, ciljano dodavanje gena, korekciju gena, ciljano brisanje gena koristeći tehnike standardne u struci za eksploataciju DNK prekida.

[0101] Prema tome, nukleaza može sadržati DNK-vezujući domen koji se specifično vezuje za ciljano mesto u bilo kom genu u koji se želi ubaciti donor (transgen).

B. Domeni razdvajanja

[0102] Bilo koji pogodan domen razdvajanja može se operativno povezati sa domenom koji se vezuje za DNK kako bi se formirala nukleaza. Na primer, PCP DNK vezujuću domeni su spojeni sa domenima nukleaze kako bi se stvorili CPN - funkcionalni entitet koji je u stanju da prepozna svoj predviđeni cilj nukleinske kiseline kroz svoj sintetički (PCP) DNK vezujući domen i izazove presecanje DNK u blizini PCP mesta vezivanja preko aktivnosti nukleaze. Pogledati, npr., Kim et al. (1996) Proc Nat'l Acad Sci USA 93(3):1156-1160. U novije vreme, CPN su korišćeni za modifikaciju genoma u različitim organizmima. Pogledati, na primer, SAD patentne publikacije 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; i Međunarodne publikacije WO 07/014275. Slično, TALE DNK-vezujući domeni spojeni su sa domenima nukleaze kako bi se stvorili TALEN.

Pogledati, npr. SAD publikaciju br.20110301073.

[0103] Kao što je gore napomenuto, domen razdvajanja može biti heterologan za DNK-vezujući domen, na primer DNK-vezujući domen cinkovog prsta i domen razdvajanja od nukleaze ili TALEN DNK-vezujući domen i domen razdvajanja, ili DNK-vezujući domen meganukleaze i domen razdvajanja iz različite nukleaze. Heterologni domeni razdvajanja mogu se dobiti iz bilo koje endonukleaze ili egzonukleaze. Primeri endonukleaza iz kojih može da se izvede domen razdvajanja uključuju, ali nisu ograničeni na, restrikcione endonukleaze i homing endonukleaze. Pogledati, na primer, Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; and Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3379-3388. Poznati su dodatni enzimi koji razdvajaju DNK (npr., S1 nukleaza; mung bean nukleaza; pankreasna DNaza I; mikrokokna nukleaza; HO endonukleaza kvasca; pogledati takođe Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Jedan ili više ovih enzima (ili njihovih funkcionalnih fragmenata) mogu se koristiti kao izvor domena razdvajanja i poludomena razdvajanja.

[0104] Slično, polu-domen razdvajanja može se izvesti iz bilo koje nukleaze ili njenog dela, kako je gore navedeno, što zahteva dimerizaciju za aktivnost razdvajanja. Generalno, dva fuziona proteina su potrebna za razdvajanje ako fuzioni proteini sadrže polu-domene razdvajanja. Alternativno, može se koristiti jedan protein koji sadrži dva polu-domena razdvajanja. Dva polu-domena razdvajanja mogu biti izvedena iz iste endonukleaze (ili njihovih funkcionalnih fragmenata), ili svaki polu-domen razdvajanja može biti izveden iz različite endonukleaze (ili njihovih funkcionalnih fragmenata). Osim toga, ciljana mesta za dva fuziona proteina su poželjno raspoređena, jedno u odnosu na drugo, tako da vezivanje dva fuziona proteina za njihova odgovarajuća ciljana mesta dovodi polu-domene razdvajanja u prostornu orijentaciju jedan prema drugom što omogućava polu-domenima razdvajanja da formiraju funkcionalan domen razdvajanja, npr., dimerizacijom. Prema tome, u nekim otelotvorenjima, bliske ivice ciljanih mesta razdvojene su sa 5-8 nukleotida ili sa 15-18 nukleotida. Međutim, bilo koji integralni broj nukleotida ili parova nukleotida može da interveniše između dva ciljana mesta (npr., od 2 do 50 parova nukleotida ili više). Generalno, mesto razdvajanja leži između ciljanih mesta.

[0105] Restrikcione endonukleaze (restrikcioni enzimi) prisutne su u mnogim vrstama i sposobne su za sekvencno-specifično vezivanje za DNK (na mestu prepoznavanja) i razdvajanje DNK na mestu vezivanja ili blizu njega. Određeni restrikcioni enzimi (npr., Tip IIS) razdvajaju DNK na mestima uklonjenim sa mesta prepoznavanja i imaju odvojive domene vezivanja i razdvajanja. Na primer, Fok I enzim Tipa IIS katalizuje dvolančano razdvajanje DNK, na 9 nukleotida od svog mesta prepoznavanja na jednom lancu i 13 nukleotida od svog mesta prepoznavanja na drugom. Pogledati, na primer, SAD patente 5,356,802; 5,436,150 i 5,487,994; kao i Li et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem.269:31,978-31,982. Tako, u jednom aspektu, fuzioni proteini obuhvataju domen razdvajanja (ili polu-domen razdvajanja) iz najmanje jednog restrikcionog enzima Tipa IIS i jednog ili više vezujućih domena cinkovog prsta, koji se mogu ili ne moraju konstruisati.

[0106] Primer restrikcionog enzima Tipa IIS, čiji se domen razdvajanja može odvojiti od domena vezivanja, je FokI. Ovaj enzim je aktivan kao dimer. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. Shodno tome, za potrebe predmetnog obelodanjenja, deo Fok Enzim I koji se koristi u obelodanjenim fuzionim proteinima smatra se polu-domenom razdvajanja. Dakle, za ciljano dvolančano razdvajanje i/ili ciljanu zamenu ćelijskih sekvenci pomoću Fok I fuzija cinkovog prsta, dva fuziona proteina, od kojih svaki sadrži a FokI polu-domen razdvajanja, može se koristiti za rekonstituisanje katalitički aktivnog domena razdvajanja. Alternativno, mogu se koristiti jedan molekul polipeptida koji sadrži domen vezivanja cinkovog prsta i dva Fok I polu-domena razdvajanja. Parametri za usmereno razdvajanje i izmenu ciljane sekvence pomoću cinkov prst-Fok I fuzije su date na drugom mestu u predmetnom obelodanjenju.

[0107] Domen razdvajanja ili polu-domen razdvajanja mogu biti bilo koji deo proteina koji zadržava aktivnost razdvajanja ili koji zadržava sposobnost multimerizacije (npr., dimerizaciju) za formiranje funkcionalnog domena razdvajanja.

[0108] Primeri restrikcionih enzima Tipa IIS opisani su u Međunarodnoj publikaciji WO 07/014275. Dodatni restrikcioni enzimi takođe sadrže odvojive domene za vezivanje i razdvajanje, i oni su obuhvaćeni predmetnim obelodanjenjem. Pogledati, na primer, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.

[0109] U nekim otelotvorenjima, domen razdvajanja sadrži jedan ili više sintetičkih poludomena razdvajanja (koji se nazivaju i mutanti domena dimerizacije) koji minimizuju ili sprečavaju homodimerizaciju, kao što je opisano, na primer, u Pogledati, npr. SAD patente br. 7,914,796; 8,034,598 i 8,623,618. Ostaci aminokiselina na položajima 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 i 538 od FokI su svi meta uticaja na dimerizaciju FokI polu-domena razdvajanja.

[0110] Primeri sintetičkih polu-domena razdvajanja od FokI koji formiraju obligatne heterodimere uključuju par u kom prvi polu-domen razdvajanja uključuje mutacije na aminokiselinskim ostacima na položajima 490 od i 538 FokI, a drugi polu-domen razdvajanja uključuju mutacije na aminokiselinskim ostacima 486 i 499.

[0111] Tako, u jednom aspektu, mutacija na 490 zamenjuje Glu (E) sa Lys (K); mutacija na 538 zamenjuje Iso (I) sa Lys (K); mutacija na 486 zamenjuje Gln (Q) sa Glu (E); i mutacija na položaju 499 zamenjuje Iso (I) sa Lys (K). Konkretno, ovde opisani polu-domeni razdvajanja razdvajanja su pripremljeni mutiranjem položaja 490 (E→K) i 538 (I→K) u jednom polu-domenu razdvajanja kako bi se proizveo sintetički polu-domen razdvajanja označen kao „E490K:I538K“ i mutiranjem položaja 486 (Q→E) i 499 (I→L) u drugom poludomenu razdvajanja kako bi se proizveo sintetički polu-domen razdvajanja označen kao „Q486E:I499L“. Ovde opisani sintetički polu-domeni razdvajanja su obligatni heterodimerni mutanti u kojima je aberantno razdvajanje svedeno na minimum ili ukinuto. Pogledati, npr. SAD patentnu publikaciju br.2008/0131962. U nekim otelotvorenjima, sintetički polu-domen razdvajanja sadrži mutacije na položajima 486, 499 i 496 (numerisane u odnosu na divlji tip FokI), na primer mutacije koje zamenjuju ostatak divljeg tipa Gln (Q) na položaju 486 sa Glu (E) ostatkom, ostatak divljeg tipa Iso (I) na položaju 499 sa Leu (L) ostatkom i ostatak divljeg tipa Asn (N) na položaju 496 sa Asp (D) ili Glu (E) ostatkom (takođe se nazivaju „ELD“ i „ELE“ domeni, respektivno). U drugim otelotvorenjima, sintetički polu-domen razdvajanja sadrži mutacije na položajima 490, 538 i 537 (numerisane u odnosu na divlji tip FokI), na primer mutacije koje zamenjuju Glu (E) ostatak divljeg tipa na položaju 490 sa Lys (K) ostatkom, ostatak divljeg tipa Iso (I) na položaju 538 sa Lys (K) ostatkom, i ostatak divljeg tipa His (H) na položaju 537 sa Lys (K) ili Arg (R) ostatkom (takođe se nazivaju „KKK“ i „KKR“ domeni, respektivno). U drugim otelotvorenjima, sintetički polu-domen razdvajanja sadrži mutacije na položajima 490 i 537 (numerisane u odnosu na divlji tip FokI), na primer mutacije koje zamenjuju Glu (E) ostatak divljeg tipa na položaju 490 sa Lys (K) ostatkom i His (H) ostatak divljeg tipa na položaju 537 sa Lys (K) ostatkom ili Arg (R) ostatkom (takođe se nazivaju „KIK“ i „KIR“ domeni, respektivno. Pogledati, npr. SAD patente br.7,914,796; 8,034,598 i 8,623,618. U drugim otelotvorenjima, sintetički poludomen razdvajanja sadrži „Sharkey“ i/ili „Sharkey'“ mutacije (pogledati Guo et al, (2010) J. Mol. Biol.400(1):96-107).

4

[0112] Sintetički polu-domeni razdvajanja opisani ovde mogu se pripremiti bilo kojim pogodnim postupkom, na primer, mutagenezom usmerenom na mesto polu-domena razdvajanja divljeg tipa (Fok I) kako je opisano u SAD patentnoj publikaciji br.

20050064474; 20080131962; i 20110201055.

[0113] Alternativno, nukleaze se mogu sastaviti in vivo na ciljanom mestu nukleinske kiseline pomoću takozvane „split-encim“ tehnologije (pogledati, npr. SAD patentnu publikaciju br.20090068164). Komponente takvih podeljenih enzima mogu biti eksprimirane bilo na odvojenim konstruktima eksprimiranja, ili mogu biti povezane u jedan otvoreni okvir za čitanje gde su pojedinačne komponente odvojene, na primer, samorazdvajajućim 2A peptidom ili IRES sekvencom. Komponente mogu biti pojedinačni vezujući domeni cinkovog prsta ili vezujući domeni meganukleaze nukleinske kiseline.

[0114] Nukleaze se mogu ispitati za aktivnost pre upotrebe, na primer u hromozomskom sistemu na bazi kvasca kako je opisano u WO 2009/042163 i 20090068164. Konstrukti eksprimiranja nukleaze mogu se lako dizajnirati postupcima poznatim u struci. Pogledati, npr., SAD patentne publikacije 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; i Međunarodnu publikaciju WO 07/014275. Eksprimiranje nukleaze može biti pod kontrolom konstitutivnog promotera ili inducibilnog promotera, na primer promotera galaktokinaze koji se aktivira (de-potiskuje) u prisustvu rafinoze i/ili galaktoze i potiskuje u prisustvu glukoze.

[0115] CRISPR/Cas sistem povezan sa Cas9 sadrži dve nekodirajuće RNK komponente: tracrRNK i pre-crRNK niz koji sadrži sekvence vodiča nukleaze (odstojnike) međusobno razmaknute identičnim direktnim ponavljanjima (DR). Kako bi se koristio CRISPR/Cas sistem za postizanje inženjeringa genoma, moraju biti prisutne obe funkcije ovih RNK (pogledati Cong et al, (2013) Sciencexpress 1/10.1126/science 1231143). U nekim otelotvorenjima, tracrRNK i pre-crRNK se isporučuju preko odvojenih konstrukata eksprimiranja ili kao zasebne RNK. U drugim otelotvorenjima, himerna RNK je konstruisana gde je konstruisana zrela crRNK (koja daje specifičnost cilja) fuzionisana za tracrRNK (koja pruža interakciju sa Cas9) kako bi se stvorio himerni crRNK-tracrRNK hibrid (takođe nazvan RNK sa jednim vodičem). (pogledati Jinek ibid i Cong, ibid).

Ciljana mesta

[0116] Kao što je detaljno opisano iznad, DNK domeni se mogu konstruisati tako da se vezuju za bilo koju sekvencu po izboru. Konstruisani DNK-vezujući domen može imati novu specifičnost vezivanja, u poređenju sa DNK-vezujućim domenom koji se prirodno javlja. U određenim aspektima obelodanjenja, DNK-vezujući domeni vezuju se za sekvencu unutar sekvence BCL11A pojačivača, na primer za ciljano mesto (tipično 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ili čak više baznih parova) nalazi se između egzona 2 i eksona 3 BCL11A, uključujući DNK-vezujuće domene koji se vezuju za sekvencu unutar DNKseI hipersenzitivnog mesta u sekvenci BCL11A pojačivača (npr., 55, 58, 62; pogledati Sliku 11). Inženjerski postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, racionalni dizajn i različite vrste odabira. Racionalni dizajn uključuje, na primer, korišćenje baza podataka koje sadrže trostruke (ili četvorostruke) nukleotidne sekvence i pojedinačne aminokiselinske sekvence cinkovog prsta, u kojima je svaka trostruka ili četvorostruka nukleotidna sekvenca povezana sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci cinkovog prsta koje vezuju određene trostruke ili četvorostruke sekvence. Pogledati, na primer, u SAD patente 6,453,242 i 6,534,261 koji su u suvlasništvu. Takođe se može izvesti racionalni dizajn TAL-efektorskih domena. Pogledati, npr. SAD publikaciju br.20110301073.

[0117] Primeri postupaka odabira koji se primenjuju na DNK-vezujuće domene, uključujući prikaz faga i dvo-hibridne sisteme, opisani su u SAD patentima 5,789,538; 5,925,523;

6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; i 6,242,568; kao i WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 i GB 2,338,237. Dodatno, opisano je poboljšanje specifičnosti vezivanja za domene vezivanja cinkovog prsta, na primer, u WO 02/077227 koji je u suvlasništvu.

[0118] Izbor ciljanih mesta; nukleaze i postupci za dizajn i konstrukciju fuzionih proteina (i polinukleotidi koji ih kodiraju) poznati su stručnjacima i detaljno su opisani u SAD publikacijama patentnih prijava br.20050064474 i 20060188987.

[0119] Osim toga, kako je otkriveno u ovim i drugim referencama, DNK-vezujući domeni (npr., proteini cinkovog prsta sa više prstiju) i/ili fuzije DNK-vezujućih domena i funkcionalnih domena mogu biti povezani zajedno pomoću bilo koje pogodne vezničke sekvence, uključujući, na primer, veznike sa 5 ili više aminokiselina. SAD patenti br.

8,772,453; 7,888,121 (npr., „ZC“ veznik); 6,479,626; 6,903,185; i 7,153,949; SAD publikacija br.20090305419) i SAD prijava br.14/471,782. Ovde opisani proteini mogu uključivati bilo koju kombinaciju odgovarajućih veznika između pojedinačnih DNKvezujućih domena proteina. Takođe pogledati, SAD patent br.8,586,526.

Donori

[0120] Predmetno obelodanjenje se odnosi na ciljanu integraciju egzogene sekvence posredovane nukleazom u genom ćelije pomoću molekula koji vezuju region BCL11A pojačivača koji je ovde opisan. Kao što je navedeno iznad, umetanje egzogene sekvence (koja se naziva i „donorska sekvenca“ ili „donor“ ili „transgen“), na primer za brisanje određenog regione i/ili korekciju mutiranog gena ili za povećano eksprimiranje divljeg tipa gena. Biće očigledno da donorska sekvenca tipično nije identična sa genomskom sekvencom u kojoj je postavljena. Donorska sekvenca može sadržati nehomolognu sekvencu sa dve regione homologije koja omogućava efikasan HDR na mestu od interesa ili se može integrisati pomoću mehanizama za popravljanje koji nisu usmereni homologijom. Dodatno, donorske sekvence mogu sadržati vektorski molekul koji sadrži sekvence koje nisu homologne za region od interesa u ćelijskom hromatinu. Donorski molekul može sadržati nekoliko, diskontinuiranih regiona homologije sa ćelijskim hromatinom, i, na primer, dovesti do brisanja regiona BCL11A pojačivača (ili njegovog fragmenta) kada se koristi kao supstrat za popravljanje DBS indukovanog jednom od ovde opisanih nukleaza. Dalje, za ciljano umetanje sekvenci koje normalno nisu prisutne u regionu od interesa, navedene sekvence mogu biti prisutne u molekulu donorske nukleinske kiseline i okružene regionima homologije do sekvence u regionu od interesa.

[0121] Polinukleotidi za umetanje se takođe mogu označiti kao „egzogeni“ polinukleotidi, „donorski“ polinukleotidi ili molekuli ili „transgeni". Donorski polinukleotid može biti DNK ili RNK, jednolančani i/ili dvolančani i može se uvesti u ćeliju u linearnom ili kružnom obliku. Pogledati, npr. SAD patentnu publikaciju br.20100047805 i 20110207221. Donorske sekvence su poželjno sadržane u DNK MC, koji se može uvesti u ćeliju u kružnom ili linearnom obliku. Ako se uvede u linearnom obliku, krajevi donorske sekvence mogu biti zaštićeni (npr., od egzonukleolitičke degradacije) postupcima poznatim stručnjacima. Na primer, jedan ili više didezoksinukleotidnih ostataka su dodati na 3' kraj linearnog molekula i/ili su samokomplementarni oligonukleotidi vezani za jedan ili oba kraja. Pogledati, na primer, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889. Dodatni postupci za zaštitu egzogenih polinukleotida od razgradnje uključuju, ali nisu ograničeni na, dodavanje terminalnih amino grupa i upotrebu modifikovanih internukleotidnih veza, kao što su, na primer, fosforotioati, fosforamidi i ostaci O-metil riboze ili dezoksiriboze. Ako se uvede u dvolančanom obliku, donor može

4

uključivati jedno ili više ciljanih mesta nukleaze, na primer, ciljana mesta nukleaze koja okružuju transgen koji treba da se integriše u ćelijski genom. Pogledati, npr. SAD patentnu publikaciju br.20130326645.

[0122] Polinukleotid se može uvesti u ćeliju kao deo vektorskog molekula koji ima dodatne sekvence kao što su, na primer, poreklo replikacije, promoteri i geni koji kodiraju rezistenciju na antibiotike. Štaviše, donorski polinukleotidi se mogu uvesti kao gola nukleinska kiselina, kao nukleinska kiselina u kompleksu sa agensom kao što su lipozom ili poloksamer, ili se mogu isporučiti virusima (npr., adenovirus, AAV, herpesvirus, retrovirus, lentivirus i integrazno defektni lentivirus (IDLV)).

[0123] U nekim otelotvorenjima, dvolančani donor uključuje sekvence (npr., kodirajuće sekvence, takođe nazvane transgeni) dužine veće od 1 kb, na primer između 2 i 200 kb, između 2 i 10 kb (ili bilo koja vrednosti između njih). Dvolančani donor takođe uključuje najmanje jedno ciljano mesto nukleaze, na primer. U nekim otelotvorenjima, donor uključuje najmanje 2 ciljana mesta, na primer za par CPN ili TALEN. Tipično, ciljana mesta nukleaze su izvan sekvenci transgena, na primer, 5' i/ili 3' u odnosu na transgene sekvence, radi razdvajanja transgena. Mesta razdvajanja nukleaze mogu biti za bilo koju nukleazu. U određenim aspektima, ciljana mesta nukleaze sadržana u dvolančanom donoru su za iste nukleaze koje se koriste za razdvajanje endogenog cilja u kom je razdvojeni donor integrisan postupcima nezavisnim od homologije.

[0124] Donor je generalno umetnut tako da njegovo eksprimiranje pokreće endogeni promoter na mestu integracije, naime promoter koji pokreće eksprimiranje endogenog gena u koji je donor umetnut (npr., globin, AAVS1 itd.). Međutim, biće očigledno da donor može sadržati promoter i/ili pojačivač, na primer konstitutivni promoter ili inducibilni ili tkivno specifični promoter.

[0125] Donorski molekul može biti umetnut u endogeni gen tako da se svi, neki ili ništa od endogenog gena eksprimiraju. U drugim otelotvorenjima, transgen (npr., sa ili bez sekvenci kodiranja globina) integrisan je u bilo koji endogeni lokus, na primer lokus sigurne luke. Pogledati, npr. SAD patentne prijave 20080299580; 20080159996 i 201000218264.

[0126] Dalje, iako nisu potrebne za eksprimiranje, egzogene sekvence mogu takođe uključivati transkripcione ili translacione regulatorne sekvence, na primer, promotere, pojačivače, izolatore, unutrašnja mesta ulaska u ribozom, sekvence koje kodiraju 2A peptide i/ili signale poliadenilacije.

[0127] Transgeni koji se nose na donorskim sekvencama opisanim ovde mogu se izolovati iz plazmida, ćelija ili drugih izvora primenom standardnih tehnika poznatih u struci, kao što je PCR. Donori za upotrebu mogu uključivati različite vrste topologije, uključujući kružne supernamotane, kružne opuštene, linearne i slično. Alternativno, mogu se hemijski sintetisati primenom standardnih tehnika sinteze oligonukleotida. Osim toga, donori mogu biti metilirani ili mogu da nemaju metilaciju. Donori mogu biti u obliku veštačkih hromozoma bakterija ili kvasca (BAC ili YAC).

[0128] Dvolančani donorski polinukleotidi opisani ovde mogu uključivati jednu ili više neprirodnih baza i/ili kičmi. Konkretno, umetanje donorskog molekula sa metiliranim citozinima može se izvršiti primenom ovde opisanih postupaka kako bi se postiglo stanje transkripcionog mirovanja u regionu od interesa.

[0129] Egzogeni (donorski) polinukleotid može sadržati bilo koju sekvencu od interesa (egzogena sekvenca). Primeri egzogenih sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na bilo koju sekvencu koja kodira polipeptid (npr., cDNK), promoterske sekvence, pojačivačke sekvence, epitopske oznake, marker gene, mesta za prepoznavanje enzima razdvajanja i različite vrste konstrukata eksprimiranja. Marker geni uključuju, ali nisu ograničeni na, sekvence koje kodiraju proteine koji posreduju rezistenciju na antibiotike (npr., rezistencija na ampicilin, rezistencija na neomicin, rezistencija na G418, rezistencija na puromicin), sekvence koje kodiraju obojene ili fluorescentne ili luminiscentne proteine (npr., zeleni fluorescentni protein, pojačani zeleni fluorescentni protein, crveni fluorescentni protein, luciferaza) i proteini koji posreduju u pojačanom rastu ćelija i/ili amplifikaciji gena (npr., dihidrofolat reduktaza). Oznake epitopa uključuju, na primer, jednu ili više kopija FLAG, His, myc, Tap, HA, ili bilo koje aminokiselinske sekvence koja se mogu detektovati.

[0130] U poželjnom otelotvorenju, egzogena sekvenca (transgen) sadrži polinukleotid koji kodira bilo koji polipeptid čija je eksprimiranje u ćeliji poželjna, uključujući, ali bez ograničenja, antitela, antigene, enzime, receptore (na ćelijskoj površini ili nuklearnoj), hormone, limfokine, citokini, reporter polipeptidi, faktori rasta i funkcionalni fragmenti bilo

4

čega od gore navedenog. Kodirajuće sekvence mogu biti, na primer, cDNK.

[0131] Na primer, egzogena sekvenca može sadržati sekvencu koja kodira polipeptid koji nedostaje ili je nefunkcionalan kod pacijenta koji ima genetsku bolest, uključujući, ali bez ograničenja, bilo koju od narednih genetskih bolesti: ahondroplazija, ahromatopsija, nedostatak kiseline maltaze, nedostatak adenozin deaminaze (OMIM br.102700), adrenoleukodistrofija, aickardi sindrom, nedostatak alfa-1 antitripsina, alfa-talasemija, sindrom neosetljivosti na androgene, apert sindrom, aritmogeni desni ventrikular, displazija, ataksija telangiktazija, bartov sindrom, beta-talasemija, nevus sindrom plave gume, kanavanova bolest, hronične granulomatozne bolesti (CGD), cri du chat sindrom, cistična fibroza, derkumova bolest, ektodermalna displazija, fankonijeva anemija, progresivna fibrodisplazija osifikans, sindrom krhkog X, galaktozema, Gaušerova bolest, generalizovane gangliosidoze (npr., GM1), hemohromatoza, mutacija hemoglobina C u šestom kodonu betaglobina (HbC), hemofilija, Hantingtonova bolest, Hurlerov sindrom, hipofosfatazija, Klinefleterov sindrom, Krabesova bolest, Langer-Giedionov sindrom, nedostatak adhezije leukocita (LAD, OMIM br.116920), leukodistrofija, sindrom dugačkog QT, Marfanov sindrom, Moebiusov sindrom, mukopolisaharidoza (MPS), sindrom patele noktiju, nefrogeni dijabetes insipdius, neurofibromatoza, Neiman-Pikova bolest, osteogeneza imperfekta, porfirija, Prader-Vilijev sindrom, progerija, Proteusov sindrom, retinoblastom, Retov sindrom, Rubinštajn-Taibijev sindrom, Sanfilipo sindrom, teška kombinovana imunodeficijencija (SCID), Švahmanov sindrom, bolest srpastih ćelija (anemija srpastih ćelija), Smit-Magenisov sindrom, Stiklerov sindrom, Tai-Saksova bolest, sindrom odsutnog radijusa trombocitopenije (TAR), Trečer-Kollinsov sindrom, trisomija, tuberkularna skleroza, Tarnerov sindrom, poremećaj ciklusa uree, von Hipel-Landauova bolest, Vardenburgov sindrom, Vilijamsov sindrom, Vilsonova bolest, Viskot-Oldričov sindrom, X-povezan limfoproliferativni sindrom (XLP, OMIM br.308240).

[0132] Dodatne primerne bolesti koje se mogu tretirati ciljanom integracijom uključuju stečene imunodeficijencije, bolesti lizosomskog skladištenja (npr., Gaušerova bolest, GM1, Fabrijeva bolest i Tai-Saksova bolest), mukopolisakahidoza (npr. Hanterova bolest, Hurlerova bolest), hemoglobinopatije (npr., bolesti srpastih ćelija, HbC, α-talasemija, βtalasemija) i hemofilije.

[0133] U nekim otelotvorenjima, egzogene sekvence mogu sadržati marker gen (gore

4

opisan), koji omogućava odabir ćelija koje su prošle ciljanu integraciju, i povezanu sekvencu koja kodira dodatnu funkcionalnost. Neograničavajući primeri marker gena uključuju GFP, marker za izbor leka i slično.

[0134] Dodatne genske sekvence koje se mogu umetnuti mogu uključivati, na primer, gene divljeg tipa koji zamenjuju mutirane sekvence. Na primer, sekvenca gena faktora IX divljeg tipa može biti umetnuta u genom matične ćelije u kojoj je endogena kopija gena mutirana. Kopija divljeg tipa može biti umetnuta na endogeni lokus ili može alternativno biti usmerena na lokus bezbedne luke.

[0135] Konstrukcija takvih kaseta eksprimiranja, prateći navode predmetne specifikacije, koristi metodologije dobro poznate u oblasti molekularne biologije (pogledati, na primer, Ausubel ili Maniatis). Pre upotrebe kasete eksprimiranja za generisanje transgene životinje, odziv kasete za eksprimiranje na induktor stresa povezan sa izabranim kontrolnim elementima može se ispitati uvođenjem kasete eksprimiranja u odgovarajuću ćelijsku liniju (npr., primarne ćelije, transformisane ćelije ili imortalizovane ćelijske linije).

[0136] Dalje, iako nisu potrebne za eksprimiranje, egzogene sekvence mogu takođe biti transkripcione ili translacione regulatorne sekvence, na primer, promoteri, pojačivači, izolatori, unutrašnja mesta ulaska u ribozom, sekvence koje kodiraju 2A peptide i/ili signale poliadenilacije. Dalje, kontrolni elementi gena od interesa mogu se operativno povezati sa reporterskim genima za stvaranje himernih gena (npr., reporterske kasete eksprimiranja).

[0137] Takođe se može postići ciljano umetanje nekodirajuće sekvence nukleinske kiseline. Sekvence koje kodiraju antisens RNK, RNKi, shRNK i mikro RNK (miRNK) takođe se mogu koristiti za ciljano umetanje.

[0138] U dodatnim otelotvorenjima, donorska nukleinska kiselina može sadržati nekodirajuće sekvence koje su specifična ciljana mesta za dodatne dizajne nukleaze. Nakon toga, dodatne nukleaze mogu biti eksprimirane u ćelijama tako da se originalni donorski molekul razdvoji i modifikuje umetanjem drugog donorskog molekula od interesa. Na ovaj način, mogu se generisati ponavljajuće integracije donorskog molekula koje omogućavaju slaganje osobina na određen lokus od interesa ili na lokus sigurne luke.

Isporuka

4

[0139] Nukleaze, polinukleotidi koji kodiraju ove nukleaze, donorski polinukleotidi i sastavi koje sadrže ovde opisane proteine i/ili polinukleotide mogu se isporučiti in vivo ili ex vivo na bilo koji pogodan način u bilo koji tip ćelije.

[0140] Pogodne ćelije uključuju eukariotske (npr., životinjske) i prokariotske ćelije i/ili ćelijske linije. Neograničavajući primeri takvih ćelija ili ćelijskih linija generisanih iz takvih ćelija uključuju COS, CHO (npr., CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (npr., HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) i perC6 ćelije, kao i ćelije insekata kao što su Spodopterafugiperda (Sf), ili ćelije gljiva kao što su Saccharomyces, Pichia i Schizosaccharomyces. U nekim otelotvorenjima, ćelijska linija je CHO, MDCK ili HEK293 ćelijska linija. Pogodne ćelije takođe uključuju matične ćelije kao što su, na primer, embrionalne matične ćelije, indukovane pluripotentne matične ćelije, matične ćelije hematopoeze, neuronske matične ćelije i mezenhimalne matične ćelije.

[0141] Postupci isporuke nukleaza kako su ovde opisane opisane su, na primer, u SAD patentima br.6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; i 7,163,824.

[0142] Nukleaze i/ili donorski konstrukti, kako je ovde opisano, takođe se mogu isporučiti korišćenjem vektora koji sadrže sekvence koje kodiraju jedan ili više CPN, TALEN ili CRIPSR/Cas sistema. Mogu se koristiti bilo koji vektorski sistemi uključujući, ali bez ograničenja, plazmidne vektore, retrovirusne vektore, lentivirusne vektore, adenovirusne vektore, poksvirusne vektore; herpesvirusne vektori i vektore adeno-povezanih virusa itd. Takođe pogledati, SAD patente br.6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; i 7,163,824. Dalje, biće očigledno da bilo koji od ovih vektora može sadržati jednu ili više sekvenci potrebnih za tretman. Prema tome, kada se jedna ili više nukleaza i donorski konstrukt unesu u ćeliju, nukleaze i/ili donorski polinukleotid mogu se nositi na istom vektoru ili na različitim vektorima (DNK MC). Kada se koristi više vektora, svaki vektor može sadržati sekvencu koja kodira jednu ili više nukleaza i/ili donorskih konstrukata. Uobičajeni postupci prenošenja gena zasnovani na virusima i nevirusima mogu se koristiti za uvođenje nukleinskih kiselina koje kodiraju nukleaze i/ili donorske konstrukte u ćelije (npr., ćelije sisara) i ciljana tkiva. Sistemi za isporuku nevirusnih vektora uključuju DNK ili RNK plazmide, DNK MC, golu nukleinsku kiselinu i nukleinsku kiselinu u kompleksu sa nosačem

4

za isporuku, kao što su lipozom ili poloksamer. Pogodni nevirusni vektori uključuju nanotaksne vektore, uključujući vektore koji su komercijalno dostupni od kompanije InCellArt (Francuska). Sistemi za isporuku virusnih vektora uključuju DNK i RNK viruse, koji nakon isporuke u ćeliju imaju ili epizomalne ili integrisane genome. Za pregled in vivo isporuke sintetičkih DNK-vezujućih proteina i fuzionih proteina koji sadrže ove vezujuće proteine, pogledati, npr., Rebar (2004) Expert Opinion Invest. Drugs 13(7):829-839; Rossi et al. (2007) Nature Biotech.25(12):1444-1454 kao i opšte reference isporuke gena kao što su Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Böhm (eds.) (1995); i Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).

[0143] Postupci nevirusne isporuke nukleinskih kiselina uključuju elektroporaciju, lipofekciju, mikroinjekciju, biolistiku, virozome, lipozome, imunolipozome, polikaciju ili lipid:nukleinska kiselina konjugate, golu DNK, veštačke virione i pojačano uzimanje DNK. Sonoporacija pomoću, npr., Sonitron 2000 sistema (Rich-Mar) se takođe može koristiti za isporuku nukleinskih kiselina.

[0144] Dodatni primerni sistemi za isporuku nukleinskih kiselina su oni koje pružaju Amaxa Amaxa Biosystems (Keln, Nemačka), Maxcyte, Inc. (Rokvil, Merilend), BTX Molecular Delivery Systems (Holiston, MA) i Copernicus Therapeutics Inc., (pogledati na primer US6008336). Lipofekcija je opisana u npr., SAD patentima br.5,049,386; 4,946,787; i 4,897,355), a reagensi za lipofekciju se prodaju komercijalno (npr., Transfectam™ i Lipofectin™). Katjonski i neutralni lipidi pogodni za efikasnu lipofekciju prepoznavanja receptora polinukleotida uključuju one od Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024.

[0145] Priprema lipid:nukleinska kiselina komplekasa, uključujući ciljane lipozome, poput imunolipidnih kompleksa, dobro je poznata stručnjaku (pogledati npr. Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther.2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem.5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992);

4

SAD patetne br.4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, i 4,946,787).

[0146] Dodatni načini isporuke uključuju upotrebu pakovanja nukleinskih kiselina koje će se isporučiti u EnGeneIC transportne nosače (EDV). Ovi EDV se specifično isporučuju ciljanim tkivima koristeći bispecifična antitela gde jedan krak antitela ima specifičnost za ciljano tkivo, q drugi ima specifičnost za EDV. Antitelo dovodi EDV na ciljanu ćelijsku površinu, i zatim se EDV unosi u ćeliju endocitozom. Kada uđe u ćeliju, sadržaj se oslobađa (pogledati MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643).

[0147] Upotreba RNK ili DNK sistema zasnovanih na virusima za isporuku nukleinskih kiselina koje kodiraju konstruisane PCP, TALE -e i/ili CRISPR/Cas sisteme, koriste prednosti visoko razvijenih procesa za ciljanje virusa na određene ćelije u telu i promet virusnog korisnog tereta na jezgro. Virusni vektori se mogu primenjivati direktno pacijentima (in vivo) ili se mogu koristiti za tretman ćelija in vitro, a modifikovane ćelije se primenjuju pacijentima (ex vivo). Konvencionalni sistemi zasnovani na virusima za isporuku PCP uključuju, ali nisu ograničeni na, retrovirusne, lentivirusne, adenovirusne, adeno-povezane, vakcinije i vektore herpes simpleks virusa za prenos gena. Integracija u genom domaćina je moguća postupcima transfera gena virusa retrovirusom, lentivirusom i adeno-virusom, što često dovodi do dugotrajnog eksprimiranja umetnutog transgena. Dodatno, visoka efikasnost transdukcije je primećena u mnogim različitim tipovima ćelija i ciljanim tkivima.

[0148] Tropizam retrovirusa može se promeniti uključivanjem stranih proteina omotača, proširujući potencijalnu ciljanu populaciju ciljanih ćelija. Lentivirusni vektori su retrovirusni vektori koji su u stanju da transduciraju ili inficiraju ćelije koje se ne dele i tipično proizvode visoke titre virusa. Izbor retrovirusnog sistema za prenos gena zavisi od ciljanog tkiva.

Retrovirusni vektori se sastoje od cis-delujućih dugačkih terminalnih ponavljanja sa kapacitetom pakovanja do 6-10 kb strane sekvence. Minimum cis-delujući LTR su dovoljni za replikaciju i pakovanje vektora, koji se zatim koriste za integraciju terapijskog gena u ciljanu ćeliju kako bi se dobilo trajno eksprimiranje transgena. Široko korišćeni retrovirusni vektori uključuju one zasnovane na virusu leukemije miša (MuLV), virusu leukemije majmuna gibona (GaLV), virusu simijanske imunodeficijencije (SIV), virusu humane imunodeficijencije (HIV) i njihovim kombinacijama (pogledati, npr. Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol.66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol.63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol.

65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).

[0149] U primenama u kojima se preferira prolazno eksprimiranje, mogu se koristiti sistemi na bazi adenovirusa. Vektori na bazi adenovirusa sposobni su za vrlo visoku efikasnost transdukcije u mnogim tipovima ćelija i ne zahtevaju ćelijsku deobu. Sa takvim vektorima postignuti su visok titar i visok nivo eksprimiranja. Ovaj vektor se može proizvesti u velikim količinama u relativno jednostavnom sistemu. Vektori adeno-povezanog virusa („AAV“) se takođe koriste za transdukciju ćelija sa ciljanim nukleinskim kiselinama, npr., u in vitro proizvodnji nukleinskih kiselina i peptida, i za in vivo i ex vivo procedure genske terapije (pogledati npr. West et al., Virology 160:38-47 (1987); SAD patent br.4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest.

94:1351 (1994). Konstrukcija rekombinantnih AAV vektora opisana je u brojnim publikacijama, uključujući SAD patent br.5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol.

5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol.4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); i Samulski et al., J. Virol.63:03822-3828 (1989).

[0150] Najmanje šest pristupa virusnih vektora trenutno je dostupno za prenos gena u kliničkim ispitivanjima, koji koriste pristupe koji uključuju komplementaciju defektnih vektora genima umetnutim u pomoćne ćelijske linije za generisanje transdukcionog agensa.

[0151] pLASN i MFG-S su primeri retrovirusnih vektora koji su korišćeni u kliničkim ispitivanjima (Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med.1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:2212133-12138 (1997)). PA317/pLASN je bio prvi terapijski vektor korišćen u ispitivanju genske terapije. (Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). Efikasnost transdukcije od 50% ili više primećena je za MFG-S upakovane vektore. (Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997).

[0152] Rekombinantni adeno-povezani virusni vektori (rAAV) su obećavajući alternativni sistemi za isporuku gena zasnovani na defektnom i nepatogenom parvovirusnom adenopovezanom virusu tipa 2. Svi vektori su izvedeni iz plazmida koji zadržava samo obrnute terminale AAV 145 bp sa bočne strane transgene kasete eksprimiranja. Efikasan transfer gena i stabilna isporuka transgena usled integracije u genome transdukovane ćelije ključne su

1

karakteristike ovog vektorskog sistema. (Wagner et al., Lancet 351:91171702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther.9:748-55 (1996)). U skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se koristiti i drugi AAV serotipovi, uključujući AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 i AAVrh.10 i bilo koji novi AAV serotip.

[0153] Rekombinantni adenovirusni vektori sa nedostatkom replikacije (Ad) mogu se proizvesti pri visokom titru i lako inficirati brojne različite tipove ćelija. Većina adenovirusnih vektora je konstruisana tako da transgen zamenjuje Ad E1a, E1b i/ili E3 gene; zatim se vektor sa defektom replikacije propagira u ljudskim 293 ćelijama koje snabdevaju funkciju izbrisanog gena u trans. Ad vektori mogu transducirati više vrsta tkiva in vivo, uključujući nepodeljene, diferencirane ćelije poput onih koje se nalaze u jetri, bubrezima i mišićima. Konvencionalni Ad vektori imaju veliku nosivost. Primer upotrebe Ad vektora u kliničkom ispitivanju uključivao je polinukleotidnu terapiju za antitumorsku imunizaciju intramuskularnom injekcijom (Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). Dodatni primeri upotrebe adenovirusnih vektora za prenos gena u kliničkim ispitivanjima uključuju Rosenecker et al., Infection 24:15-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther.9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther.2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998).

[0154] Ćelije za pakovanje se koriste za formiranje virusnih čestica koje mogu inficirati ćeliju domaćina. Takve ćelije obuhvataju 293 ćelije koje pakuju adenovirus i ψ2 ćelije ili PA317 ćelije koje pakuju retrovirus. Virusne vektore koji se koriste u genskoj terapiji obično generiše ćelijska linija proizvođač koja pakuje vektor nukleinske kiseline u virusnu česticu. Vektori tipično sadrže minimalne virusne sekvence potrebne za pakovanje i naknadnu integraciju u domaćina (ako je primenljivo), i ostale virusne sekvence se zamenjuju kasetom eksprimiranja koja kodira protein koji treba eksprimirati. Nedostajuće virusne funkcije se isporučuju u trans ćelijskom linijom za pakovanje. Na primer, AAV vektori koji se koriste u genskoj terapiji obično poseduju samo obrnute terminalne sekvence ponavljanja (ITR) iz AAV genoma koje su potrebne za pakovanje i integraciju u genom domaćina. Virusna DNK je upakovana u ćelijsku liniju koja sadrži pomoćni plazmid koji kodira druge AAV gene, naime rep i cap, ali nedostaju joj ITR sekvence. Ćelijska linija je takođe zaražena adenovirusom kao pomoćnikom. Pomoćni virus promoviše replikaciju AAV vektora i eksprimiranje AAV gena iz pomoćnog plazmida. Pomoćni plazmid nije pakovan u značajnim

2

količinama zbog nedostatka ITR sekvenci. Kontaminacija adenovirusom može se smanjiti, npr., termička obrada na koju je adenovirus osetljiviji od AAV.

[0155] U mnogim primenama genske terapije poželjno je da se vektor genske terapije dostavi sa visokim stepenom specifičnosti određenoj vrsti tkiva. Shodno tome, virusni vektor se može modifikovati tako da ima specifičnost za dati tip ćelije eksprimiranjem liganda kao fuzionog proteina sa proteinom virusne kičme na spoljnoj površini virusa. Odabrano je da ligand ima afinitet za receptor za koji je poznato da je prisutan na tipu ćelije od interesa. Na primer, Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995), izvestili su da se Moloney virus mišje leukemije može modifikovati tako da eksprimira ljudski heregulin fuzionisan za gp70, i rekombinantni virus inficira određene ćelije raka dojke kod ljudi koje eksprimiraju receptor ljudskog epidermalnog faktora rasta. Ovaj princip se može proširiti i na druge virus-ciljane ćelije parove, u kojima ciljana ćelija eksprimira receptor, a virus eksprimira fuzioni protein koji sadrži ligand za receptor ćelijske površine. Na primer, filamentozni fag se može konstruisati tako da prikazuje fragmente antitela (npr., FAB ili Fv) koji imaju specifičan afinitet vezivanja za praktično bilo koji izabrani ćelijski receptor. Iako se opis iznad prvenstveno odnosi na virusne vektore, isti principi se mogu primeniti i na nevirusne vektore. Takvi vektori se mogu konstruisati tako da sadrže specifične sekvence preuzimanja koje pogoduju usvajanju od strane specifičnih ciljanih ćelija.

[0156] Mogu se isporučiti vektori genske terapije in vivo primenom pojedinačnom pacijentu, obično sistemskom primenom (npr., intravenozna, intraperitonealna, intramuskularna, subdermalna ili intrakranijalna infuzija) ili lokalna primena, kao što je opisano u nastavku. Alternativno, vektori se mogu isporučiti ćelijama ex vivo, kao što su ćelije eksplantirane od pojedinačnog pacijenta (npr., limfociti, aspirati koštane srži, biopsija tkiva) ili univerzalne donorske matične ćelije hematopoeze, praćene ponovnom implantacijom ćelija pacijentu, obično nakon odabira ćelija u koje je ugrađen vektor.

[0157] Vektori (npr., retrovirusi, adenovirusi, lipozomi, itd.) koji sadrže nukleaze i/ili donorske konstrukte takođe se mogu primeniti direktno u organizam radi transdukcije ćelija in vivo. Alternativno, može se primeniti gola DNK. Primena se vrši na bilo koji od načina koji se obično koriste za uvođenje molekula u krajnji dodir sa ćelijama krvi ili tkiva uključujući, ali bez ograničenja, injekciju, infuziju, lokalnu primenu i elektroporaciju.

Pogodni postupci primene takvih nukleinskih kiselina su dostupni i dobro poznati stručnjacima, i iako se moge primeniti više od jednog puta za primenu određenog sastava, određeni put često može pružiti neposredniju i efikasniju reakciju od drugog puta.

[0158] Vektori pogodni za uvođenje polinukleotida (npr. donora koji kodiraju nukleazu i/ili dvolančanih donora) opisani ovde uključuju neintegrišuće lentivirusne vektore (IDLV). Pogledati, na primer, Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Virol.72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol.72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222; SAD patentnu publikaciju br.2009/0117617.

[0159] Farmaceutski prihvatljivi nosači delimično su određeni određenim sastavom koji se primenjuje, kao i posebnim postupkom koji se koristi za primenu sastava. Shodno tome, postoji veliki izbor odgovarajućih formulacija farmaceutskih sastava, kako je opisano u nastavku (pogledati npr. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989).

[0160] Biće očigledno da sekvence koje kodiraju nukleazu i donorski konstrukti mogu biti isporučeni korišćenjem istih ili različitih sistema. Na primer, nukleaze i donori se mogu prenositi istim DNK MC. Alternativno, donorski polinukleotid se može preneti pomoću MC, dok se jedna ili više nukleaza mogu preneti standardnim plazmidom ili AAV vektorom. Dalje, različiti vektori se mogu primenjivati istim ili različitim putevima (intramuskularna injekcija, injekcija repne vene, druga intravenozna injekcija, intraperitonealna primena i/ili intramuskularna injekcija. Vektori se mogu isporučiti istovremeno ili bilo kojim uzastopnim redosledom.

[0161] Dakle, predmetno obelodanjenje uključuje in vivo ili ex vivo tretman bolesti i stanja koja su podložna ubacivanju transgena koji kodiraju terapeutski protein. Sastavi se primenjuju ljudskom pacijentu u količini efikasnoj za postizanje željene koncentracije terapijskog polipeptida u serumu ili ciljanom organu ili ćelijama. Primena se može izvršiti na bilo koji način na koji se polinukleotidi isporučuju do željenih ciljanih ćelija. Na primer, razmatraju se i in vivo i ex vivo postupci. Intravenozna injekcija u portalnu venu je poželjan način primene. Drugo in vivo načini primene uključuju, na primer, direktnu injekciju u režnjeve jetre ili bilijarnog kanala i intravenoznu injekciju distalno od jetre, uključujući kroz hepatičku arteriju, direktnu injekciju u parenhim jetre, injekciju preko hepatične arterije i/ili retrogradnu injekciju kroz bilijarno stablo. Ex vivo načini primene uključuju transdukciju in vitro reseciranih hepatocita ili drugih ćelija jetre, nakon čega sledi infuzija transduciranih,

4

reseciranih hepatocita nazad u portalnu vaskulaturu, parenhim jetre ili bilijarno stablo ljudskog pacijenta, pogledati npr., Grossman et al., (1994)Nature Genetics, 6:335-341.

[0162] Efikasna količina nukleaza i donora koja će se primenjivati variraće od pacijenta do pacijenta i u skladu sa terapijskim polipeptidom od interesa. Shodno tome, efikasne količine najbolje određuje lekar koji primenjuje sastave, i odgovarajuće doze može lako odrediti stručnjak. Nakon što se omogući dovoljno vremena za integraciju i eksprimiranje (tipično 4-15 dana, na primer), analizom seruma ili drugih nivoa terapijskog polipeptida u tkivu i poređenjem sa početnim nivoom pre primene će utvrditi da li je količina koja se primenjuje preniska, unutar pravog raspona ili previsoka. Pogodni režimi za početnu i narednu primenu su takođe promenljivi, ali su tipizirani početnom primenom koju slede naknadne primene ako je potrebno. Naknadne primene mogu se primenjivati u promenljivim intervalima, u rasponu od dnevno do godišnje do svakih nekoliko godina. Stručnjak će razumeti da se mogu preporučiti odgovarajuće imunosupresivne tehnike kako bi se izbegla inhibicija ili blokada transdukcije imunosupresijom vektora za isporuku, pogledati npr., Vilquin et al., (1995) Human Gene Ther., 6:1391-1401.

[0163] Formulacije za ex vivo i in vivo primene uključuju suspenzije u tečnosti ili emulgovanim tečnostima. Aktivni sastojci se često mešaju sa ekscipijensima koji su farmaceutski prihvatljivi i kompatibilni sa aktivnim sastojkom. Pogodni ekscipijensi uključuju, na primer, vodu, fiziološki rastvor, dekstrozu, glicerol, etanol ili slično, i njihove kombinacije. Pored toga, sastav može da sadrži manje količine pomoćnih supstanci, kao što su agensi za vlaženje ili emulgovanje, agensi za puferisanje pH, agensi za stabilizaciju ili drugi reagensi koji povećavaju efikasnost farmaceutskog sastava.

Ćelije

[0164] Ovde su takođe opisane ćelije i/ili ćelijske linije u kojima je modifikovana endogena sekvenca BCL11A pojačivača. Modifikacija može biti, na primer, u poređenju sa sekvencom ćelije divljeg tipa. Ćelije ili ćelijske linije mogu biti heterozigotne ili homozigotne za modifikaciju. Modifikacije BCL11A sekvence mogu sadržati umetanja, brisanja i/ili njihove kombinacije.

[0165] Prema ovde opisanom obelodanjenju, sekvenca BCL11A pojačivača može biti modifikovana nukleazom (npr., CPN, TALEN, CRISPR/Cas sistem, Ttago sistem, itd.), na primer nukleazom kako je ovde opisano. BCL11A pojačivač može se modifikovati bilo gde između egzona 2 i egzona 3. BCL11A pojačivač može biti modifikovan u regionima prikazanim u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 3 (Slika 11). Modifikacija je poželjno na ili blizu mesta vezivanja i/ili razdvajanja nukleaze, na primer, unutar 1-300 (ili bilo koja vrednosti između njih) baznih parova uzvodno ili nizvodno od mesta razdvajanja, poželjnije unutar 1-100 baznih parova (ili bilo koja vrednosti između njih) sa obe strane mesta vezivanja i/ili razdvajanja, još poželjnije unutar 1 do 50 baznih parova (ili bilo koja vrednosti između njih) sa obe strane mesta vezivanja i /ili razdvajanja. Modifikacija može biti na ili blizu „+58“ regiona BCL11A pojačivača, na primer, na ili blizu mesta vezivanja nukleaze prikazanog u bilo kojoj od SEQ ID NO: 4 do 80 i 362. Modifikacija može biti na ili blizu „+55“ regiona BCL11A pojačivača, na primer, na ili blizu mesta nukleaze prikazanog u bilo kojoj od SEQ ID NO: 143 do 184 i 232-251.

[0166] Bilo koja ćelija ili ćelijska linija mogu biti modifikovani, na primer matična ćelija, na primer embrionalna matična ćelija, indukovana pluripotentna matična ćelija, matična ćelija hematopoeze, neuronska matična ćelija i mezenhimalna matična ćelija. Drugi neograničavajući primeri ćelija koji su ovde opisani uključuju T-ćelije (npr., CD4+, CD3+, CD8+itd.); dendritičke ćelije; B-ćelije. Takođe je obelodanjen potomak matične ćelije, uključujući delimično ili potpuno diferenciranu ćeliju (npr., eritrocit ili ćelija prekursora eritrocita). Neograničavajući primeri druge ćelijske linije, uključujući modifikovanu sekvencu BCL11A, uključuju COS, CHO (npr., CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (npr., HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) i perC6 ćelije, kao i ćelije insekata kao što su Spodopterafugiperda (Sf), ili ćelije gljiva kao što su Saccharomyces, Pichia i Schizosaccharomyces.

[0167] Ćelije kako je ovde opisano su korisne u tretmanu i/ili sprečavanju poremećaja, na primer, pomoću ex vivo terapije. Ćelije modifikovane nukleazom mogu se proširiti, i zatim ponovo uvesti u pacijenta standardnim tehnikama. Pogledati, npr. Tebas et al (2014) New Eng J Med 370(10):901. U slučaju matičnih ćelija, nakon infuzije u pacijenta, takođe dolazi do in vivo diferencijacije ovih prekursora u ćelije koje eksprimiraju funkcionalni transgen. Takođe su obelodanjeni farmaceutski sastavi koji sadrže ćelije kao što je ovde opisano. Osim toga, ćelije se mogu kriokonzervirati pre primene pacijentu.

[0168] Bilo koja od ovde modifikovanih ćelija ili ćelijskih linija može pokazati povećano eksprimiranje gama globina. Takođe su obelodanjeni sastavi kao što su farmaceutski sastavi koji sadrže genetski modifikovane ćelije kao što je ovde opisano.

Primene

[0169] Ovde opisani postupci i sastavi su za modifikovanje eksprimiranja proteina ili za ispravljanje aberantne sekvence gena koja kodira protein eksprimiran u genetskoj bolesti, kao što je bolest srpastih ćelija ili talasemija. Prema tome, postupci i sastavi pružaju tretman i/ili prevenciju takvih genetskih bolesti. Uređivanje genoma, na primer matičnih ćelija, može se koristiti za ispravljanje aberantnog gena, umetanje gena divljeg tipa ili promenu eksprimiranja endogenog gena. Kao neograničavajući primer, gen divljeg tipa, npr. kodiranje najmanje jednog globina (npr., α i/ili β globin), može se umetnuti u ćeliju (npr., u endogenu sekvencu BCL11A pojačivača koristeći jednu ili više nukleaza kako je ovde opisano) kako bi pružio proteine globina koji su deficitarni i/ili nedostaju u ćeliji, i na taj način tretira genetsku bolest, npr., hemoglobinopatiju, uzrokovana neispravnim eksprimiranjem globina.

Alternativno ili pored toga, genomsko uređivanje sa ili bez primene odgovarajućeg donora, može ispraviti neispravan endogeni gen, npr., ispravljanje tačkaste mutacije u α- ili βhemoglobinu, za obnavljanje eksprimiranja gena i/ili tretman genetske bolesti, npr. bolest srpastih ćelija i/ili izbacivanje ili promena (prekomerno eksprimiranje ili potiskivanje) bilo kog direktnog ili indirektnog gena za regulaciju globina (npr. inaktivacija gena za regulaciju γ globina BCL11A ili BCL11A-regulator KLF1). Konkretno, sastavi prema pronalasku imaju primenu u tretmanu ili prevenciji hemoglobinopatija.

[0170] Nukleaze koje su ovde opisane ciljaju na region BCL11A pojačivača, za koji je poznato da je potreban za eksprimiranje BCL11A, a time i za smanjenje regulacije eksprimiranja gama globina. Modifikacija ovog pojačivača može dovesti do eritrocita sa povećanom eksprimiranjem gama globina, pa može biti od pomoći u tretmanu ili prevenciji bolesti srpastih ćelija ili beta talasemije.

[0171] Naredni primeri se odnose na primere izvođenja predmetnog obelodanjenja u kojima nukleaza sadrži cinkov prst nukleazu (CPN) ili TALEN.

PRIMERI

Primer 1: Sastavljanje cinkov prst nukleaza i TALEN nukleaza

[0172] CPN su sastavljeni protiv ljudskog BCL11A gena i testirani su CEL1 testovima kako je opisano kod Miller et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25:778-785. TALEN su sastavljeni kako je opisano kod Miller et al (2011) Nature Biotechnology 29 (2): 143-151. Dodatno, pogledati SAD patentne prijave 14/013,236 i SAD patent br.8,586,526 koji su u suvlasništvu. TALEN su sastavljeni sa 63 arhitekturom.

Primer 2: Uvođenje brisanja u 55, 58 i 62 regionima BCL11Apojačivača [0173] Kako bi se ispitalo koji su regioni BCL11A intron 2 pojačivača (Slika 1) potrebni za potiskivanje gama globina tokom eritropoeze, napravljen je TALEN niz koji ciljaju delove ovih regiona (Slika 2). TALEN parovi prikazani su u Tabeli 1 u nastavku. Nukleotidi na ciljanom mestu sa kojima dolazi u dodir nukleaza označeni su velikim slovima; nedodirnuti nukleotidi navedeni su malim slovima.

Tabela 1: TALEN ciljani na region BCL11A pojačivača

[0174] Ljudske K562 ćelije su kultivisane u DMEM dopunjenom sa 10% FBS, i 200.000 ćelija je transficirano sa 800 ng plazmidne DNK koja kodira TALEN pomoću Amaxa Nucleofector® prema uputstvima proizvođača. Cel-I test (Surveyor™, Transgenomics) kako je opisano kod Perez et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26: 808-816 and Guschin et al. (2010) Methods Mol Biol.649:247-56), korišćen je za detektovanje TALEN-indukovanih modifikacija ciljanog gena. U ovom testu, PCR-amplifikacija ciljanog mesta bila je praćena kvantifikacijom umetanja i/ili brisanja (indela) pomoću enzima za detektovanje neusklađenosti Cel-I (Yang et al. (2000) Biochemistry 39: 3533-3541) koji je dao procenu donje granice DSB frekvencije. Duboko sekvenciranje na Illumina platformi („miSEQ“) korišćeno je prema uputstvima proizvođača za merenje efikasnosti uređivanja, kao i prirode uređivanja generisanih alela. Kako bi se otkrila brisanja nakon tretmana ćelija sa više od jednog para nukleaza, korišćen je test zasnovan na PCR u kom se genomska DNK u velikoj količini amplifikuje prajmerima koji okružuju region za brisanje, i gel se koristi za odvajanje PCR proizvoda dobijenog iz alela divljeg tipa, i onaj izveden iz alela koji nosi brisanje. Svi dizajni prikazani u Tabeli 1 su bili aktivni.

[0175] Tri dana nakon transfekcije TALEN vektora eksprimiranja pri standardnim uslovima (37°C), genomska DNK je izolovana iz K562 ćelija pomoću DNeasy kompleta (Qiagen) ili QuickExtract (Epicentre) i podvrgnuta PCR amplifikaciji.

[0176] Rezultati Cel-I testa pokazali su da su TALEN sposobni da izazovu razdvajanje na odgovarajućim ciljanim mestima.

[0177] Kako bi se testirao efekat na relativno eksprimiranje gama globina, mRNK koje kodiraju TALEN parove uvedene su u CD34+ ćelije (dobijene od zdravih donora dobrovoljaca) pomoću BTX nukleofekcije prema uputstvima proizvođača. Ćelije su zatim diferencirane u eritrocite. Ukratko, CD34+ ćelije su prečišćene pomoću Ficoll-Paque (GE Healthcare) i CD34<+>mikro perle (MiltenyiBiotec) prema uputstvima proizvođača. CD34+ ćelije su kultivisane u MDM od Iscove sa BIT 95000 (StemCell Technologies) u prisustvu faktora rasta. Ćelije su diferencirane prema eritroidnoj liniji korišćenjem trostepenog modela tečne kulture. Tokom prvih 6 dana (prva faza), CD34<+>ćelije su proširene sa SCF (100 ng/ml), Flt3-L (100 ng/ml) i IL-3 (20 ng/ml). Proširene ćelije su zatim učvršćene i diferencirane prema eritroidnoj liniji (druga faza) sa Epo (2 U/ml) i SCF (50 ng/ml). Pogledati, Giarratana et al. (2011)Blood118(19):5071-9.

[0178] Za analizu relativnog eksprimiranja gama globina, odnosi mRNK koji kodiraju gama globin i beta globin nakon TALEN tretmana određeni su 14 dana nakon uvođenja TALEN pomoću Taqman® analize. Analiza je izvedena standardnom Taqman® analizom, prateći protokol i koristeći genetski specifične testove koje je dostavio proizvođač (Applied Biosystems) i isporučene komplete prajmera. Relativni nivoi gama globina normalizovani su nivoom eksprimiranja alfa ili beta globina gde je odnos upoređen sa odnosom alfa/beta ili gama/beta u netretiranim ćelijama. Rezultati (Slike 3, 4 i 5) pokazali su da je brisanje regiona unutar 58 i 55 BCL11A DNKseI hipersenzitivnog mesta rezultovalo povećanjem relativnih nivoa eksprimiranja gama globina u ovim eksperimentima.

Primer 3: TALEN „hodanje“ po 58 DNKse I hipersenzitivnom mestu u BCL11A [0179] Kako bi se dalje definisalo područje potrebno za pojačivačku aktivnost u 58 regionu, napravljen je TALEN niz za stvaranje DSB niza i brisanja na ovom delu DNK. TALEN korišćeni u ovom eksperimentu prikazani u Tabeli 2 z nastavku.

Tabela 2: TALEN koji se koriste u hodanju 58 pojačivača

1

2

[0180] U ovoj tabeli, 'Uzorak' se odnosi na uzorke prikazane na Slici 6. Rezultati pokazuju da je TALEN par 102853/102852 (označen strelicom na slici) mogao povećati relativno gama eksprimiranje. Dalje, velika brisanja uvedena su nekim TALEN parovima (Uzorak 24: par iz Uzorka 22 par iz Uzorka 6; Uzorak 25: par iz Uzorka 16 par iz Uzorka 6; Uzorak 26: par iz Uzorka 22 par iz Uzorka 16) su takođe mogli da povećaju relativno gama eksprimiranje.

4

TALEN su konstruisani u ovoj studiji za ispitivanje u čitavom 58 regionu (pogledati Sliku 8 koja prikazuje sekvencu pojačivača i TALEN mesta razdvajanja). Svi dizajni prikazani u Tabeli 2 bili su aktivni.

Primer 4: CPN ciljani na 58 region BCL11A pojačivača

[0181] Paralelno sa TALEN parovima opisanim u Primeru 3, napravljeni su CPN parovi koji ciljaju 58 region. Korišćeni CPN prikazani su u Tabeli 3 u nastavku. Nukleaze su identifikovane po svom „SBS“ broju, jedinstvenom numeričkom identifikatoru za svaki protein.

Tabela 3: CPN parovi specifični za 58 region BCL11A pojačivača

[0182] Ovi CPN su korišćeni za razdvajanje 58 regiona BCL11A pojačivača u CD34 ćelijama, i transficirane ćelije su analizirane na relativno gama eksprimiranje nakon diferencijacije eritrocita. Identifikovan je jedan CPN par, 45844/45843 koji je izazvao povećanje relativnog gama eksprimiranja u poređenju sa ćelijama tretiranim GFP kontrolom transdukcije, ili ćelijama tretiranim sa drugim CPN. Slika 8 pokazuje da se mesto koje cilja ovaj par CPN delimično preklapa sa ciljem najaktivnijeg TALEN para opisanog u Primeru 3. Bliži pregled sekvence koja se razdvaja otkriva da ona sadrži „GATA-1“ konsenzusno mesto (A/T GATA A/G), za koju se zna da je jedna od sekvenci vezanih od strane GATA1 i srodnih faktora transkripcije. Pogledati, npr. Martin i Orkin (1990) Genes Dev 4:1886-1898;

Fujiwara et al. (2009) Molecular Cell 36:667-681; Tijssen et al. (2011) Developmental Cell 20:597-609; May et al. (2013) Cell Stem Cell 13:1-15. Svi dizajni prikazani u Tabeli 3 su bili aktivni.

[0183] Region koji sadrži mesto razdvajanja je amplifikovan pomoću PCR, i nakon amplifikacije, PCR proizvod je sekvenciran pomoću MiSeq analize visokog protoka sekvenciranja prema uputstvima proizvođača (Ilumina) za CPN 45843/45844 i TALEN 102852/102853 parove. Pet najčešćih genotipova prikazano je u Tabelama 5a i 5b u nastavku, koje pokazuju razdvajanje na ili blizu ciljanih mesta nukleaze i otkrivaju gubitak komsenzus sekvence GATA-1 posredovan nukleazom (uokvireno) u oba slučaja (Tabela 5a prikazuje SEQ ID NO: 201-205 odozgo na dole; Tabela 5b prikazuje SEQ ID NO: 206-210 odozgo na dole). Par TALEN se razdvaja blago nizvodno od konsenzus sekvence, što potencijalno može rezultovati manjom učestalošću obaranja iz ove sekvence.

Primer 5: TALEN hodanje po 55 DNKseI hipersenzitivnim mestima u regionu BCL11A pojačivača

[0184] Kako bi se dodatno poboljšalo područje potrebno za pojačivačku aktivnost u 55 regionu, napravljen je niz TALEN parova kako bi se stvorio niz mutacija preko ovog dela DNK. TALEN parovi napravljeni u ovom eksperimentu prikazani u Tabeli 4 u nastavku.

Tabela 4: TALEN parovi koji prepoznaju 55 regiona BCL11A pojačivača

1

[0185] TALEN su uvedeni u CD34+ ćelije kao što je gore opisano i ćelije su indukovane da se diferenciraju u eritroidne ćelije kao što je gore opisano. Taqman® analiza je izvedena kako je opisano i identifikovano je nekoliko mesta koja su uzrokovala povećanje relativnog gama eksprimiranja (Slika 9). Mesta razdvajanja su prikazana na Slici 10. Svi dizajni prikazani u Tabeli 4 su bili aktivni. Zanimljivo je da se jedan od TALEN parova koji je izazvao povećanje mRNK gama globina razdvaja na drugoj GATA-1 konsenzus sekvenci (mesto razdvajanja 17 na Slici 10).

Primer 6: CPN usmereni na 55 DNKse I hipersenzitivno mesto u BCL11A

[0186] Slično Primeru 4, napravljen je set CPN za ispitivanje 55 DNKse I hipersenzitivnog regiona. CPN su prikazani u Tabeli 6 u nastavku.

2

Tabela 6: CPN specifični za 55region pojačivača: dizajn i ciljevi

4

[0187] CPN specifični za 55 region testirani su na aktivnost razdvajanja pomoću Cel-I testa i otkriveno je da su aktivni u K562 ćelijama. Svi dizajni prikazani u Tabeli 6 bili su aktivni, i modifikacija gena izazvana sa CPN, opisana kao %NHEJ (nehomološko spajanje krajeva) pronađena za svaki par, navedena u Tabeli 7 u nastavku.

Tabela 7: Aktivnost razdvajanja CPN specifičnog za 55 region BCL11A pojačivača u K562 ćelijama

[0188] CD34+ ćelije su transficirane sa CPN parovima kako je opisano u Primeru 4, i zatim su diferencirane u eritrocite kao gore. CPN prikazani u 6 vezuju se i modifikuju region BCL11A pojačivača 55 i modifikuju ga.

Primer 7: Povećanje aktivnosti 58 specifičnih CPN parova

[0189] CPN koji ciljaju 58 region dodatno su poboljšani pomeranjem ciljanih sekvenci, promenom identičnosti prsta i korišćenjem alternativnih veznika između DNK-vezujućeg domena cinkovog prsta i FokI domena razdvajanja.

[0190] CPN parovi su napravljeni da ciljaju sekvencu vrlo blizu mesta razdvajanja CPN para 45843/45844. Parovi su prikazani u Tabeli 8 u nastavku, i lokacija njihovih mesta vezivanja prikazana je na Slici 12A.

Tabela 8: CPN ciljaju na 58 region pojačivača

[0191] Kao što se može videti na Slici 12, mesto vezivanja novih parova nalazi se jedan bazni par bliže centru GATA-1 konsenzus sekvence. Svi parovi su bili aktivni za vezivanje i razdvajanje svojih ciljeva u genomu kako je izmereno početnim testom K562 ćelija. mRNK koje kodiraju CPN su elektroporisane u CD34+ ćelije, i zatim su ćelije diferencirane u eritroidnu liniju kao što je opisano u Primeru 2. Za analizu relativnog eksprimiranja gama globina, odnosi mRNK koji kodiraju gama globin i beta globin nakon CPN tretmana utvrđeni su Taqman® analizom 14 dana nakon uvođenja CPN. Rezultati (Slika 12B) pokazali su da CPN parovi koji ciljaju pomerena mesta vezivanja imaju veći uticaj na eksprimiranje gama globina.

[0192] Zatim su proteini napravljeni sa alternativnim tipovima veznika kako bi se testirao efekat na Bcl11a proteine. Napravljeni su slični setovi CPN koji sadrže iste spirale u istim prstima, ali svaki od njih sadrži različite veznike između DNK vezujućeg domena PCP i FokI nukleaze. Na primer, CPN 46801, 46786, 46816 i 46934 imaju isti DNK vezujući domen PCP, ali su povezani sa domenom nukleaze pomoću L7a, L0, L8c4 i L7c5 veznika. Slično, CPN 45844 i 47021 imaju isti DNK vezujući domen, ali 45844 ima L7a veznik, dok 47021 koristi L7c5 veznik. Osim toga, 46880, 47923, 50679 i 50680 imaju iste DNK vezujuće domene, ali 46880 koristi L7a veznik; 47923 ima L7c5 veznik; 50679 koristi L0[-1], a 50680 ima L0[-3]. Veznici su prikazani na Slici 14 i Slici 17.

[0193] Kao što je prikazano na Slici 13, CPN su testirani u različitim parovima gde je jedan set parova ciljao mesto vezivanja označeno onim koje cilja 45843/45844 par, a zatim drugi set koji je označen onim koje cilja 46801/46880. Parovi koji su ispitani prikazani u Tabeli 9 u nastavku na naredni način, zajedno sa procentom razdvajanja (NHEJ) mereno analizom sekvence bilo na Dan 0 (D0) ili Dan 14 (D14). Svaka tačka podataka je srednja vrednost od tri ponavljanja.

Tabela 9: Efekat veznika na aktivnost razdvajanja CPN

[0194] Dodatni testovi su dizajnirani za merenje broja uređivanja koja sadrže indel koja su uništila GATA mesto na cilju. U Tabeli 10 u nastavku prikazane su kombinacije CPN sa različitim veznicima i efekat koji veznicima imaju na povećanje ukupnog procenta indela i povećanju indela koji rezultuju gubitkom GATA vezujućeg mesta.

Tabela 10: Primeri aktivnosti veznika

1

2

[0195] Kao što se može pogledati u gornjoj tabeli, dorada prvobitnog para, 46801 (L7a)/47923 (L0), čija je aktivnost izmerena u ovom eksperimentu na 19% ukupne formacije indela, gde je 86% izmerenih indela uništilo GATA vezivno mesto, može dovesti do ukupnog povećanja aktivnosti razdvajanja (indela) i ukupnog povećanja procenta indela koji dovode do uništenja GATA. Pogledati, na primer, 46934 (L7c5)/47923 (L0) gde je primećeno 47,8% ukupnih indela i 92% tih indela je imalo uništeno GATA mesto. Ovi i drugi opisani veznici (pogledati Sliku 17) mogu se uključiti u CPN kako bi se povećala i/ili poboljšala aktivnost.

[0196] Tako se alternativni veznici mogu koristiti sa ovde opisanim CPN parovima za razdvajanje Bcl11a i povećanje gama hemoglobina u odnosu na alfa hemoglobin.

Primer 8: In vivo primena

[0197] Sastavi uključujući ćelije (npr., HSC i/ili ćelije prekursora eritrocita), proteini (npr., nukleaze) i/ili polinukleotidi (npr., kodirajuće nukleaze), kako je ovde opisano, primenjuju se pacijentu, na primer pacijentu sa hemoglobinopatijom, u suštini kao što je opisano u SAD patentima br.7,837,668; 8,092,429; SAD patentnoj publikaciji br.20060239966; SAD patentima br.6,180,613; 6,503,888 i /ili SAD patentima br.6,998,118 i 7,101,540 da pruži terapiju pacijentu kome je to potrebno.

[0198] Osim toga, ćelije se proučavaju za upotrebu u velikoj proizvodnji uređenog LT-HSC. Grupa CD34+ ćelija je prethodno stimulisana citokinima koji sadrže Stemspan™ CC110, Flt-3 ligand, SCF i TPO i sve njihove kombinacije u koncentracijama od 10 ng/mL do 1000 ng/mL. Prethodna stimulacija može zahtevati vreme izlaganja od 24, do 48 i do 72 sata. Za kliničku HSPC transfekciju može se koristiti bilo koji sistem velikog kapaciteta (npr.

Maxcyte GT Flow Transfection System).

[0199] Za ex vivo terapije, uređene ćelije (npr., HSC) podvrgavaju se testovima formiranja kolonija u medijumu metilceluloze kako bi se potvrdila učestalost pluripotentnih ćelija i proverilo da li kolonije poseduju željenu genetsku izmenu na očekivanim frekvencijama. Studije metilceluloze se sprovode postupcima poznatim u struci (pogledati na primer Keller et al (1993) Mol Cell Bio 13(1):473).

[0200] Kako bi se dodatno osigurala sposobnost presađivanja BLC11a-uređnih ćelija (npr., HSC), ćelije su presađene u relevantan model miša i/ili model primata koji nije čovek.

Presađivanje ovih životinja vrši se prema postupcima poznatim u struci. Pogledati, na primer Holt et al. (2010) Nat Biotech 28, 839-847, Ho et al (2009) Retrovirology 6:65 i Peterson et al (2014) J. Med Primatol 42: 237. Presađivanje sa (1020 cGy zračenjem) ili bez (200 cGy zračenja) mijeloablativnog predkondicioniranja koristi se za ispitivanje optimalnih uslova transplantacije i ekspanzije za transplantaciju matičnih ćelija.

Primer 9: In vivo primena i presađivanje

[0201] Kao što je opisano iznad, ljudske CD34+ ćelije su tretirane sa mRNK koje kodiraju CPN specifične za 55 pojačivač, i zatim su presađene u NSG miševe. CD34+ ćelije su dobijene od zdravih ljudskih dobrovoljaca. U nekim slučajevima, rađene su strategije mobilizacije CD34+, koristeći bilo G-CSF (Neupogen®) ili G-CSF Pleriksafor (Mozobil®) pre afereze. G-CSF se primenjivao svakodnevno četiri dana pre afereze prema uputstvima proizvođača i, ako se koristio Pleriksafor, primenjivao se poslednje večeri pre prikupljanja, ponovo prema uputstvima proizvođača. Afereza je izvedena standardnim postupcima. CD34+ ćelije su obogaćene iz mobilisanog PBMC leukopaksa korišćenjem Miltenyi CliniMACs sistema standardnim postupcima i prema uputstvima proizvođača.

[0202] Ograničene i poliadenilovane mRNK koje kodiraju CPN su sintetisane pomoću Ambion mMessage mMachine® T7 ultra kompleta prema uputstvima proizvođača, a zatim su elektroporisane u CD34+ ćelije korišćenjem Maxcyte GT sistema ili BTX ECM830 elektroporatora, oba prema uputstvima proizvođača.

[0203] NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tmWjl>lSzJ miševi su korišćeni za primanje CD34+ transplantacije. Jedan dan (16-24 sati) pre implantacije, miševi su podvrgnuti subletalnom zračenju (300 RAD). Ranije navedene CD34+ ćelije tretirane sa CPN transplantirane su u ozračene miševe injekcijom u repnu venu, gde je po mišu dat 1 milion ćelija u 0,5 mL PBS-0,1%BSA.

[0204] Za ovaj eksperiment, CD34+ ćelije su elektroporisane sa mRNK koje kodiraju ili par

4

45843/45844 (elektroporacija #1) ili par 46801/46880 (elektroporacija #2). U oba slučaja, GFP je korišćen kao kontrola. Nakon transplantacije u miševe, uzorci su uzeti 4 ili 16 nedelja nakon transplantacije kako bi se uočio nivo označavanja u ćelijama. U nedelji 4, do približno 4% ćelija u perifernoj krvi bile su ljudske ćelije iz obe elektroporacije (pogledati Sliku 15A). Uređivanje genoma (indeli) u ovim ćelijama bilo je oko 30-40% (Slika 15B).

[0205] U nedelji 16 nakon transplantacije, nivo uređivanja je meren u ljudskim panmijeloidnim, B-ćelijama, eritroidnim i matičnim ćelijama kod miševa. U ovim eksperimentima, ćelije iz obe elektroporacije su objedinjene. Podaci (Slika 16) pokazuju da je 40-50% uređivanja gena detektovano u svim analiziranim populacijama ljudskih ćelija. Ovaj eksperiment pokazuje da se transplantirane CD34+ ćelije održavaju i diferenciraju uz održavanje uređivanja gena na BCL11A lokusu.

1

2

4

1

11

12

1

14

1

11

12

1

11

12

1

14

1

14

Claims

Patentni zahtevi

1. Genetski modifikovana ćelija koja sadrži brisanja i/ili umetanja u endogenu sekvencu BCL11A pojačivača napravljenu od nukleaze koja sadrži domen razdvajanja i DNK-vezujući domen koji se vezuje za ciljano mesto koje sadrži najmanje 9 baznih parova od SEQ ID NO: 71 do 74.

2. Genetski modifikovana ćelija prema patentnom zahtevu 1, gde je ćelija matična ćelija.

3. Genetski modifikovana ćelija prema patentnom zahtevu 2, gde je matična ćelija matična ćelija hematopoeze, kao što je CD34+ matična ćelija hematopoeze.

4. Genetski modifikovana diferencirana ćelija koja potiče od matične ćelije prema patentnom zahtevu 2 ili 3.

5. Genetski modifikovana diferencirana ćelija prema patentnom zahtevu 4, gde je ćelija crveno krvno zrnce (RBC).

6. Genetski modifikovana ćelija prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 5, gde DNK-vezujući domen sadrži protein cinkovog prsta (PCP), protein TAL-efektorskog domena ili RNK sa jednim vodičem od CRISPR/Cas sistema.

7. Farmaceutski sastav koji sadrži genetski modifikovanu ćeliju prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 6.

8. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 7 za upotrebu u tretmanu ili prevenciji hemoglobinopatije.

9. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 7 za upotrebu u postupku tretmana ili sprečavanja hemoglobinopatije kod pacijenata kojima je potrebno povećanje eksprimiranja gena globina, gde se postupak sastoji od primene pacijentu farmaceutskog sastava u količini dovoljnoj za povećanje eksprimiranja gena globina kod pacijenta.

10. Farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, gde eksprimiranje gena globina predstavlja nivo proizvedene globinske mRNK ili globinskog proteina.

11. Farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu od 8 do 10, gde je hemoglobinopatija talasemija ili bolest srpastih ćelija, kao što je β-talasemija.

1 1